de acidos nucleicos

Los ácidos nucleicos se encuentran confinados en el interior del núcleo, citoplasma mitocondrias y cloroplastos. Para su
obtención, se deben superar una serie de membranas, además de la pared celular en su caso (procariota, levaduras,
hongos y células vegetales).
La obtención de ácidos nucleicos purificados, a partir de una muestra biológica, se lleva a cabo a partir de un único
protocolo técnico continuado, que se divide en tres etapas: pretratamiento, extracción y purificación.

El pretratamiento consiste en obtener suspensiones celulares formadas por células libres y agregados celulares que
flotan dispersos en el seno de un medio líquido.
Los pretratamientos más habituales de las muestras con las que se trabaja en biología molecular son los siguientes:

La sangre es una de las muestras más OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA

utilizadas para estudiar los ácidos La sangre debe ser tomada en un tubo EDTA, aunque también es
nucleicos, purificándolos a partir de los posible obtener sangre total anticoagulada con heparina y citrato
leucocitos. El grupo hemo es un potente sódico.
inhibidor de la PCR, por lo que un objetivo La extracción de ácidos nucleicos es conveniente hacerla en las 24 horas
común en los distintos pretratamientos es siguientes a la obtención de la muestra, pero se puede conservar en refrigeración
la eliminación de la hemoglobina por a 4ºC durante 5 días; solo 3 días, si se requieren moléculas de ADN sin
medio de la lisis de los hematíes. fragmentar, como para el Southern blot).

LISIS DE LOS HEMATÍES

El pretratamiento más habitual en las muestras de sangre, aplicable también a muestras de médula ósea, consiste en:
A) Lisis de los hematíes. Se usa un tampón de lisis en proporción 1:3 (3 lisis/sangre) que suele basarse en
fenómenos osmóticos (NH4Cl, KHCO3 y EDTA) y/o detergentes suaves (Tris-HCL, Tritón X-100, sacarosa).
B) Centrifugar. Se centrifuga la muestra y se elimina el sobrenadante con una pipeta Pasteur; así se eliminan los
componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina. En el sedimento quedan los leucocitos.
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS
La sangre se puede utilizar también para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos de algunos retrovirus que infectan
linfocitos, por lo que, en estos casos, interesa aislar las PBMC (células mononucleadas de sangre periférica), es decir,
linfocitos y monocitos, mediante una centrifugación en gradiente de densidad que requieren un medio de separación.
Se lleva a cabo de la siguiente manera;
A) Medio se separación. Se coloca el medio de separación y encima la sangre. El más utilizado es una mezcla de Ficoll
(un polisacárido hidrofílico producido por la copolimerización de sucrosa y epiclorhidria) y diatrizoato sódico. Este
medio tiene una viscosidad baja, una densidad de 1,077 g/ml y una osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad
celular. En el mercado destacan Ficoll-paque®, Histopaque®, Lymphoprep®…
B) Centrifugar. La polisucrosa causa agregación de los hematíes que sedimentan junto con los granulocitos; las células
mononucleadas, en cambio, permanecen en la interfase entre el medio de separación y el plasma. Una vez
eliminado el plasma sobrenadante, la capa de células mononucleadas se absorbe con una pipeta Pasteur y se transfiere
a otro tubo para lavarlo con tampón o solución salina.
Los cultivos celulares sirven para realizar estudios genómicos y de expresión génica en determinadas condiciones y bajo
ciertos estímulos. El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células.
A) Cultivo en suspensión. Se recolecta en un tubo, se elimina el medio de cultivo mediante centrifugación y se lavan
las células con tampón o suero fisiológico.
B) Cultivos en monocapa.
• Utilizar el propio frasco. Se desecha el medio de cultivo y se lavan las células en monocapa con tampón o solución
salina para iniciar in situ el proceso de extracción.
• Pasar la monocapa a un tubo. Para esto, se debe despegar las células de la pared del frasco. Se puede hacer de
forma mecánica con un raspador; o bien, por métodos enzimáticos, incubando las células en una solución de
tripsina (habiendo desechado el medio y lavado las células previamente). En ambos casos se deben lavar las células
con tampón o solución salina antes de continuar con la extracción.

La obtención de ácidos nucleicos a partir de CANTIDAD DE MUESTRA

tejidos frescos requiere un pretratamiento La cantidad del tejido que se va a procesar depende del tipo de
que consiste en una homogeneización. Este tejido, del método de homogeneización y del procedimiento de
proceso consiste en un tratamiento mecánico o extracción y purificación de ácidos nucleicos. Así, para obtener
químico al que se somete un tejido para liberar entre 10 y 40 µg de ADN, se necesitan 10-25 mg de tejido
las células que lo integran. animal y 100-1000 mg de tejido vegetal.

A) Homogeneización mecánica. Consiste en someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo.
En algunos protocolos la homogeneización mecánica se realiza directamente en un tapón de lisis, simultaneándola con
el primer paso del proceso de extracción.
• De forma manual. Se colocan los fragmentos de tejido en un mortero y se cubren con nitrógeno líquido para
congelarlos. Entonces se pulverizan con la mano del mortero y se deja evaporar el nitrógeno.
• De manera automatizada. El tejido se corta primero en pequeños fragmentos y luego se homogeneiza por la acción
mecánica de agentes abrasivos (esferas de vidrio o cerámica) y agitación (movimientos de oscilación o por
sonicación). Hay que tener en cuenta que el proceso de rotura mecánica del tejido puede liberar proteasas y otras
enzimas, por lo que conviene realizar estos procesos en frío y de forma rápida (o añadir inhibidores enzimáticos).
B) Homogeneización química. Consiste en someter al tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan
los componentes tisulares. Se suele realizar para muestras pequeñas y cortes de tejido en congelación obtenidos con
un criostato. Se realiza añadiendo a la muestra la mezcla de incubación (proteasas y detergentes) para llevarlo a la
incubadora (37-56ºC durante 12-24 horas). Si en la mezcla de incubación se añaden enzimas y detergentes que rompen
las membranas celulares se puede simultanear con el primer paso de la extracción.

Este material se usa en estudios retrospectivos, aunque la calidad de sus ácidos nucleicos es peor que en tejido fresco.
Esta pérdida de calidad tiene lugar porque durante el proceso de fijación el ADN se fragmenta y el ARN puede ser
parcialmente degradado, según el tiempo que transcurra entre la obtención y la fijación de la muestra.
El pretratamiento que se necesita en este tipo de tejidos es la desparafinización que consiste en la eliminación de la
parafina. Se consigue cortando el tejido con un microtomo (5-10µm) para transferir los cortes, entre 5 y 10 mg, a un tubo
eppendorf. Se incuba en xilol para disolver la parafina y se rehidrata utilizando etanoles de concentraciones decrecientes
y agua destilada y estéril. El último paso es la homogeneización química, con enzimas, para disgregar las células.

CULTIVOS BACTERIAS Y LEVADURAS

El pretratamiento consiste en situar las bacterias y levaduras en un tapón en un tapón de suspensión, también
denominada solución GTE con glucosa 50mM, tris 25mM pH8 y EDTA 10mM. Si se trabaja a partir de cultivos en medio
líquido, primero se centrifuga para eliminar el sobrenadante (medio de cultivo); en cambio, para colonias aisladas, se
recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril y se resuspende en GTE.
CÉLULAS DE LA MUCOSA ORAL
En el mercado se encuentran soluciones y kits comerciales para su recogida y conservación. Existen diversos sistemas de
obtención: raspar la mucosa oral con torunda o cepillo y sumergir la muestra en una solución conservante; enjuagar
con una solución conservante; o recolectar directamente saliva. El pretratamiento consiste en centrifugar la suspensión
y eliminar el sobrenadante.
ESPUTO
Puede usarse para detectar la presencia de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias. El
pretratamiento consiste en fluidificarlo con un agente mucolítico (N-acetil-L-cisteína, NALC) en una disolución de citrato
sódico. Si se quiere detectar micobacterias (tuberculosis) se añade también NaOH para descontaminar la muestra.
El proceso de extracción consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ácidos
nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aislados.
Implica dos pasos: la lisis celular, para conseguir la liberación de ácidos nucleicos, y la inactivación de las nucleasas
celulares (ADNasas y ARNasas). Ambos procesos se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una
solución de lisis. En células con pared celular, será necesario aplicar algunas variaciones del tratamiento.

La solución de lisis depende del tipo de célula que se va a lisar y puede incluir:

DETERGENTES EDTA PROTEASAS AGENTES

CAOTRÓPICOS
Son los componentes principales. Es un quelante Digieren las proteínas,
Su función es desestructurar la de cationes tanto las de la Desnaturalizan e
bicapa lipídica de las membranas divalentes, membrana celular como inactivan las
y desnaturalizar las proteínas. El como el calcio y las citoplasmáticas, macromoléculas,
docedil-sulfato-sódico (SDS), un el magnesio eliminando además las como el
compuesto tensioactivo aniónico, es (cofactor de las nucleasas. La más isotiocianato
el más utilizado en las soluciones ADNasas). De utilizada es la proteinasa de guanidinio,
de lisis celulares, especialmente en esta forma inhibe K, especialmente en un potente
muestras humanas y animales, en la actividad de muestras de tejidos inactivador de
combinación con EDTA. las ADNasas. frescos y FFPE. las ARNasas.

Para degradar la pared celular se hacen necesarios otros tratamientos como:

A) Tratamientos enzimáticos. Se puede poner en práctica antes de usar la solución de lisis o simultáneamente,
incorporando la enzima a la solución de lisis celular.
• lisozima o lisostafin para degradar la pared de las bacterias gran positivas.
• liticasa o zimolasa, para células vegetales, levaduras y hongos.
B) Tratamientos mecánicos. En bacterias, se utilizan métodos como ebullición en agua destilada o tampón, ciclos de
congelación-descongelación, sonicación…
C) Tratamiento con CTAB. Se puede sustituir el SDS por otro detergente iónico, el CTAB, que facilita la eliminación de
los polisacáridos y derivados polifenólicos (interfieren en procesos enzimáticos utilizados en biología molecular).

Se debe comprobar que se ha conseguido una solución homogénea que indique que el proceso de lisis celular ha sido
eficiente. En caso contrario, si se observan grumos, cuerpos celulares, etc., se deberá prolongar el protocolo y reincubar
con más solución de lisis las muestras, incluso a temperaturas más elevadas (37-65ºC).

Cuando se quiere purificar exclusivamente ADN, es necesario eliminar el ARN presente en el lisado, añadiendo ARNasas
e incubándolo a 37ºC durante 15-45 minutos.
Este paso no suele ser necesario en muestras de sangre periférica o médula ósea porque la contaminación por ARN es
mínima, pero si aconsejable en muestras como saliva, tejidos y raspados celulares.

Una vez finalizada la lisis, los ácidos nucleicos se encuentran inmersos en un extracto celular complejo junto con proteínas,
sales minerales, componentes celulares solubles y los propios reactivos empleados en la extracción.
El proceso de purificación consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado. Las diferentes
técnicas de purificación se basan en algunas de las propiedades físico-químicas de ácidos nucleicos.
FUNDAMENTO
La purificación con solventes orgánicos se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado
celular en solventes orgánicos.
PROCEDIMIENTO
El procedimiento se puede dividir en cuatro fases:
A) Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
• Se utiliza como disolvente Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoámilico (25:25:1) en un volumen igual al del lisado y
se agita con un vórtex; el cloroformo disuelve los lípidos y el fenol desnaturaliza y disuelve las proteínas.
• Se centrifuga y la mezcla se divide en dos fases: la acuosa, en la parte superior del tubo, con los ácidos nucleicos,
las sales y el resto de componentes hidrosolubles del lisado; y la orgánica, en la parte inferior del tubo, con las
proteínas y lípidos.
B) Precipitación del ADN. La fase acuosa se transfiere a un tubo limpio y el ADN se precipita añadiendo acetato
sódico e isopropanol o etanol al 100% frío. El alcohol elimina la capa hidratante que rodea las moléculas de ADN
y el acetato sódico neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato (cede Na+), lo que permite que las moléculas de
ADN se puedan unir. Finalmente, mediante centrifugación, el ADN precipitado sedimenta en el pellet, en forma de
maraña de hebras blanquecinas, y el sobrenadante contiene los contaminantes hidrosolubles del lisado, por lo que este
último se elimina.
C) Lavado del ADN. El pellet de ADN se lava con etanol al 70-95% (1ml) y se vuelve a centrifugar. El ADN es insoluble
en etanol; al contrario de los restos de sales y posibles contaminantes, por lo que se eliminan con el sobrenadante.
D) Resuspensión del ADN.
• El etanol interfiere en muchas técnicas de biología molecular por lo que se elimina dejándolo secar a temperatura
ambiente.
• Después se resuspende en agua destilada estéril (SDW) o en un tampón de baja fuerza iónica y ligeramente
alcalino (pH 8) como un tampón Tris-HCl + EDTA (TE).
• La rehidratación del ADN es un proceso lento y se puede realizar una incubación inicial a 55-65ºC seguido de una
incubación a temperatura ambiente con agitación suave hasta la completa disolución del pellet o una incubación en
nevera a 4ºC hasta el día siguiente.

( - )
FUNDAMENTO
La precipitación con sales se basa en la precipitación de proteínas en
presencia de altas concentraciones salinas.
Estas concentraciones generan medios con elevada fuerza iónica, lo que
determina un incremento de las interacciones hidrofóbicas entre proteínas,
disminuyendo drásticamente su solubilidad en el medio acuoso y provocando
su precipitación.
Las sales más utilizadas es una solución precipitante I de NaCl 6M o solución
precipitante II de acetato de amonio 10M.
PROCEDIMIENTO
El protocolo consta de tres fases:
A) Precipitación de proteínas. Se añade al lisado un volumen igual de una solución salina concentrada y se agita
con vórtex. A continuación, se centrifuga la mezcla, con lo que las proteínas sedimentan en el fondo del tubo como un
pellet de color pardo; en el sobrenadante quedan los ácidos nucleicos, sales y demás componentes hidrosolubles.
B) Precipitación, lavado y resuspensión del ADN.

í
FUNDAMENTO
La cromatografía de intercambio iónico se basa en la unión electrostática reversible de iones en solución a grupos
funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria. Cuando dichos grupos
funcionales tienen carga neta positiva, se habla de intercambiadores aniónicos, ya que se unen a aniones. Si es al contrario
se llaman intercambiadores catiónicos.
Para purificacion de ácidos nucleicos se usan
matrices de sílice o celulosa (fase estacionaria)
empaquetadas en columnas de polipropileno. A
la matriz se le une covalentemente un
intercambiador aniónico: metilaminoetanol
(MAE) y el dietilaminoetil (DEAE).
PROCEDIMIENTO
El procedimiento consta de tres pasos:
A) Cargar la columna de cromatografía. Se carga con una
dilución del lisado en un tampón de baja salinidad y pH neutro.
En estas condiciones, los ácidos nucleicos (-) y se unen a los
grupos funcionales de resina (+). Las proteínas, polisacáridos y
otros contaminantes con carga positiva eluyen de la columna.
B) Lavado de la columna. Se lava con tampones de
concentración salina creciente, con lo que se van eliminando
contaminantes con débil carga negativa.
C) Elución del ADN. Con un tampón de máxima salinidad y alto
pH. El ADN eluido se precipita, se lava y se resuspende.

í
FUNDAMENTO El vidrio está formado principalmente por
La cromatografía de adsorción se basa en la capacidad de silicatos con una estructura molecular tetraédrica,
adsorción de los ácidos nucleicos a la sílice del vidrio en capaz de formar puentes de hidrogeno con las
presencia de sales caotrópicas que aumentan la solubilidad de moléculas de agua. Por tanto, en contacto con
sustancias apolares y modifican interacciones moleculares no agua, la superficie del vidrio se recubre de una
covalentes desestabilizando proteínas. capa hidratante; al igual que los ácidos
nucleicos (el agua se une a los grupos fosfato
Cuando al medio acuoso se añade una sal caotrópica, esta atrae a
por puentes de hidrogeno).
las moléculas de agua y retira la capa hidratante.
Ambas capas impiden la interacción entre ellas.
Se usan perlas de sílice y membranas de vidrio empaquetadas columnas de polipropileno.
PROCEDIMIENTO
El procedimiento consta de tres pasos:
A) Cargar la columna de cromatografía. Se carga con el lisado diluido en un tampón que
contiene un agente caotrópico. En estas condiciones, los ácidos nucleicos y se unen a las
membranas de vidrio. Las proteínas y otros componentes celular eluyen de la columna en
un tubo recolector por centrifugación.
B) Lavado de la columna. Se utiliza alcohol del 70%.
C) Desorción de los ácidos nucleicos. Se ajusta a la columna a un tubo eppendorf limpio
y se resuspende la columna en agua destilada estéril o tampón TE. De esta manera se
recupera la capa hidratante, lo que causa la desorción. Se incuba 3-5 minutos, ya que
favorece la resuspensión, se centrifuga y se desecha la columna, de manera que los ácidos
nucleicos quedan recolectados en eppendorf.

FUNDAMENTO VARIACIÓN
La purificación mediante esferas magnéticas
Una variación de esta técnica consiste en recubrir las esferas con
se basa en la unión de los ácidos
estreptavidina.
nucleicos a microesferas magnéticas
que pueden ser retenidas mediante un En este caso el lisado celular se incuba con oligonucleótidos poli-T
imán. Estas microesferas suelen estar marcados con biotina.
constituidas por nanopartículas de magnetita Una vez que se ha producido la unión Poli T-ARNm, se añaden las
encapsulada en una matriz inerte. microesferas recubiertas con estreptavidina. Dada la fuerte afinidad de
La unión de los ácidos nucleicos a las esferas la estreptavidina por la biotina, se produce la unión del ARNm-PoliT a
puede realizarse por adsorción o afinidad. las esferas. A partir de aquí se continua como en el caso anterior.

ADSORCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS A ESFERAS MAGNETICAS

Las microesferas se recubren de sílice o grupos funcionales con alta afinidad por los ácidos nucleicos.

A) Adición de las esferas. Las esferas se añaden al lisado junto con un agente caotrópico que favorece la unión por
adsorción.
B) Separador magnético. Se coloca el tubo con la mezcla en un soporte magnético de manera que las esferas son
atraídas por el imán y se agrupan en la zona de la pared del tubo que está en contacto con el mismo. El resto del
lisado, con las proteínas y contaminantes, se elimina por pipeteo o decantación.
C) Lavado. Se retira el tubo del separador magnético, se lava con etanol 70%, y se vuelve a colocar en el separador,
para eliminar la solución de lavado eliminando el resto de los contaminantes.
D) Desorción. Para que los ácidos nucleicos se separen de las esferas magnéticas y se disuelvan en el medio, una vez
retirado el tubo del imán, se resuspende (SDW o tampón TE). Se coloca nuevamente en el separador para que se
agrupen las esferas y poder pipetear la solución que contiene los ácidos nucleicos para transferirla a un tubo limpio.
SEPARACIÓN MAGNETICA POR AFINIDAD
Las microesferas, magnéticas o de látex, que se recubren con oligonucleótidos poli-T se usan para la purificación de
ARNm eucariota.
A) Adición de las esferas. Las esferas magnéticas se añaden al lisado junto con un tapón que favorezca la hibridación
entre la cola poli-A de los ARNm y la cadena poli-T de las microesferas.
B) Separador magnético. Se aplica entonces un imán que atraiga a las microesferas para eliminar el resto de los
componentes del lisado.
E) Lavado. Se retira el tubo del separador magnético, se lava con etanol 70%, y se vuelve a colocar en el separador,
para eliminar la solución de lavado eliminando el resto de los contaminantes.
F) Desorción. Una vez retirado el tubo del imán, se resuspende (SDW o tampón TE) y se eleva la temperatura para
separar por desnaturalización térmica la unión ARNm-PoliT. Se coloca nuevamente en el separador para que se
agrupen las esferas y poder pipetear la solución que contiene los ácidos nucleicos para transferirla a un tubo limpio.

FUNDAMENTO
La ultrafiltración se basa en la retención por tamaño de las moléculas de acidos nucleicos mediante membranas con un
tamaño de poro determinado. Las membranas se sitúan en la base de columnas que ajustan en tubos colectores. Este
método se suele utilizar para purificar productos de PCR con un tamaño superior a 150 pb.
PROCEDIMIENTO
La muestra se carga directamente en la columna y se centrifuga, de manera que sobre el filtro quedan retenidos los
productos amplificados de PCR y al tubo pasan los contaminantes. El filtro se lava con etanol para eliminar restos de
contaminantes. Los productos de PCR se resuspenden y se transfieren a un tubo limpio por pipeteo.

Los plásmidos son una herramienta muy útil en la clonación de secuencias génicas. El problema que se plantea durante
su purificación es que hay que separarlos del ADN cromosómico bacteriano y del ARN bacteriano.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD
Tras aislar el ADN total de una bacteria, se somete a una ultrafiltración en gradiente de densidad de cloruro de cesio
con bromuro de etidio (solo se une a moléculas bicatenarias) para poder observar las bandas que se forman tras la
centrifugación con luz UV. La densidad del ADN cromosómico es mayor que la del ADN plasmídico, por lo que
ambos tipos se separan en bandas diferenciadas.
Esta técnica dura varios días, por lo que está en desuso.
LISIS ALCALINA
La lisis alcalina se basa en las diferencias en el proceso de desnaturalización/renaturalización de ambos tipos de
molécula. Consta de varias fases:
A) Lisis alcalina. A partir de un cultivo microbiano en suspensión, se centrifuga para eliminar el sobrenadante y se
resuspende e incuba el pellet con solución GTE. Se añade la solución de lisis alcalina, que contiene SDS (rompe la
bacteria) y NaOH (que desnaturaliza el ADN por el pH 11). Durant
B) Neutralización rápida. Se añade una mezcla concentrada una solución concentrada (3M) de acetato potásico a
pH ácido (4,8):
• Brusca neutralización del pH. Esto provoca reasociaciones aleatorias en las moléculas de ADN cromosómico,
originando agregados insolubles que precipitan. Mientras, el ADN plasmídico, al ser de tamaño mucho menor,
renaturaliza perfectamente (por lo que no precipita).
• Alta concentración salina. Esto provoca la precipitación de las proteínas junto con el SDS. Entonces se deja
incubar y se centrifuga, de manera que sedimentas todos los componentes insolubles, permaneciendo en el
sobrenadante el ADN plasmídico en su configuración nativa.
C) Purificación del ADN plasmídico. El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se lava y se resuspende; también
se puede tratar con ARNasas.

El ARN es muy sensible a la acción de las ARNasas, omnipresentes en OBTENCION DE REACTIVOS LIBRES
superficies y materiales, como consecuencia de la contaminación por DE ARNasas
bacterias, hongos y células de descamación de la piel. Además, la esterilización
El agua se trata con DEPC
del material por calor no las elimina ni tampoco el EDTA.
(dietilpirocarbonato) al 0,1%, que se
Por ello, la purificación de ARN debe hacerse en condiciones especiales: une covalentemente a ciertos
trabajar con guantes en cabina de flujo laminar; limpieza de superficies con aminoácidos, inactivando las
soluciones comerciales inactivadoras de ARNasas; el material y los reactivos ARNasas. Antes de usarla el agua
debe ser libre de ARNasas; y la solución de lisis debe tener isocianato de debe autoclavarse 20 minutos a
guanidina, un agente caotrópico que inactiva las ARNasas. 120ºC para eliminar el DEPC.
Varias metodologías ya descritas se han automatizado y se han optimizado con el diseño de robots automatizados de
extracción (96 muestras simultáneos) y kits de reactivos específicos para las diferentes muestras.

Las ventajas que aporta la automatización del proceso de extracción son claras:
• Garantiza la obtención de acidos nucleicos altamente purificados.
• Mínima la contaminación por proteínas.
• Evita la contaminación cruzada entre muestras.
• Aporta rapidez (una hora).

BASADOS EN EL USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS

Utilizan cartuchos cerrados de reactivos con un compartimento para cada paso de la técnica con el correspondiente
reactivo específico. El paso de las esferas magnéticas de un compartimento a otro se realiza con émbolos metálicos que
portan un electroimán en el extremo y que funcionan también como agitadores; permiten eligir el volumen de elución.
De esta manera, el tiempo de extracción se reduce a 30-50 minutos.
BASADOS EN LA CROMATOGRAFÍA DE ABSORCIÓN
Las columnas de sílica gel se cargan mediante pipeteo automático y el paso de los reactivos por la columna se fuerza con
sistemas de vacío (sustituye la centrifugación).
INSTRUMENTOS MODULARES
Se adaptan a distintas metodologías, añadiendo brazos manipuladores y módulos específicos para agitación, vacío, esferas
magnéticas, centrifugación…

Una buena calidad en la obtención de ácidos nucleicos es la clave para conseguir una adecuada funcionalidad de los
mismos en las diferentes técnicas de biología molecular que se van a aplicar. La calidad viene determinada por tres
parámetros: integridad, pureza y concentración.

La integridad determina si un ácido nucleico conserva su tamaño original. Se valora realizando una electroforesis en
gel de agarosa 0,7%-1,2% (p/v).
ADN GENÓMICO
Aquellas muestras que hayan mantenido su integridad, se obtendrá una única banda perfectamente definida en la parte
superior del gel. Si, en cambio, el ADN se degrada, aparecerá una estela fluorescente o smear a lo largo de la calle, cuya
extensión e intensidad dependerá del grado de degradación del ADN.
Este patrón electroforético no es aplicable a las muestras purificadas a partir de tejido FFPE.
ADN PLASMÍDICO
Lo ideal es obtener una única banda, correspondiente al plásmido con su estructura nativa, es decir superenrrollado. En
muchas ocasiones aparece una banda débil correspondiente al plásmido con una estructura relajada e incluso una
tercera banda correspondiente a dímeros, llamada conformación lineal.
ARN
Es normal que aparezca un ligero smear, debido al ARNm; dos bandas nítidas, de ARNr 28S y 18S; una banda más débil,
correspondiente a los ARNr 5,5S y 5S y a los ARNt.
La pureza determina la ausencia de posibles contaminantes (proteínas, polisacáridos, sales, reactivos usados para
extracción y purificación). Su determinación se basa en la medición de absorbancia con un espectrofotómetro.
Esta medida se basa en:
SOLUTOS MÁXIMA ABSORBANCIA
Glúcidos y sales 230nm
Ácidos nucleicos 260nm
Proteínas y derivados fenólicos 280nm
Partículas en suspensión 320nm

Para que la medición sea fiable, debe estar comprendida entre 0,1-1, por lo que, para resultados mayores, es necesario
diluir la muestra en SDW o en tampón TE para volver a medir.
ABSORVANCIA A 320nm
La absorbancia a 320nm mide la turbidez de la solución, es decir, la presencia de partículas en suspensión. Este valor
se debe restar de las medidas a 260nm, 280nm y 230nm antes de calcular los cocientes.
COCIENTE A260/A280
El cociente entre las absorbancias a 260nm y 280nm indica, si su valor se encuentra entre 1’7 y 2, la muestra de ADN es
aceptable. En caso contrario, cuando se obtengan valoren menores que 1,7, se añade proteinasa K a la muestra para
eliminar las proteínas; para eliminar los derivados fenólicos, se repite el proceso de purificación con
cloroformo/alcohol isoamílico y posterior precipitación del ADN con isopropanol o etanol.
Valores superiores a 2 indican una concentración elevada de ARN, que se elimina fácilmente con ARNasas. Esto se debe
a que la absorbancia del ARN a 260nm es mayor que la del ADN, por lo que, si se quiere obtener ARN, el cociente debe
estar entre 1’8 y 2’1.
COCIENTE A260/ A230
Se considera que el ácido nucleico es puro cuando el valor del cociente se encuentra entre 1,5 y 2,2. Un valor inferior a
1,5 puede indicar presencia de glúcidos y sales, por lo que se debe precipitar y lavar con etanol, dejarlo secar y
resuspenderlo de nuevo.

La concentración es la cantidad de ácido nucleico por unidad de volumen de solución final (ng/µl o µg/ml). Para ello se
mide la absorbancia a 260nm.
Según la ley de Lambert-Beer: A=Ɛ·c·l. Las equivalencias entre A260 y las concentraciones:
• ADNds: 1 DO260 = 50 ng/µl
• ARN: 1 DO260 = 40 ng/µl [ANs]=(A260-A320)·FC·FD
• ADNss: 1 DO260 = 33 ng/µl
Otro método es el de la fluorescencia, utilizando SYBR Green I, PicoGreen, Bisbenzimidazol… que emiten fluorescencia
cuando se combinan con ADNds, de manera que la concentración y la fluorescencia son directamente proporcionales.
La técnica requiere la elaboración de una curva de calibración con cantidades de ADN conocidas.

El sistema de almacenamiento de alícuotas debe garantizar su integridad y asegurar su completa trazabilidad.

Para evitar o reducir al mínimo la degradación de las muestras:

• Usar tubos eppendorf o criotubos con cierre hermético y libre de nucleasas.
• Se almacenan en frío. Las muestras de ADN, se puede mantener a 4º C si se va a utilizar en pocos días; ya que para
tiempos mayores se requiere una congelación a -20ºC o, preferiblemente, a -80ºC. Las muestras de ARN siempre se
congelan a -80ºC.
• Conviene que los congeladores cuenten con un sistema de seguridad: sistema de alarma en caso de mal
funcionamiento, sistema de seguridad de CO2 que ermita conservar la temperatura en caso de avería, sistema de
monitorización de temperatura para comprobar las posibles oscilaciones de la temperatura…
El sistema de identificación de tubos puede consistir en la rotulación directa de los tubos, con tintas indelebles
resistentes a disolventes y a las bajas temperaturas; uso de etiquetas alfanumérica; etiquetas con código de barras 1D;
tubos con codificación 2D grabada en tubo… Las cajas o racks también deben esta correctamente identificadas.