Hemoglobina

Determinación de la
concentración de
Hemoglobina
HEMOGLOBINA:
 Proteína conjugada cuya función es el transporte de O2 y CO2.

 Es un compuesto intensamente coloreado, y esta característica es aprovechada
para estimar colorimétricamente su concentración en sangre.
 Para su determinación exacta es necesaria la preparación de un derivado
estable que incluya todas las formas de Hemoglobina, debido a que en la sangre
existe una mezcla de Hemoglobina (Hb), Oxihemoglobina (HbO2),
Carboxihemoglobina (HbCo2), metahemoglobina y otras formas de este
pigmento que se encuentran en cantidades menores.
Los métodos mas utilizados son:

Algo de historia:
Metodos usados para medir la concentración
de Hemoglobina
Metodo Gravimetrico
Utiliza una solución de Sulfato de Cobre

en la que se deposita una gota de sangre
Metodo de Hematina alcalina o
Hematina ácida
|
METODO DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA (Hicn)
Es el método recomendado por el ICSH

(Comité internacional para la estandarización de la
Hemoglobina).
Fundamento de la determinación:
 Al combinar un volumen determinado de sangre con solución
de Drabkin , que es una solución que contiene K3[Fe(CN)6] y
KCN, los compuestos de hemoglobina (excepto la
Sulfohemoglobina) se transforman en cianmetahemoglonina:
 Hemoglobina + K3[Fe(CN)]6 metahemoglobina

 Metahemoglobina + KCN cian metahemoglobina
El ferricianuro convierte al Fe+2 de las hemoglobinas

en Fe+3 formando metahemoglobina.
Luego la Metahemoglobina se une con el KCN
formando la Cianmetahemoglobina, que es un
compuesto de color rojo anaranjado brillante.
La intensidad es directamente proporcional a la
concentración fe Hemoglobina de la muestra.
Determinación de hemoglobina por el
1.- Muestra: Sangre venosa con EDTA (o sangre capilar)
2.- Materiales:
Tubos de 10 ml
Pipetas automáticas de 20 ul
Pipeta volumétrica de 5 ml
Fotocolorímetro o espectrofotómetro
Cubetas para espectrofotómetro (si corresponde)
Determinación de hemoglobina
3.- Solucion estándar de Hemoglobina
4.- Reactivo: Solución de Drabkin. Puede

prepararse en el laboratorio o usar preparado
comercial.
Reactivos:
Composición de la Solución de Dabkin
 Bicarbonato de Sodio NaHCO3 1 gr
 KCN 50 mgr
 Ferricianuro de Potasio 200 mgr
 H2O destilada csp 1000 ml
 pH final: 6,8
Se obtiene una solución de color amarillo transparente,
Debe tener una DO de 540 si se mide usa agua como blanco.
Descartar si presenta turbidez o cambio de color
Estabilidad: varios meses a T° ambiente y en frasco oscuro
Se obtiene una solución de color amarillo transparente,
Debe tener una DO de 540 si se mide usando agua como blanco.
Descarte si presenta turbidez o cambio de color
Estabilidad: varios meses a T° ambiente y en frasco oscuro
PRECAUCION: reactivo toxico.

Manipule con precaución.
TECNICA:
Rotule 3 tubos: Blanco (B), Muestra (M) y Estándar

(S)
Distribuya 5 ml de solución a cada tubo.
Mezcle la muestra suavemente por agitación
suave (20 veces aprox.) o en mezclador
mecánico.
Tome 20 ul de sangre homogeneizada del
paciente y limpie el exceso de sangre que haya
quedado en las paredes externas de la punta.
TECNICA:
Introduzca la pipeta hasta el fondo del tubo que

contiene el reactivo y expulse suavemente la
sangre y enjuague la punta unas 6 veces en a
parte superior del tubo.
Mezcle por inversión suave tapando previamente
el tubo.
Espere como mínimo 5 minutos hasta que se
produzca una hemolisis total y se transforme
completamente la hemoglobina en
Cianmetahemoglobina
 Mida la DO en el espectrofotómetro usando como blanco un tubo con Drabkin.
 Proceda del mismo modo con la solución estandar
 El color de la mezcla de reacción es estable al menos 24 horas si es conservada
protegida de la luz (oscuridad)
 Calculo de los resultados:
 Hb (gr%) = DO x Fc
donde: Fc = St (gr%)
DO St
CALIBRACION
Cada vez que se comience a usar un fotocolorímetro o se
le realice alguna modificación, cambio de ampolleta, etc,
es necesario realizar un grafico (curva ) de calibración.
Para esto se necesita una solución de referencia de
hemoglobina.
A partir de esta solución de referencia se debe realizar
varias diluciones y procesarlas en las mismas condiciones
que la muestra.
Con las lecturas (D.O) obtenidas se realiza un grafico que
relaciona la concentración y las D,O
 VALAORES NORMALES
 Mujer = 14 + 2 g%
 Hombre 16 + 2 g%
Causas de error en la determinación:
Toma de muestra
▪ Error en la extracción : estasis venoso,
hemodilución (exceso de presión en caso de
punción capilar)
▪ Anticoagulante inadecuado
▪ Muestra coagulada
Dilucion:
• Mezcla inadecuada de la muestra
• Material volumétrico descalibrado , sucio, deteriorado o húmedo
• Dilución incompleta de la sangre en el reactivo.
• Reactivo deteriorado
 Muestra:
• Sangre Lipémica
• Leucocitosis
 Equipo:
• Instrumento mal calibrado
• Cubetas sucias o rayadas
Reactivos:
• Conservación en botellas de polietileno
• Congelación del reactivo
• Uso de reactivos vencidos.

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Determinación de la

 Proteína conjugada cuya función es el transporte de O2 y CO2.

Los métodos mas utilizados son:

Utiliza una solución de Sulfato de Cobre

Es el método recomendado por el ICSH

 Hemoglobina + K3[Fe(CN)]6 metahemoglobina

El ferricianuro convierte al Fe+2 de las hemoglobinas

1.- Muestra: Sangre venosa con EDTA (o sangre capilar)

3.- Solucion estándar de Hemoglobina

4.- Reactivo: Solución de Drabkin. Puede

PRECAUCION: reactivo toxico.

Rotule 3 tubos: Blanco (B), Muestra (M) y Estándar

Introduzca la pipeta hasta el fondo del tubo que

 Calculo de los resultados:

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