INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
Departamento de Fisiología
Fisiología General

Práctica No. 1
ASPECTOS GENERALES DEL MANEJO DE
ANIMALES DE LABORATORIO Y VÍAS DE
ADMINISTRACIÓN

GRUPO: 4FM2 EQUIPO: 2

INTEGRANTES:
• Castañón Román Juan Carlos

• García Pérez Yaravid

• Nieto Hernández Brenda Edith

• Plata Ortiz Ángel

PROFESORES:
• Gerardo Ávila Velarde

• Brenda Beatriz García Iglesias

• Ana Lilia Gutiérrez Lozano

5 de marzo del 2013.

1
Introducción
Manejo de animales
El empleo de animales en la investigación y enseñanza involucra
responsabilidad de quienes los utilizan; por tanto, es un deber evitar la
crueldad y procurar su bienestar. Para la utilización y manejo de animales, los
procedimientos que se realicen deberán cumplir con un justificado propósito
científico y de enseñanza, proveer la habilidad necesaria para el manejo
adecuado de técnicas. (Rosales F., 2009)

Para trabajar con animales de laboratorio es necesario tener en cuenta

como mínimo, se cumpla lo siguiente:
 Garantía de parámetros de calidad genética y ambiental adecuadas
para la experimentación (agentes patógenos, climáticos, físicos,
habitacional, nutricional, sistema inmune)
 Modelo Experimental claro y adecuado para la especie utilizada.
 Calculo preciso del tamaño de la muestra a utilizar, de acuerdo con
el tipo de estudio (www.facultadsalud.unicauca.edu.com 2012 Vantage Media)

Para transferir una rata o ratón de su jaula a otra, debe de tomarse de la

base de la cola. Algunas normas rigen el territorio mexicano para el manejo
de animales.

Figura 2
figura1

1.-En esta imagen la rata o ratón es tomada del lomo y de la cola, recargando las patas
traseras sobre una base o soporte. 2- Se inmoviliza la rata o ratón tomándola completamente
del lomo. (Fuentes Paredes F.M; 2008)

NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 Especificaciones técnicas

para la producción, cuidado y el uso de animales de laboratorio.

Esta Norma tiene por objeto establecer y uniformar las especificaciones

técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.
Las instalaciones destinadas para el alojamiento de animales de laboratorio,
serán diseñadas de acuerdo con las necesidades de los sujetos
experimentales, de los usuarios y del personal que interviene en su cuidado
diario.
Después del uso de animales se procederá a sacrificarlos por algún método
sin causar dolor y sufrimiento.

Eutanasia
Métodos recomendables son: Agentes inhalables. (Anestésicos. Bióxido de
carbono (CO2).) Fármacos no inhalables. (Derivados del ácido barbitúrico.)
Métodos inadmisibles. Administración parenteral de hidrato de cloral,

2
 sustancias que inducen parálisis muscular sin causar inconsciencia. (Tarmeño
J.A. 2009)

Vías de Administración
Un fármaco puede introducirse en un organismo en forma de gas, de
solución, de suspensión, o en estado sólido. El estado físico, es un factor
importante en la velocidad de absorción, la vascularización del
sitio de administración, y la velocidad de absorción hay varios tipos de
administración. (Manual Laboratorio Fisiología General 2013)

Vía Parenteral
Esto es, atravesando una o más capas de la piel o de las membranas
mucosas mediante una inyección.
Vía Enteral
Mediante el aparato digestivo estos pueden ser:
Vía oral Con píldoras, comprimidos o jarabes.
Vía rectal Supositorios y enemas.

Via PATRÓN DE UTILIDAD (Ventajas) LIMITACIONES Y IMAGEN

ABSORCIÓN PRECAUCIONES
(Desventajas)
SUBCUTÁNEA Rápida (solución Útil para fármacos insolubles No útil para volúmenes
(SC) acuosa). e implantación de gránulos grandes de fármacos.
Vía Parenteral Lenta y sostenida sólidos (pellet). Posibilidad de dolor o
en preparados de necrosis por sustancias
liberación lenta. irritantes.
1
INTRAGASTRICA Variable, depende Económica. La disponibilidad puede ser
(IG) de muchos Por lo general, es inocua irregular e incompleta en
Vía Enteral factores. fármacos poco solubles, de
absorción lenta, inestables o
que sufren un marcado
metabolismo de 1° paso.
2

INTRAPERITONEAL Gran área Amplia superficie de Irritación, sufre efecto de

(IP) absorbente, por absorción, epitelio delgado, primer paso hepático,
Vía Parenteral donde entra el gran vascularización, útil en perforación de órganos,
fármaco con gran investigaciones, absorción infecciones, adherencias.
rapidez en la rápida
3
circulación

Cuadro 1. Vías de administración.

El cuadro presenta las vías de administración de fármacos usadas en el área biológica, comparando tipo de vías,
abreviaturas, patrón de absorción, utilidad limitaciones y la ejemplificando con figuras.
1, 2,3: figuras tomadas de (bvs.minsa.gob.pe/local/INS/962_INS68.pdf, 2005)
(www.facmed.unam.mx/deptos/fisiologia/index.html,2011.)

En algunas determinaciones se usan farmacos conocidos para obervar el

comportameinto de lso aniamles ante una dosis de este, uno de ellos es el
pentobarbital sodico.

Pentobarbital sodico
Efecto depresor no selectivo del SNC por disminución de la excitabilidad pre
y postsináptica e inhibición de la conducción ascendente a nivel de la
formación reticular. Como resultado: sedación, inducción de sueño
depresión respiratoria, actividad anticonvulsivante y reducción de la fase

3
REM del sueño. Cabe destacar que otra función de este fármaco es para la
eutanasia. (Katzung B. G. 2005)
Pentobarbital Sódico es usado como anestésico en ratas.

Otro efecto de este Anestésico es el DESCENSO DE LA TEMPERTURA, el tiempo

en hacer efecto es variado dependiendo del tipo de vía de que se le
administre, es importante mencionar la regulación de la temperatura en un
animal.

Figura 3

Estructura química del pentobarbital sódico,

esto nos indica que el fármaco tiene una
estructura liposoluble. (Katzung B. G. 2005)

¿Cómo regula la temperatura un animal?

Para mantener la temperatura un animal puede ser mediante procesos

biológicos y enzimáticos, por actividad física, estos organismos son
endotermos ya que ante una perturbación logran mantener su temperatura
sin necesidad de la temperatura externa, otros animales son ectotermos que
no logran mantener fácilmente su temperatura ya que dependen de la
temperatura externa.

¿Donde se integran los reflejos Enderezamiento y Flexor de los animales?

El reflejo flexor Se origina a partir de receptores del dolor presentes en la piel
y los músculos (receptores nocioceptivos). La estimulación de los mismos
produce una respuesta motora que tiende a separar el miembro del estímulo
doloroso, activando los músculos flexores de la extremidad afecta, por ello
recibe también el nombre de reflejo de retirada. Estos reflejos se integran en
la MEDULA ESPINAL. (David Le Vay 2004)

El reflejo de enderezamiento viene dado por la información que

proporcionan al cerebro la vista y el aparato vestibular (situado en el oído
interno). El reflejo de enderezamiento consiste en que el cuerpo del animal
permanezca en posición prono o que intente regresar a esta posición
cuando se coloca al animal en posición supino.

Hipótesis
Si el Fármaco Pentobarbital Sódico deprime el sistema nervioso central
(SNC), entonces la temperatura colonal y el reflejo de enderezamiento y el
flexor se verán afectados. En el sentido de un descenso gradual tanto de la
temperatura colonal como de los reflejos con respecto al tiempo.
Si de las tres vías aplicadas, la vía intraperitoneal (IP) tiene mayor are de
absorción, la vía subcutánea (SC) se aplica en un área lipídica y la vía
intragastrica (IG) sufre un efecto mayor de metabolismo de primer paso
entonces la vía intraperitoneal (IP) será la vía con mayor efecto del fármaco
seguido de intragastrica (IG) y por último la subcutánea (SC).

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OBJETIVO GENERAL.

Aprender a manipular, distribuir aleatoriamente, marcar y pesar a los

animales de laboratorio.
° Determinar el efecto de pentobarbital sódico (35mg/kg) administrado por
las vías intragastrica, intraperitoneal, y subcutánea sobre la temperatura
colonal y los reflejos flexor y enderezamiento de ratas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Manipular adecuadamente a los animales de laboratorio conforme a
las normas.
 Determinar el efecto del fármaco administrado, en la temperatura
colonal de la rata administrada por vía subcutánea, cada 5 min por
25minutos.
 Determinar el efecto del fármaco administrado, en la temperatura
colonal de la rata administrada por vía intraperitoneal, cada 5 min por
25minutos.
 Determinar el efecto del fármaco administrado, en la temperatura
colonal de la rata administrada por vía intragastrica, cada 5 min por
25minutos.
 Calcular la dosis de pentobarbital sódico a administrar por rata.
 Aprender a manipular el termómetro indicado para medir la
temperatura colonal de cada una de las ratas una vez administrado
el pentobarbital sódico, desde un tiempo cero cada 5 min. Durante
25 min.
 Determinar presencia y ausencia de reflejos flexor y enderezamiento
con perturbaciones una vez administrado el pentobarbital sódico por
las 3 vías, desde un tiempo cero cada 5min. Durante 25 min.

FUNDAMENTO
El animal de laboratorio tiene que ser respetado como ser vivo, entender
que padece necesidades y sufre dolor, por ley es obligación del
investigador, asegurar su bienestar y confort mientras viva, por eso es
importante aprender a manejarlos de la forma correcta.
La distribución aleatoria de los animales la llevamos a cabo con el fin de
conseguir ciertas garantías que aseguran que la información obtenida a
partir de la muestra es relevante a la población y no es simplemente una
propiedad del método de selección.

Se utilizaron ratas ya que son animales endotermos, que pueden llegar a

regular su temperatura sin perturbaciones. El uso de pentobarbital sódico ya
que este es un anestésico y no causa dolor o sufrimiento a las ratas.
La administración de Pentobarbital Sódico la llevamos a cabo por tres vías
principalmente, ya que estas presentan diferentes características cuando se
administra un fármaco.
Se medirá la temperatura colonal ya que el fármaco afecta la temperatura
del animal, se mide cada 5 min por 25minutos ya que el fármaco tarda
diferentes tiempos en inhibir el sistema nervioso central, dependiendo de la
vía de administración.
Se mide la temperatura colonal ya que esta se asemeja mucho a la
temperatura central en una rata.
Es importante determinar la presencia o ausencia de reflejos flexores y de
enderezamiento, ya que estos reflejos son controlados por el sistema nervioso

5
central, el cual se verá afectado por el pentobarbital sódico. Se observara
que reflejo se pierde primero para determinar cuál es afectado
principalmente por el fármaco.

METODOLOGÍA
I.- Manejo de la rata y vías de la administración
Distribución
aleatoria de las Marcar y pesar
Calcular
ratas las ratas y tomar
temperatura y volumen de
reflejos basales anestésico
para cada
rata; solución
0.063 g/mL, la
a) Subcutánea Administrar la
dosis
b) Intraperitone anestesia por
anestésica
al vía:
para ratas es
c) Intragástrica
de 35 mg/Kg

II.- Efectos de la anestesia por las diferentes

vías
Determinar la Introducir por el recto Aplicar un
temperatura el bulbo del estimulo
colónica de las termómetro con doloroso en
ratas vaselina, 5 cm alguna de las
patas para
observar el
Determinar los Colocar a la rata en reflejo de
reflejos y la posición supina dorsal, flexión
temperatura para observar el reflejo
colónica c/ 5 de enderezamiento
minutos por 25
minutos.
Fig.4 Metodología del experimento. (Departamento de Fisiología,
Manual de Laboratorio de Fisiología General, 2013)

6
Resultados

Fig. 5 Efecto del pentobarbital sódico en la temperatura colonal en ratas por

diferentes vías.
IP (vía intraperitoneal), SC (vía subcutánea), IG (vía intragastrica)
Prueba estadística fue “Two Way Repeated Measures ANOVA (One Factor
Repetition)” mediante el programa (sigma stat) grafica obtenida programa
(GraphPad Prism 5)

Los resultados obtenidos en la práctica fueron reportados y

organizados en graficas (figura 5) donde la número 1 es la que se
encuentra en la parte posterior donde, se observa que al minuto 10 se
alcanza la latencia de las vías IP(*) e IG(*), pero no de la vía SC(*) que
se alcanza hasta los 15 minutos, a si mismo la vías IG(#) y SC(#) en el
mismo tiempo de latencia alcanzan su efecto máximo, pero esto no
sucede con la via IP(#) que alcanza su efecto máximo hasta los 20
min. En los minutos 20 y 25 se observa un diferencia significativa entre
las vías IP(B) e IG(A).

Fig. 6 Pérdida del reflejo flexor por la administración de pentobarbital sódico

(35 mg/Kg por diferentes vías.
(IP) vía intraperitoneal, (SC) vía subcutánea, (IG) vía intragastrica
grafica obtenida programa (GraphPad Prism 5) Prueba estadística fue “Two
Way Repeated Measures ANOVA (One Factor Repetition)” mediante el
programa (sigma stat)

7
En la figura 6 observamos el porcentaje de pérdida del reflejo flexor en
las ratas de laboratorio administradas con pentobarbital sódico por
vías
(IP) vía intraperitoneal, (SC) vía subcutánea, (IG) vía intragastrica,
donde la vía IP el tiempo de latencia se da en el minuto 10 y su efecto
máximo se alcanza hasta el minuto 25, en el caso de las vías IG y SC su
punto de latencia es el mismo en donde alcanza su mayor efecto
siendo, el minuto 5 y el minuto 25 respectivamente para cada vía. Se
realizo una prueba estadística siendo “Two Way Repeated Measures
ANOVA (One Factor Repetition)” mediante el programa (sigma stat),
donde le programa dio como resultado que no había diferencias
significativas para la grafica de la pérdida del reflejo flexor por la
administración de pentobarbital sódico (35 mg/Kg por diferentes vías.

FIG. 7 Pérdida del reflejo de Enderezamiento por la administración de

pentobarbital sódico (35 mg/Kg por diferentes vías.
(IP) vía intraperitoneal, (SC) vía subcutánea, (IG) vía intragastrica
grafica obtenida programa (GraphPad Prism 5) Prueba estadística fue “Two
Way Repeated Measures ANOVA (One Factor Repetition)” mediante el
programa (sigma stat)

En la figura 7 observamos que la vía IP el tiempo de latencia se da en

el minuto 5 y su efecto máximo se alcanza hasta el minuto 25, en la vía
SC su latencia se da en el minuto 15 y su máximo efecto se da en el
minuto 20, pero esto no es el caso para la vía IG ya que no hubo un
punto donde existiera latencia ni un efecto máximo. Se realizo una
prueba estadística siendo “Two Way Repeated Measures ANOVA
(One Factor Repetition” mediante el programa (sigma stat), donde le
programa dio como resultado que no había diferencias significativas
para la grafica Pérdida del reflejo de Enderezamiento por la
administración de pentobarbital sódico (35 mg/Kg por diferentes vías.

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Discusiones
Para el manejo de los animales respectivamente ratas, se tomaron en
cuenta varias normas, para el traslado, repartición y marcaje de las
ratas se realizaron conforme lo explicado por los profesores.
Las vías de administración de un fármaco son importantes, ya que
mediante el tipo de vía que se utilice dependerá él tiempo de
latencia y el tiempo en que tiene una acción máxima, para esto se
realizo el estudio conforme transcurría el tiempo al administrar el
fármaco y observar la presencia de reflejos (reflejo flexor y reflejo de
enderezamiento) antes de administrar el pentobarbital sódico.
Al administrar el pentobarbital por vía subcutánea, intragástrica e
intraperitoneal, estas vías son de mayor uso en el área farmacéutica
para la administración de fármacos en animales (ratas).
Se midió durante 25 minutos, la temperatura colonal y los reflejos de
enderezamiento y el reflejo flexor, esto cada 5 minutos hasta llegar al
tiempo final, en cada una de las ratas que se suministro el fármaco por
diferente vía.
Para la determinación del tiempo de latencia y el tiempo en el que se
observo el efecto máximo, se realizo la prueba estadística en el
programa “sigma stat” el cual realizo un estudio “Two Way Repeated
Measures ANOVA (One Factor Repetition)” donde se comparo el
tiempo en el que se realizo el estudio y las vías de administración la
cual podemos observar en la primera grafica.

Sabemos que el reflejo flexor es regulado por la medula espinal ya que

es un reflejo que realiza un movimiento muscular involuntario, al sentir
un estimulo como lo realizamos con un pinchazo en la pata de la rata.
(David Le Vay 2004).

Esta información nos ayuda a comprender y discutir los resultados

obtenidos en la práctica como lo es que el reflejo de enderezamiento
es más complejo ya que este se regula por la orientación en el
espacio que se encuentra el cuerpo, siendo este reflejo, regulado por
la corteza cerebral, este enderezamiento se observa en primer
estancia el enderezamiento del cuello y posteriormente el
enderezamiento del tronco. (David Le Vay 2004)
Se observa que conforme pasa el tiempo disminuye la temperatura
colonal de la rata, para la vía subcutánea tenemos, que en un tiempo
cero los 2 reflejo están presentes, así se mantienen al transcurrir el
tiempo hasta los 15 minutos, esto lo comparamos con el estudio y
observando que en este tiempo se observa una diferencia significativa
en el descenso de temperatura, podemos decir que este es el tiempo
de latencia, siendo este el tiempo en el que inicio el efecto del
fármaco, el fármaco tiene un efecto máximo a los mismo 15 minutos
ya que no se observo cambio drástico en la temperatura, esto ya que
la administración por vía subcutánea, existen grasas donde el fármaco
se disuelve y este tarda más tiempo en llegar al sistema nervioso
central.

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Con respecto a los reflejos se observa que no hay perdida del reflejo
de enderezamiento mientras que si hay perdida del reflejo flexor a los
25 minutos esto para las 3 vías de administración y el reflejo de
enderezamiento se empieza a perder en un porcentaje de ratas a los
15 minutos , esto tiene un error ya que el efecto que primero se pierde
es el reflejo de enderezamiento y posteriormente el reflejo flexor y
sabemos que el reflejo flexor se integra en la medula espinal y el reflejo
de enderezamiento se integra en la corteza por lo que se necesita
menos fármaco para inhibir la corteza que la medula espinal. Este
error podemos atribuirlo, a que no realizamos bien la prueba para la
observación de reflejos, como no pinchar bien a la rata o no observar
si la rata está completamente en posición supina “con las 4 patas
hacia arriba”.

Para la prueba mediante una administración de pentobarbital, por vía

intragástrica obtenemos que la temperatura colonal disminuye. Esto lo
podemos explicar ya que la prueba intragástrica tiene una menor
absorción del fármaco o este haya entrado en contacto con algunos
alimentos que tiene grasas y hay una pequeña perdida del fármaco
en el metabolismo de primer paso en el hígado, el pentobarbital se ha
disuelto con algunos alimentos en el estomago y tarda más tiempo en
llegar al sistema nervioso central. Esta vía se utilizo la misma prueba
con un pinchazo para el reflejo flexor y girando el cuerpo del animal
para observar si hay enderezamiento del tronco para colocarlo en
posición supino. Se obtiene que el reflejo flexor se pierde al tiempo de
los 25 minutos y el reflejo de enderezamiento ninguna rata lo pierde.
Este error cae en el mismo caso que para la vía subcutánea ya que no
pinchamos bien o no se coloco completamente a la rata en posición
supina.

En la última prueba, se realizo la dosis del pentobarbital, mediante la

vía intraperitoneal, en esta prueba fue donde hubo un mayor
descenso de la temperatura ya que en la comparación con el estudio
hecho por el programa, se observa que el tiempo de latencia es a los
10 minutos y tiene un efecto máximo hasta los 20 minutos, hay que a
este tiempo ya no se observa cambio drástico en la temperatura. Se
puede explicar que esta vía tuvo tiempo de latencia igual que la vía
intragástrica, pero diferente tiempo de efecto máximo, esto porque
en la vía intraperitoneal tiene una mejor velocidad de absorción del
fármaco y este no se disuelve con alguna grasa, por lo que
teóricamente llega el volumen completo del pentobarbital, este en
un solo volumen, teniendo un efecto máximo a los 20 minutos y
llegando al sistema nervioso central a los 10 minutos. Esta vía presento
mejores resultados conforme al tiempo y la disminución de la
temperatura en la administración del pentobarbital. Al igual que la
pérdida del reflejo de enderezamiento y flexor. Observamos que un
100 % de la ratas perdieron el reflejo de enderezamiento el inicio de la
perdida de este reflejo es a los 5 minutos, mientras que del reflejo flexor
solo un 60 % lo perdió este se vio la perdida a los 10 minutos. Estos

10
resultados si coinciden con el esperado ya que esta vía presenta
mejores resultados de la administración del fármaco.

Debemos señalar que las tres vías son buenas dependiendo de qué
parámetro se quiere medir o analizar dependiendo de los tiempos que
se necesita el efecto del fármaco. Para la perdida de los reflejos flexor
y enderezamiento, los resultados son contrarios a los que se
esperaban, ya que el reflejo flexor fue el que tuvo mayor perdida en
las ratas y el reflejo de enderezamiento tuvo menor perdida, siendo
este lo contrario ya que el reflejo de enderezamiento se pierde
primero y el reflejo flexor al último, esto porque el reflejo flexor tiene
una respuesta que proviene de la medula espinal, este reflejo es un
movimiento involuntario ya que este al sentir una perturbación tiende
a moverse y el reflejo de enderezamiento tiende a perderse más
rápido ya que este reflejo se integra en la corteza cerebral donde hay
una mayor información y mayor uso de sistemas de coordinación
como lo son el de orientación en el espacio, es sistema de
observación y el acústico.
Por lo que este tiende a perderse mas fácilmente al inhibir una de las
vías del sistema nervioso central.
Podemos decir que la misma cantidad de fármaco inhibe primero el
reflejo de enderezamiento y posteriormente el reflejo flexor. Por lo que
si quisiéramos inhibir el reflejo flexor, se necesitaría más dosis de
fármaco que para inhibir el reflejo de enderezamiento. Cabe resaltar
que esto no sucedió en la práctica ya que cada equipo y persona en
especifico tiene diferente fuerza de pinchar y el criterio de decidir si se
de observa el reflejo o no se observa.

CONCLUSIONES

 Se aprendió a manipular, distribuir aleatoriamente, marcar y

pesar a los animales de laboratorio.
 Conforme pasa el tiempo de administración del pentobarbital
sódico, se pierden los reflejos de enderezamiento y flexor.
 Conforme transcurre el tiempo la temperatura colonal de la rata
disminuye, esto por vía subcutánea
 El descenso de la temperatura colonal es más rápida por la vía
intragastrica que la vía subcutánea.
 El descenso de la temperatura colonal es más rápida por la vía
intraperitoneal que las otras 2 vías.
 La dosis de cada rata es determinada por su peso (tamaño)
 Se aprendió a manipular el termómetro para medir la
temperatura colonal de cada rata.
 Conforme transcurre el tiempo, se pierden al 100% el reflejo
flexor y de enderezamiento.

11
  La pérdida del reflejo de enderezamiento se da en menor
tiempo, con respecto a la pérdida del reflejo flexor.
 La vía intraperitoneal, es la vía con mayor porcentaje de
pérdida de reflejos flexor y de enderezamiento

 Se aprendió a manipular, distribuir aleatoriamente, marcar y pesar a los

animales de laboratorio.
 El pentobarbital sódico, disminuye la temperatura colonal de las ratas
por las tres vías (intragastrica, intraperitoneal y subcutánea), así mismo
inhibiendo los reflejos flexor y de enderezamiento con mayor perdida
en el reflejo de enderezamiento.

Bibliografía
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Mecanismos y adaptaciones. 4a ed. Ed. McGraw-Hill-
Interamericana. Madrid, España, pp. 334-358
 www.facultadsalud.unicauca.edu.com (consultada 20/02/2013)
 Ganong, F.W.; 2000 Fisiologis medica. 17a ed. Ed. El Manual
Moderno, Mexico, pp. 608-612
 NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 (consultada de
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 KATZUNG B. G. "FARMACOLOGIA BÁSICA Y CLÍNICA” 9a ed.
México 2005
 Manual Laboratorio Fisiología General 2013 ESCUELA NACIONAL
DE CIENCIAS BIOLOGICAS IPN.
 Compendio de Psiconeurofarmacología Alfonso Velasco
Martín,Francisco Javier Álvarez Gonzále, Ed. Díaz Santos 1998.

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