Durante los últimos 30 años el alcance de la biocatálisis ha estado expandiendo debido a los avances

tecnológicos en varioscampos. técnicas diversas como la mejora estructural de la enzima (por ejemplo,
la ingeniería de proteínas, directala evolución), métodos de ingeniería (por ejemplo, líquidos iónicos,
fluidos supercríticos) y estabilización física

(Inmovilización por ejemplo, CLEAS) se han desarrollado, que en combinación son herramientas
poderosas para mejorarbiotransformación y sintetizar nuevos productos. En el presente trabajo, los
recientes avances en la biocatálisis son revisados.

1. Enzima propiedades: ventajas y limitaciones

Las enzimas son catalizadores adaptados naturalmente a proteína sintetizadarealizar en condiciones

fisiológicas. Sin embargo, biotransformacionesimplicar la utilización de enzimas en condiciones que
pueden apartarsesignificativamente de los estados fisiológicos. El reto consiste encatalizadores de
construcción que conservan las propiedades funcionales de las enzimaspero lo suficientemente robusta
como para soportar duras condiciones de proceso. Las enzimasson catalizadores de exquisita
especificidad, siendo entonces muy apreciados porla síntesis de productos farmacéuticos y productos
químicos finos (Woodley,2008). Por otro lado, muchas enzimas son bastante promiscuacatalizadores ya
que son capaces de catalizar varias reacciones y /o transformar muchos sustratos, además de aquellos
para los queque están fisiológicamente especializados, o evolucionaron (Khersonsky yTawfik, 2010). Las
enzimas poseen estructuras moleculares complejas,que son lábiles y costoso de producir. Además, uno
de los principales problema sen biocatálisis enzima es la baja estabilidad operativa. A pesar delas
limitaciones de enzimas, muchas estrategias complementarias erandesarrollado para mejorar su
rendimiento. La ingeniería de enzimas esbasado ya sea en physicalmodifications de proteína o ADN. En
adición, la evolución reciente de la producción de enzimas por fermentación alta tecnologíapermitir la
producción de enzimas más baratos y más fuertes parauso industrial. Esto abre oportunidades sin
precedente más allálas áreas tradicionales de alimentos y productos de limpieza, como en la escuela
agregado procesos de valor para la producción de productos farmacéuticos, cosméticos,-agroquímicos y
productos de química fina (Ran et al., 2008).

Las enzimas pueden producirse a partir de cualquier organismo vivo, ya sea porextraerlos de sus células
que albergan o mediante la recuperación de la célulaexudados. Las células microbianas son excelentes
fábricas de enzimas que representanaproximadamente el 90% del mercado total de biotransformación.
detección microbianaEs un método simple y frecuentemente utilizado para la búsqueda de nuevos
biocatalizadores con propiedades requeridas. En la actualidad, de alto rendimiento-seleccióny se utiliza
el análisis de metagenome de microorganismos no cultivadospara sacar el máximo provecho de la
diversidad microbiana (Steele et al., 2009)y para producir nuevas enzimas con propiedades
excepcionales. Esto es departicular interés para la síntesis orgánica que por lo general requiere no
convencional medios de reacción en la que biocatalizadores deben ser activosy estable (Illanes, 2008).
Adicionalmente, los avances en la molecularla genética y la ingeniería genética han hecho posible clonar
y expresar prácticamente cualquier gen en un huésped microbiano adecuado.

Al mismo tiempo, los microbios pueden ser vistos como Microbial Química

Fábricas (FMC) con las vías metabólicas y enzimas que tienen evolucionado a lo largo de las condiciones
ambientales difíciles paramilenios. De ingeniería vía de novo facilita la expansión
microbiana de compuestos sintetizados más allá de los productos naturales.La ingeniería de proteínas se
puede utilizar para la mejora de lala selectividad y actividad de las enzimas y se puede complementar
eficazmenteenfoques de ingeniería metabólica convencionales, tales comoaumentar la oferta precursor
por enzima de la ruta variandolos niveles de expresión o la anulación de la competencia vías para
mejorarproductividad. Algunos estudios recientes se centran en el diseño, ingenieríay la optimización de
los FMC son revisados previamente (Dhamankary Prather, 2011).

2. Los biocatalizadores: pasado, presente y perspectivas

De acuerdo con la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), enzimasestán divididos en seis clases:
oxidorreductasas, transferasas,hidrolasas, liasas, isomerasas, y ligasas. Cientos de enzimasse utilizan
industrialmente, más de la mitad son de hongos, más de un tercio sona partir de bacterias, y el resto
procedente de animales (8%)y la planta (4%) fuentes. Más de 500 productos comerciales se hacenel uso
de enzimas. El mercado de enzimas industriales alcanzó los U $ 1.6 billónen 1998 y en 2009, el mercado
fue de U $ 5.1 mil millones. En el1980 y 1990, las enzimas microbianas reemplazados muchas plantas y
animalesenzimas y han encontrado uso en muchas industrias, incluyendoalimentos, detergentes,
textiles, cuero, papel y celulosa, diagnósticos,y la terapia (Sánchez y Demain, 2011).

Por otra parte, la inmovilización de enzimas se amplió el alcance deaplicación permitiendo enzimas
menos estables, intracelulares y no hidrolíticasa desarrollarse como catalizadores de proceso y la
biocatálisis en no acuosomedios de comunicación. Este enfoque permitió abrir un vasto campo de la
enzimaaplicaciones en reacciones de síntesis orgánica, con una exquisitaselectividad, especialmente
para la síntesis de productos farmacéuticos ycompuestos bioactivos (Illanes, 2008). La actividad
enzimática bajo levecondiciones es también un atributo de valor para la producción de lábilcompuestos,
que tiene profundas implicaciones tecnológicas, significativamentecativamente la reducción de los
costos de equipo, energía y aguas abajooperaciones. Sin embargo, el uso de catalizadores de enzimas en
la síntesis orgánicaha sido difícil de adoptar por una industria que no está suficientemente
familiarizadopara hacer frente a materiales biológicos. Los cuellos de botella dela tecnología de enzimas
son su elevado coste, la inestabilidad y el bajo rendimientobajo las condiciones del reactor, estrecha
especificidad de sustrato yrequerimientos de cofactores complejos, los principales obstáculos para el
desarrollo del proceso.Muchas de estas limitaciones hay en el camino que hay que superartanto por los
avances en la ingeniería biocatalizador y medio y pordiseño del biorreactor (Berenguer-Murcia y
Fernández-Lafuente,2010; Dalby, 2011). De notable potencial tecnológico es eluso de hidrolasas
robustos y fácilmente disponibles en reacción inversade la síntesis. Como ejemplos típicos, las proteasas
pueden catalizar la formaciónde un enlace peptídico (Kumar y Bhalla, 2005), puede
carbohidrasascatalizar la síntesis de oligosacáridos por transglicosilación

(Park y Oh, 2010) y lipasas pueden catalizar la esterificación, interesterificacióny reacciones de

transesterificación (Hasan et al., 2006).

Más allá de la síntesis orgánica, biocatálisis enzima desempeña unpapel cada vez más importante en la
producción a gran escala debiocombustibles a partir de recursos renovables, ya que no están
asociadoscon la producción de CO2. La hidrólisis enzimática de la lignocelulosa pretratadala biomasa es
una operación clave en la segunda generación de bioetanolproducción. Por lo tanto, el desarrollo de
más activo y máscelulasas estable es crucial. El objetivo principal es reducir el impacto de los costesde
alrededor de US $ 0,1 a alrededor de US $ 0,02 por litro de bioetanol porel desarrollo de una tecnología
de primera línea (Gray et al., 2006). El biodiesel es
un sustituto de combustible diesel producido a partir de fuentes de triglicéridos, como verduraaceites,
grasas animales y aceites de cocina-incluso reciclados y la biomasa de algas.

El biodiesel es considerado como un sustituto del diesel fósil que ha sidoproducido por
transesterificación química de ser triglicéridos, paraActualmente, la tecnología de elección. Sin embargo,
la catálisis enzimáticaes más específico y ambientalmente benigna entonces,
enzimáticatransesterificación con lipasas está bajo intensa investigación, siendoel coste de la enzima el
principal inconveniente para la realización de lasíntesis química (Ranganathan et al., 2008). En términos
relativos, la enzimaSe espera que las aplicaciones biocatálisis relacionados con la energía y la saludtener
el crecimiento más significativo en la próximadécadas, las aplicaciones mientras tanto convencionales
en los alimentos, detergentes,Se espera que los textiles y cuero creciendo a un ritmo menor.

3. Mejora de biocatalizadores

La disponibilidad de enzimas adecuadas con alta actividad y la estabilidadbajo condiciones de proceso, la

selectividad de sustrato deseado yse requiere una alta enantioselectividad para la aplicación eficaz
debiocatalizadores. Muchos biocatalizadores presentan alta quimio-, regio- yestéreo-selectividad a
temperatura ambiente, lo que los superiores acatalizadores químicos. Los recientes avances en las
técnicas de manipulación genéticapermitido la mejora de la ampliación de la producciónde muchas
enzimas a precios razonables. Por ejemplo, el cambio de unacofactor puede aumentar la actividad de la
enzima, como se informó para la novelacarbonilo reductasa dependiente de NADH (Ye et al., 2010).

Nuevas enzimas con mejor rendimiento se pueden aislar de la vidaorganismo (prospección de la

biodiversidad). La bioprospección es relevante parael aislamiento de las enzimas funcionales en
ambientes extremos, talescomo disolventes orgánicos o pHs extremos, ya que sus aplicaciones
potencialesa nivel industrial. enzimas de tipo salvaje, casi universalmente, exhibiciónactividades de bajo
y / o estabilidades (en presencia de estos disolventes), yano se seleccionaron como enzimas tolerantes
de disolventes orgánicos

(Torres et al., 2009, 2011). Últimamente, se han hecho diversos intentospara detectar enzimas de
diversos microorganismos incluyendo orgánicasolvente bacterias tolerantes, termófilos, halófilos y
mesófilos.

Sin embargo, la identificación y caracterización de nuevos biocatalizadores(Por ejemplo, la detección de

muestras de suelo) no siempre dió enzimas adecuadaspara las reacciones de bioprocesos. el uso de la
ingeniería de proteínastécnicas y mutagénesis dirigida al sitio de cómputo, o por dirigidatécnicas de
evolución (moleculares) pueden ser una poderosa herramienta paraproducir enzimas con características
optimizadas tales como la actividad, la selectividad(Enantio-, regio- y quimio), estabilidad, especificidad
de sustrato, cofactorespecificidad, y la solubilidad en co-disolventes, pH óptimo y cofactorrequisitos,
entre otros. Esos enfoques están demostrandopara tener éxito en la producción biocatálisis a gran
escala.

3.1. las estrategias estructurales: la evolución dirigida y diseño racional

Como se puede señalado anteriormente, los métodos más utilizadospara mejorar biocatalizadores
incluyen: (1) la evolución dirigida y (2) racionaldiseño.

3.1.1. La evolución dirigida

La evolución dirigida (DE) comprende un grupo de biología moleculartécnicas que permiten a los
procesos evolutivos naturales seanimitado en el laboratorio para optimizar proteínas funcionales,
mediante la creación deun número finito de variantes distribuidas al azar, irradiandohacia el exterior en
el espacio de secuencias de las enzimas de padres que yatener actividad medible (Dalby, 2011). DE
implica el azarmutagénesis (RM) de uno o más genes a partir enzimáticos, seguidopor una etapa de
tamizado o selección para aislar o enriquecer de enzimavariantes con mejoras en uno o más
deseablepropiedades. El proceso puede repetirse hasta que el cambio deseadose alcanza, o hasta que
se provoca ningún cambio adicional. Los más comunesestrategias son propenso a errores PCR (epPCR)
(Chen y Arnold, 1993)y el ADN arrastrando los pies. El epPCR introduce mutaciones puntuales
aleatoriasen una población de productos de ADN que produce un alto número demutaciones
simultáneas por gen, siendo útil para identificarA. Illanes et al. / Bio-Tecnología 115 (2012) 48-57
49puntos de acceso para mutagénesis dirigida al sitio de saturación (SDSM). ADNtécnicas de
recombinación aleatoria arrastrando los pies permitirán típicamente entrelos genes de los padres con
las quimeras más del 70% de homología que exploransecuencias de enzimas funcionales matriz de
contención máximaproporción de la progenie funcional (Stemmer, 1994). otra recombinacióntécnica es
el proceso de extensión escalonada (paso) que consistede cebado de la secuencia (s) plantilla seguido de
repetidosciclos de desnaturalización y recocido extremadamente abreviada / polimerasa
catalizadaextensión. En cada ciclo, los fragmentos crecienterecocido a diferentes plantillas basado en
secuencias complementariasy ampliar aún más. El procedimiento se repite hasta secuencias de longitud
completase forman (Zhao et al., 1998). métodos de recombinacióncrear mutaciones que son en su
mayoría presentes en al menos uno de los funcionalsecuencias de los padres, cuando el RM puede crear
mutaciones no naturales.Por lo tanto, los métodos de recombinación tienden a generar una
mayorproporción de secuencias que conservan la actividad nativa de RM, siendola tarde más útil para la
adquisición de nueva función. Con posterioridad DEtécnicas de acceder a una gama más amplia de los
aminoácidos a través de SDSMo mutagénesis de casete (CM) dirigida sitios pre-elegido o por lositios
distribuidos al azar, y ha permitido la recombinación al azarde los genes no homólogos. Por lo tanto,
SDSM implica la aleatorizaciónde los residuos individuales a los 20 aminoácidos; que se utilizó para
crearmutantes individuales en puntos de acceso. En lugar de ello, CM produce simultáneamutagénesis
de saturación en múltiples residuos diana adyacentes.Otras técnicas pueden crear inserciones y
deleciones de azarcodones, dominios de reproducción aleatoria o exones, o regiones del bucle, y
producir unabiblioteca de truncamientos aleatorios.Los nuevos métodos de DE se utilizaron para
mejorar la termoestabilidadLook-A través de mutagénesis (LTM), que fue desarrollado como unamétodo
para la detección rápida. LTM consiste en aminoácidos mutacionesen posiciones seleccionadas de
secuencias de proteínas introducir propiedades favorables(Hokanson et al., 2011). Además,
combinatoria Beneficial

Mutagénesis (CBM) es un nuevo método para la identificación de la mejorconjunto de mutaciones

individuales. Por ejemplo, ambos métodosse utilizaron para mejorar la estabilidad de tipo salvaje GH11
xilanasa 2de Hypocrea jecorina (Hokanson et al., 2011). Además,podría ser aplicable para mejorar
rápidamente las propiedades fisicoquímicaspropiedades de las enzimas a gran escala.

Tradicionalmente, DE se basa en un protocolo de dos pasos iterativo, inicialmentela generación de

diversidad molecular mediante mutagénesis aleatoria yen la recombinación in vitro, a continuación, la
identificación de miembros de la biblioteca conmejoras en el fenotipo deseado de selección de alto
rendimientoo selección. Este enfoque puede ser problemático, ya que las bibliotecas de proteínas
inclusocon millones de miembros todavía muestra sólo una pequeña fraccióndel vasto espacio de
secuencia posible para un promedio de proteína (Stefan,2010). Este problema puede ser resuelto por un
semi-racional, inteligente odiseño de la biblioteca basada en el conocimiento, que utiliza información
sobre las proteínassecuencia, estructura y función, así como computacionalalgoritmos predictivos para
preseleccionar prometiendo sitios diana y limitadosamino ácido diversidad de la ingeniería de proteínas.
El enfoque en concretoposiciones de aminoácidos se traduce en la reducción dramáticatamaños
biblioteca mientras la consideración de la variabilidad evolutiva,restricciones topológicas y las
características mecánicas para intervenir ende identidad de aminoácidos puede resultar en bibliotecas
con mayor funcionalidadcontenido. Juntos, estos conceptos ofrecen prometedoras para predictoresque
altera las proteínas características tales como la especificidad de sustrato, equipo de música-selectivity y
la estabilidad por rediseño enzima sin modificarmaquinaria catalítica, así como la creación de nuevas
funciones por diseño de novo.

A pesar de que las técnicas de DE han sido ampliamente utilizados paramuchos años, que es necesario
para adaptarse a la enzima singular, ydepende de la función de la enzima o la propiedad de ser
mejorado. AActualmente, las estrategias más rápidas y más eficientes son necesarios DEa desarrollar no
sólo para superar la función de la enzima ypropiedades, sino también para crear funciones catalíticas
aún no observadosen enzimas.3.1.2. El diseño racionalel diseño racional de proteínas (RD) fue el
enfoque más temprana para la ingenieríaenzimas. RD consiste en un conjunto de técnicas de biología
molecular,tales como la mutagénesis dirigida al sitio (SDM), basado en enzimaestudios estructurales. La
identificación correcta de los residuos responsables para las interacciones sustrato-enzima, la actividad,
especificidad, de acoplamiento y la estabilidad es esencial para la aplicación de RD de una manera
dirigida.

En algunos casos, es necesario realizar barrido de alanina o la secuenciahomología de especies afines

combinados con datos de la biofísica.

Las mejoras en la predicción del efecto de SDM se han creadoPor lo tanto, al mismo tiempo el efecto de
la mutación en la estabilidad, ligandoafinidad y pK (a) valores puede ser evaluada, así como las
predicciones paravarios mutantes en una presentación. Por ejemplo, el sitio activo Trpresiduos de la
xilanasa GH10 de Cohnella laeviribosi HY-21 juego unapapel clave en la catálisis y / o por unión al
sustrato significa SDM. Además,mutantes podrían ser explotados como biocatalizadores para una
mayorsíntesis de glicósidos de alquilo o xilooligosacáridos sustituidocon p-nitrofenol (Kim et al., 2010).

Desde RD necesita el conocimiento de la estructura de la enzima deintereses y / o su secuencia en varias

especies y afines, la cristalografíay el análisis espectroscópico de muchas enzimas tienensido una
herramienta poderosa para utilizar en modelos informáticos. Este enfoquedepende de los progresos
realizados en la determinación de la estructura, la mejoraprotocolos de modelado y nuevos
conocimientos sobre la estructura-funciónrelaciones. Por otra parte, los avances en el
modelado,especialmente los cálculos de perturbación de energía libre y moleculardinámica (MD)
pueden predecir las mutaciones adecuadas para la mejorade enzima enantioselectividad. Las tendencias
recientes utilizando maduramétodos enzimáticos, en su mayoría con un pliegue enzimas / B-hidrolasa
tienenhan revisado (Kourist y Bornscheuer, 2011). varias subclasesde las enzimas que presentan veces
que tener un motivo conservado

GGG (A) X en su sitio activo que fue identificado primero porEl grupo de Bornscheuer como el motivo es
necesario para la actividad haciaalcoholes terciarios. Por RD, la primera Gly ha demostrado ser una
claveresiduo que afecta fuertemente la enantioselectividad en BS2 esterasaa partir de Bacillus subtilis
sp. Además, los métodos de modelado molecularen combinación con selección de alto rendimiento
demostrado ser útilpara la identificación de los residuos clave y los cambios en la selectividadpara BS2
esterasa a partir de B. subtilis sp. Además, la creación de algunosbases de datos estructurales como la
Base de Datos de Ingeniería lipasa con anotadosalineados secuencias y estructuras superpuestas de
microbianalipasas ayudan a comprender el papel funcional de amino individuoácidos en la estructura de
la enzima (Pleiss et al., 2000).

Teniendo en cuenta las limitaciones evolutivas y contribuciones de energía,Se desarrollaron estudios de

simulación por ordenador para elmejora de la catálisis enzimática. La hipótesis de desolvataciónfue
considerado y se señaló que los estudios de mutación sonincompatibles con los mecanismos de
desestabilización del estado fundamental(Warshel Florián, 1998). Recientemente, en simulaciones MD,
aproximarcálculos de la energía y de la energía de enlace de hidrógeno libres eranintegrada para
descubrir las relaciones estructura-actividad. Igualmente,la integración de las diferentes técnicas de
predicción estructuralesse puede aplicar en RD de las enzimas como es el caso de acoplamiento
molecular,FMO cálculo y modelado 3D-QSAR CoMFA (Zhang et al.,2008). Dado que, la información
estructural no siempre está disponible, un nuevoestrategia, diseño de la secuencia consenso (CSD) fue
desarrollado. CDSes una estrategia atractiva para la estabilización de proteínas, que
explotaconservación de aminoácidos en grupos de proteínas homólogas aidentificar mutaciones
probablemente beneficiosos y que no depende de ladisponibilidad de información estructural (Jäckel et
al., 2010). basadas en datosCSD se basa en el simple supuesto de que la frecuenciade un determinado
residuo en una secuencia múltiples alineaciones (MSA) deproteínas homólogas se correlaciona con la
contribución de amino ácido dea la estabilidad de la proteína. Sin embargo, su éxito depende de
ladiversidad filogenética de la secuencia disponible. La aplicaciónde este método muestran que un DCV
filogenéticamente imparcial50 A. Illanes et al. / Bio-Tecnología 115 (2012) 48-57puede conducir a la
estabilización sustancial de motivos estructurales secundariosen las proteínas mesostable. La
optimización del alfabeto aminoácido usadopara la asignación al azar con respecto a tendencias
estructurales y funcionalesla diversidad, y teniendo en cuenta la covariación en el diseñoproceso son
estrategias adicionales que podrían ser explotadas para maximizarestabilización preservando al mismo
tiempo la actividad.

Recientemente, RD por MD simulaciones se aplicó en termoestabilidadmejora sin reducir la actividad

enzimática teniendo en cuentapropiedades de la proteína de la superficie en lugar de características de
proteínas de núcleotales como el embalaje y el relleno de la cavidad central (Joo et al., 2011).Por lo
tanto, los residuos superficiales flexibles tolerantes a mutaciones son objetivos válidospara la
termoestabilización y que la estabilización-interacción localde los residuos en cavidades de
revestimiento utilizando el método de MD puede ser una efectivaalternativa al método de llenado de la
cavidad convencional.experimentos de dispersión de RMN de relajación Novel acoplados a
mutagénesisestudios recientemente se han aplicado al estudio de la enzimacatálisis, que complementa
de manera efectiva '' estructura-función "análisis"con la "flexibilidad de función '' investigaciones '.
métodos de RMN proporcionan unapoderosa herramienta para ayudar a la caracterización de los
efectos de largo alcance controlarredes de residuos flexibles que afectan a la función
enzimática(Doucet, 2011).

Otro nuevo enfoque consiste en la combinación de SDM conla inmovilización sobre un soporte para
mejorar las propiedades de inmovilizadobiomoléculas para uso como biosensores o biocatalizadores.
Además,SDM para controlar la inmovilización es útil para mejorar la actividad,la estabilidad e incluso la
selectividad de la proteína inmovilizada. Avancesen el diseño de apoyo y más profundo conocimiento de
los mecanismosde las interacciones enzima-apoyo han permitido explorar nuevo ymejores posibilidades
(Hernández y Fernández-Lafuente, 2011).

3.1.3. métodos combinados

Para biocatálisis industrial puede ser necesario combinar diversosestrategias y técnicas que pueden
incluir DE la basada en el conocimientodiseño de bibliotecas de variantes de enzimas. métodos
computacionalespotencialmente puede guiar el RM de proteínas haciendo el más
eficiente.Alternativamente, la utilización de funciones potenciales molecular puedeser útil para predecir
los efectos de las mutaciones sobre la estructura de proteínasy la estabilidad para las bibliotecas de
variantes de la enzima genera in silico.Varios ejemplos de la combinación de DE y RD se pueden
encontraren la literatura para mejorar la estabilidad, adaptación al frío, las actividades nuevasy
productos, la enzima base de la secuencia de especificidad de sustrato que utilizarediseñar entre otros.

Para una rápida evolución de la estabilidad de la enzima, un método conocido comoiterativo

mutagénesis de saturación (ISM) combina la aleatorizaciónde SDSM con RD, donde la saturación se
dirige a las áreasde la proteína que son propensos a crear un fenotipo mejoradobasado en información
estructural o catalítica (Reetz y Carballeira,2007). Además, el ISM representa una forma '' rápida '' de la
evolución enel cual las bibliotecas creadas son pequeñas y por lo tanto, la concentración yno requieren
extensos programas de cribado.datos de factor B cristalográfico También se han utilizado en los
últimosejemplos, para identificar sitios en los cuales RM podría mejorar la estabilidad.El iterativo de
ensayo B-Factor (B-FIT) destaca los aminoácidos conla más alta flexibilidad y crea de este modo los
objetivos para la mutagénesis.Una tecnología útil para la termoestabilidad mejoradausando DE basado
en ISM en combinación con el método B-FIT,mostró, además, un aumento significativo en la tolerancia a
la hostil orgánicadisolventes (Reetz et al., 2010).ingeniería de proteínas Como se puede apreciar es una
herramienta poderosay se aplica ampliamente en el estudio y la mejora de las enzimaspara ser utilizado
en bioprocesos.

3.2. enfoques de ingeniería ambientalenfoques de ingeniería Biotransformación implican la puesta a

punto detodos los parámetros físico-químicas de los medios de reacción. Los cambios en
elmicroambiente del biocatalizador no sólo son capaces de modularla actividad enzimática y la
estabilidad, sino también para dar forma a la selectividad de la enzima.Una de las principales variables
en biotransformaciones es el aguacontenido en el microambiente de la enzima. Sin embargo, las
enzimas que actúaen medio acuoso a granel no son generalmente útiles en biotransformaciones.Por lo
tanto, el uso de biocatalizadores en reacciones de síntesis esrestringida a ambientes en los que se
restringe la actividad de agua.La actividad de agua es relevante, ya que implica el efecto del aguala
acción de masas en el equilibrio químico (Castro y Knubovets,2003). Además, el papel del agua es
complejo y diverso, ya que el aguaes capaz de participar directamente como un sustrato, y / o durante
las transicionesestados y / o como producto de reacción. Además, el agua puedetomar parte en la
reacción no directamente, sino en un papel igualmente relevantecomo '' lubricante '', proporcionando la
solvatación a los residuos polares del biocatalizadory otra intervenir moléculas con el fin de facilitar
proteínascambios conformacionales durante el proceso de biocatalıtica y a la velocidadla reacción. Hay
muchos enfoques diferentes para controlarla actividad de agua en biotransformaciones, pero el control
de los medios de comunicación esla más simple. La optimización del proceso de biocatalıtica implicael
conocimiento de la fuente de enzima y sus propiedades,el estado físico del biocatalizador y los medios
de reaccióncaracterísticas.La enzima se puede disolver en el medio o añadido a lamedios de reacción en
diferentes formas heterogéneas como polvo ocristal o sistemas como microheterogéneas (por ejemplo,
liposomas). Diferentetipos de medios de reacción se pueden encontrar y se pueden clasificar,desde un
punto de vista físico-químico de, en dos grupos principales: continuaSin límites en el interior del medio)
o discontinua(Con la frontera dentro del medio, o heterogénea o multifásico)como se ha descrito
previamente (Davidson et al., 1997). Muchas sustanciasy disolventes, como disolventes orgánicos (con
diferente fisicoquímicaPropiedades), gases (fluidos supercríticos) y líquidos iónicos pueden
sermezclados entre sí en diferentes proporciones para encajar en una de encimagrupos -mentioned.
Además, es importante señalar que lacomportamiento de las moléculas de agua en la proximidad de la
enzima dependeráen la naturaleza del medio orgánico, la proteína que rodeacaracterísticas intrínsecas y
extrínsecas y otros fisicoquímicaparámetros relacionados con las condiciones ambientales.

3.2.1. disolventes

Los disolventes pueden ser categorizados como: miscible en agua (monofásicasistemas acuosos-
orgánicos, incluyendo algunos sistemas líquidos iónicos),no acuoso (sistema orgánico monofásica),
inmiscible en aguaMultifásica sistemas acuosos-orgánicos, y la mayoría de líquido iónicoLos sistemas
descritos hasta ahora), sistemas anhidros (incluyendo disolventeLos sistemas libres), los fluidos
supercríticos y en fase gaseosa y revertidomicelas. Las dos últimas, están fuera del alcance de la
presente revisión, yno se consideran aún más. El efecto de los disolventes orgánicos en eldespliegue de
las enzimas está bien descrita en la literatura, y puedeatribuirse a muchas causas. Los efectos de polar y
no polardisolventes sobre la actividad de la enzima son bastante diferentes; tanto reducir elactividad de
la enzima por diferentes razones. En disolventes polares, extracción de aguaes la principal, pero no la
única, causa de la reducción de enzimaactividad. desmontaje del agua se refiere a la capacidad de
orgánico polardisolventes para desplazar las moléculas de agua de la superficie de la proteína, aser
reemplazado por las moléculas de disolvente que, rigidizar la molecularestructura de la enzima y de
forma concomitante afecta a la enzimaturn-over (Castro y Knubovets, 2003). Adicionalmente,
disolventes polarespuede interferir con las interacciones iónicas de la proteína y /o romper
interacciones polares que inducen al menos una parcialdespliegue de la estructura molecular,
especialmente en enzimas conpolares dipolares transiciones de estados e intermedios /. alta
conversióneficiencia en biocatálisis homogénea no acuosa puede serlogrado solamente con la
solubilidad de la enzima alta y la estabilidad en elmezcla orgánica-agua. disolventes polares miscibles en
agua se considerancomo sistema no acuoso homogéneo cuando el disolvente

A. Illanes et al. / Bio-Tecnología 115 (2012) 48-57 51concentración es superior a 20% v / v (Davidson et
al., 1997). losracional de este codisolvente orgánico 20% en la mezcla de agua se considerabasado en la
reducción de 10% de la actividad de agua en la solución deestimado para disolventes hidrófilos como el
etanol o glicerol porla ley de Raoult. En las últimas tres décadas, varias enzimas conalta actividad
catalítica y la estabilidad en disolventes orgánicos miscibles con aguafue reportado. (Baigorí et al, 1996;..
Costas et al, 2008). Sin embargo,en presencia de altas concentraciones de desnaturalizante
típicamentedisolventes (superior a 40% v / v), como sulfóxido de dimetilo o dimetilformamida,la
actividad enzimática se reduce drásticamente. Sobre elcontrario, a altas concentraciones (80% v / v o
más) de polihidroxiladosdisolventes tales como 1,2 dietilenglicol y propilenglicol,la actividad enzimática
se mantenga inalterada con al menos durante 12 h en el casode algunas lipasas, proteasas y lisozima
(Costas et al., 2008). Enen particular, los estudios espectroscópicos confirmó el correcto plegamiento de
lisozima en 99% de glicerol (Castro y Knubovets, 2003). Sin embargo,no sólo enzimas requieren un
intacta secundaria y terciariaestructura en el medio de reacción, sino también la flexibilidad
conformacionalproporcionado por el agua que se correlaciona con la actividad de la enzima.
Además,derivados de glicerol pueden ser útiles con el fin de desarrollarnuevos disolventes iónicos y no
iónicos con propiedades novedosas(Díaz-Álvarez et al., 2011).

El descubrimiento de los líquidos iónicos (IL) en 2000 abrió nuevas perspectivasen todas las áreas de
investigación que incluyen la biocatálisis. Los líquidos iónicos sonsales orgánicas que permanecen
líquidos a temperatura ambiente, sinpresión de vapor, pero que tiene una viscosidad mayor que el agua.
Conformea su estructura química, IL se puede agrupar en cuatro tipos: alquil-3-metilimidazolio,
alquilpiridinio, tetraalquilamonio yiones de fosfonio; Mientras tanto, hay más opciones para eliones de
signo contrario, al pasar de aniones inorgánicos como Cl a las moléculas orgánicas(Por ejemplo, citrato,
tosilates). En consecuencia, la fisicoquímicapropiedades de IL dependen tanto, el tipo de catión pair /
anión yla cadena de alquilo de los iones, y esto es porque son considerados como ILdisolventes de
diseño. En particular, se han descrito muchos sistemas de ILen el área de la biocatálisis, al pasar de
hidrofílico monofásicaa los sistemas hidrófobos y multifásicos (Quijano et al.,2010). La enorme variedad
de opciones de iones permite la manipulación de lacombinación de sustratos, productos y efectores. En
consecuencia,muchas clases de enzimas se han trabajado con éxito en IL, pasandode las hidrolasas
caballo de trabajo clásicos (por ejemplo lipasas, proteasas)a deshidrogenasas, nucleasas, peroxidasas,
entre otros, siguiendocasi el mismo mecanismo que en medios acuosos (Quijanoet al., 2010). IL
biocatálisis es igualmente tan importante como en orgánicadisolventes, que presentan algunas ventajas
tales como una baja volatilidad yalta estabilidad térmica, además de la posibilidad de ajuste fino de
algunos fisicoquímicapropiedades tales como la polaridad, hidrofobicidad, termoestabilidad,viscosidad,
miscibilidad y, con sólo modificar lacadenas laterales adjuntas. Además, la biocatálisis en la IL
mantenerlas propiedades regio, enantio y estéreo-selectiva de las enzimasrequerido en
biotransformaciones para la síntesis de moléculas complejas.Es una suposición común de que las
enzimas se disolvió en ILson inactivos debido a la pérdida de la estructura secundaria que conduce
adesplegamiento de la proteína, pero alguna excepción también fueron reportados con solublesenzimas
sobre IL muestran alta estabilidad térmica y largo plazoestabilidad de almacenamiento. Sin embargo,
algunas desventajas deben sermencionados: las enzimas presentes en el comportamiento de solubilidad
impredecibleacuoso y sistemas no acuosos IL, y la toxicidad pueden ser, enalgunos casos, mayor que en
disolventes orgánicos moleculares (Quijanoet al., 2010).

En disolventes no polares, las enzimas son insolubles pero la solubilidad desustratos y productos
hidrófobos se mejora. la mejoradasolubilidad de los sustratos y los productos en disolventes no polares
implicala estabilización de estados fundamentales de las moléculas, y por consiguientela disminución de
la velocidad de reacción biocatalítica. Además,disolventes no polares tienden a rigidizar la estructura de
la proteína, pero un delicadoequilibrio en la dinámica de la estructura de la proteína entreSe requiere
flexibilidad de proteínas y la rigidez de la estructura de cubierta de proteína.El trabajo principal de
Halling (1994) describe la adiciónde hidratos de sales al medio de reacción con el fin de mantener el
aguaactividad a niveles constantes que permiten cierta flexibilidad enzima en limpiodisolventes apolares
para lograr la mejora de la actividad enzimática. Estas

Los resultados fueron confirmados recientemente por espectroscopía de RMN, lo cualmostró una alta
activación de la proteasa subtilisina Carlsberg, en elpresencia de agua altamente móvil (Eppler et al.,
2006). Experimentalmente,sales se añaden habitualmente en forma de hidratos de sal o sal
saturadasoluciones a las muestras durante la manipulación de la enzimay antes de iniciar la reacción con
el fin de reducir las interrupciones iónico.Sin embargo, el papel de las sales sobre la actividad enzimática
no sólo dependeen los iones individuales, sino también de la concentración de sal. A baja iónicafuerza
que van desde 10 a 30 mM concentraciones de sal, la mayorefecto en la superficie biocatalizador se
produce por la interacción electrostática(momentos dipolares). La interacción electrostática se produce
a una distanciamenos de 0,50 nm de la superficie de la proteína. Al menos cantidad de
salconcentraciones parece que el agua a granel no se ve afectada. EnAl contrario, a concentraciones
elevadas de sal, el efecto sobre la enzimaestructura también se relaciona con los grupos polarizables de
la enzima,incluyendo la capa de disolvente (agua) en la superficie de la proteína y lael agua circundante.
Además, los iones presentes son capaces de interactuarcon sustratos, productos y productos
intermedios de reacción cambiantela cinética y los parámetros termodinámicos de la biocatálisis.Desde
el punto de vista termodinámico, la contribución de salespara biocatálisis proceso es casi entrópico y en
relación con los gradosde la libertad conformacional a lo largo de los estados de transición, conningún
papel entálpico (Eppler et al., 2006).

3.2.2. Sales

Históricamente, las sales se han clasificado en una serie liótropa (oserie Hofmeister) de los iones en
función de su capacidad de iones para cambiarla estructura del agua por hidratación iónica (puentes de
hidrógeno). KosmotropicLos iones son capaces de establecer enlaces de hidrógeno; Mientras tanto
caotrópicoiones simplemente se rompen ellos. El mismo efecto sobre las proteínas está relacionada
conla salazón o en salazón fenómenos, y posteriormente en elestabilidad de las estructuras secundarias
y terciarias. En los lados opuestos,iones fueron clasificados como estabilizadores de la estructura de
proteínas o disruptores,como se ilustra en la siguiente serie, desde kosmotropic a caotrópicode aniones:
SO2 F

4> HPO2

4> CH3COO> Cl> NO

3> Br

> ClO

3> I> ClO

4> SCN, y cationes de: NHþ

4> K +> Na +> Li +

> Mg2 +> Ca2 +> guanidinio.

Los estudios empíricos determinaron que los aniones parecen tener más fuerteefecto sobre proteínas
que cationes, aniones porque son más polarizable(Grossfield et al., 2003). Hay varios coeficientes
utilizadospara predecir las interacciones proteína-agua de iones, pero la más aceptadauno es el
coeficiente de viscosidad B en la ecuación Jones-Dole.El coeficiente B se asocia con la tendencia de iones
para establecer puentes de hidrógeno,edificio o agua estructurada de última hora y en consecuenciael
cambio de viscosidad del agua. La ecuación Jones-Dole se puede expresar
como sigue:

gramo

ir

¼ 1 þ Ac1

2 þ þ Bc Dc2

donde g and Go son las viscosidades de soluciones de sal y agua puraen condiciones experimentales,
respectivamente, y c es la concentración de sal;la constante A está relacionada con las interacciones
electrostáticas de largo plazo,la constante B para las interacciones ion-disolvente, y la constanteD se
considera sólo a concentraciones muy altas de sal. Kosmotropiciones tienen valores positivos y B
muestran fuertes interacciones conagua. Además, el coeficiente B en iones caotrópicos es negativo
ymostraron interacciones débiles con agua (Ru et al., 2000). Dado que el aguadesempeña un papel
crucial en la proteína de mediano enlace de hidrógeno, los iones imitandoel papel del agua en aceptar o
donar enlace de H facilitar conformacionalcambios y funcionamiento de las enzimas. Además, el efecto
deiones kosmotropic en el agua que rodea los residuos hidrófobos de52 A. Illanes et al. / Bio-Tecnología
115 (2012) 48-57la proteína se asocia con el aumento en el agua molecularorden. Al mismo tiempo, los
iones kosmotropic mejorar la fuerza delas interacciones hidrofóbicas que proporcionan una cubierta de
proteína más cerradaestructura y por lo tanto aumentar la estabilidad (Dill, 1990). Además,la secuencia
de aminoácidos de la proteína debe ser consideradoen el paisaje biocatálisis ya que los grupos
polarizables están participandoen el proceso de reacción. Mediante el uso de los mismos criterios de
sales,se puede distinguir entidades kosmotropic en la proteína comocarboxilatos (por ejemplo, residuos
de glutamilo y aspartilo) y caotrópicoentidades como restos amida y amina (por ejemplo tirosilo,
asparagil,residuos arginilo) (Sedlak y col., 2008). El delicado equilibrio entrelos residuos de aminoacilo
liotrópicos de la proteína y el liotrópicaserie de iones, sales y IL, afecta a la solubilidad de los solutos en
la superficiede la proteína y determina plegado / desplegado y la estabilidad dela proteína.

El racional de serie liotrópica todavía no está claro y algunos informesmostraron cierto grado de
incoherencia o el orden inverso de la serie, que puedeser probablemente asociado a la enzima
características estructurales yplegable. Aun así, la serie liotrópica y el coeficiente B son
comúnmenteaceptado, como criterios generales, como un buen predictor de heterogéneabiocatálisis.
Sin embargo, el principal reto de la ampliación a escalabiocatálisis heterogénea a nivel industrial es la
obtención de un altoestabilidad operacional del biocatalizador y para validar el sistemaen condiciones
optimizadas.

3.2.3. Los fluidos supercríticos

Los estudios sobre los fluidos supercríticos (SF) comenzaron en los años 90y se basaron principalmente
en dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2).Uno de un atributo principal de SC-CO2 es la solubilidad
que presentanalgunos materiales en este líquido, que es similar a los líquidos y conbaja viscosidad
comparable y de alta difusividad cerca ordinariagases. SC-CO2 tiene la ventaja de trabajar a baja presión
crítica(7,36 MPa) y temperaturas suaves (31.6 C), además de ser noinflamable y no tóxico. El alto
rendimiento de muchas enzimastales como hidrolasas, oxigenasas y deshidrogenasas en SC-CO2en
comparación con los disolventes orgánicos utilizados para la hidrólisis y síntesisefectos están bien
documentados y revisados recientemente (Wimmery Zarevúcka, 2010). Sin embargo, con el fin de
reducir las gotas de aguala inestabilidad, los nuevos sistemas fueron desarrollados para la elaboración
de biocatálisisen cerca de SF crítico. En algunos casos SC-CO2 fue sustituida por otracompuestos como el
hexafluoruro de azufre (SCSF6) (Celia et al., 2005).Alternativamente, las lipasas procedentes de
diferentes fuentes a cabo en cercacondiciones críticas que utilizan gases como el metano, etano,
propano ocon altas tasas de reacción (García et al., 2005). Aditivos como polímerosy moléculas
hidrófilas fueron incorporados en el sistema depor la adición de agentes tensioactivos de fluorocarbono
(Holmes et al., 1998)y co-disolventes miscibles con agua (metanol, etanol, y otros)se utilizaron para
modular la hidrofilicidad / hidrofobicidad de sustratos,productos intermedios y productos (Paljevac et
al., 2007).Varias ventajas de la biocatálisis en SF se pueden enumerar: (1)la hidratación sintonizable de
la enzima hace posible un control finode la cinética de reacción por los cambios de presión y
temperaturay sin producir interferencias en el sistema y (2) fácilpurificación de los productos y
productos intermedios, ya que, SF son gases atemperatura ambiente. Sin embargo, este sistema todavía
no es escalable para la producciónel nivel y la reutilización de las enzimas se ve obstaculizada por laalta
inactivación producida en la presurización / despresurizaciónproceso.

3.2.4. sistemas semisólidos

El uso de disolventes en biocatálisis es bastante contradictorio yase aparta del concepto de química
verde, que es un prominenteventaja de la catálisis enzimática. Un resultado similar se puede obteneren
un medio acuoso si se trabaja a altas sustratosconcentración es decir, el uso de concentraciones de
sustratos más allá de lalímite de solubilidad (Youshko et al., 2004), o incluso en estado sólido

(Basso et al., 2006). Así, los sistemas semisólidos tallos como muy prometedortecnología que evita el
uso de productos químicos nocivos y permitela obtención de concentraciones muy altas de productos.
catálisis enzimáticaen los sistemas de casi sólidas o semi-sólidas se ha estudiado, en la quela mezcla de
reacción consta de reactivos sólidos en suspensión en uncomparativamente pequeño volumen de fase
líquida (Ulijn et al., 2003).Esa fase líquida, acuosa u orgánica, se satura consustratos de este modo, la
reacción se produce y los precipitados producto formadoa partir de esa fase líquida. Una clara ventaja
de sólidosistemas es la extremadamente alta productividad volumétrica alcanzableya que, al final de la
reacción, prácticamente todo el contenido deel reactor está compuesta por el producto. Otras
características destacadasson su inocuidad medioambiental, altos rendimientos de conversión
enreversión de reacciones hidrolíticas y alta estabilidad de la enzima. Sin embargo,limitaciones de
transferencia de masa y los problemas de mezclado puede representaruna desventaja importante,
especialmente cuando se escala hastase requiere nivel de producción (Erbeldinger et al., 1998).El uso de
altas concentraciones de sustratos en un medio acuosoes una alternativa más verde que la mayoría de
los medios no acuosos. losprecipitación solución acuosa consiste en mantener una concentración
saturadadel sustrato durante toda la reacción por repetitivoadiciones. Se ha aplicado con éxito a la
síntesis de ampicilinacon penicilina acilasa por adiciones repetidas de la nucleófilo(Ácido penicilánico 6-
amino), con un rendimiento de conversión más del 97%(El más alto reportado hasta ahora) han sido
obtenidos. trabajando bajosobresaturación sustrato, un aumento significativo en el rendimiento
tienenhan obtenido para la ampicilina y cefalexina con respecto al homogéneasistemas (Youshko et al.,
2004). mejora sustancialse ha obtenido en la síntesis cinéticamente controlada de galacto-
oligosacáridoscon b-galactosidasa a muy alta y también enconcentraciones de lactosa sobresaturadas
(Huerta et al., 2010).
3.3. estabilización física

3.3.1. inmovilización

Por razones técnicas y económicas, la mayoría de los procesos químicoscatalizada por enzimas
requieren la estabilización, reutilización o continuoutilizar del biocatalizador para un tiempo muy largo.
De una economía industrialpunto de vista, la simplicidad y la rentabilidad son propiedades clavede
técnicas de inmovilización, pero a largo plazo industrial reutilizaciónde enzimas inmovilizadas también
requiere la preparación de muy establederivados que tienen las propiedades funcionales adecuadas
para un dadoreacción (Cao, 2005). Los métodos de inmovilización pueden ser ampliamentedivide en dos
categorías: vehículo o portador obligado dependiendo libresobre la inclusión de una matriz inerte. La
Tabla 1 muestra el directorcaracterísticas de los métodos de inmovilización más relevantes.Entre
muchos sistemas para la inmovilización a soportes inertes sólidos,unión covalente de múltiples puntos,
donde la enzima esrelacionado con el soporte poroso (vidrio, poliacrilamida, celulosa,agarosa, etc.) a
través de varios residuos de aminoácidos es particularmenteinteresante desde muy alto de
estabilización se puede lograr (Trany Balkus, 2011). Un esquema de la unión covalente de múltiples
puntos espresentado en la Fig. 1.

La generación de un número de puntos de unión entrecada molécula de enzima inmovilizada y el

soporte ejerce muyfuerte efectos estabilizando así, en este sentido soportes heterofuncionaleshan
tenido éxito (Mateo et al., 2007).biocatalizadores libre de soporte son unos catalizadores enzimáticos
novedoso tipo de rodamientolas ventajas de la alta concentración de enzima activadentro de la partícula
biocatalizador y el coste reducido, ya que, no inertematriz sólida se requiere como apoyo, que es a veces
incluso máscaro que la enzima en sí (Roessl et al., 2010). En este caso,la proteína enzimática constituye
su propio soporte de manera que las concentracionescerca del límite teórico de embalaje se obtienen
(Cao,2005). Por lo tanto, las enzimas inmovilizadas libre de portadores son ventajosascomo
catalizadores en procesos en los que la alta productividad y rentabilidadA. Illanes et al. / Bio-Tecnología
115 (2012) 48-57 53se requiere o en el caso de enzimas lábiles que no pueden ser
correctamenteestabilizado por inmovilización convencional a soportes sólidos

(Illanes et al., 2009). enzimas inmovilizadas libre de portadores se preparanpor reticulación química
directa de la proteína que contienela enzima, utilizando glutaraldehído principalmente como agente de
reticulación. Estaestrategia se ha aplicado a las enzimas en solución (EAC), a la enzimacristales (CLEC) y
más recientemente a la enzima agregados (CLEAs).A pesar de que, muchas de las ventajas de este tipo
de catalizadores esdebido a la existencia de una alta densidad de proteínas dentro del catalizador,esto
promueve restricciones difusionales a sustratos y productosdentro de la matriz de enzima. CLEAs tienen
ventajas sobre las evaluaciones a nivel institucionalde mejores propiedades mecánicas y rendimientos
más altos de actividad yson más simples y mucho más barato de producir que los CLEC, que
requierenuna proteína cristalina purificada como material de partida.CLEAs son producidos por
reticulación de los agregados de proteínas de la enzimaproducido por técnicas de precipitación de
proteínas convencionales, comodesalación, precipitación disolvente o polímero como se muestra en la
Fig. 2.Este método representa una importante contribución a la biocatálisis debidoque combina las
propiedades de no compatible (carrier-libre)biocatalizadores con simplicidad y bajo costo de producción
(Sheldon,2011). Sin embargo, no se han propuesto directrices generales para lala preparación de CLEAs,
condiciones particulares, deberán ser determinadas

tabla 1
Los métodos de inmovilización de enzimas.

Principio principales características Referencias

La inmovilización de matriz inerte (unido a vehículo)

La inmovilización covalente de alta estabilidad operacional, bastante flexible, de modo que la

inmovilización dirigida se puede hacer para adaptarse a lo particularcaracterísticas del procesoMateo et
al. (2007)

No covalenteinmovilización

Método sencillo, el vehículo puede ser recuperado fácilmente después de la actividad enzimática
agotamiento mediante la promoción de la proteínadesorción. los rendimientos de inmovilización son
generalmente altos y no hay reactivos desagradables están involucrados. El principal inconveniente:
laenzima puede desorbe fácilmente de su soporte por los cambios sutiles en el medio de reacción

Mateo et al. (2000)

La inmovilización poratrapamiento

Consiste en el confinamiento de la enzima dentro de las cavidades internas de una matriz polimérica
sólida lo suficientemente compacto como para retenerlas moléculas de enzima dentro de ella. La
mayoría de las matrices populares para el atrapamiento de gel: alginato, poliacrilamida,poliuretano,
alcohol de polivinilo y j-carragenina

Tran y Balkus (2011)

La contención de membrana de retención de membranas de ultrafiltración es relevante para los

procesos que intervienen enzimas coenzima que requieren. Ambosla enzima y el coenzima derivatizado
se retienen

Liu y Wang (2007)

La inmovilización sin apoyo (sin vehículo)reticulado EACenzima solución

Considerado para algunos fines industriales hace algunas décadas, en la actualidad ya no se utilizan,
principalmente debido a supobres propiedades mecánicas y severas limitaciones de transferencia de
masaCao (2005)reticulado CLECcristales de enzima

Están dotados de excelentes propiedades: alta estabilidad en condiciones muy duras, la resistencia a la
autolisis yproteolisis exógena y extremadamente alta volumétrica (y específicas) actividad, relevante
para las reacciones más bien lentode la síntesis. CLEC de varias enzimas se han producido, el principal
inconveniente es el alto coste del biocatalizadordebido a la alta grado de pureza que se requiere para la
cristalización de la enzimaRoy y Abraham (2004)entrecruzada CLEAagregados enzimáticos

Presentan mejores propiedades mecánicas que el EAC, también mayores rendimientos de la actividad y
son más simples y mucho más barato

Produce. No proteína cristalina purificada se requiere como material de partida y la precipitación de

proteínas sencillométodos se utilizan antes de la reticulación. tipos:Sheldon (2011) Roesslet al. (2010)?
Por co-agregación de la enzima y el polímero y también por encapsulación en partículas de gel de Wilson
et al. (2006)

? CLEAs de enzimas multiméricas con una mayor estabilidad mediante la prevención de la disociación de
la subunidad Wilson et al. (2004)

? Combi-CLEAs permitiendo múltiples no en cascada o en cascada de reacciones Dalal et al. (2007)

Sheldon

et al. (2007)

y optimizado para cada enzima (Wilson et al, 2006;. Roesslet al., 2010). Se ha informado de que CLEAs
de enzimas multiméricaspresente una mayor estabilidad evitando la disociación de la subunidad(Wilson
et al., 2004). CLEAs producidos por coagregación de enzimay el polímero y también por la encapsulación
de partículas de gel permite lacreación de un microambiente apropiado con respecto al
sustratonaturaleza y mejorar las propiedades mecánicas del biocatalizador(Wilson et al., 2006). enzimas
co-agregado (combi-CLEAs)permitir que múltiples no en cascada (Dalal et al., 2007) o en cascada
(Sheldonet al., 2007) reacciones. Debido a su potencial, CLEAs de muchos industrialmenteenzimas
importantes se han producido en los últimos años ySe han propuesto configuraciones especiales de
reactores para la recuperación y manejo de CLEAs (Sorgedrager et al., 2008).

3.3.2. nano biocatálisis

Nano biocatalizadores se considera el área de enlace de la biotecnologíay la nanotecnología, que

comenzó en el 90' s. Estructurado nanomateriales que tienen características tales como poros bien
establecidosdiámetro (5-100 nm aproximadamente), geometría definida, la dureza, la hidrofobicidad /
hidrofilicidadratio, propiedades magnéticas, de conductividad,y así sucesivamente, lo que permite el
diseño de biocatalizadores robustos. Muchas estructurasy materiales para la biocatálisis se han
desarrollado y explorado con éxitoen virtud de uno o más conceptos de nanopartículas,
nanofibras,nanotubos (Wang et al., 2011). La principal ventaja de los catalizadores de nanobioes la alta
relación de superficie / volumen de los nanoobjetos que mejorala exposición del biocatalizador al medio
de reacción como el tamañode las disminuciones nanotransportador. Dos enfoques principales han
sidoadsorción de la enzima en la superficie del material con o sin: utilizadomás enlace covalente, y la
encapsulación de la enzima y el atrapamientoen materiales definidos, en general, utilizando la
metodología deautoensamblaje (Kim et al, 2006;. Zhao et al., 2011).Entre las ventajas de utilizar
nanovehículos para la inmovilización de enzimas,se puede mencionar la posibilidad de ajuste fino de
laactividad biológica mediante el diseño de material específico para la requeridauso, y el área de
superficie alta que permite una alta carga de la enzima. UNejemplo típico en la tecnología
nanobiotacalysis es el uso de selfassemblyenfoque de la nanotecnología para el desarrollo de un
solonanopartículas de enzimas (SENS) basados en la deposición de un híbridopolímero acumulado sobre
una superficie que proporciona la quimotripsina similaresconstante cinética pero con la ventaja de
escudo enzima (Kimet al., 2008). Otro modelo atractivo es el uso de enzimas adjuntoa las nanopartículas
de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIONs)con diferentes enzimas no alostéricos (Kim et al.,
2006). Curiosamente,un sistema complejo compuesto por alostérico dependiente de NADHenzimas
como glutamato deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa yel cofactor inmovilizada por separado en
SPIONs fue desarrollado. Porquedel movimiento browniano de partículas producido por la alternanciael
campo magnético, el cofactor podría regenerarse y reutilizarse,y la velocidad de reacción se puede
acelerar 1,8 pliegues (Zheng et al., 2011).Nanobiocatalysis es nuevo campo prometedor y emocionante
de entendery desarrollado nuevos biotransformaciones proceso por ella manipulación de las complejas
interacciones moleculares a nivel atómicoentre el medio ambiente y todos los componentes de la
reacción.

4. Conclusiones

Biocatálisis se está convirtiendo en una de las herramientas más poderosas de la biotecnología,tener un

profundo impacto social sobre la salud, suministro de alimentos,protección del medio ambiente y la
producción de combustible sostenible.Biocatálisis está ganando un lugar destacado en el presente y
nuevaescenarios de biotecnología blanca en el marco de verdeQuímica, que se nutre de los avances en
varios campos comogenética, biología molecular, tecnología de fermentación, bioinformática,la
nanotecnología, la ciencia de materiales, la espectroscopia avanzada yotros. Los principales desafíos se
refieren a la producción de robustacatalizadores enzimáticos a un precio reducido, siendo a la vez
abordado adecuadamentepor un amplio espectro de desarrollos tecnológicos que han florecidoen
décadas recientes.

Expresiones de gratitud

El presente trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigaciones

Científicas y Técnicas (CONICET), y la Agencia Nacional

de Promoción Científica y Técnica (ANPCyT) de Argentina a G.R.C.