UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA, MANAGUA

FAREM – CHONTALES
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
CARRERA DE MEDICINA
ACTIVIDAD No. 2

SEMINARIO: MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS E IDENTIFICCIÓN DE COCOS

GRAM POSITIVOS.

TEMARIO:
- Tinción de Gram
- Pruebas para la identificación de bacterias.

II. OBJETIVOS:
Al finalizar esta actividad práctica el estudiante será capaz de:
1. Señalar las caracteristicas morfologicas, estructurales y funcionales de la célula bacteriana.
2. Explicar los fundamentos científicos de los diferentes métodos de observación bacteriana.
3. Reconcocer las caracteristicas de las colonias de bacterias Gram positivas y Gram negativas en los medios de cultivos.
4. Identificar las especies de las bacterias gram positivas utilizando diferentes técnicas de laboratorio (Tinción de Gram,
catalasa, coagulasa, optoquina, bacitracina y prueba de CAMP)
4. Caracterizar los grupos bacterianos (gram positivas y negativas) a través de microscopía óptica según sus características
de tinción.

III. Introducción:
Los métodos de laboratorio por lo común comprenden el estudio microscópico de materiales obtenidos en frescos sin teñir
y con tinción, así como la preparación de cultivos con medios idóneos para la proliferación de agentes muy diversos.
Los métodos de exámlenes directos de laboratorio; por ejemplo, la preparación al fresco de una suspensión microbiana se
utiliza para examinar muestras clínicas sin colorear. Permite observar microorganismos (bacterias, parásitos y hongos)
vivos y ciertas actividades biológicas como movilidad, morfología y disposición.

Las técnicas de coloración en microbiología se clasifican en simples y compuestas:

-Coloración Simple: Es un método que utiliza un solo colorante, ácido o básico y tiñen todos los elementos por igual.
-Coloraciones Diferenciales o Compuestas: Por ejemplo, la Tinción de Gram: es un procedimiento de gran utilidad
empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que
utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram
positivas.

Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más
utilizadas universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta.

En microbiología clínica, la tinción de Gram resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas
(exudados, sangre, LCR, Liquido peritoneal, liquido pleural, material purulento, tejidos obtenidos de biopsia) obtenidas de
los pacientes con patologías infecciosas, con sepsis, meningoencefalitis bacteriana, abscesos, neumonía de la comunidad
etc. Se puede saber de manera rápida los posibles microorganismos causantes de una infección.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le
confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias gram positivas está
constituida por una capa celular gruesa de peptidoglucano, pero no cuentan con membrana celular externa; en cambio las
gram negativas cuentan con una capa delgada de peptidoglucano y una membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglucano en la pared celular de las bacterias explica y determina las
características tintoriales.
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglucano
de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta
por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglucano de la pared bacteriana. En
seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de
solventes orgánicos (alcohol-acetona).

Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglucano, retienen con mayor fuerza este complejo,
mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglucano. Por último, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no
pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. La afinidad de las Gram positivas y negativas de las bacterias depende
de la composición química de la pared celular y en parte de su estructura física.

Los colorantes utilizados en la tinción de Gram:

1. Cristal violeta o Violeta de Genciana (colorante primario o principal)
2. Zafranina o Fucsina básica (contracolor o colorante secundario o básico)
3. Lugol o solución yodada (mordiente o fijador del colorante principal)
4. Alcohol acetona (disolvente orgánico o decolorante).

Ventajas:
 Es un método rápido, sencillo y económico.

Desventajas:
 Las Micobacterias y ciertos hongos, pueden no tomar la coloración de Gram.
 Tiñe débilmente bacterias sin pared como los Micoplasma y Ureaplasma.
 Su técnica es más laboriosa que la de una coloración simple.

Utilidades:
 Permite observar forma, tamaño y disposición
 Diferencia a las bacterias Gram positivas y Gram negativas
 Permite detectar la presencia de más de una bacteria en la muestra (mixta o monoespecífica)
 Proporciona información para la toma de decisiones del médico
 Conservación de los preparados teñidos.

Luego de identificar las bacterias según la tinción de Gram podemos discriminar su naturaleza orientando el diagnóstico
clínico en base a su morfología, los medios de cultivo en donde se evidencia el crecimiento y las pruebas bioquímicas
necesarias para su identificación.

Las bacterias gram positivas, se caracterizan por presentar forma de cocos (redondeados) con disposición en racimos o
cadenas, son bacterias que se asocian a infecciones en el humano, se transmiten por objetos afilados o puntiagudos
contaminados, éstos provocan lesiones en piel debidas a traumas o en procedimientos quirúrgicos. También se han aislado
en pacientes que presentan heridas infectadas, heridas quirúrgicas infectadas, celulitis, erisipela y abscesos etc. Dentro de
este grupo se encuentran las especies patógenas de los géneros Staphylococcus y Streptococcus.
Algunas especies se recuperan regularmente de sitios con mala higiene, polvo de los pisos, paredes y de una variedad de
objetos inanimados.

Estas bacterias son capaces de producir enzimas y toxinas durante su metabolismo provocando lesión tisular localizada
(meninges, alvéolos, membrana timpánica, piel, tejido celular subcutáneo, cavidad articular, tejido óseo etc.).
Las muestras obtenidas de los pacientes pueden ser; secreción de heridas y/o abscesos, secreción nasal y/o faríngea,
sangre, esputo, secreción ótica, orina, piel, líquido articular, tejido óseo, tejido blando, LCR, Líquido pleural, etc. Éstas
deben ser tomadas en condiciones de asepsia y antisepsia en recipientes estériles o medios de trasporte y deben ser
enviadas al laboratorio debidamente identificado (nombre y apellido del paciente, edad, sexo, tipo de muestra, sitio de la
toma, fecha de la toma, diagnóstico, etc.) y en el menor tiempo posible.

En ambos casos, éstas deben ser manipuladas cerca de un mechero, con guantes e inoculada en los medios de cultivos
correspondientes, por ejemplo en agar sangre de carnero y agar McConkey, agar chocolate. Posteriormente se incuban (18
a 24 horas) a 35 grados centígrados (cultivo primario), posteriormente se realiza un cultivo secundario a partir del cual se
realizan todas las pruebas bioquímicas para su debida identificación.

IV. DESARROLLO
El seminario se realizará en 3 tiempos:
1ero: Pregunta escrita inicial y revisión de las tareas.
2do: se dividirán en 4 sub grupos a cada uno se le entregara una tabla con diferentes colonias para su identificación según
las características morfológicas y los resultados de las pruebas bioquímicas (ver flujograma).
3ro: ponencia de modo que el estudiante comparta los conocimientos adquiridos con sus compañeros (se expondrán y
discutirán los resultados de las pruebas de identificación) y realizar una evaluación cruzada entre los mismos.

1. Al iniciar la actividad práctica se debe discutir sobre las características morfológicas, estructurales y funcionales
de la célula bacteriana (Revisar el capítulo de estructura bacteriana en su texto básico y en las conferencias sobre
Citología Bacteriana, que es la base científica para comprender el fundamento de las tinciones).
2. (Tarea) Con respecto a las Preparaciones microscópicas y tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología
clínica, describa los principios y aplicaciones de las tinciones de: Tinción de Ziehl-Neelsen, GRAM y el medio de
cultivo Agar McConkey (porque es este un medio diferencial y selectivo).
3. Describa las características generales de la bacteria Gram positivas en base a: Morfología, factores de virulencia y
patogenicidad, principales especies patógenas, enfermedades que producen y métodos diagnósticos. Nota: en el
caso de los Streptococcus debe manejar Su denominación según la especie y según grupo de Lancefield y tipo de
hemólisis.
4. (Tarea) Identificación de las características morfológicas de las colonias de Staphylococcus y Streptococcus,
observando la forma, color y tamaño de las colonias crecidas en el medio de cultivo y en las imágenes de
microscopia simple.
 5. (Tarea) Observe las siguientes colonias de Streptococcus y describa que tipo de hemólisis produjeron, anote lo
observado y brinde ejemplos de especies que producen este tipo de hemólisis.
1.

2.

3.

Nota: hemólisis, es el halo que se forma alrededor de la colonia crecida en el medio de cultivo o sea que hay un
aclaramiento del medio que rodea la colonia. Nota: Las colonias de Staphylococcus presentan un tipo de hemólisis beta
sin embargo los Streptococcus producen hemolisinas de modo variable que pueden brindar diversos tipos de hemólisis.
 6. Mencione los principios de las siguientes pruebas bioquímicas para la identificación de bacteria.
 Prueba de la catalasa:
 Prueba de la Coagulasa:
 Prueba de la Bacitracina:
 Prueba de Optoquina:
 Prueba de CAMP- Test:

7. (Tarea) Dibujar flujograma de identificación de bacterias.

Bibliografía:
1. Brooks, G.C, Butel, J, Morse, S, Mietzner, T. (2011). Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 25ª
Edición. Mc Graw Hill LANGE. Capítulo 2, Pag 13
2. Murray P, Rosenthal KS, Pfaller, M.A.(2017). Microbiología Médica. 8va edición. Editorial MOSBY, Madrid,
España. Capítulo 4. Pag 21
3. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología – Medigraphic.www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf.
4. Facultad de ciencias médicas, Departamento de microbiología y parasitología, Guías de laboratorios y seminarios
Asignatura Microbiología médica Elaborado por: Colectivo docente Departamento de microbiología y
parasitología. Managua, enero 2019. Guía 2 y 3.
5. Microbiología y Parasitología Médica, Llop Hernández Alina, La Habana: Editorial Ciencias Médicas. 2001.
Capítulos: 7, 18 y 19.