Qumica Forense

FaCENA
Laboratorio N3

Tema: Alcoholemia. Determinacio n de semen

Objetivos:
- Conocer las diferentes te cnicas cualitativas y cuantitativas para la
determinacio n de etanol.
- Realizar el dopaje de alcohol en diferentes muestras y ver su
correlatividad en sangre.
- Conocer las diferentes te cnicas para la determinacio n de semen.
- Aprender a correlacionar los hallazgos me dico-legales para le
elaboracio n
- Interpretar los resultados de las te cnicas aplicadas.

Determinacin de semen

Pretratamiento de la muestra:

Se macerara el hisopo (o la muestra que correspondiera) con unos mililitros de

solucio n fisiolo gica, luego se centrifuga:
- Culot : se realiza extendido ( en caso de que ya no lo hayan enviado) se
observa en fresco y se colorea con May Grunwald Giemsa. Se observa al MO
en busca de espermatozoides.
- Sobrenadante: se realizan la determinacio n de Fosfatasa A cida Prosta tica y
Antgeno Prosta tico Especfico.

Fosfatasa Acida Prosta tica (FAP)

El esperma contiene una elevada proporcio n de fosfatasa a cida (400 a 8000

unidades por ml) por lo cual se usa esta propiedad para identificacio n de manchas
de semen.
La fosfatasa a cida es cualquier enzima capaz de hidrolizar un fosfato orga nico en
medio a cido. Se denomina fosfatasa a cida prosta tica a la existente en el plasma
seminal, que produce la hidrolisis de la fosforil colina en a cido fosfo rico y colina.
Esta enzima actu a preferentemente a pH 5, aunque el mismo vara de acuerdo con
el e ster fosfoo rico a hidrolizar entre 4,5 y 5.
La actividad fosfata sica se miden en base a una reaccio n en la que se liberan los
productos feno licos. El aumento de fosfatasa a cida prosta tica en el suero
sanguneo es patognomo nico del ca ncer metasta tico de pro stata, por lo cual el
dosaje de dicha enzima en el suero sanguneo es de suma importancia diagno stica.
Se ha demostrado que la Fosfatasa a cida prosta tica es inhibida por el a cido L (+)
tarta rico, en tanto que la sangunea no lo es.
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Entonces este me todo se basa en dos hechos : 1- la excepcionalmente alta actividad
de la fosfatasa a cida presente en el semen humano es de origen prosta tico y por lo
tanto independiente de los espermatozoides:
2- Tal enzima es inhibida en forma
pra cticamente total por el L(+) tartrato 0,04 M

Reactivos:
-Buffer de citrato (pH 4,9)
Acido Ctrico Monohidratado.. 18,9 gramos
Agua destilada..500 ml
Hidro xido de Sodio 1N 180 ml
Acido Clorhdrico 0,1 N ... 100 ml
Ajustar el pH a 4,9 y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Conservar en heladera.
-Tartrato 0,4 M
Acido L (+) Tarta rico 6,004 gramos
Agua destilada 50 ml
Hidro xido de sodio 2N35 ml
Ajustar a pH a 4,9 y llevar a 100 ml con agua destilada.
Conservar en heladera.
-Reactivo I (sin tartrato)
Alfa- naftil fosfato so dico.. 50 mg
Buffer de citrato .. 50 ml
Disolver en el momento del uso
Fast Blue B. 50 mg
Disolver por fuerte agitacio n.

-Reactivo II ( con tartrato)

Alfa naftil fosfato so dico.. 50 mg
Buffer de citrato . 45 ml
Tartrato 0,4 M 5 ml
Disolver. En el momento del uso de agregar:
Fast Blue B.. 50 mg
Disolver por fuerte agitacio n

Procedimiento:
La prueba se puede realizar en tubo o en placa de toque. Se prepara blanco con
agua, testigo y la muestra.
En placa de toque en los dos pocillos de la primera se coloca, una gota de agua, en
la segunda hilera se coloca una gota del testigo en cada pocillo y en la u ltima hilera
una gota de la muestra.
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Al blanco, testigo y la muestra de la primera fila se le coloca el reactivo I (sin
tartrato), y a todos los pocillos de la segunda fila se coloca una gota del reactivo II
( con tartrato).
Si en la muestra con el reactivo I se produce color pu rpura, haba fosfatasa a cida. Si
e sta no se desarrolla el examen es negativo, pudiendo descartarse la presencia de
semen.
Si la muestra con el reactivo II, no desarrolla color, la fosfatasa a cida es de origen
prosta tico.
Si con ambos reactivos se desarrolla color pu rpura la fosfatasa a cida es de origen
no prosta tico, y se descarta la presencia de semen humano.
Este mtodo es adecuado para el examen de manchas seminales an en caso que se
tratara de semen asprmico o de semen mezclado con otras secreciones humanas,
pues no se ha hallado otras fosfatasas cidas de origen humano que sea inhibida por
el L(+) Tartrato. Constituye una excepcin, rarsima por otra parte, la sangre de un
hombre afectado por un tumor metasttico de prstata.

Antgeno Prosta tico Especfico (PSA)

Es un inmunoensayo cromatogra fico para la ra pida deteccio n semicuantitativa de

PSA. Este contiene dos anticuerpos monoclonales anti PSA como componentes
activos. La sensibilidad del test es de 2 ng/ml.

Interpretacin de resultados:
- En casos que se observe un espermatozoide entero por MO no es necesario la
realizacin de las dems determinaciones.
- Cuando no se observan espermatozoides por MO, se deben realizar las dems
pruebas:
FAP (+) y PSA (+) = Presencia de Semen
FAP(-) y PSA (-) = Ausencia de Semen
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MTODO DE MICRODIFUSIN:

FUNDAMENTO DEL ME TODO: Se basa en el proceso de particio n, por el cual una

sustancia vola til pasa, a trave s de la atmo sfera generada en un dispositivo cerrado,
a un solvente puro o a un reactivo en el cual es considerablemente ma s soluble que
en la muestra que lo contiene.

Este proceso de particio n puede ser favorecido y/o acelerado por el empleo de un
reactivo liberador.
El dispositivo ma s comu nmente utilizado para este tipo de procedimiento es la
Ca psula de Conway, la cual consta de dos compartimientos: uno interno, ma s
pequen o y otro externo, ma s grande. Como norma general, en el compartimiento
interno se coloca el reactivo o el solvente puro (K 2Cr2O7) sobre el cual se disolvera
el to xico vola til que se investiga (CH 3CH2OH). En el compartimiento externo se
coloca la muestra sospechosa de contener el to xico objeto de nuestro estudio y el
reactivo que actu a como agente liberador (K2CO3).

3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 3 CH3COOH + 2 Cr2(S04)3 + 2 K2SO4 + 11 H20

naranja verde

Las muestras que se pueden utilizar son sangre, orina, saliva y otros fluidos
biolo gicos.

Las ventajas que ofrece e ste me todo son:

- Se necesita escasa cantidad de muestra para realizar el ensayo.
- No necesita procesos previos de purificacio n, se trabaja directamente con la
muestra problema.
- Es un me todo muy sencillo, econo mico y ra pido.
- Es un me todo de elevada sensibilidad, lo cual acarrea falsos positivos.
Las sustancias susceptibles de ser analizadas pueden ser liberadas de la muestra
por distintos principios fsico-qumicos, ya sea aprovechando la mayor solubilidad
del to xico en el reactivo al que se lo enfrenta; o por reduccio n de la solubilidad del
to xico en la muestra que lo contiene.

MATERIALES UTILIZADOS:
- Ca psula de Conway (c/tapa).
- Grasa de siliconas.
- Pipetas graduadas Propipeta.
- Estufa
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REACTIVOS UTILIZADOS:
- Dicromato de potasio 0,4N en a cido sulfu rico 10N.
- Solucio n saturada de Carbonato de potasio.
- Testigos de concentracio n conocida (T1: 1g/l; T2: 2g/l; T3: 3g/l).

PROCEDIMIENTO:
1- En el compartimiento interior se coloca 0,5ml de la solucio n de K 2Cr2O7
(agente atrapante).
2- En el compartimiento externo se agrega la muestra (o agua o testigos
cuando corresponda) ma s 1ml de la solucio n de K2CO3 (agente liberador).
3- Cubrir la placa con la tapa rotulada correspondientemente, previa
lubricacio n con grasa de siliconas en los bordes para evitar que los gases
difundan al exterior de la ca psula. Agitar suavemente sobre una superficie
plana, con movimientos circulares hasta homogeneizar los agregados.
4- Dejar reaccionar aprox. 2hs a 50C.

Blanco Testigo 1 Testigo 2 Testigo 3 Desconocido

K2Cr2O7 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
K2CO3 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
H20 1ml - - - -
Testigo 1 - 1ml - - -
Testigo 2 - - 1ml - -
Testigo 3 - - - 1ml -
Muestra - - - - 1ml

Una vez cumplido el perodo de difusio n se observara el cambio de color en el

compartimiento interno (si la muestra contena alcohol) ya que se produce la
captacio n y oxidacio n del etanol hacia a cido ace tico. Las muestras se procesan en
paralelo junto a tres testigos de concentracio n conocida de etanol (T1: 1g/l de
etanol, T2: 2g/l y T3: 3g/l), ya que este me todo se utiliza de forma cualitativa pero
comparando los colores de los compartimientos internos de las muestras con los
testigos podemos aproximarnos al valor de alcohol en la muestra, y e ste se
confirma y cuantifica con Cromatografa en Fase Gaseosa.

Interpretacio n de resultados:

Naranja: (-) negativo

Verde: (+) positivo: T1 = (+)
T2 = (++)
T3 = (+++)
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CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA CON DETECTOR DE IONIZACIN A LA

LLAMA (CG-FID):

La cromatografa de gases es una de las te cnicas ma s utilizadas internacionalmente

para el ana lisis de drogas de abuso, debido a que es muy especfica. Para llevar a
cabo un ana lisis cromatogra fico es necesario que la sustancia de intere s sea lo
suficientemente vola til como para que su mole cula se encuentre en forma de vapor
o gas a una temperatura igual o inferior a 400C y que adema s no se descomponga
a esas temperaturas. La CG-FID es una te cnica de separacio n, que se puede emplear
como te cnica de deteccio n, de confirmacio n y de cuantificacio n.
Existen varios tipos de detectores y su eleccio n depende de varios factores como
ser: precio, sensibilidad, selectividad, facilidad para operar con e l, dificultad para
encontrar repuestos, etc. Este detector (FID) es fa cil de usar, barato y tiene
respuesta con casi todas las drogas de intere s toxicolo gico. La respuesta del FID
depende del nu mero de a tomos de carbono en la mole cula. La mayor aplicacio n de
este detector es en el ana lisis de compuestos vola tiles, como el etanol.
Se utiliza como te cnica de muestreo HEADSPACE (espacio de cabeza). Se trabaja
con viales, en los cuales se coloca la muestra que se quiere analizar (1ml) junto
con 1ml del standart interno (ej: isobutanol). Se deja reposar 25 minutos a 70C,
donde el to xico se volatiliza y se satura el aire del compuesto, etanol. Luego
automa ticamente el equipo aspira ese aire y se lo inyecta en el CG-FID.
El esta ndar interno se utiliza con el fin de poder efectuar una determinacio n
cuantitativa, ya que la cantidad de analito es proporcional a la intensidad del pico.
La curva es una dependencia entre la relacio n de concentraciones y la relacio n de
a reas (Analito/esta ndar interno), el esta ndar garantiza una relacio n constante de
a reas con los analitos presentes en la muestra. Por esto se hace necesario
inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta el esta ndar interno en cuanto a
sus a reas y a su tiempo de retencio n.
Los gases son arrastrados a trave s de una columna donde se van separando las
distintas mole culas en base a las diferentes afinidades que presenten por la fase
estacionaria contenida en la columna. Al final de la columna esas mole culas son
captadas por un detector de ionizacio n a la llama, el cual traduce la sen al obtenida
de los iones generados a un cromatograma, en el cual cada pico corresponde a un
compuesto diferente, y la respuesta es lineal a la concentracio n del mismo.
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En el laboratorio del Cuerpo Medico Forense utilizamos el Cromato grafo Agylent
7820 A, el cual trabaja con las siguientes temperaturas:
- Tiempo de la corrida: 3 minutos
- Temperatura de la columna: 80C
- Temperatura del inyector: 150 C
- Temperatura del detector: 250C
Este equipo se usa exclusivamente para las alcoholemias, ya que cuenta con una
columna CARBOWAX, cuyo componente es polar, por lo cual presenta elevada
afinidad por elementos polares como es el caso de los alcoholes. El cromato grafo
fue estandarizado con una curva de calibracio n con testigos de diferentes
concentraciones del estandar interno (en nuestro caso butanol) de 1g/l, 2g/l y
3g/l, por lo cual al hacer correr las muestras el equipo realiza directamente el
calculo de la concentracio n de etanol presente en la muestra tomando en cuenta
e sta curva.

MATERIALES UTILIZADOS:
- Viales de vidrio con sus correspondientes tapas.
- Sellador de tapas
- Pipetas graduadas Propipetas
- Estufa
- Cromato grafo gaseoso

REACTIVOS UTILIZADOS:
- Solucio n de isobutanol
- Testigos de concentracio n conocida (T1: 1g/l; T2: 2g/l; T3: 3g/l).

PROCEDIMIENTO:
1- Se rotula la cantidad necesaria de viales y se cargan con 1 ml de butanol.
Luego se coloca 1ml de muestra segu n.
2- Se los coloca en los viales del headspace
3- Preparacio n del Cromato grafo:
- Abrir los gases (N2: carrier; H2 y aire: para generar la llama)
- Prender el equipo, headspace y la impresora.
- Cargar los datos de la nueva secuencia o muestra a analizar..
-Procesarlos con el me todo correspondiente, en nuestro caso
ALCOHOLEMIA.
-Guardar la secuencia con el nombre adecuado.
- Correr la secuencia y apretar START manualmente en el Headspace.
4- El equipo procesara automa ticamente todas las muestras cargadas en la
secuencia a analizar con los para metros del me todo cargado previamente.
5- Luego de terminada la corrida se obtendra n los cromatogramas, con los
valores de concentracio n de etanol y de standart interno correspondientes.

En caso de que la muestra no sea sangre, se debera considerar los coeficientes que
relacionan la concentracio n de alcohol en los diferentes tejidos con respecto a la
alcoholemia.
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