Distribuidora de Reactivos y Agentes de Diagnstico para Laboratorio

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Inserto Gonadotropina Corinica Humana- (hCG)

MONOBIND, INC.
Gonadotropina Corionica Humana-
Cdigo de Producto: 875-300
Intencin de uso:
La determinacin cuantitativa de la concentracin de la Gonadotropina
Corionica en suero humano o plasma por un micro plato de anlisis de
Quimioluminiscencia (CLIA).

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la reaccin de

alta afinidad de streptavidin y el anticuerpo biotinilado. Esta interaccin esta
ilustrada abajo:

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA.

La concentracin de la gonadotropina corionica humana (hCG) se incrementa
dramticamente en la sangre y orina durante un embarazo normal. hCG es
secretada por el recubrimiento de la placenta, comenzando con la trophoblast
primitiva, casi desde el tiempo de la implantacin, y sirve para soportar el corpus
luteum durante las primeras semanas de embarazo. hCG o glicoproteinas similares
hCG pueden tambin ser producidas por una amplia variedad de tumores
trophoblastic y no trophoblastic. La medicin de hCG, por los sistemas de anlisis
con adecuada sensitividad y especificidad han provedo de un gran valor en la
deteccin de embarazo y el diagnstico temprano de desordenes en el embarazo.
De acuerdo a la literatura, hCG es detectable en un tiempo de tan solo 10 das
despus de la ovulacin, alcanzando los 100mIU/ml en el primer periodo perdido.
Por el tiempo de la siguiente ovulacin, los niveles de hCG son 200 mIU/ml
(aproximadamente 28 das despus de la concepcin) (1). Un pico de 50,000 o
hasta 100,000 mIU/ml es obtenido en el tercer mes, entonces despus un declive
gradual se observa. (2,3).
En este mtodo, el calibrador hCG, el espcimen del paciente o el control se
agrega a un pozo cubierto de streptavidin. Monoclonal Biotinilado y los anticuerpos
etiquetados enzima (dirigidos contra epitomes distintos y diversos de hCG) se
agregan y se mezcla el reactivo. La reaccin entre los varios anticuerpos de hCG
nativo forma un complejo de sndwich que se enlaza con el streptavidin cubierto al
pozo.
Despus de la terminacin del perodo requerido de la incubacin, el anticuerpo de
la enzima-gonadotropina corionica conjugada atada es separada de la conjugacin
desatada de la enzima-gonadotropina corionica por la aspiracin o la decantacin.
La actividad de la enzima presente en la superficie del pozo es cuantificada por la
reaccin con un sustrato adecuado para producir luz.
El empleo de varias referencias de suero con niveles conocidos de gonadotropina
corionica permite la construccin de un grfico de la actividad y de la
concentracin. De la comparacin de la curva de la reaccin a cierta dosis, la
actividad de un espcimen desconocido se puede correlacionar con la
concentracin de gonadotropina corionica.

PRINCIPIO
Anlisis Inmunoenzimomtrico:
Los reactivos esenciales requeridos por un anlisis Inmunoenzimomtrico incluyen
alta afinidad y anticuerpos especficos (enzima e inmovilizado), diferentes y con
reconocimiento distinto del eptome, en exceso, y antgeno nativo. En este
procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el anlisis en la superficie del
micropozo a travs de la interaccin de streptavidin recubierto en el pozo y el
exgeno agregado monoclonal biotinilado al anticuerpo de anti-hCG. Mezclando
el anticuerpo inmovilizado, conjugacin del enzima-antgeno etiquetado y un suero
que contienen el antgeno nativo, una reaccin de la competicin resulta entre el
antgeno nativo y los anticuerpos sin competencia o steric hidrance, para formar un
sndwich complejo soluble. La interaccin es ilustrada por la siguiente ecuacin:

Despus de que se obtiene el equilibrio, la fraccin del anticuerpo-unido es

separado del antgeno desatado por la decantacin o la aspiracin. La actividad
enzimtica, determinada por la reaccin con un sustrato que genera luz en el
anticuerpo-limite es directamente proporcional a la concentracin nativa del
antgeno. Utilizando diversas referencias del suero de los valores sabidos del
antgeno, una curva de la reaccin a cierta dosis puede ser generada de la cual la
concentracin del antgeno de un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. Calibradores hCG-1ml/vial - Iconos A-F
Seis (6) frascos de referencia para el antgeno hCG en los niveles de 0(A), 5(B),
25(C), 50(D), 100(E) y 250(F) mIU/ml*. Almacene a 2-8C. Se ha agregado un
preservativo.
*Nota: Los calibradores, basados en suero humano, se calibraron usando una
preparacin de referencia, el cual fue ensayado contra el WHO 3rd IS (75/537).
B. REACTIVO DE TRAZO hCG - 13ml/- frasco del icono
Un (1) frasco que contiene la enzima etiquetada del anticuerpo de afinidad
purificado, biotinilado monoclonal de Ratn IgG en solucin, tinte y preservativo.
Almacene a 2-8C.
C. POZOS DE REACCIN A LA LUZ - 96 pozos - icono ?
Un (1) microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en una
bolsa de aluminio con un agente deshidratado. Almacnese a 2-8C.
D. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA--20ml - icono
Un (1) frasco que contiene un surfactante en solucin salina. Un preservativo ha
sido agregado. Almacnese a 2-30C.
A
E. REACTIVO DE SEAL A -- 7ml/frasco icono S
Un (1) frasco que contiene luminol en solucin. Almacn en 2-8C.
B
F. REACTIVO DE SEAL B --7ml/frasco icono S
Un (1) frasco que contiene el perxido de hidrgeno (HO) en solucin.
Almacnese en 2-8C.
G. Instrucciones del producto.
Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estn
almacenados en 2-8C.
Nota 3: Los reactivo son para una sola microplaca de 96-pozos.
MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
1. Pipeta capaz de entregar los volmenes 50l con una precisin mejor de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.350ml
con una precisin de mejor de 1.5%.
3. Lavador de Micro placas o una botella de apretn (opcional).
4. Luminmetro de micro placas.
5. Tubos de Prueba para mezclar los sustratos A&B.
6. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la micro placa.
7. Plstico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la incubacin.
8. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado.
9. Contador de tiempo.
10. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONES
Para el Uso De Diagnstico In Vitro No Para el Uso Interno o Externo en Seres
Humanos o Animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antgeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer termine el aseguramiento que los agentes infecciosos estn
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como

otencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos

procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden
encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la
Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgicos y biomdicos," 2da Edicin,
1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

del desconocido intersecta la curva de calibracin a 23.2mIU/ml de la

concentracin de hCG (ver Ejemplo 1)

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION

Los especimenes deben ser sangre, suero en tipo y tener las precauciones
generales en la coleccin de muestras del veni-puntura. Para la comparacin
exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la
maana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo liso de
venipunctura de tapn rojo sin aadidos o anticoagulantes. Permita que la sangre
coagule. Centrifugue el espcimen para separar el suero de las clulas.
Las muestras se pueden refrigerar en 2-8C por un perodo mximo de cinco (5)
das. Si el espcimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se
puede almacenar en las temperaturas de -20C por hasta 30 das. Evite congelar y
deshelar. Cuando analice en duplicado, se requiere 0.050 ml del espcimen.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

1. SOLUCION LAVADORA.
Diluir el contenido del concentrado lavador a 1000ml con agua destilada o
desionizada en un contenedor adecuado. Almacnese a temperatura ambiente
entre los 20-27C.
2. SOLUCIN DE TRABAJO SUSTRATO.
Determine la cantidad de reactivo necesario y prepare mezclando porciones
iguales del reactivo de seal A y el reactivo de seal B en un contener limpio. Por
ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos (2) tiras de 8 pozos (Se crea un
exceso pequeo de solucin). Deseche la porcin sin usar si no se usa dentro
de las 36 horas siguientes despus de ser mezclado. Si la utilizacin de los
reactivos se completa anticipadamente, dentro del tiempo, vierta los contenidos del
Reactivo de Seal B dentro del Reactivo de Seal A y etiquete adecuadamente.

Nota: El software de la reduccin de datos de la computadora diseado para los

anlisis de Quimioluminiscencia se puede tambin utilizar para la reduccin de
datos.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el anlisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a la temperatura ambiente (20 - 27C).
1. Ajuste el formato de los pozos de las micro placas para que cada referencia del
suero, control y espcimen del paciente sean analizados en duplicado. Guarde los
micro pozos nuevamente dentro del bolso de aluminio, sllela y almacnela
en 2-8C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100l) de la solucin del reactivo de la enzima hCG.
4. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir.
5. Incube 45 minutos en la temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido del micro placa por decantacin o la aspiracin. Si
decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel absorbente.
7. Agregue 350 l de la solucin lavadora (vase la seccin de la preparacin del
reactivo), decntelo (golpee y borre) o asprelo. Repita cuatro (4) veces adicionales
para un total de cinco (5) lavadas. Una lavadora automtica o manual de la
placa puede ser utilizada. Siga las instrucciones del fabricante para el uso
apropiado. Si se emplea una botella de apretn, llene cada uno bien
presionando el envase (evite burbujas de aire) para dispensar la lavada.
Decante la lavada y repita cuatro (4) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100l) de solucin activadora del substrato a todos los pozos
(vase la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos
en el mismo orden para reducir al mnimo diferencias de tiempo de
reaccin entre los pozos.
NO AGITE DESPUES DE ADICIONAL EL
SUSTRATO
9. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por cinco (5) minutos.
10. Lea las Unidades Relativas de Luz en cada pozo con un lector de microplato
de quimioluminiscencia por 0.5-1.0 segundo. Los resultados se deben leer en el
plazo de treinta (30) minutos de agregado el sustrato.

CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la
curva de la reaccin para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos
controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada
mtodo de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de
mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos provedos. Los mtodos
estadsticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias.
Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un
cambio experimental en las condiciones o degradacin del kit de reactivos. Se
deben usar reactivos frescos para determinar la razn de las variaciones.

CALCULO DE RESULTADOS
Una curva en la reaccin se usa para comprobar la concentracin de
gonadotropina corionica humana en especimenes desconocidos.
1. Registre los RLUs obtenidos del listado del lector del micro placas conforme al
ejemplo 1.
2. Trace la intensidad de luz para cada referencia duplicada del suero contra la
concentracin correspondiente de hCG en mIU/ml en el papel de grfico lineal.
3. Dibuje la mejor curva a travs de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentracin del hCG para un desconocido, localice el
promedio de RLUs del desconocido en el eje vertical del grfico, encuentre el
punto que se interseca en la curva, y lea la concentracin (en mIU/ml) del eje
horizontal del grfico (los duplicados del desconocido se pueden hacer un
promedio segn lo indicado). En el siguiente ejemplo, el promedio de RLUs (9012)

* Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas

solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada ensayo.
En adicin, los RLUs de los calibradores deben ser normalizados a 100,000 RLUs
para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversin minimiza las diferencias
causadas por la eficiencia de la variedad de instrumentos que pueden ser usados
para medir la salida de luz.

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD

En orden para que los resultados del anlisis sean considerados vlidos los
criterios siguientes deben ser conocidos:
1. La Curva de Respuesta a la Dosis debe estar dentro de los parmetros
establecidos.
2. Cuatro fuera de seis piscinas de control de calidad deben estar dentro de los
rangos establecidos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

A. Funcionamiento del Anlisis.
1. Es importante que el tiempo de la reaccin en cada uno pozos este llevada a
cabo constante para que se produzcan los resultados. El medir con una pipeta de
muestras no debe extender ms all de diez (10) minutos para evitar la deriva del
anlisis. Si se utiliza ms de una (1) placa, se recomienda repetir la curva de la
reaccin a cierta dosis.
2 El no retirar la solucin adecuadamente en el paso del lavado y de la aspiracin o
de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a resultados falsos.
3. Las muestras que puedan estar contaminadas micro biolgicamente, no deben
ser usadas en el anlisis. La lipemica elevada o especimenes hemolizados no
deben ser usados.
4. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reactivos de diferentes equipos.
5. Se recomiendas las pipetas multicanales para la adicin de los reactivos.
B. Interpretacin
1. Si la reduccin de datos controlados de la computadora se utiliza para interpretar
los resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los
calibradores caigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. Resultados Positivos falsos pueden ocurrir en la presencia de una amplia
variedad de tumores trophoblastic y no trophoblastic que segregan hCG. As pues,
La posibilidad de un hCG segregando neoplasia debe ser eliminada
prioritariamente al diagnostico del embarazo.
3. As, resultados positivos falsos pueden ser vistos cuando se analicen los
especimenes de sus individuales tomando la droga Pergonal* y Clomid**.

Adicionalmente Pergonal puede estar seguida con una inyeccin de hCG.

4. Micro abortos espontneos y embarazos hetpicos pueden tender a tener
valores que son menores que los esperados durante un embarazo normal mientras
que valores altos son vistos continuamente en mltiples embarazos.
5. Siguiendo los abortos teraputicos, la hCG detectable puede persistir por un
periodos de 3 a 4 semanas. La desaparicin del valor de hCG, despus de un
aborto espontneo, puede variar dependiendo de una cantidad de residuos viables
trophoblast (4,5,6,7).
*Pegonal es una marca registrada de Serono Laboratorios, Inc
**Clomid es una marca registrada de Merriel-National Laboratorios

B. Exactitud
El procedimiento de hCG por micro plato de CLIA fue comparado con un mtodo
de referencia de inmunoanlisis. Especimenes biolgicos de poblaciones normales
y embarazos fueron analizados. El nmero total de estos especimenes fue de 88.
La ecuacin de regresin del ltimo cuadro y la correlacin del coeficiente fueron
computadas por la hCG CLIA en comparacin con el mtodo de referencia. La
informacin obtenida se muestra a continuacin.

RANGOS ESPERADOS Y VALORES

Un estudio de un normal adulto aparentemente normal fue tomado para determinar
valores previstos para el sistema de pruebas por micro plato de hCG por ELISA.
Los valores de significado (X) desviaciones estndar (?) y rangos esperados (2?)
estn presentados en la tabla 1.
TABLA I
Valores Esperados por el Sistema de Pruebas de hCG por CLIA.
( en mIU/ml 3rd IS 75/537)
Nmero
50
Significado
2.3
Desviacin Estndar
1.6
Rangos Esperados (2?)
0.01 5.5

Solo una pequea cantidad de la referencia de diagonal entre este mtodo de hCG
CLIA y el mtodo de referencia es indicada por la proximidad de los valores
medios. La ecuacin de la regresin de la ltima tabla y el coeficiente de
correlacin indica el acuerdo excelente del mtodo.
C. Sensibilidad
La sensitividad (lmite de deteccin) fue comprobado por la determinacin de la
variabilidad del suero calibrador 0mIU/ml y usando el 2? (95% certeza) estadstica
para calcular la dosis mnima. Esto fue determinado a ser 0.6mIU/ml.

Niveles esperados para hCG durante el embarazo normal (3) se presentan en la

tabla 2.
TABLA 2
Valores Esperados para niveles de hCG (3rd IS 75/537)
Durante el embarazo normal (en mIU/ml)
1 Semana
10 30
2 Semana
30 100
3 Semana
100 1000
4 Semana
1,000 10,000
2 y 3 Mes
30,000 100,000
2 Trimestre
10,000 30,000
3er Trimestre
5,00 15,000
Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores
que se pueden esperar ser encontrado por un mtodo dado para una poblacin de
personas normal es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la
especificidad del mtodo, de la poblacin probada y de la precisin del mtodo en
las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la
gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una
lata interna de la gama determinada por los analistas usando el mtodo con una
poblacin indgena al rea en la cual el laboratorio est situado.

CARACTERISTICAS DE ACTUACIN
La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de hCG ELISA
Micro placa fue determinada por anlisis en tres diversos niveles de los sueros del
control. El nmero (N), el valor medio(X), la desviacin de estndar (?) y el
coeficiente de variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se
presentan en la tabla 2 y la tabla 3.

D. Especificidad:
El mtodo de reactividad cruzada del hCG para seleccionar sustancias fue
evaluada agregando la sustancia que interfera a una matriz del suero en las varias
concentraciones. La reactividad cruzada fue calculada derivando un cociente entre
la dosis de la sustancia que interfera a la dosis de Gonadotropina Corionica
necesaria para producir la misma intensidad de luz.

Sustancia
Gonadotropina Corionica(hCG)
-hCG subunidad
Folitropina (FSH)
Lutropina (LH)
Tirotropina (TSH)

REFERENCIAS

React Cruzada
1.0000
<0.0001
<0.0001
< 0.0001
< 0.0001

Concentracin
---1000ng/ml
1000ng/ml
1000ng/ml
1000ng/ml