UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA:
FUNDAMENTOS DE
BIOPROCESOS

AUTORES:
Marcia Juana Quequezana Bedregal
Raúl Omar Gallegos Jara

DATOS DEL ALUMNO

Nombre del alumno …………………………………………………………................................……

Grupo………………………………………………………. Turno Calificación………………….

AREQUIPA–PERÚ-2022
PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto de hacer llegar al

interesado los alcances actuales de los fundamentos básicos para bioprocesos aplicados
en el laboratorio.

La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica y microbiología han

determinado el gran impulso para el ilimitado campo de los bioprocesos

Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el conocimiento

previo de los fundamentos en bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la elaboración

de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos productivos con
menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que puedan producir
sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas
que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos bioprocesos.

La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de Ingeniería Química las

destrezas básicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio
práctico de los fundamentos de bioprocesos.

Los Autores
ÍNDICE

PROLOGO

ÍNDICE

PRACTICA 1: BIOSEGURIDAD Y RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE

BIOPROCESOS

PRACTICA 2: SEPARACION DE AMINOACIDOS.

PRACTICA 3: CUANTIFICACION DE PROTEINAS

PRACTICA 4: PROPIEDADES Y SEPARACION DE PROTEINAS

PRACTICA 5: EXTRACCIÓN DE ALMIDON NATIVO DE PAPA

PRACTICA 6: OBTENCIÓN DE PLASTICOS BIODEGRADABLES A PARTIR DE ALMIDÓN

PRACTICA 7: EXTRACCIÓN DE ACEITE ESENCIAL

PRACTICA 8: PRODUCCION DE BIODIESEL

PRACTICA 9: EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES

PRACTICA 10: CINÉTICA ENZIMÁTICA EN UREASA

PRACTICA 11: METABOLISMO EN FERMENTACION ALCOHOLICA E

INMOVILIZACION DE CELULAS

PRACTICA 12: EXTRACCION DE ADN

PRACTICA 13: MICROSCOPIA

PRACTICA 14: RECONOCIMIENTO DE ALGAS, PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS IN

VIVO, COLORACION VITAL

PRACTICA N° 15: REPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO; COLORACIÓN SIMPLE

Y DIFERENCIAL; TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE HONGOS

2
 INSTRUCCIONES GENERALES

a. Busca los conceptos antecedentes y repórtalos, previo a la realización de la práctica.

b. Construye la hipótesis de trabajo, antes de solicitar el material.

c. Lee cuidadosamente los experimentos antes de ejecutarlos.

d. Recurre a tus libros de texto y/o de consulta para aclarar dudas y comprender el porq ué
de las operaciones que se han efectuado; o consulta de inmediato al profesor responsable.

e. Realiza cuidadosamente tus experimentos, procurando entender el porqué de los hechos

acaecidos.

f. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa minuciosamente
y anota los cambios ocurridos: (olor, color, gases, liberación o absorción de calor,
e t c . ), en tu manual o cuaderno.

g. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario para su futura revisión.

h. Elabora tus conclusiones.

Material necesario para trabajar por alumno:

a) Individualmente: U n a bata de trabajo con manga larga.

b) Por equipo: Una cinta masking-tape de 1/2 pulgada, un paquete de toallas de papel, un
marcador indeleble, un lienzo para limpiar la mesa.

3
PRECAUCIONES EN EL DESARROLLO DE CADA EXPERIMENTO

Las medidas oportunas y la comprensión de las prácticas a seguir, hará del laboratorio
un lugar seguro como cualquier salón de clases. Para ello deberán tenerse en cuenta,
en forma general, las siguientes precauciones:

1. Observa dónde dejas el material caliente, cerciorándote de que esté frío antes
de tomarlo con la mano.

2. Cuando calientes un tubo de ensaye, no lo apuntes hacia ti o hacia tus

compañeros, puede proyectarse su contenido.

3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lávate inmediatamente con

agua abundante y llama a tu instructor.

4. Nunca pruebes una sustancia si no se te indica. Puede ser veneno.

5. Al detectar el olor de un líquido, no pongas la cara sobre la boca del recipiente.

Con tu mano abanica hacia ti el aroma.

6. Antes de usar un reactivo, lee dos veces l a etiqueta para estar seguro de su
contenido.

7. Los aparatos o recipientes en los que haya desprendimientos gaseosos no

deben cerrarse herméticamente, pues las presiones formadas en su interior
pueden explotarlo.

8. Los tubos de ensayo no deben calentarse por el fondo sino por las paredes, para
evitar la expulsión de su contenido.

9. No arrojes cuerpos sólidos en los lavabos, a menos que estén pulverizados y

sean fácilmente solubles en agua. No viertas directamente los ácidos en los
lavabos, ya que los corroe.

10. Cuando interrumpas un experimento, coloca etiquetas con leyendas

apropiadas a los frascos y matraces que contengan sustancias, así te será fácil
identificarlos.

11. Cuando trabajes con fuego, ma nté n t u cabello recogido para evitar se
incendie.

12. Cuando necesites encender el m e c h e r o , nunca lo hagas con un papel,

p u e d e iniciar un incendio.

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El profesor indicará el uso adecuado y la ubicación d e las instalaciones de agua, luz,
drenaje, gas, y otras que existen en el labora- torio. Se recomienda que los alumnos
realicen un croquis de dichas instalaciones y practiquen simulacros de evacuación
del edificio.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO

1. Tendrán derecho al acceso y uso de laboratorio únicamente los alumnos que

están matriculados en el curso o las personas debidamente autorizadas por la
Dirección.

2. Los alumnos respetarán el horario asignado.

3. No se permitirá la entrada al laboratorio si el alumno no se presenta con su bata.

4. Es obligación d e l os alumnos conservar en buen estado las instalaciones,

materiales y equipo del laboratorio, así como mantenerlo aseado, depositando
la basura en los cestos que para tal efecto existen.

5. El material y equipo d e laboratorio recibido deberá ser revisado de inmediato y

reportar cualquier anomalía o desperfecto al responsable de laboratorio.

6. Es obligación del alumno entregar el material y equipo usado, limpio y en buen

estado, 5 minutos a n t e s de l término de la sesión de práctica

7. El material o equipo que se deteriore o se pierda será repuesto por los

responsables en un plazo no mayor de 5 días hábiles, de lo contrario se perderá
el derecho de uso de laboratorio.

8. Sin excepción de persona, está prohibido fumar e ingerir alimentos y bebidas

en el interior del laboratorio.

9. Las prácticas se evaluarán de acuerdo al criterio del profesor

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 PRACTICA 1

BIOSEGURIDAD Y RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE

BIOPROCESOS

1. OBJETIVOS
 Establecer un protocolo de seguridad y bioseguridad a seguir para el desempeño en
forma segura y funcional en laboratorio, evitando el riesgo de accidentes, daños
físicos y la exposición a enfermedades.
 Determinar los procedimientos de bioseguridad, medidas de prevención y control
del COVID 19.

2. FUNDAMENTO

Bioquímica. Es la ciencia que estudia la base molecular de los procesos químicos que
tiene lugar en los seres vivos. Para entender los bioprocesos es necesario conocer la
composición química del organismo, sus transformaciones y los principios que los
controlan.

Microbiología industrial. Estudia la diversidad de microorganismos con potencial uso

en procesos industriales, además favorece la selección racional del tratamiento
antimicrobiano sobre la base de las pruebas de laboratorio.

Riesgos químicos. Por la manipulación inadecuada de agentes químicos se está

expuesto a: ingestión, inhalación y/o contacto con la piel, mucosas u ojos, de sustancias
tóxicas, irritantes o corrosivas.

Riesgos por patógenos

Los principales mecanismos por los que un patógeno penetra al cuerpo son:
a. Inhalación: Fundamentalmente por la inhalación de aerosoles infecciosos o
partículas contaminadas con el agente infeccioso, transmitidas por el aire.
b. Ingestión: A través de la penetración por las manos u objetos contaminados a la
vía digestiva.
c. A través de heridas en la piel. Cuando la piel se pone en contacto con superficies
o materiales contaminados.
d. Acupunción: Fundamentalmente por heridas con objetos cortantes o punzantes,
como agujas, cuchillas, etc.
e. Oftálmica: A través de derrames, salpicaduras o contactos con las manos o por
el uso de lentes de contacto contaminados.

COVID – 19: El Nuevo Coronavirus COVID-19 es una cepa de la familia de

coronavirus que no se había identificado previamente en humanos. Los síntomas
comienzan similares a los de una gripe común, malestar general, fatiga, dolores de
cabeza y/o musculares, a los que se agregan fiebre (habitualmente sobre 38°C), tos seca
y, en ocasiones, dificultad para respirar. Se estima que los síntomas del coronavirus
aparezcan entre 1 a 14 días después de la exposición al virus.

 Sanitización: Es el proceso por el cual se realiza una reducción sustancial del

contenido microbiano, hasta un nivel de seguridad, sin producir algún tipo de
infección.

6
  Termómetro infrarrojo: Es un termómetro sin contacto que permite medir la
temperatura a distancia en personas.
 Higiene de manos: Medida de higiene personal que consiste en el lavado de manos
con agua y jabón por 20 segundos o solución hidroalcohólica (alcohol en gel), para
la prevención de la propagación de numerosas enfermedades.
 Individuo Infectado: Es una persona o animal que alberga un agente infeccioso y
que presenta signos y síntomas de la enfermedad o una infección inaparente.
 EPP. Equipo de protección personal

Materiales y equipos de laboratorio de biotecnología.

Materiales
Micropipetas, pipetas Pasteur, placas Petri, Asa de siembra de microorganismos, medios
de cultivo,
Equipos.
Plancha calefactora con agitación, estufa o cámara de cultivo, horno mufla, microscopios,
espectrofotómetro uv-vis, baño maría, autoclave, centrífuga, balanza analítica.

3. METODOLOGÍA

Observe los siguientes videos.

 https://www.youtube.com/watch?v=g9cmQXjpRAI
Normas de Bioseguridad

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Protocolos de bioseguridad frente a COVID-19

a. Información en prevención de COVID-19

 dispondrá de un panel informativo y afiches, con el fin de mantener informados
a todos los participantes en temas referentes a la prevención del COVID-19,
sobre el uso obligatorio de la doble mascarilla, síntomas del coronavirus, las
buenas prácticas de higiene y lavado de manos

b. Lavado de manos obligatorio

 Lavado de manos frecuente con jabón o un desinfectante a base de alcohol por
más de 20 segundos.
 Se realizará; al ingreso, después de tocar cualquier superficie expuesta y
después de ir a los servicios higiénicos.

c. Uso obligatorio de mascarillas

 En prevención del COVID–19, se exige el uso obligatorio de la mascarilla
 Es obligatorio el uso de doble mascarilla (01 mascarilla KN95).
 No se permite mascarilla elastomérica ni con válvula.
 La obligación del uso de mascarilla se refiere también a su correcta utilización,
de modo que cubra de nariz al mentón y ajuste lo más posible a la cara por los
laterales.

7
  Todos deben portar su propia mascarilla tanto dentro de las instalaciones, como
fuera de las mismas.

d. Mantener el distanciamiento físico.

 El uso de mascarilla no exime de la obligación de mantener la distancia de
seguridad interpersonal.
 Se mantendrá el distanciamiento social
 Mantener la distancia mínima de 1.5 metros entre dos personas.
 Mantener el distanciamiento durante todo el proceso, desde el ingreso hasta la
salida.
 El material de laboratorio, será de uso personal estricto.
 Los participantes sólo podrán realizar el traspaso de cualquier bien, siempre y
cuando se proceda a la desinfección previa.

e. Control de la temperatura
 Se exigirá la medición de la temperatura antes del ingreso al laboratorio
 Las personas con temperaturas igual o mayores a 37.5 °C no podrán ingresar

f. El Aforo y ventilación

 En todos los casos los ambientes asignados permanecerán con las ventanas y
puertas abiertas.
 Las aulas estarán abiertas para ventilar al menos 15 minutos antes de la entrada
de los estudiantes. Durante las prácticas, se mantendrá una ventilación natural
cruzada de manera permanente, de ser posible, abriendo ventanas y puertas
opuestas o al menos en lados diferentes del aula.

g. Procedimiento de actuación en caso de sospecha de contagiados.

 En caso de que alguna persona presente alguno de los siguientes síntomas:
Temperatura mayor o igual a 37.5°C, tos, dificultad para respirar, o cualquier
otro síntoma relacionado a COVID, se deberá proceder de la siguiente manera:
 Será reportado a la Dirección de Escuela y derivado al Centro Médico
 Según lo evaluado por el médico se derivará al participante o médico postulante
a un establecimiento de salud para su atención.
 Si el sospechoso se encuentra estable deberá de retornar a su domicilio
 Desinfección de utensilios de uso manual, que tocó el sospechoso

4.2. Protocolos generales de seguridad y bioseguridad

Con el objeto de prevenir accidentes, se debe tener en cuenta lo siguiente:

 Ventilar el ambiente antes de ingresar, prestar atención a las indicaciones del
docente, para cada procedimiento.
 Dentro de las instalaciones utilizar su mandil blanco (guardapolvos), evitar uso
de brazaletes, aretes largos, cabellos sueltos, anillos, etc.
 Lavarse las manos con jabón, Antes y Después de cada practica
 Leer y respetar las normas de seguridad y bioseguridad, las normas de
eliminación y disposición de residuos comunes y especiales.

8
 Realizar únicamente las actividades contempladas dentro de las guías de
prácticas, trabajar con responsabilidad, orden, disciplina, siga las instrucciones
del docente.
 Mantener el laboratorio limpio, cumplir con las normas de eliminación y
disposición de residuos instalados en el laboratorio respectivo.
 No comer, beber ni fumar durante el desarrollo de las practicas
 Utilizar una pipeta por cada reactivo y marcar con un plumón indeleble que
sustancia manipula, nunca pipetea con la boca, utilizar las bombillas de succión.
 Leer con detenimiento las etiquetas de los reactivos, determine previamente su
naturaleza para los cuidados respectivos o su manipulación y en sus diferentes
formas de preparación.
 Utilizar las campanas extractoras para todos los procesos de trabajo con
reactivos.
 Evitar los desplazamientos innecesarios y no correr.
 No colocar sobre la mesa del laboratorio, ningún tipo de prenda.
 Nunca devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados
 Tanto aparatos como reactivos, estarán lejos del borde de la mesa.
 Nunca pipetear con la boca, líquidos corrosivos o venenosos.
 Mantener las sustancias inflamables lejos de las llamas de los mecheros. Si
hubiera que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca
directamente a la llama.
 Nunca mire por la boca de los tubos de ensayo o matraces cuando ocurre una
reacción.
 Al diluir ácidos, hay que echar siempre el ácido sobre el agua y con cuidado.
 Utilizar gafas y guantes en aquellas operaciones que por sus peculiaridades lo
requieran.
 En caso de que una sustancia entre en contacto con alguna parte del cuerpo:
 Con la piel, consultar la ficha de seguridad de la sustancia para conocer el
correcto procedimiento de primeros auxiliaos y algún efecto posterior.
 Proceder a remover rápidamente las prendas y accesorios contaminados,
proceder de inmediato.
 Usar inmediatamente la fuente de lavaojos por lo menos 30 minutos.
 Trasladar el paciente al aire fresco. Si no respira administrar respiración artificial
(Evite el método boca a boca). Si respira con dificultad suministrar oxígeno
mantenga la victima abrigada y en reposo. Buscar atención Médica
inmediatamente, la victima debe estar bajo observación médica mínimo las 24
horas.
 Tener en cuenta probable reacciones de los reactivos, siempre consultar a su
docente, que va a realizar, ante cualquier derrame o salpicadura de un líquido o
solido lavarse inmediatamente con abundante agua y trasladarse al centro
médico para su traslado a un especialista médico.
 Evitar arrojar desperdicios, reactivos químicos sólidos o líquidos en los
lavaderos y cañerías, previamente deben ser neutralizados o deberá ser
solubilizados con abundante agua, consultar permanentemente con su docente
de aplicarse este procedimiento.

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  Dejar ordenado y limpio la mesa de trabajo, los materiales asignados en la
práctica y los bienes que utilizo.
 Si trabaja con jeringas, no desechar las agujas sin capuchón, utilice los
dispensadores de desechos descartables.
4.3.Principales equipos de laboratorio
Cámara de extracción de gases Estufa de cultivo

5. CUESTIONARIO
1. Que se entiende por bioseguridad
2. Cómo se transmite el coronavirus
3. Indique las principales acciones que debe realizar al ingresar al laboratorio de
biotecnología.
4. Porque cree que es importante la existencia de circulación de aire en el laboratorio
de biotecnología.
5. Que deficiencias de bioseguridad observa en el laboratorio
6. Que es una cámara de extracción de gases
7. Porque es importante la existencia de una cámara de extracción en un laboratorio
8. Para que se usará el microscopio óptico

6. OBSERVACIONES
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFIA
 Funes F. et al., 2005, Bioseguridad y Seguridad Química en Laboratorio
 Lar-Villegas H. et al., 2008 Bioseguridad en el laboratorio: medidas importantes para el
trabajo seguro

10
 PRACTICA 2

SEPARACION DE AMINOACIDOS.

1. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de aminoácidos
presentes en una muestra biológica.

2. FUNDAMENTO

2.1. Aminoácidos
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida
o alcalina; este proceso rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los
cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por métodos
cromatográficos.

 Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para
formarlos son los a -aminoácidos.
 Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.
 In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
 El pKa de los grupos carboxilo y amino de los alfa -aminoácidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
 Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá
perdido un protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la
forma ZWITTERION.
 En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos
que se incorporan a las proteínas.
 Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
 Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos
modificados que se hallan en las proteínas.
 La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas,
básicas, neutras) permite una gran complejidad funcional en las
proteínas.

11
2.2. Cromatografía

Es un método de separación que permite separar, aislar e identificar componentes

estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas. En estos métodos se
emplea:
 Fase estacionaria: Sólido / líquido
 Fase móvil: liquido / gas
Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase
estacionaria por medio de una fase móvil que fluye”.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre
los componentes de la muestra.

Cromatografía en Capa Fina

La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla.
Permitiendo así identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
La cromatografía en capa fina es una cromatografía de adsorción, que tiene 2
partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria, es un sólido poroso capaz de retener solvente y
sólido pueden ser de celulosa, sílica, óxido de aluminio… etc.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de

SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

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El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de
la migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.

La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del

material en qué, la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
 Éter de petróleo
 Éter dietílico
 Ciclohexano
 Tetracloruro de carbono†
 Acetato de etilo
 Piridina†
 Cloroformo†
 Diclorometano†
 Benceno†
 Etanol
 Metanol
 Agua
 Ácido acético
 † compuestos cancerígenos.

En la elección del eluyente influyen varios factores, como. Precio, Pureza.

Se recomienda, no utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las
proporciones de los disolventes que conformen la mezcla (reproducibilidad), No
utilizar compuestos muy volátiles, Evitar que contengan trazas de metales
(catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la
polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez más polares.

La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción

de los componentes de la muestra con la superficie del sólido en la fase
estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la
polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase
estacionaria y de la polaridad de la fase móvil.

Después del desarrollo cromatográfico se aplica una etapa de revelado, ya que los
analitos son incoloros. Se utiliza la ninhidrina como agente de revelado, la cual
forma con los aminoácidos un derivado de color azul-violáceo.
La constante RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posición de un
compuesto sobre una placa, y como una fracción decimal, mide la retención de un
componente. Se define como:
RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del eluyente desde el origen
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de
la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que
los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de
la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor
de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma
placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan

13
 los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del
mismo compuesto. Por el contrario, si los RF son iguales los compuestos pueden
ser iguales o no.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma
placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una
separación mínima. En este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que
alterarían los compuestos, sino indicador ultravioleta.

Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros
estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado
por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable
para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan
por fluorescencia.
Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar
fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada
fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina.

3. Metodología.

Observe los siguientes videos.

 https://www.youtube.com/watch?v=g71IWP2O5pg
Prácticas de Química Orgánica I: Cromatografía en capa fina

 https://www.youtube.com/watch?v=IeqUkw-KZcY
Cromatografía de aminoácidos

4. Procedimiento:
4.1. Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.
 Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha
entre 1 y 2 mm de diámetro.
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.

4.2. Segundo Proceso: Elusión (fenol-agua).

 Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de
un solvente de elusión.
 Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

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  “El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.
 El solvente comienza a subir por capilaridad.
 Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarán rápidamente otros no.

4.3. Tercer Proceso: Visualización o Revelado

El producto puede verse:
 Por sí mismo porque tiene color.
 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.
 Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dónde está la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.
 Usando métodos químicos, con una sustancia química reveladora (ninhidrina
en butanol, acetona, etanol)

4.4. Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

15
 Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo
RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una

sustancia patrón en idénticas condiciones.
“La razón de estas distancias se designa por Rf”

Parte experimental:
a. Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
b. Corrida cromatográfica. Elusión
c. Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
d. Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación
cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la
parte superior de la placa.
e. Repetir el proceso con butanol-ácido acético.
f. Revelado del cromatograma
g. Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.
h. Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa
con ayuda de una secadora de cabello.
i. Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en solvente sobre la placa.
Secar la placa con una secadora.
j. Identificación
k. Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder
a aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rf de los
estándares y luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
l. Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una
coloración azul violeta.

5. Cuestionario
1. Dibuje un esquema, que represente de los resultados observados. (indicar distancias
recorridas)

16
 2. Calcular los Rf de los estándares y muestras, y complete la tabla.

Rf de patrón Rf en Muestra
Aminoácidos
patrón

3. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de intercambio

iónico y cuáles son sus aplicaciones.
4. Qué métodos existen para identificar a los aminoácidos.
5. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y alúmina.
6. Escriba el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.
7. Explique el mecanismo por el cual, se separan los aminoácidos en la cromatografía
de capa fina.
8. Explique la diferencia entre cromatografía de papel y cromatografía de capa fina
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía
 Jorrín J. et al., 2014. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina
y detección mediante reacción con ninhidrina.
 Medina M. et al., 2013 Identificación de aminoácidos libres por cromatografía de
capa fina en jugo fresco de naranja (Citrus sinensis L. Osbeck) variedad
“Valencia”

17
 PRACTICA 3

CUANTIFICACION DE PROTEINAS

1. Objetivos.
 Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en una muestra
desconocida por el método de micro-kjeldahl.
 Determinar la concentración de una solución de proteínas mediante la reacción
de Biuret por espectrofotometría.
 Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o solución que las
contenga, por diálisis.

2. Fundamento Método de micro-kjeldahl

El método de micro-kjeldahl, es una simplificación hecha por HACH en el

proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo análisis en un tiempo corto y
con pequeñas muestras.
Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las proteínas a nitrógeno
inorgánico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
 En la primera, se digiere el material por acción del ácido sulfúrico en
presencia de oxidantes fuertes (peróxido de hidrógeno), de esta manera todo
el carbono presente se libera como CO2 y nitrógeno como NH3, luego este se
combina con el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio.
 En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la acción de un
álcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solución de ácido
débil en presencia de colorante indicador.
 En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte cuantificando el
nitrógeno presente.
Luego se aplica la relación siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dónde: ml. N. fc. meq = peso de nitrógeno en la muestra
ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml)
N. normalidad del ácido
Fc. Factor de corrección del ácido
meq.= peso del miliequivalente del nitrógeno
Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples con 16% de N, el
porcentaje de proteínas será:
Proteína = 6.25xN

18
2.1 Metodología.

Observar el siguiente video

https://www.youtube.com/watch?v=Q0yT6qtj0cg
Determinación de proteínas en pasta por el método Kjeldahl

2.2 Procedimiento
El proceso de determinación se hace en tres etapas:

a. Digestión.
 Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es sólido) y colocar en el matraz
de digestión.
 Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz
 Verificar que el control automático del digestor este en 440ºC y que haya
succión en la columna de fraccionamiento.
 Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado la temperatura
indicada.
 Añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de
un embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna
incoloro, añadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se
aclare.
 Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de
fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se
haya enfriado.
 Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.

b. Destilación
 El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un balón de destilación.
 Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de ácido bórico al 4%
(en volumen) adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo,
dando una coloración violeta.
 Al balón de destilación que contiene el digesto se añade 13 a 15 ml de
hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
 Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto durante unos 10 a
20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloración verdusca y su
volumen sea más o menos 3 veces del volumen inicial)

c. Titulación.
 Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y valorizarla.
 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

19
3 Fundamento método espectrofotométrico.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción

del Biuret, reactivo que contiene CuSO4 en solución alcalina. La reacción se basa
en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares
de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos, que toma coloración violeta.

La curva de calibración para aplicar este método, se hará utilizando como patrón
solución de extracto de levadura, cuya concentración es de 8 mg/ml preparada con
agua destilada.

Espectrofotometría. Principios básicos

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert, que establece que la fracción

de luz incidente absorbida por una solución es proporcional a la concentración de
soluto y al espesor de la cubeta atravesada por la luz. Se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Donde:
E: es el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una
longitud de onda y condiciones determinadas (M-1, cm-1).
C es la concentración de la muestra a medir (M),
1 el espesor de la muestra. La mayoría de los espectrofotómetros utilizan cubetas
para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que 1 se puede ignorar.
La concentración desconocida de la sustancia será:

C = Abs /e

La Absorbancia (Abs) ó Densidad Óptica (DO) es la relación entre luz incidente

(Io) y la reflejada (I), e indica la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la
muestra.
El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una
longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir,
y de un detector que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra.
La reacción de Biuret es cuantificable, es decir a mayor concentración de proteínas,
mayor intensidad de color violeta. Por tanto, midiendo la intensidad de color se
puede conocer la concentración de la sustancia que lo produce.

20
3.1 Metodología

Observar el siguiente video

 https://www.youtube.com/watch?v=aP7cxxKWOyw
Determinación de Proteínas Totales y Albúmina

3.2 Procedimiento

Parte 1. Cuantificación espectrofotométrica de proteínas.

Realización de una curva patrón: Se construye una curva patrón, midiendo la

absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de proteína, para sobre ella
interpolar el valor de Abs de la solución problema y determinar su concentración
gráficamente y/o por regresión lineal. Para ello se dispone de una solución de 10 mg/ml
de proteína (extracto de levadura) a partir de ella se realizan diluciones conocidas
aplicando la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf
Dónde:
Ci = concentración de la solución madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial
Cf= concentración final de la solución a preparar
Vf= volumen total final de la solución a preparar

En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre (Ci=10 mg/ml) las

soluciones de la tabla.

Conc. final Volumen Volumen Volumen Volumen Abs.

Sol. a Solución agua Rx. final 570nm
preparar madre Biuret
inicial
Tubo Mg/ml ml Ml ml ml
Blanco 0 0,0 4,0 4 8
1 0,5 3,5 4 8
2 1,0 3,0 4 8
3 1,5 2,5 4 8
4 2,0 2,0 4 8
5 2,5 1,5 4 8
6 3,0 1,0 4 8
7 3,5 0,5 4 8
8 4,0 0,0 4 8
Muestra 4,0 0,0 4 8

Añadir el reactivo Biuret, dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia.

21
Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro:
 Seleccionar la longitud de onda, 570 nm (longitud de máxima absorbancia para la
reacción del Biuret)
 Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo blanco, secarla y
limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro.
 Ajustar la lectura a 100% de transmitancia y 0 de absorbancia.
 Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las soluciones
de los otros tubos, comenzando por el de menor concentración.
 Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.
 Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye una
recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abscisas
y las absorbancias en las ordenadas.
 Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su concentración.
 Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración
y que la relación es lineal (Y = A + B. Conc.). Utilizando regresión lineal se obtiene
el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar la concentración de la muestra
desconocida.

4 Cuestionario
1. Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.
2. Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas simples y dos
proteínas conjugadas
3. Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el
proceso de determinación del nitrógeno
4. Efectué los cálculos y determiné el contenido de proteínas en la muestra
5. Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante la etapa de
digestión
6. Explique el objetivo de la etapa de destilación.
7. Explique porque la titulación se hace con ácido sulfúrico y no con un álcali.
8. Indique otros métodos de cuantificación de proteínas.
5 Observaciones

6 Conclusiones

7 Bibliografía

 García E. et al., 2015 Determinación de proteínas de un alimento por el método

Kjeldahl. Valoración con un ácido fuerte.
 M. quintela et al., 2009 Optimización y revalidación del análisis de nitrógeno
por el método Kjeldahl en muestras de taurina
 Leenin Flores Ramos*a, Anthony Ruiz Sotoa 2017 Implementación de una
metodología analítica para la cuantificación de proteínas en la microalga
Arthrospira platensis

22
 PRACTICA 4

PROPIEDADES Y SEPARACION DE PROTEINAS

1. Objetivos

 Identificar las propiedades de las proteínas, solubilidad y capacidad espumante.

 Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de proteínas hidrosolubles en
solución acuosa.
 Separar proteínas de una solución acuosa por precipitación salina.

2. Fundamento

Punto isoeléctrico:

Todas las proteínas tienen una carga neta, dependiendo del pH del medio en el
que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas
de los ligandos que se encuentren unidos a la proteína.
En un medio ácido, l a s prot e í na s tienen carga neta positiva, debido a que los
grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico están en forma neutra
pero los grupos amino de Arginina y Lisina están protonados (-NH3+). En un pH
muy alto la proteína está cargada negativamente, pues los grupos carboxilo
estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra
(NH2).
Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero, y se le
denomina punto isoeléctrico (pI), en el cual la proteína puede precipitar por
disminución de su solubilidad.

Caseína:

La secuencia aminoacídica de la caseína contiene un número inusual de residuos

prolina: entre 10 en la α-s2-caseína y 35 en la β-caseína. Como resultado, las
caseínas son relativamente hidrofóbicas. Su punto isoelectrico es pH 4,6, y el pH
de la leche es 6,8, al cual la caseína cargada negativamente y solubilizada como
sal cálcica y fosfatos, esta como suspensión de micelas surfactantes (microesferas
hidrofílicas en el exterior e hidrofóbicas al interior), que se estabilizan por su carga
superficial negativa.
Es una proteína globular estable a desnaturalización por calor, fácilmente
dispersable en álcalis diluidos y en soluciones salinas como oxalato sódico y
acetato sódico.
Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se
neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.

Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

Química y física de las caseínas.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el solvente (la

ruptura de los puentes de hidrógeno, desaparición total o parcial de la envoltura

23
acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas) disminuye su estabilidad en
solución y provoca que precipite.
La desnaturalización de proteínas es la pérdida de las estructuras, secundaria,
terciaria y/o cuaternaria, quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero
sin estructura tridimensional fija.

Figura 1. Estados de una proteína.

Los agentes desnaturalizantes, pueden ser: agentes físicos, como el calor; y

químicos, como, detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica, etc. En
algunos casos la desnaturalización es reversible, y se puede usar para precipitar
proteínas de manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente, la
fuerza iónica, el pH, la temperatura.

La precipitación salina es una técnica que precipita una fracción de proteínas por el
aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a
una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-H2O porque quita la
capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y haciendo que
precipiten. La concentración salina para producir precipitación no es igual para
todas las proteínas, lo que permite usar esta propiedad para separar proteínas a partir
de mezclas. Para ello, se suele usar sulfato de amonio (NH4)2SO4, por su gran
solubilidad (760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a 20°C) y porque el ion
sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. La adición gradual de esta
sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son
precipitadas, pero no desnaturalizadas.

Propiedades funcionales de proteínas en alimentos.

La funcionalidad de las proteínas son sus propiedades físicas y químicas que

afectan su comportamiento. Dos principales propiedades funcionales en los
alimentos son la emulsificación y la espumación.
 Las emulsiones pueden contener agua, aceite y proteína, y pueden ser
alteradas por: el pH, las sales, la temperatura, el tipo y cantidad de grasa.
La concentración de proteínas, el aporte de energía y la temperatura afectan
las propiedades de la emulsión. La estabilidad de emulsión se ensaya
determinando la cantidad de grasa que puede separar.
 Las espumas son dispersiones de burbujas de gas en una fase líquida, que
requieren aporte de energía y gas para su formación. El volumen de la

24
 espuma depende de la capacidad de una proteína para bajar la tensión
superficial entre la fase acuosa y las burbujas de gas. También dependen
del aporte de energía, del pH, de la temperatura, y del tipo y concentración
de iones, los azúcares, los lípidos y las proteínas presentes en la espuma.
Los parámetros utilizados para evaluar las espumas son volumen y
estabilidad. Se anota el volumen de espuma generado durante la
espumación, y el esponjamiento o expansión de la espuma se calcula como:

(peso 100 mL líquido − peso 100 mL espuma)

𝐸𝑠𝑝𝑜𝑛𝑗𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) =
(peso de 100 mL de líquido)

La estabilidad de la espuma depende de las propiedades de la película de

proteína formada alrededor de las burbujas de gas.

Espuma en clara de huevo.

La clara de huevo está compuesta por agua y proteínas

(fundamentalmente ovoalbúmina), que coagula a 65ºC tornándose de color blanco,
y al batirse atrapa burbujas de aire y aumenta de volumen tomando consistencia
semisólida, conocido como punto de nieve.

Mecanismo de formación de espuma.

El batido, introduce aire y produce un flujo en la matriz acuosa que puede

desenvolver los ovillos menos estables de proteína, haciéndolos perder su estructura
original y presentar al exterior las zonas hidrófobas. Las proteínas así
desnaturalizadas se ubican en la interfaz agua-aire orientando sus zonas apolares
hacia el interior de la burbuja y sus zonas polares hacia la matriz acuosa; esto reduce
la tensión superficial de la burbuja actuando como surfactante.

Al inicio del batido se forma una espuma de burbujas grandes y poco estables,
surfactadas principalmente por las ovomucinas (proteínas de la clara que más
fácilmente pierden su estructura globular). Si el batido prosigue se incorporan a la
capa surfactante ovoglobulinas y ovotransferrinas, las burbujas se hacen cada vez
menores y aumenta la extensión de la interface.

Al perder las proteínas su estructura de ovillo, muchos enlaces débiles que la

mantenían, quedan libres y tienden a rehacerse, luego al encontrarse con otras
moléculas proteínicas entremezcladas en la capa surfactante, algunos de estos
enlaces se rehacen, asociando muchas moléculas en una red proteínica continua
que estabiliza la espuma. En este punto, es importante el papel de la conalbúmina,
que no es surfactante, pero al oxidarse con el oxígeno de las burbujas se asocia con
las proteínas surfactantes conectando burbujas vecinas y fortaleciendo la red.

25
Si continúa el batido durante mucho tiempo o con una potencia excesiva, la
apertura de enlaces prosigue y las proteínas vecinas se asocian tan estrechamente
que expulsan el agua contenida en la red y la espuma queda seca y poco flexible,
haciendo difícil su mezcla con otros componentes. Si se prosigue el batido,
aparecen gránulos de proteína rígidos que supuran líquido.

Factores que afectan la espumabilidad.

 A temperatura ambiente espuma mejor que una fría, pues la baja

temperatura dificulta la desnaturalización de las proteínas. Sin
embargo, en frío es más fácil separar claras y yemas. Por tanto, se
recomienda separar claras y yemas en frio y dejar templar antes de
batirlos.

 El pH original de la clara de huevo es ligeramente alcalino, que facilita

la formación de enlaces disulfuro por unión de grupos SH de diferentes
las moléculas de proteína, reforzando la red, y en caso de sobre batido
estos enlaces causan rigidez de la espuma y de la aparición de grumos.
Por eso, el batir las claras con medios mecánicos, conviene acidificarla
ligeramente, para que los grupos sulfuro se saturen con protones
tomando la forma de –SH, en vez de formar puentes disulfuro. Así, la
espuma queda suave y cremosa siendo fácil de mezclar con otros
ingredientes.

 Tradicionalmente se afirma que la clara a punto de nieve queda mejor

formada si se utiliza un recipiente de cobre; lo cual se explica porque
los iones de cobre se asocian también con los sulfuros, formando –
SCu, con efectos similares a los de la acidez, pero comunica algo de

26
 sabor y un ligerísimo tinte verdoso a la espuma.

 Adición de sal
Los iones de la sal al disolverse en la matriz acuosa bloquean la formación
de enlaces intermoleculares incluso a baja concentración, e impiden que
consolide la red proteínica disminuyendo la espumabilidad y la
persistencia.

 Adición de azúcar.
El azúcar si se añade al principio dificulta la formación de espuma
bloqueando la formación de enlaces intermoleculares, de modo parecido a
la sal. Si se añade cuando la espuma está levantada la hace espesar,
retrasando el drenaje y mejorando la persistencia.
Si se bate la clara a mano es indispensable no añadir azúcar al principio del
batido, pero si se bate con medios mecánicos el efecto no es importante.

 Frescura de los huevos.

Los huevos al envejecer se alcalinizan debido a la pérdida del CO 2 de la
matriz acuosa a través de los poros de la cáscara, la clara puede pasar de un
pH 7,5 a uno de 9. Comienzan a deshacerse los agregados de la clara
viscosa y las proteínas se repelen volviéndose más transparente y fluida.
Estos cambios afectan su espumabilidad: por un lado, las proteínas se
desnaturalizan mejor y la clara se espuma más fácilmente; pero la pérdida
de viscosidad favorece el drenaje y la espuma es menos firme y estable.

 Presencia de grasas y detergentes.

Las grasas compiten con las proteínas surfactantes en la interfaz agua-aire
de las burbujas y bloquean la formación de enlaces entre proteínas
debilitando la red de la espuma. Los detergentes o los lípidos polares que
son surfactantes, debilitan la espuma pues interfieren su acción.

3. Materiales y reactivos
a. 13 tubos de ensayo de 10 X 150 mm, Balanza analítica
1 pipeta de 10 ml, 5 pipetas de 5 ml, 1 pipeta de 5 ml, 1 gradilla
Caseína, agua destilada.
b. Probetas de 25 mL, Embudos
c. Claras de huevo, Azúcar común, Jugo de limón, Yema de huevo, Batidora,
Recipiente para el batido. Licuadora

4. Metodología

Observar el siguiente video

 https://www.youtube.com/watch?v=IGmLeWXn5M8
Estabilización de las Espumas y Punto de nieve

27
5. Procedimiento.

4.1 Solubilidad de la caseína.

Se provoca cambios de solubilidad en proteínas, mediante la modificación de las
propiedades de los solventes.

a. Aislamiento de la caseína:
 Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitado y mida el pH.
 Agregue lentamente ácido acético 1M, gota a gota agitando hasta
obtener un pH de 4,7. Registre las observaciones del efecto del pH sobre
las propiedades de la leche (suspensión de proteínas en agua).
 Pese el papel de filtro y filtre al vacío usando un embudo Büchner (al
vacío). Determine el peso de las caseínas (después de la filtración).
Tenga en cuenta este peso para determinar la concentración de caseínas
totales en la leche (%).
 Mida el volumen del sobrenadante y téngalo en cuenta para determinar
el porcentaje de las proteínas de la leche que son solubles a pH 4.7.

b. Preparación de la solución de caseína:

 Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50 ml.
 Agregue 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta
lograr una solución total de la caseína.
 Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml,
adicione 5 ml de ácido acético 1N, diluya con agua destilada hasta 50
ml y mezcle bien.
 La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.
4.2. Determinación de las proteínas totales en la leche.
 En un tubo de ensayo tome 1,5 mL de agua destilada y adicione 1,5 mL
del reactivo de Biuret. Mezcle bien y calibre el espectrofotómetro.
 En otro tubo de ensayo adicione 1,5 mL de leche y 1,5 mL del reactivo
Biuret, mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de
calibración que obtuvo en la práctica anterior.
 Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones
hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de
calibración. Para realizar las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2, y
anote los datos de las diluciones para calcular la concentración de las
proteínas totales de la leche.
4.3. Fraccionamiento de las proteínas de la leche.
Precipitación salina de las proteínas solubles (presentes en el sobrenadante).
 Tome 1,5 mL de la solución de sulfato de amonio saturada y mézclela
con 1,5 mL del sobrenadante (proteínas solubles).
 Centrifugue y observe si se forma un pellet. Pese el pellet y mida el
volumen del sobrenadante.

4.4. Capacidad espumante de proteínas.

 Separar la clara de la yema de 4 huevos. Agitar suavemente las claras
para homogenizar sin provocar espumado.

28
  Pesar 30 g de clara y 10 g de agua destilada (control)
 Colocar todo en el recipiente y batir con batidora a velocidad 3 durante
3 minutos.
 Colocar la espuma formada dentro del embudo y éste a su vez dentro de
la probeta.
 Medir el volumen escurrido a diferentes tiempos (5, 10, 15 y 20
minutos).
 Tomar una pequeña muestra y observar al microscopio a tiempo 0 y 20
minutos. Hacer foco utilizando un aumento de 10X y tomar foto.

Repetir el ensayo para las siguientes muestras:

a) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar al inicio
b) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar a los 2 minutos de
batido
c) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de sal al inicio
d) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de yema al inicio
e) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de limón
Calcule la expansión o esponjamiento de las espumas obtenidas a tiempo
0.
Realizar una gráfica de volumen escurrido (ml) versus tiempo (min) para
las diferentes muestras y analizar los resultados.
Comparar la distribución de tamaño de burbujas.

Aditivos Volumen escurrido en tiempo

(min)
Agua Otro 5 10 15 20
Clara
10 0
30
10 25 g azúcar a tiempo 0
30
10 25 g de azúcar a 2 min
30
10 2 g de sal al inicio
30
10 2 g de yema al inicio
30
10 2 g de limón.
30

5. Cuestionario

1. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca, en la caseína la

adición de un ácido o una base, y la relación con su PI.
2. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.
3. ¿Qué otros métodos, diferentes a la precipitación salina, se pude usar para la
precipitación de proteínas?
4. Investigue la composición química y el pI de la clara de huevo y explique su
comportamiento con respecto a la formación de espuma.

29
 5. Como afectan la temperatura, el pH y las sales en las propiedades espumantes de
las proteínas.
6. Como afectan el azúcar (es) y la presencia de grasas en las propiedades
espumantes de las proteínas.
7. Señale las principales técnicas de separación de solutos por membrana, y las
principales aplicaciones de cada una de ellas.
8. Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solventes por
osmosis.
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 González J. et al., 2010 Propiedades funcionales de las proteínas del huevo de

codorniz y contenido nutrimental

30
 PRACTICA 5

EXTRACCIÓN DE ALMIDON NATIVO DE PAPA

1. Objetivo

Obtener almidón nativo a partir papa

2. Fundamento

La papa o patata (Solanum tuberosum), es una especie herbácea perteneciente al

género Solanum de la familia de las solanáceas, originaria del altiplano sur del Perú.

Las células del tubérculo contienen granos de almidón (leucoplastos), llamado chuño o
el almidón de papa. Para extraerlo, las patatas se machacan, liberando los granos de
almidón de las células destruidas, luego se lava, decanta y seca para obtener un polvo.

Este almidón contiene típicamente grandes gránulos ovales a esféricos, cuyo tamaño
oscila entre 5 y 100 μm. El almidón de patata es muy refinado, conteniendo una
cantidad mínima de proteína y grasa. Esto da al polvo un color blancuzco, teniendo el
almidón cocido características típicas como el sabor neutral, buena claridad, alta fuerza
cohesionadora, textura larga y mínima tendencia a formar espuma o amarillear la
solución. Este almidón contiene aproximadamente 800 ppm de fosfato enlazado, lo que
incrementa la viscosidad y da a la solución un ligero carácter aniónico, una baja
temperatura de gelatinización (aproximadamente 60 °C)1 y un alto poder de hinchazón.

El almidón está formado por dos polímeros: la amilosa y la amilopectina. La amilosa es

un polímero lineal que presenta un arreglo helicoidal en el espacio y consiste en más de
6000 unidades de glucosa enlazadas mediante uniones glucosídicas α-1,4. Según el
origen del almidón, su contenido de amilosa es de 15 a 25%. Por otro lado, la
amilopectina está formada por cadenas lineales de aproximadamente 10 a 60 unidades
de glucosa, unidas por enlaces α-1,4 y cadenas laterales de 15-45 residuos de glucosa
unidas mediante enlaces α-1,6. La molécula completa de amilopectina contiene
aproximadamente 2 000 000 unidades de glucosa, lo que la convierte en una de las más
pesadas en la naturaleza y se encuentra en una proporción de 75 a 85% (van der Mareel,
et al., 2002).

31
 Propiedades fisicoquímicas de amilosa y amilopectina

Dextrina
Es un polímero intermedio entre el almidón y la dextrosa, se presenta como un sólido
amorfo color crema hasta marrón, soluble en agua fría e insoluble en alcohol. Para
obtener una dextrina se debe calentar el almidón teniendo usando catalizadores ácidos
o alcalinos, o mediante el uso de enzimas, de modo que la molécula no se degrada
totalmente. Al reducir a dextrina se presentan cambios notorios como un aumento de
la solubilidad en disolvente frio (agua) y un descenso en la viscosidad. Las dextrinas
se pueden obtener mediante dos rutas: vía húmeda y vía seca, todo depende de lo que
se dese obtener
 Vía Húmeda. Esta vía consiste en dispersar en agua el alimón y calentarlo en
presencia de enzimas o catalizadores ácidos o alcalinos.
Las dextrinas obtenidas por esta vía son del grupo de las maltodextrinas, cuyo
principal uso es en la industria de alimentos.
 Vía Seca. Esta vía consiste en calentar el almidón, pero con pequeñas
cantidades de catalizador, son conocidas como dextrinas de torrefacción o
pirodextrinas. Al calentar el almidón se presentan cambios irreversibles en el
proceso, debido a que hay ruptura hidrolítica, generando una repolimerización
y son conocidas como pirodextrinas.

32
 Se presentan dos principales cambios, los cuales son las características principales de
estos procesos. El primero es el tamaño de la molécula y el segundo es un cambio en
el grado de linealidad. Cada cambio mencionado tiene efectos claros y concretos en
las características físicas y químicas de la dextrina. Teniendo en cuenta que se genera
una variación en el peso molecular, que influye en la viscosidad de la dextrina,
mientras que la solubilidad se ve afectada por el cambio en la linealidad de la estructura
molecular.
En la figura N°4, se presenta un esquema del hidrolisis y repolimerización durante la
dextrinización del almidón. Estas propiedades están altamente influenciadas por el
origen del almidón y las condiciones del proceso de extrusión.
Figura 4. Hidrólisis y repolimerización durante la dextrinización del almidón.

Fuente: Aristizábal, Johanna., Sánchez, Teresa. Y Mejía, Danilo.2019

Ensayo con Lugol. El yodo es atrapado por el almidón y dependiendo de su estructura,

da una coloración característica; si el polisacárido es lineal se obtendrá una coloración
azul, pero si es ramificado, la coloración obtenida va de púrpura al rojo. Es posible
analizar la presencia de almidón, basándose en la capacidad de amilosa a formar
complejos coloreados con el yodo. El reactivo de Lugol contiene una mezcla de yodo y
yoduro, y permite reconocer polisacáridos por la formación de una coloración azúl-
violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja. El ensayo
con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis del almidón, donde la
coloración va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular del
compuesto orgánico

3. Materiales y reactivos

Para extracción de almidón

 01 Kg de papa, licuadora, tela, vaso de precipitados.
Para reacciones de cuantificación.
 Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)
 Fenol en agua al 80% en peso: 3.2 g fenol más 0.8 ml de agua.
 Solución problema, jugos de frutas.
 Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO4◦5H2O en 500 ml de agua)

33
  Solución de Fehling B (Disolver 173 g de tartrato doble de sodio y potasio y 50
g de hidróxido de sodio en agua y diluir a 500 ml, dejar reposar dos días y
filtrar).
 Azul de metileno (0.2%)
 Solución patrón de glucosa al 1%
 Solución de acetato básico de plomo al 30%
 Oxalato de sodio o potasio en polvo
 Solución de HCl 1:1 9. Solución de NaOH 6 N.

4. Metodología

Observar el siguiente video

 Extracción de almidón
https://www.youtube.com/watch?v=XSOSWRhkH9w
 Planta de almidón
https://www.youtube.com/watch?v=Z496gBscdq8

5. Procedimiento
4.1 Ensayo del Almidón frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%, añada una gota
de solución de Iodo - lodurada, observe el color de la solución. Luego caliente la
solución coloreada a ebullición y observe el efecto, observe también qué efecto
produce el enfriamiento de la solución.
4.2 Cuantificación de azucares totales (reductores y no reductores)
Existe varios métodos colorimétricos que utilizan distintos reactivos como antrona,
fenol, orcinol o resorcinol, pero el más utilizado es el de DuBois et al. debido a la
facilidad, sensibilidad, rapidez de los resultados y por ser apropiado para cuantificar
diferentes azúcares como monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
En la reacción de fenol-ácido sulfúrico ocurre una sulfonación in situ del fenol, el
ácido fenolsulfónico formado es capaz de disminuir la intensidad de color del HMF.
Si el ácido sulfúrico se agrega primero a la solución de carbohidratos para hacer la
hidrólisis, seguido por adición de fenol, se genera una reacción colorimétrica a
longitud de onda de 490 nm.
A la solución de carbohidratos se adiciona el ácido sulfúrico concentrado, seguido
inmediatamente por fenol al 5 %, la mezcla se deja en incubación a 90 °C por 5 min
y se somete a enfriamiento en baño a 25 °C por 5 min.
Para todos los casos, se construye una curva de calibración para hallar
equivalencias, y se realizan los ensayos por triplicado para obtener valores
promedios.

4.3 Metodología de Extracción del almidón.

El procedimiento sigue los pasos del diagrama N° 1.
 Lavado. Se elimina la tierra e impurezas adheridas,lavando con agua destilada
 Pelado. En esta etapa se procede a retirar la cascara de 1000 gramos de papa.
 Molienda húmeda. Las papas limpias, se fragmentan para desintegrar el tejido
amiláceo y liberar los gránulos de almidón. Se utiliza una licuadora a máxima

34
 velocidad 4 minutos, en proporción 1:3 papa:agua, con la tercera parte de
capacidad del vaso
 Utilizar bisulfito de sodio disuelto en el agua de molienda húmeda para evitar
fermentación. Colectar el licuado dentro de un depósito.
 Filtración. Se realiza la separación de la pulpa o material fibroso de la lechada
de almidón, mediante filtración sobre una malla de nylon de 120 micrones.
 Sedimentación. Consiste en precipitar el almidón mientras este se encuentra en
movimiento. Los materiales más livianos (fibras, impurezas, etc.) no sedimentan
y estos son los que salen con las aguas residuales. Cuando se desea acelerar el
proceso, se toma la lechada de almidón filtrada y se deposita en tubos Falcón para
ser centrifugados a 6000 rpm, 15°C, durante 15 minutos,
 Secado. El almidón obtenido, forma una masa compacta con alto contenido de
humedad, y se busca deshidratar por calor a 50°C.
 Pulverizar el almidón seco sometiéndolo a molienda en licuadora Osterizer,
utilizar la cuarta parte de la capacidad del vaso de la licuadora, a velocidad
máxima durante 4 minutos aproximadamente. Tamizar el producto obtenido en
malla N° 100, guardar el almidón en frasco de vidrio hermético y rotular el frasco

Figura N°1 Extracción del almidón.

4.4. Eficiencia de la extracción

Pesar el almidón extraído, y determinar la eficiencia de extracción.
5. Cuestionario
1. Determine el porcentaje de rendimiento del almidón de papa.
2. El almidón de yuca contiene teóricamente, 16,7% de amilosa y 83% de
amilopectina. ¿En el laboratorio como lo comprobaría?
3. Defina usted 3 ventajas de los almidones modificados e hidrolizados.
4. Según las tendencias actuales en que transformaría usted al almidón, describa

35
 los métodos de caracterización del almidón de papa.
5. ¿Cuál es la importancia de la amilosa y amilopectina en los almidones? ¿Influye
esto en su utilización industrial?
6. ¿Cómo podría medir en forma cualitativa, a nivel de laboratorio, el poder
reductor del almidón al ser sometido a hidrólisis acida?
7. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras de almidón?
8. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis del almidón?
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 Ávila Núñez, Ramona; Rivas Pérez, Bernarda; Hernández Motzezak, Rómulo;

Chirinos, Marluy. Contenido de azúcares totales, reductores y no reductores en
Agave cocui Trelease. Multiciencias, vol. 12, núm. 2, abril-junio, 2012, pp. 129-
135 Universidad del Zulia Punto Fijo, Venezuela.
 Jiménez Ramos Edén y Martínez De La Cruz Silverio. Obtención y
caracterización fica y química del almidón de yuca (Manihot esculentum)
variedad Guayape. 2021.
 NMX-F-312-1978. Determinación de reductores directos y totales en alimentos.
Normas mexicanas.
 Rey Cespedes, Jaime Alejandro. Desarrollo de un sistema piloto de separación
de harina de yuca por vía húmeda para la producción de almidón. 2013.
 Xiomara López-Legarda, Andony Taramuel-Gallardo, Carolina Arboleda
Echavarría, Freimar Segura-Sánchez, Luis Fernando Restrepo-Betancur
xiomara. Comparación de métodos que utilizan ácido sulfúrico para la
determinación de azúcares totales. Rev. Cubana Quím.Vol. 29, no.2, mayo-
agosto, 2017, págs. 180-198, e-ISSN: 2224-5421.

36
 PRACTICA 6
OBTENCIÓN DE PLASTICOS BIODEGRADABLES A PARTIR DE ALMIDÓN

1. Objetivo.
 Obtener una película biodegradable a partir de almidón de yuca y realizar su
caracterización física, mecánica y de biodegradabilidad.

2. Fundamento

Problemática.

El consumo mundial anual de los plásticos sintéticos provenientes del petróleo es más
de 200 millones de toneladas, con un incremento anual de aproximadamente 5%
(Siracusa et al., 2008). La alta resistencia a la corrosión, al agua y a la descomposición
bacteriana los convierte en residuos difíciles de eliminar convirtiéndose en un problema
ambiental.
En los últimos años se busca desarrollar y usar bioplásticos, que son materiales
biodegradables producidos de recursos renovables y en algunos casos presentan
propiedades similares a los plásticos de petróleo.
La biodegradabilidad de un material depende de su estructura química por lo que
existen bioplásticos no degradables. La ASTM D5488-944, define la biodegrabilidad
como la capacidad de un material de descomponerse en CO 2, metano, agua y
componentes orgánicos, o biomasa, donde el mecanismo predominante es la acción
microbiana.
Los biopolímeros se dividen en 3 grandes grupos según su origen: a) Polímeros a partir
de biomasa (polisacáridos y proteínas) como el almidón, celulosa, caseína y gluten, b)
Polímeros a partir de síntesis química utilizando monómeros obtenidos a partir de
recursos naturales como Bio-poliester y ácido poliláctico (PLA) c) Polímeros obtenidos
a partir de microorganismos como el PHA y PHB (Sprajcar et al., 2012)
El almidón es un polímero prometedor para elaboración de películas biodegradables
debido a que es económico, de alta disponibilidad y se obtiene de fuentes naturales. Sin
embargo, sus películas tienen varias limitaciones como: propiedades mecánicas pobres,
alta permeabilidad al vapor de agua, tendencia a la retrogradación, alta rigidez, son
quebradizas, entre otros. Por ello se debe añadir sustancias que puedan contrarrestar
dichas limitaciones, con el fin de obtener películas más parecidas a las sintéticas.

2.2. Otros componentes.

 Agua destilada.
Es un solvente que permite mezclar las sustancias. Sirve como plastificante para
desestructurar el almidón en la mezcla, produciendo almidones termoplásticos. Está
libre de impurezas e iones.
 Glicerol
Es un alcohol con tres grupos hidroxilo, soluble en agua, actúa como lubricante y
facilita la movilidad de las cadenas poliméricas del almidón. Es el plastificante más
usado, hace que el producto final incremente su permeabilidad al vapor.
 Pectina
Es un complejo aniónico, polisacárido de β-1,4-D– ácido galacturónico. Puede ser
pectina de alto metoxilo (HMP) o de bajo metoxilo (LMP); la HMP forma
excelentes películas. La mezcla de plastificante de pectina cítrica y almidón de alta

37
 amilosa dan estabilidad y flexibilidad a la película, la cual es térmicamente estable
sobre 180 °C.
 Almidón termoplástico (ATP)
Los plastificantes atraen las moléculas de agua a su alrededor, reduciendo las
interacciones intramoleculares entre moléculas del almidón, e incrementan la
flexibilidad del mismo (Ke, T.; & Sun, X. 2001). Durante la plastificación, el
almidón se transforma de un material granular semicristalino a un sistema con restos
de gránulos en una pasta amorfa (Smits, A. L. M. et al.,2003).
Los plastificantes más usados son: el agua, alcoholes como glicerol o sorbitol,
amidas funcionalizadas como urea y formamida, el dimetil sulfóxido y algunos
azúcares de bajo peso molecular. Los plastificantes son moléculas pequeñas e
hidrofílicos. (Ma, X.; & Yu, J. 2004).
El agua y el glicerol son plastificantesefectivos. Un mínimo de 20% de glicerol u otro
es necesario para plastificar el almidón. Al incrementar la cantidad del plastificante,
las propiedades del ATP, como la resistencia a la tensión, el módulo de Young y la
temperatura de transición vítrea (Tg), disminuyen; mientras que la elongación y la
permeabilidad, aumentan (Pushpadass, et.al., 2008).
El ATP es un producto muy hidrofílico y a veces es necesario un procesamiento
adicional del almidón para reducir este carácter. Este problema puede ser superado
mediante mezclas con polímeros hidrofóbicos, que protejan al almidón de la
humedad; o bien, a través de la modificación química de los grupos hidroxilo libres,
que sufren fácilmente reacciones tales como acetilación, esterificación y
eterificación, que reducen la hidrofilicidad del almidón (Tang, X. Z.; Kumar, P.;
Alavi, S.; & Sandeep, K. P. 2012).

 Desestructurantes

Bastioli 1994, reporta que los agentes desestructurantes se agregan exclusivamente

al almidón para “desbaratar” su estructura, mejorar su procesabilidad y su unión
con otros polímeros. La presencia de agua en el almidón “desestructurado” limita
la unión con otros polímeros para formar mezclas con características deseadas. La
mezcla sólo puede ser extruída o procesada a bajas temperaturas y bajas presiones.
Por esta razón se utiliza un agente desestructurante, pues esta sustancia interrumpe
los puentes de hidrógeno formados por la amilosa y la amilopectina, permitiendo
que el porcentaje de agua empleado para procesar el material sea menor, así como
la energía necesaria para el proceso.
La úrea es el agente desestructurante más común. Su presencia en la matriz
amilácea permite que la estructura cristalina del almidón sea destruida con ayuda
de pequeñas cantidades de agua. También sirven los hidróxidos alcalinos y
alcalinotérreos (Bastiolli et al, 1995) y algunos ácidos grasos (Halley, et al, 2006).
Es preferible que su adición sea entre el 2 a 7 % del peso del total de la composición
de la mezcla.

 Aditivos.

Entre ellos están los estabilizantes contra rayos ultravioleta (UV), sustancias
ininflamables, fungicidas, herbicidas, antioxidantes, fertilizantes, estabilizantes, y
otros. Se reporta el uso de materiales como talco, mica, dióxido de titanio, óxido de
aluminio, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, hidróxido de calcio, dióxido

38
 de titanio, cerámicas, sílica gel, minerales naturales, entre otros, en concentraciones
de 0,05 a 5 % del peso de la composición.
Estos aditivos, reducen la capacidad de la amilosa para formar complejos y sus
efectos hidrofílicos (como formación de puentes de hidrógeno) (Bastiolli et al,
1995). Algunas arcillas retardan la formación de cristales del almidón logrando que
los materiales se mantengan amorfos, lo cual incide en la transparencia del material
y mejora la elongación al momento de ruptura del material (Halley et al, 2006). Los
inhibidores microbianos se utilizan para atenuar la biodegradación de la matriz
polimérica. Algunos son de origen natural como aceites esenciales (Denesuk,
2004), o el sorbato de potasio (Famá et al, 2007). El porcentaje de aditivos suele
estar entre 0,005 % y 1 % del peso de la mezcla.

Procesamiento de películas

Las formas de procesamiento más comunes de biopelículas basadas en almidón son:

 El moldeo
Efectuar el moldeo, el almidón, el plastificante y algunos polímeros se dispersan en
una cantidad de agua de 5 a 15 veces el peso del almidón y la suspensión resultante
se calienta con agitación constante, se moldea como película y se seca de manera
adecuada. El calentamiento se hace con el fin de gelatinizar el almidón, fundir otras
sustancias y remover burbujas que pueden afectar la calidad final de la película.

 La extrusión.
El almidón se mezcla con agua y plastificante hasta formar una matriz que sea
procesable y pueda ser mezclada con otros polímeros. Se hace el calentamiento de
las diversas zonas del barril y el compuesto es extruido a través de un dado, en
forma de ranura, a las temperaturas necesarias para lograr la gelatinización del
almidón.

3. Materiales y reactivos

Vasos de precipitación de 100 mL

Vaso de precipitación de 250 mL
Estufa
Malla de serigrafía
Agitador magnético
Calibrador pie de rey de 30 cm de longitud
Recipiente de vidrio de 20 de ancho x 30 de largo
Ácido acético 30% v/v CH3COOH (Ac. Ac.)
Almidón de yuca
Glicerina C3H8O3
Estufa
Filtro o matiz
Cacerola
Espátula
Licuadora
Balanza

39
4. Metodología.

Observar el siguiente enlace:

 https://www.youtube.com/watch?v=t7G16XhOzk4
Elaboración de Biopelículas a base de almidón de yuca

5. Procedimiento

Formación de la biopelícula.

Pesar 18 g de almidón en un vaso de precipitación de 400 mL. Adicionar 200 mL de

agua destilada, y 6 mL de ácido acético diluido (5,2 N/ 30% v/v). Agitar por 15 minutos
y medir el pH de la muestra. Con agitación constante agregar la glicerina, según el
porcentaje requerido. No dejar que la solución plastificante llegue a los 90°C puesto
que a esta temperatura se carboniza el polímero (plástico).
Finalmente agitar con calentamiento en baño maría hasta 65ºC y mantenerla por 15
minutos. Vaciar la mezcla viscosa en un molde de vidrio, y llevar a secado en estufa a
60°C por 10 horas, desprender la película cuando tenga una contextura sólida que pueda
desmoldarse con facilidad.

Diagrama de flujo de la obtención de bioplásticos

Fuente:
Parra

Joselyne. 2019.

Prueba 1:
a. Colocar en un vaso de precipitados 8 g de almidón. Agregar, mezclando
bien, 64 ml de agua destilada (50 - 70 °C) y 4 ml de glicerina.
b. Mantener aproximadamente 10 minutos en baño maría, en hervor, agitando
continuamente, hasta que la mezcla quede viscosa. Adicionar ácido acético
4 ml, para disminuir la viscosidad.
c. Verter la mezcla.

40
 d. Secar a temperatura ambiente

Prueba 2:
a. Colocar en un vaso de precipitados 4 g de almidón. Agregar, mezclando
bien, 68.8 ml de agua destilada (50 - 70 °C) y 4 ml de glicerina.
b. Mantener aproximadamente 10 minutos en baño maría, en hervor, agitando
continuamente, hasta que la mezcla quede viscosa. Adicionar vinagre 4 ml,
para disminuir la viscosidad.
c. Verter la mezcla.
d. Secar a temperatura ambiente

Caracterización de las películas

Luego de la obtención de las películas biodegradables se procede a caracterizarlas.
a. % Humedad. Norma INEN 1462.
La humedad se determina pesando las películas secadas al ambiente y
posteriormente colocándolas en la estufa con circulación de aire a 105 °C
durante 5h.

𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐈𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐏𝐞𝐥𝐢𝐜𝐮𝐥𝐚−𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐅𝐢𝐧𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐏𝐞𝐥𝐢𝐜𝐮𝐥𝐚

b. %𝐇𝐮𝐦𝐞𝐝𝐚𝐝 = 𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐟𝐢𝐧𝐚𝐥 𝐝𝐞 𝐥𝐚 𝐩𝐞𝐥𝐢𝐜𝐮𝐥𝐚
∗ 𝟏𝟎𝟎

c. Solubilidad en agua.
Las películas secas se colocan en 80 ml de agua destilada con agitación de
100 rpm durante una hora, posteriormente se filtra y se coloca en la estufa a
40 ºC hasta que esté seca y luego a 105 ºC hasta que tenga un peso constante.

𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐈𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥 𝐒𝐞𝐜𝐨−𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐅𝐢𝐧𝐚𝐥 𝐒𝐞𝐜𝐨

d. %𝐒𝐨𝐥𝐮𝐛𝐢𝐥𝐢𝐝𝐚𝐝 = ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝐏𝐞𝐬𝐨 𝐈𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥 𝐒𝐞𝐜𝐨

e. Espesor de la película
Se utiliza un micrometro, con una resolución de 0,002 cm, se obtienen 10
medidas aleatorias y se registra el promedio de las mismas. En la
determinación del espesor de las películas se aplica la adaptación de la
Norma INEN 891.

f. Biodegradabilidad. Norma ASTM D-5488-94D)

Este análisis se fundamenta en la pérdida de peso de las películas vía
anaeróbica y aeróbica en periodos de tiempo: 4, 10, 15, 20 días. Se evalúa
por el método gravimétrico, con exposición de 10 días, y se evalúa la
pérdida de peso cada dos días en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
Biodegradación aeróbica (en presencia de oxígeno): con producción de
biomasa, dióxido de carbono, agua y minerales.
Biodegradación anaeróbica (ausencia de oxígeno): los productos
usualmente resultantes son biomasa, biogás (principalmente metano), agua,
metabolitos intermedios y minerales.
g. Ensayo de tracción
Este ensayo mide la resistencia de un material a una fuerza estática o
aplicada lentamente. Tracción en un solo sentido con la norma ASTMD-
882. Velocidad: 500 mm/min ‘'Gauge Length'': 48,70 mm. Separación entre
mordazas: 48,70 mm Temperatura de ensayo: 18°C

41
 h. Módulo de elasticidad
La medida en las tablas es el módulo de Young, que es la relación entre
tensión (esfuerzo) y extensión (deformación)
𝐅∗𝐥
i. = 𝐀∗∆𝐥𝟎
Donde:
F: es la fuerza perpendicular
A: área transversal
l: deformación
Lo: es la longitud del plástico

6. Cuestionario

1. Que propiedades deben ser controladas en los materiales biodegradables para

conseguir un sistema de envasado similar a los utilizados con polímeros de uso
común.
2. Por qué el almidón se considera un principal polímero biodegradable para films.
3. Indique cual es la diferencia entre biodegradabilidad y compostabilidad.
4. Por qué que se agita a 70°C el almidón por 10 minutos.
5. ¿Qué función cumple la adición de ácido acético?
6. Indique cual sería la influencia de adicionar aceites esenciales sobre las propiedades
de físicas y mecánicas de los films obtenidos
7. Mencione los tipos de moldeo que se utilizan para la obtención de films
8. Mencione ejemplos de plastificantes y reticulantes en la elaboración de films

7. Observaciones

8. Conclusiones

9. . Bibliografía
 Bastioli, C., Bellotti, V., Del Guidice, L., Del Tredici, G., Lombi, R. And Rallis, A.
Biodegradable ar ticles based on starch and process for producing them.
Us5262458. U.s. pto. 1993.
 Denesuk, M. Degradable plastics possessing a microbe-inhibiting quality.
Us6756428. U.s. pto. 2004.
 Famá. L., Goyanes, S. And Gerschenson, L. Influence of storage time at room
temperature on the physicochemical properties of cassava starch films.
Carbohydrate polymers, 70 (1), 2007, p. 265-273.
 Halley, P., Mcglashan, S. And Gralton, J. Biodegradable polymer. Us7094817. U.s.
pto. 2006.
 Ke, T.; & Sun, X. (2001). Thermal and mechanical properties of poly (lactic acid)
and starch blends with various plasticizers. Transactions of the American Society,
44, 945-953.
 Ma, X. F.; Yu, J. G.; & Wang, N. (2007). Fly ash-reinforced thermoplastic starch
composites. Carbohydrate Polymers, 67, 32-39.
 Ma, X.; & Yu, J. (2004). Formamide as the plasticizer for thermoplastic starch.
Journal of Applied Polymer Science, 93, 1769-1773.
 Parra, J.” Variabilidad Genética De Siete Cultivares De Arracacha (Arracacia
Xanthorrhiza Bancroft) Producidos En Los Municipios De Boyacá Y Turmequé
(Boyacá) Utilizando Marcadores Microsatélites.2018 [Consulta: 19 Julio 2019].

42
 Disponible En:
Https://Repository.Unimilitar.Edu.Co/Bitstream/Handle/10654/18146/Parrafuente
smadeleyne20 18. Pdf? Sequence=1&Isallowed=Y
 Pushpadass, H. A.; Marx, D. B.; & Hanna, M. A. (2008). Effects of extrusion
temperature and plasticizers on the physical and functional properties of starch
films. Starch-Stärke, 60, 527-538.
 Smits, A. L. M.; Kruiskamp, P. H.; Van Soest, J. J. G.; & Vliegenthart, J. F. G.
(2003). The influence of various small plasticisers and malto-oligosaccharides on
the retrogradation of (partly) gelatinised starch. Carbohydrate Polymers, 51, 417-
424.
 Sprajcar, M., Horvat, P., Krzan, A. (2012) Biopolymers and bioplastics: plastics
aligned with nature. Informational - educational material for teachers and
laboratory assistants of chemistry at primary and secondary schools. National
Institute of Chemistry, Ljubljana
 Tang, X. Z.; Kumar, P.; Alavi, S.; & Sandeep, K. P. (2012). Recent advances in
biopolymers and biopolymer-based nanocomposites for food packaging materials.
Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 52, 426-442.

43
 PRACTICA 7

EXTRACCIÓN DE ACEITE ESENCIAL

1. Objetivos

 Extracción de un aceite esencial a partir de una fuente vegetal, utilizando la

técnica de arrastre por vapor de agua y extracción soxhelt.

2. Fundamento

Extracción de aceites esenciales

Actualmente se conocen más de doscientos aceites esenciales de apreciado valor
comercial en los cuales se han identificado alrededor de cuatrocientos componentes
químicos. Junto con los terpenos, se encuentran compuestos oxigenados como alcoholes
libres (borneol, geraniol, linalol, nerol, mentol, terpineol, etc.) o en forma de ésteres o
aldehídos (cinámico, benzaldehído, neral citral, geranial, citronelal, salicílico, etc.),
cetonas (alcanfor, carvona, fenchona, mentona, tuyona, etc.), fenoles (carvacrol,
eugenol, isoeugenol, timol, etc.), ácidos libres (acético, benzoico, cianhídrico, cinámico,
propiónico, valeriánico, etc.) en pequeñas cantidades o en forma de ésteres o éteres.
Actualmente se han analizado más de tres mil aceites esenciales de un gran número de
especies botánicas. Más de doscientos aceites tienen un alto valor comercial y se utilizan
en diferentes ramas de la industria (alimentos, jabones, ambientadores, perfumes,
cosméticos, licores, insecticidas, fármacos, etc.).
Las esencias naturales son empleadas como aromatizantes (anís, cardamomo, clavo,
menta, tomillo, naranja, etc.) y/o saborizantes (anís eneldo, hinojo, limón, naranja, etc.),
como ingredientes de algunos preparados farmacéuticos (caléndula, eucalipto, manzana,
menta, salvia, etc.) o son base de perfumes y productos cosméticos (albahaca, geranio,
jazmín, salvia, rosa, etc.), desodorantes, lociones, jabones líquidos (orégano, salvia,
yerbabuena, etc.), pastas dentífricas (anís, eucalipto, menta, orégano, tomillo, etc.).
El valor comercial del aceite esencial depende básicamente de su composición química.

Terpenos
Son una familia diversa de compuestos con esqueletos de carbono compuestos de cinco
unidades de isopentilo (isopreno). Por lo regular, se aíslan de los aceites esenciales de
plantas, que se concentran a partir de la planta por una destilación por arrastre con vapor.
El término aceites esenciales significa literalmente “aceites derivados de la esencia” de
las plantas. Con frecuencia tienen sabores y aromas agradables, y se usan como
saborizantes, desodorantes y medicamentos.

44
Hidrodestilación
Es una variante del arrastre con vapor, que consiste en que el material a extraer se
encuentra en contacto y en el mismo recipiente que el agua con el cual se va a
realizar la extracción y todo en conjunto se calienta por ebullición y el vapor que sale
del balón se conduce a través del tubo de vidrio hasta el condensador, donde cambia de
fase y los vapores resultantes son condensados como en el caso de las sustancias
volátiles y posteriormente son separados.

La extracción Soxhlet.
La extracción de muestras sólidas con disolventes, generalmente es conocida como
extracción sólido-líquido o lixiviación
La extracción Soxhlet es muchos casos, el método estándar de extracción de muestras
sólidas más utilizado, y es el principal método de referencia con el que se comparan
otros métodos de extracción. Además, muchos métodos de la EPA (U.S. Environmental
Protection Agency) y de la FDA (Food and Drugs Administration) utilizan esta técnica
clásica como método oficial para la extracción continua de sólidos.
En este procedimiento la muestra sólida finamente pulverizada se coloca en un cartucho
de material poroso que se sitúa en la cámara del extractor soxhlet (ver figura). Se calienta
el disolvente extractante, situado en el matraz, se condensan sus vapores que caen, gota
a gota, sobre el cartucho que contiene la muestra, extrayendo los analitos solubles.
Cuando el nivel del disolvente condensado en la cámara alcanza la parte superior del
sifón lateral, el disolvente, con los analitos disueltos, ascienden por el sifón y retornan
al matraz de ebullición. Este proceso se repite hasta que se completa la extracción de los
analitos de la muestra y se concentran en el disolvente.

3. METODOLOGÍA

Observación de video previo

 https://www.youtube.com/watch?v=IC0qYhQ2XNg
Destilación por arrastre de vapor. Aceite esencial de limón

Materiales

 Extractor
 Condensador del extractor
 Equipo Soxhlet
 Matraz tipo balón - Tijera pata cortar tallo de plantas
 Mangueras de goma
 Embudo separador de fases

45
  Matraz erlenmayer
 Balanza digital
 Probeta
 Vaso de precipitados 100 mL
 Vaso de precipitados 250 mL
 Termómetro
 Soportes universales
 Cocinilla electrica
 Telas de asbesto
 Agua

4. Procedimiento

4.1 Extracción por arrastre de vapor

a. Con ayuda de un rallador obtener la piel amarilla de la cascara de naranja fresca

(80 gramos)
b. Introducir la piel dentro de un balón de 500 mL
c. Adicionar 250 mL de agua destilada dentro del balón, colocar una barra
magnética.
d. Ensamblar el equipo de destilación simple, utilizando una plancha de
calentamiento con agitación.
e. Iniciar el calentamiento con agitación, recibir el condensado aproximadamente
hasta 200 mL.
f. Realizar una extracción liquido-liquido usando 10 mL de hexano como
solvente, con ayuda de un embudo de decantación., drene la fase acuosa, la fase
orgánica reserve en un vaso.
g. Con la fase acuosa drenada volver a realizar la extracción con 10 mL de hexano
y recuperar la fase orgánica.
h. En la fase orgánica recuperada evaporar el hexano por calentamiento a 62.5 °C
con ayuda de una plancha de calentamiento hasta obtener aproximadamente un
volumen a 10 mL, lavar el vaso con 2 mL de hexano y adicionarlo al vial, volver
a evaporar el solvente dentro del vial hasta que la temperatura llegue a 80°C
donde finaliza la evaporación del solkvente, pesar y rotular.

46
 Figura 1. Esquema de montaje de hidrodestilación
4.2 Extracción Por Soxhlet:

a. Empaquetar 20 g. de material vegetal (cascara seca de naranja triturada) en

una hoja de papel de filtro y colocar en un equipo de soxhlet con 200 ml. de
etanol.
b. Someter a calentamiento y efectuar ciclos de extracción durante 20 minutos.
c. Recuperar el extracto y proceder a evaluar su rendimiento.

Fig. 2. Dispositivo de extracción soxhlet

Cálculos
El porcentaje en grasa G (%) se calcula según la siguiente expresión:

En dónde:

m1:masa en g del matraz de fondo redondo vacío (con trozo de porcelana ysoporte).

m2: masa en g del matraz de fondo redondo con grasa (con trozo de porcelana y
soporte) tras el secado.
M : peso de la muestra en g.

5. Cuestionario

1. ¿Cuál es la estructura química del limoneno y del eugenol, y cual su uso

industrial?
2. ¿Qué ventajas y desventajas presenta la hidrodestilación en comparación
con la destilación por arrastre de vapor?.
3. ¿En qué consiste la hidrodestilación ultrasónica de aceites esenciales?.

47
 4. ¿Explique que es la hidrodestilación asistida por radiación de microondas
(MWHD) y que beneficios se obtienes en la extracción?
5. Señalar ventajas e inconvenientes de la extracción Soxhlet.
6. ¿Cuál es el fundamento del método de soxhlet?
7. Calcular el rendimiento de la extracción.
8. Grafique un soxhlet e identifique sus partes.

6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 Augusto Saavedra Luis Patiño, Martínez José. Extracción por arrastre de vapor
de aceite esencial del romero. Facultad de Ciencias Tecnológicas, Sucre-
Bolivia. 2014.
 Clevenger, J. F. (1928), Apparatus for the determination of volatile oil. J. Pharm.
Sci., 17: 345-349. doi:10.1002/jps.3080170407.
 Como producir y procesar plantas medicinales y aromáticas de calidad.
Fundación para la innovación Agraria Ministerio de Agricultura. Santiago de
Chile 2003.
 González Villa Angela Andrea. Obtención de aceites esenciales y extractos
etanólicos de plantas del Amazonas. 2004.
 Palacio Manuel Oscar. Buenas prácticas de recolección acondicionamiento y
conservación de plantas medicinales. jardín botánico “ing. lucas d.roic” facultad
de ciencias forestales – UNSE. 2019.
 Sethi, A. Systematic Laboratory Experiments In Organic Chemistry. New
Age International Publishers, New Delhi, 2003.
 Shriner, R. L.; Fuson, R. C.; Curtin, D. Y. Identificación Sistemática de
Compuestos Orgánicos. LIMUSA,v México, 2008.
 Vogel & Berti. Libro de Como producir y procesar plantas medicinales y
aromáticasde calidad. 2003.

48
 PRACTICA 8
PRODUCCION DE BIODIESEL

1. Objetivo
 Aplicar los conocimientos de estructura y reacciones de los acilglicéridos a la
producción de biodiesel.

2. Fundamento

Características de los aceites

Los aceites y grasas pueden ser caracterizados según sus propiedades físicas
(densidad, viscosidad, punto de fusión, índice de refracción) o químicas (índice de
acidez, índice de yodo, índice de peróxido, índice de saponificación, índice de éster).
• La densidad estándar para los aceites vegetales va de un mínimo de 0.90 g/ml a
un máximo de 0.93 g/ml a 15°C, y su viscosidad desciende con el incremento en
la insaturación y con el descenso del peso molecular de sus ácidos grasos.
• El índice de acidez se define como los miligramos de NaOH o KOH necesarios
para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 gramo de aceite o grasa, y
constituye una medida del grado de hidrólisis de una grasa. La causa de la
existencia de ácidos grasos libres es la actividad enzimática de las lipasas. Por este
motivo, el aceite de arroz y el de palma, por lo general, tienen una acidez alta. Los
aceites extraídos de semillas descompuestas tienen acidez alta, al igual que los
aceites almacenados durante mucho tiempo.
• El comportamiento del índice de Acidez (expresado como % de ácido oleico)
durante el almacenamiento en los aceites y grasas comestibles evidencia un
incremento en una primera etapa, como resultado de la actividad enzimática de las
lipasas, hasta alcanzar un valor máximo, a partir del cual comienza a disminuir.
Esta disminución pudiera ser explicada porque los ácidos grasos libres pueden
oxidarse a compuestos oxigenados, como hidroperóxidos, por acción del oxígeno,
temperatura, luz, trazas metálicas o por agentes bioquímicos (microorganismos,
enzimas lipoxidasas) o la combinación de ambos, en función de las condiciones
de almacenamiento y de la composición del aceite almacenado. Así, un valor de
acidez bajo pudiera indicar: que el producto está poco hidrolizado, o que el estado
de deterioro es más avanzado y que parte de los ácidos grasos libres han
comenzado a oxidarse, por lo que es necesario realizar otros análisis (índices de
peróxidos, Yodo y Saponificación, entre otros), para conocer el estado de un
aceite o grasa.
• El porcentaje de ácidos grasos libres (AGL). Puede expresarse también como
porcentaje de ácido oleico, palmítico o láurico, según el ácido graso que
predomine en la grasa en cuestión. Los ácidos grasos libres en aceites y grasas
refinados deben ser menores a 0,2% como ácido oleico para ser aptos para su uso
en alimentación. Sin embargo, los aceites crudos y los usados en frituras,
comúnmente tienen un contenido de ácidos grasos libres significativamente
superior a éste (2% o más). Este índice es muy importante para la
transesterificación en el proceso de producción de biodiesel, ya que los ácidos
grasos libres pueden reaccionan con el catalizador (NaOH ó KOH) formando
jabones y disminuyendo el rendimiento de biodiesel. Luego los jabones
producidos, forman emulsiones que dificultan la purificación de biodiesel. Para
eliminar la acidez libre, se lava el aceite con agua cáustica.

49
• Tanto el índice de yodo como el de refracción indican el contenido de ácidos
grasos no saturados. El índice de iodo, mide el grado de insaturación (números de
dobles enlaces) de las grasas, y se define como los gramos de yodo absorbidos por
10 g de grasa. El valor del índice de refracción está relacionado con el grado de
saturación y es un indicativo de la pureza del aceite.
• El índice de peróxido (IP) mide el grado de oxidación primaria que ha sufrido la
grasa o aceite (rancidez), y se define como miliequivalentes de peróxido por Kg
de grasa. La velocidad de oxidación crece con un incremento en la temperatura,
con la exposición al oxígeno, presencia de luz y contacto con materiales pro-
oxidantes como el cobre metálico, latón, bronce u otras aleaciones de cobre.

Especificaciones para aceites y grasas.

La viscosidad dinámica (o viscosidad absoluta) es la propiedad de los fluidos que

indica su resistencia a fluir, debida al rozamiento entre sus moléculas. En el Sistema
Internacional se mide en Pascales-segundo, pero la unidad más utilizada es el
centipoise (cps), equivalente a 1mPa-s. Para ciertos líquidos, la viscosidad es
constante y solo depende de la temperatura y presión. Este grupo se denominan
líquidos Newtonianos. Los líquidos que no siguen esta relación proporcional son
denominados fluidos no-Newtonianos.
La viscosidad cinemática es el cociente entre viscosidad dinámica y densidad, y se
mide en centistokes. Para el análisis de la viscosidad cinemática de un liquido se
estudian los movimientos de la ‘pelota’ en dichos fluidos haciendo uso del balance
de fuerzas de la segunda Ley de Newton. En este caso, el fluido alrededor de una
esfera sufre el empuje (fuerza ejercida sobre la esfera por el flujo de un fluido
alrededor de ella) y está dado por:
Empuje= 6π.resfera.μ.v
Siendo: resfera= el radio de la esfera, y v= la velocidad de la esfera

Método del viscosímetro de Ostwald (o Canon Fenske).

El fundamento de este viscosímetro, es la fórmula de Poiseuille, que da el caudal Q
(volumen de fluido por unidad de tiempo) que atraviesa un capilar de radio R y
longitud l entre cuyos extremos se aplica una diferencia de presiones Δp

50
Q=v/t= Π.Δp.R 4/8Ƞ. l
donde Ƞ es la viscosidad del fluido. Esto es Ƞ= Π.Δp.R4t/v.8l
Como R, l y V son constantes para un tubo determinado, se agrupan en la constante
K (al igual que Π /8) y por lo tanto se tiene: Ƞ= K Δ p t
Si el líquido fluye únicamente por acción de la gravedad en un tubo vertical, la
diferencia de presión Δp es la que ejerce la columna de líquido, esto es, Δp = ζ gh,
siendo ζ la densidad del líquido y h la altura de la columna.

Por lo tanto,
Ƞ= K ζ g h t
Si el capilar no fuera vertical habría que tener en cuenta el ángulo que forma con la
vertical. Para un tubo determinado se tiene: Ƞ= K* ζ t (1)
El valor de K* depende por lo tanto de la geometría de cada viscosímetro en
concreto y suele darlo el constructor. También puede determinarse utilizando un
líquido de viscosidad conocida. Normalmente se determinan las viscosidades
relativas referidas al agua. Para el agua se tendrá:
Ƞ agua= K* (ζ agua) t.
De esta expresión se puede determinar K* e introducir en la expresión (1) para
determinar la viscosidad desconocida del líquido en estudio.

El viscosímetro de Ostwald es un aparato relativamente simple para medir

viscosidad, de fluidos Newtonianos.

51
El Biodiesel.

Es un combustible renovable derivado de aceites o grasas de origen vegetal o

animal, que puede ser usado en forma pura o mezclado con diesel de petróleo. Se
obtiene por transesterificación usando un catalizador, que puede ser: un álcali, un
ácido, enzimas, ultrasonido o condiciones supercríticas.
Químicamente, son monoalquil-ester de ácidos grasos de cadena larga, obtenidos
cuando los aceites reaccionan con un alcohol (etanol o metanol) por
transesterificación, y la reacción sustituye el glicerol por etanol o metanol,
formando así los metil o etil ésteres del ácido graso. Esto se logra tratando los
triglicéridos con metanol o etanol en medio ácido o alcalino y la mezcla obtenida
es inmiscibles, separándose en dos fases correspondientes al biodiesel y al glicerol
(glicerina).

52
 La separación de productos contribuye forzando a que la reacción siga
desplazándose hacia la síntesis de productos.

Materia prima.
El aceite para producir biodiesel debe ser refinado, con el objetivo de: eliminar
ácidos grasos libres (AGL), eliminar ceras para mejorar el desempeño en frío del
biodiesel, eliminar contaminantes de la glicerina y eliminar sólidos que interrumpan
el proceso de transesterificación.
También, es posible utilizar aceites usados como materia prima, pero calentar un
aceite cambia sus características y el aceite residual suele tener grandes cantidades
de ácidos grasos libres, gomas, humedad y otras impurezas que afectan el proceso
de transesterificación alcalina.

Purificación del biodiesel.

A nivel industrial se puede recuperar el metanol que se encuentra en esta fase por
destilación y refinar la glicerina, o venderla a la industria jabonera o de cosméticos.
Para utilizar el biodiesel en vehículos, es recomendable implementar controles de
calidad, según las normas internacionales de calidad de combustibles. Además, es
necesario cambiar ciertas mangueras plásticas o caucho del vehículo, empaques,
sellos, diafragmas, etc., pues el biodiesel podría dañarlas.

3. Metodología

Observe los siguientes videos

 https://www.youtube.com/watch?v=t2NFqqkODjQ
Síntesis de biodisel

 https://www.youtube.com/watch?v=UKc0CRW_B7Q
Producción de biodiésel a partir de aceite vegetal

Materiales y reactivos

 Vasos de precipitados, probetas, embudos, pera de decantación, soporte

universal, agitador magnético, balanza analítica.
 Papel filtro, aceite de cocina.
 Hidróxido de sodio, agua destilada, metanol.

3.1. Caracterización de los aceites.

Esto implica hacer análisis previos: determinación de ácidos grasos libres y según
esto efectuar el lavado; observar la humedad y según eso desecarlos; determinar la
densidad y la viscosidad.

53
a. Determinación de la densidad.
Tomar muestra del aceite y determinar la densidad mediante picnómetro. Seguir
los siguientes pasos:
1. Lavar y secar el picnómetro
2. Pesar el picnómetro vacío
3. Llenarlo con agua destilada hasta que rebose y taparlo
4. Secar el exterior del picnómetro y volverlo a pesar
5. Vaciar, lavar y secar el picnómetro
Llenarlo con el biodiesel obtenido y volverlo a pesar.
Aplicar la relación:
ρm = W(picn+m) – Wpicn.. ρagua.
W(picn+agua)-Wpicn
También se puede determinar el volumen del picnómetro con el agua destilada
sabiendo la densidad del agua a temperatura ambiente. Luego, conociendo el
volumen del picnómetro y sabiendo la masa de aceite, se puede calcular la
densidad del aceite.

b. Determinar la viscosidad cinemática

Cargar el viscosímetro tipo Ostwald y colocarlo en el baño maría.
Mantener el viscosímetro cargado en el baño el tiempo suficiente para que
alcance la temperatura del ensayo (38 ºC).
Ajustar el nivel superior de la muestra en el capilar a unos 7 mm por encima de
la primera marca de cronometraje, bien por aspiración (si la muestra no contiene
componentes volátiles) o bien por presión.
Deje escurrir el líquido poniendo en marcha el cronómetro en el momento en
que la superficie del líquido pasa por a y deteniéndolo en el momento que pasa
por b.
Realice al menos 10 determinaciones del tiempo que tarda el líquido en escurrir
desde a hasta b.
Vacíe el viscosímetro y séquelo.
Después de que el viscosímetro se haya secado y alcance nuevamente la
temperatura ambiente repita el procedimiento con agua destilada y determine la
viscosidad relativa del líquido respecto del agua.
Cálculos:
Se registra el tiempo de flujo t, de un volumen dado V (entre las marcas a y b)
a través de un tubo capilar de longitud L bajo la influencia de la gravedad. Se
repite el experimento con agua destilada, y se aplica la relación:
η1 = ρ1.t1
η2 ρ2.t2
dónde: η1, ρ1 y t1, son para el agua, y η1, ρ1 y t1, son para la muestra

54
c. Determinación de la cantidad de ácidos grasos libres
El método se basa en la neutralización de los ácidos grasos libres presentes
en el aceite o grasa con solución etanólica de hidróxido (de potasio o sodio)
en presencia de fenolftaleína como indicador. El índice de acidez se expresa
en mg de hidróxido de potasio (o sodio) necesarios para neutralizar un gramo
de grasa. También puede expresarse en porcentaje de ácido oleico.
Reacciones químicas:
RCOOH + NaOH ---- R-COONa + H2O
Procedimiento.
Mezclar 1 ml de aceite con 10 ml de alcohol isopropílico, mas 2 gotas de
solución de fenolftaleína.
Gota a gota, añada solución de hidróxido de sodio al 0,1N mediante
agitación vigorosa hasta que la solución quede rosácea durante 10 segundos
y registre los mililitros de solución de sosa al 0,1N usados.
Índice de acidez = (40N.V) / P
En donde:
40 = equivalente químico de la sosa.
N = normalidad de la solución de sosa.
V = cm3 de solución valorada de NaOH gastados en la titulación de la
muestra.
P = masa de la muestra en gramos.
Se puede expresar como % de ácido oleico, palmítico o láurico, utilizando
el meq del ácido graso de referencia:
% ácidos grasos libres = (meq x N x V x 100) / P
En donde:
meq = miliequivalente químico del ácido graso de referencia
N = normalidad de la solución de hidróxido.
V = cm3 de solución valorada de hidróxido, gastados en la titulación de la
muestra.
P = peso de la muestra en gramos.
Lavado.
Para 100 ml de aceite vegetal liquido adicione 20 ml de solución cáustica
(2,5 gr de NaOH en 20 ml de agua). El aceite vegetal y la solución cáustica
se ponen en contacto, se calienta y agita levemente y se deja reposar por 24
horas. Esto hará que los ácidos grasos libres reaccionen con la soda cáustica
formando jabón, que ira al fondo del recipiente y el aceite flotante quedara
sin ácidos grasos libres.

d. Desecado -Agua en aceite vegetal

Para comprobar la existencia de agua, colocar el aceite en un frasco de

vidrio, allí debe estar completamente cristalino, si se ve algo opaco, es
porque posee agua.
Es necesario evitar que el aceite contenga agua ya que genera problemas en
la separación del biodiesel y en la calidad del mismo, por tanto, es necesario
retirar el agua presente en el aceite calentándolo a 104ºC durante una hora o
hasta que no se vean burbujas. Se deja enfriar.

55
 e. Determinar el Índice de Yodo (método de Hanus)

Reactivos: Solución de yodo de Hanus (O Wijs), Cloroformo (CHCl3), Yoduro

de potasio (KI) al 15 %. Tiosulfato de sodio (Na 2S2O3) al 0,1 N, Solución de
almidón al 1%.
Preparación del reactivo de Hanus. Disolver 13.615 g de Iodo en 825 ml de
ácido acético concentrado (al 99.5%) calentando. Tomar 25 ml de la solución y
titularlos con tiosulfato de sodio 0.1 N. Tomar 200 ml de ácido acético y
añadirle 3 mL de bromo. Tomar 5 ml de la mezcla con bromo (punto anterior),
añadirle 10 ml de KI al 15% y titular con tiosulfato de sodio 0.1 N. Calcular de
acuerdo a las titulaciones realizadas la cantidad de solución de bromo que hay
que adicionar a la solución de Iodo para duplicar el contenido de halógenos.
Mezclar las soluciones y hacer los ajustes necesarios. Guardar el reactivo en
frasco ámbar y en la oscuridad.

Procedimiento.
a. Pesar alrededor de 4 gotas de aceite (0,1 g de grasa) en una fiola de 500 ml
o en frasco con tapón de vidrio (se acostumbra pesar 0,5 g de grasa; 0,25 g
de aceite y de 0,1-0,2 g de aceite con un alto poder absorbente).
b. Disolver en 10 ml de cloroformo. Añadir con pipeta volumétrica de 10 ml
de la solución Hanus (o Wijs) y dejar reposar exactamente 30 minutos en
la oscuridad agitando ocasionalmente (el exceso de yodo debe ser mayor o
igual al 60% de la cantidad añadida).
c. Añadir 5 ml de solución de KI al 15%, agitar vigorosamente y añadir 100
ml de agua recién hervida y enfriada, lavando cualquier cantidad de yodo
libre de la tapa.
d. Titular el yodo con tiosulfato 0,1 N añadiéndolo gradualmente, con
agitación constante, hasta que el color amarillo de la solución casi
desaparezca.
e. Añadir 1 ml del indicador. Continuar la titulación hasta que el color azul
desaparezca completamente. 6. Hacia el fin de la titulación, tapar el
Erlenmeyer y agitar vigorosamente de manera que todo el yodo remanente
en la capa de cloroformo pase a la capa de yoduro de potasio. Correr un
blanco con la muestra.
b. El número de mililitros de tiosulfato 0,1 N requeridos por el blanco (V B)
menos los usados en la determinación de la muestra (VM) dan la cantidad de
tiosulfato equivalente al yodo absorbido por la grasa o el aceite. Calcular el
porcentaje en peso de yodo absorbido

f. Índice de peróxido:
Reactivos: a. Solución de ácido acético-cloroformo (60:40) b. Solución
saturada de yoduro de potasio (KI) (20 ºC) c. Tiosulfato de sodio (0,1 y 0,01
N) d. Almidón al 1% 3.
Procedimiento:

56
 Pesar 5,00 ± 0,05 g de la grasa (o aceite) en un Erlenmeyer de 250 ml de
tapa de vidrio. Añadir 30 ml de la solución HOAC-CHCl3 y agitar para
disolver.
Añadir 0,5 ml de la solución saturada de KI, agitar vigorosamente y dejar
reposar en la oscuridad durante 2 minutos añadir unos 30 ml de agua.
Titular inmediatamente el yodo liberado con tiosulafato 0,1 N; agitando
vigorosamente hasta que el color amarillo casi desaparezca.
Añadir alrededor 0,5 ml de solución de almidón al 1% y continuar titulando
(al final de la titulación agitar vigorosamente para extraer todo el yodo de la
capa de cloroformo) hasta que el color azul desaparezca. Si se gasta una
cantidad menor de 0,5 ml de tiosulfato, repetir la determinación con
tiosulfato 0,01 N.
Correr un blanco conjuntamente con la muestra (debe ser igual o menor a
0,5 ml de tiosulfato 0,01 N). Restar al resultado obtenido al de la muestra.
Cálculos: Restar al volumen de Na2S2O3 gastado en la muestra el obtenido
para el blanco. Expresar el índice de peróxido como meq de peróxido/ Kg
de grasa.
Índice de peróxido = (V.N.1000) /peso de la muestra.

4. Procedimiento

4.1 Proceso de transesterificación.

Se toman 150 ml de aceite vegetal, se colocan en un vaso de precipitados de 250 ml

y se calienta a 60 ºC. tener cuidado al manipular el aceite caliente para evitar
quemaduras.
En un vaso de precipitados de 100 ml se colocan 37 ml (25% en volumen) de
metanol a los que se añaden 1.37 g (1% en peso) de hidróxido sódico remover
vigorosamente (la mezcla debe ser ligeramente nublosa y se denomina metóxido
sódico). Observe el incremento de la temperatura.
Tome las precauciones del caso (usar cubrebocas, guantes de hule y anteojos).
Se añade la mezcla metanol-sosa al aceite caliente, poco a poco mientras los agita
vigorosamente, utilizando un agitador. Agítelo durante 60 minutos. La mezcla es al
inicio más viscosa y luego menos.

4.2 Proceso de decantación y lavado

Dejar reposar el producto en un decantador, en unos 30 minutos se observa dos

fases; en la parte superior una fase liquida y dorada (biodiesel) y en la inferior una
parte café (glicerina y jabón)
Preparar una solución acuosa de HCl al 10% y calentar a 80 °C, lavar sucesivas
veces el biodiesel hasta neutralizar el biodiesel, y lograr que el agua sea
transparente. Separar la fase acuosa de la fase de esteres.

4.3 Evaporación. Calentar el biodiesel hasta 10°C para eliminar el agua presente del
biodiesel.

57
4.4 Determinación de los parámetros fisicoquímicos.

Determinar la densidad, la viscosidad y punto de inflamación del producto obtenido y

compararlo con datos de diésel comercial.
Determinar la densidad. Determinar la densidad mediante picnómetro.
Determinar la viscosidad cinemática. Cargar el viscosímetro tipos Ostwald y
colocarlo en el baño de la forma obligada por el diseño del aparato. Aproximadamente
su valor a 40 °C es 3.91950 mm2/s.
Determinar punto de inflamación. Se usa el método de ensayo del equilibrio rápido
en vaso cerrado. Calentar una muestra en forma lenta y constante agitando
continuamente, introducir una pequeña llama al recipiente a intervalos regulares de
tiempo. El punto de inflamación será la temperatura más baja a la cual la aplicación de
la llama de prueba provoca que el vapor sobre la muestra se encienda. El equipo usado
es el de Pensky Martens. Aproximadamente su valor está en 170.67°C.

4.5 Tratamiento del biodiesel

El biodiesel debe secarse, para ello se calienta el aceite a 104ºC durante una hora o
hasta que no se vean burbujas. Se deja enfriar.
Este biodiésel claro puede contener una muy pequeña cantidad de jabón. Si se
quiere usar en un vehículo, puede que no tenga mayor importancia. No obstante, si
se quiere fabricar en grandes cantidades o para la venta, se debe retirar el jabón por
lavado u otros medios.

5. Cuestionario

1. Calcular el rendimiento de la reacción (Lt de biodiesel/Lt aceite).

2. Presentar los resultados de análisis e interpretar los resultados.
3. Presentar la composición química del aceite usado.
4. Ventajas y desventajas ambientales, técnicas y sociales del uso de biodiésel
frente a un combustible fósil tradicional (gasoil).
5. Pasos a seguir para la obtención de biodiésel a escala industrial.
6. Comparar los parámetros fisicoquímicos obtenidos con los reales de un diésel
comercial.
7. Describa las acciones requeridas para la producción de biodiesel a partir de
aceites usados.
8. Diga cuál es la importancia de la producción de biodiesel

6. Observaciones

7. Conclusiones.

8. Bibliografía

 Malagón Micán Martha Lucia 2012, Obtención de biodiesel, a escala de

laboratorio, a partir de aceites comestibles de desecho: una nueva alternativa de
energía renovable

 Stratta, J. (2002). Biocombustibles: los aceites vegetales como constituyentes

principales del biodiesel. Disponible en http:// www.aupec.univalle.edu.co.
[Recuperado: 20 de enero de 2012]

58
 PRACTICA 9
EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES

1. Objetivo.
 Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su actividad
catalítica.

2. Fundamento.
Las enzimas son proteínas con acción catalítica, se encuentran en el interior de las
células en un estatus particular, a pH fisiológico, y con estructura nativa estabilizada
por diversas mezclas de sustancias.
La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven las características
estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica, debido a la enzima
ureasa presente en la cáscara.
La ureasa (urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5), es una enzima que se encuentra en
diversos organismos vivos, mas no en el organismo humano. Algunas fuentes
comunes son las bacterias, o la cáscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposición de la urea según la reacción:
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de cualquier reacción
puede ser determinada midiendo:
a. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de
reacción
b. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la
cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO 2 ó NH3)
producidos en un tiempo determinado.
Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por medios
espectrofotométricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de
mercurio y potasio (K2Hg14), que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino
forma un complejo de color anaranjado castaño (HgONH2I).
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O
La intensidad del color formado será directamente proporcional a la cantidad de
amoniaco presente en cada tubo y se medirá la absorbancia de cada tubo a 420 nm
(filtro morado).
La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico de la enzima y se
obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza.
La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml
de solución que transforma o produce 1 mg de sustrato ó producto por minuto medidas
en las condiciones óptimas de operación de la enzima.

59
3. Metodología

Observe el siguiente enlace.

 https://www.youtube.com/watch?v=fP8Awc_vttc
Efecto de la concentración de la enzima

Materiales y equipos.

a. Primer ensayo.
 150 gr. De cubierta de frejol, solución de úrea0.3 M, agua destilada
 Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
 Espectrofotómetro, Baño María, Balanza, Equipo de filtración, papel filtro,
Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Balón de
500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.
b. Segundo ensayo.

Materiales.
 Preparar 50 ml de solución de urea 0.3 M.
 Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M
 Reactivo Nessler.
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4ºC)
 100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-5 M (5x10-5milimoles/ml)

Material de vidrio.
 02 fiolas de 50 ml.
 02 fiola de 100ml.
 08 tubos de ensayo.
 01 gradilla para tubos.
 01 espectrofotómetro.
 baño de hielo.
 Incubadora a baño maría.

4. Procedimiento.

4.1 Extracción de la Enzima.

 Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fría),
después de 24 horas remover la cáscara por fricción, y proceder a escurrir el agua.
 Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M. (PO4HNa2), y 200ml. De
solución EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua destilada fría, mezclar
ambas soluciones, y enfriar a 4ºC. En un balón de 500 ml.
 Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500 ml.
 Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar cuidando se
mantenga baja la temperatura.
 Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.
 Centrifugar la suspensión a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solución por un filtro
rápido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.

60
  Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido, llevar a
refrigeración.
 Preparar un cuadro de resultados.

Cascara Buffer Agua Extracto Final (ml)

4.2 Comprobación de La actividad enzimática.

a. Determinación de presencia de proteínas en el extracto por
espectrofotometría.
 Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.
 Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml de
reactivo biuret.
 Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar la
presencia de proteínas.
 Anotar la lectura de Absorbancia, y determinar la concentración proteica.

b. Determinación de la curva de calibración.

Se preparan en los tubos de ensayo, con soluciones de sulfato de amonio según la
tabla siguiente:
Calcular la concentración final de la sal de amonio, para cada tubo

Patrón ml de Buffer Nessler Volumen SO4(NH3)2 Absorbancia

Nº SO4(NH3)2 (ml) (ml ) final ml nmol/ml 420 nm.
Blanco 0.0 6.30 0.2 6.50
1 1.0 5.30 0.2
2 2.0 4.30 0.2
3 3.0 3.30 0.2
4 4.0 2.30 0.2
5 5.0 1.30 0.2
6 6.0 0.30 0.2

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de calibración.

Patrón Nº Concentración Absorbancia

(NH3) mol/ml
Blanco 00
1
2

61
 3
4
5
6

c. Medida de la actividad ureasica.

 Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro
como tubo de blanco.
 En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
 Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
 Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solución de ureasa y 4.8 ml de agua,
al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
 Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 10 min.
 Después de incubar los tubos, sacar el tubo de incubación e introducir en
baño de hielo para detener la reacción.
 Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos y agitar.
 Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
 Leer la absorbancia a 420 nm.
 Haciendo uso de la curva de calibración, determine la cantidad de
amoniaco producido y calcule la velocidad de reacción en nmol de NH3
producido/min.

5. Cuestionario
1. Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la extracción de la
enzima ureasa.
2. Que es la ureasa, donde está presente y cuál es la reacción que cataliza
3. Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.
4. Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y la
refrigeración.
5. Presente las características estructurales de la enzima ureasa y que inhibidores
pueden afectar su actividad catalítica.
6. Utilizando los datos obtenidos de concentración proteica y velocidad de
reacción, calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa.
7. Realizar los cálculos de micro moles de sulfato, amoniaco, y urea para cada
tubo patrón usados en la construcción de la curva de calibración.
8. Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad específica.
6. Observaciones
7. Conclusiones
8. Bibliografía
 Olguin M.C. et al., 2001 Actividad ureásica en productos de soja. Propuesta de un
nuevo método.

62
 PRACTICA 10
CINÉTICA ENZIMÁTICA EN UREASA

1. Objetivo.
 Verificar la variación de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la
concentración del sustrato.

2. Fundamento.
La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa, para formarse
amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente ecuación.
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometría a  =
420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.
Cinética de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimáticas varía con la concentración del sustrato
según una cinética autosaturante que se describa por la Ecuación de Michaelis-
Menten.

V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma:

La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la Linearización

de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

63
 Donde los parámetros anteriores se relacionan por la ecuación de una recta.
1 = 1 + [S]
V VmaxKs

3. Metodología

Materiales y equipos
o 20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M
o 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con
EDTA, 0.5 nM.
o Agua destilada.
o Reactivo Nessler.
o Baño de hielo.
o Equipos y material de vidrio.
o Fiolas de 50 y 100 ml.
o 07 tubos de ensayo de 10 ml.
o 02 matraz de 100 ml.
o pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
o Equipo de baño maría.
o 01 espectrofotómetro Espectronic 20D+
o 01 termómetro de 0- 100 ºC
4. Procedimiento.
4.1 Preparación de muestras.
 Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de amonio al 5x10-
4
M
 Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0.3 M

4.2. Calibración del Espectrofotómetro .

A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de
concentración del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la
enzima se trazará una curva de equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs.
Concentración. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentración conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para
obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se
usará soluciones de sulfato de amonio.
 Preparar solución madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

64
  Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de
Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su
equivalencia con nmol de úrea. Completar la siguiente tabla.

Tabla Nª 1. Calculo de volumen requerido.

Patrón Contenido nmol Sol. de Contenido Equivalencia en

de sulfato sulfato(ml) nmol de NH3 nmol de úrea
1 5
2 10
3 15
4 20
5 25
6 30

Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de la práctica anterior.

Completar la siguiente tabla.

Tabla Nº 2

Muestra Volumen de NH3 en la Absorbancia

sulfato muestra
tomado ( ml) (nmol)
Blanco
1
2
3
4
5
6

Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación que relaciona DO

vs [NH3], haciendo los tratamientos estadísticos que sean necesarios.
4.3. Pruebas cinéticas.
 A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un
blanco para completar la tabla 3 como se muestra.
 Preparar solución madre de ureasa 6 gr/l en buffer fosfato (o usar el
extracto enzimático de ureasa)
 Preincubar los tubos con sustrato, a 37°C por 3 minutos.
 Agregar la ureasa a cada tubo para iniciar la reacción.

65
  Incubar los tubos con sustrato y extracto enzimático, a 37°C por 10
minutos, en baño maría.
 Transcurrido el tiempo de reacción, sacar los tubos del baño maría y
colocarlos en baño de hielo.
 Agregar el reactivo Nessler, manteniendo los tubos en el baño de hielo.
 Sacar los tubos del baño de hielo, y llevarlos a lectura en el
espectrofotómetro, previamente calibrado. Anotar la absorbancia y
completar la tabla.

Tabla Nª 3. Datos de preparación de curva cinética

Tubo Urea Buffer Ureasa Nessler Volumen Urea Abs

0.3M fosfato final
ml ml µMol 420 nm.
ml ml
ml
Blanco 0 3.5 0.3 0.1 3.9
1 0.5 3.0 0.3 0.1
2 1.0 2.5 0.3 0.1
3 1.5 2.0 0.3 0.1
4 2.0 1.5 0.3 0.1
5 2.5 1.0 0.3 0.1
6 3.0 0.5 0.3 0.1
4.4. Tratamiento de datos.
Determinar la cinética de Michaelis-Menten, primero construyendo la curva
auto saturante y luego por linearización.
a.- Construcción de la curva autosaturante.
Usando los datos de absorbancia obtenidos y la curva de calibración, calcular
la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona (de la curva de
calibración), y completar la tabla 4.

Tabla Nº 4. Datos de construcción de la curva cinetica.

Muestra [urea] en Densidad nmol de NH3 nmol de urea

nmol/ml x10-2 óptica (Abs) producidos que reaccionan.
1
2
3
4
5
6
Blanco -

66
 b.- Linearización de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reacción mediante la relación v = P/t,
donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de reacción enzimática (10
min.).
Completar la siguiente tabla, y construir la linearización de Lineweaber y Burk.

Tabla 5. Datos para linearización.

Muestra [S] nmol/ml. 1/[S] V(nmol/min.) 1/v

1
2
3
4
5
6

5. Cuestionario.
1. Presentar los cálculos de preparación de la curva de calibración (tabla 1).
2. Presentar los cálculos de construcción de la curva cinetica (tabla 3)
3. Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante, y estimar, en ella el valor
de Vmax.
4. Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una línea recta.
5. Determinar gráficamente los valores de Vmax. Y Ks.
6. Escribir la ecuación que representa a esta reacción enzimática.
7. Compare los resultados de determinación de las constantes cineticas obtenidas
de la curva autosaturante y de la curva linearizada, y explique los resultados.
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía
 Olguin M.C. et al., 2001 Actividad ureásica en productos de soja. Propuesta de un
nuevo método.

67
 PRACTICA 11

METABOLISMO EN FERMENTACION ALCOHOLICA E INMOVILIZACION

DE CELULAS

1. Objetivos
 Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
 Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
 Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación

2. Fundamento
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas, por lo que se puede
medir la fermentación por la producción de CO2 y por la concentración del producto
formado o por la disminución de la concentración del sustrato (en grados Brix)
Producción de cerveza.
Existen principalmente dos procesos biotecnológicos: la producción de la malta, jora
o guiñapo (malteado), la hidrólisis del almidón en azúcares (sacarificación) y la
fermentación alcohólica que transforma los azucares en etanol y CO 2.
Malteado
El principal objetivo del malteo o germinación es la formación de enzimas necesarias
para llevar a cabo las transformaciones del almidón en la solución múltiple que es la
cerveza o la chicha. Las principales enzimas presentes son: amilasas, proteasas, fitasas
y oxidasas
Sacarificación
Se hace por maceración, la cual busca primero hidrólisis del almidón por acción de las
enzimas amilasas para producir azúcares que puedan ser utilizados por los
microorganismos. Para una eficiente hidrólisis enzimática del almidón por las amilasas
conviene que esté gelatinizado, por esta razón se realiza un cocimiento del almidón
antes de la adición de dichas enzimas. El almidón se transforma en glucosa, maltosa y
dextrinas por acción de diversas enzimas amilasas
Fermentación alcohólica
La fermentación alcohólica es realizada principalmente por levaduras. La más
importante es Saccharomyces cerevisiae, que se emplea también en la fabricación de
vino, cerveza, alcoholes industriales y pan. En ella los azúcares se oxidan hasta
piruvato por la vía EMP, luego este se descarboxila para convertirse en acetaldehído
que se reduce a etanol, regenerando NAD+.
3. Metodología
Observar el siguiente enlace

68
 Materiales.
 Material biológico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas
 Reactivos: Agar-agar, solución de glucosa 5%
 Material: balones, probetas, pipetas, hipodérmicas de 20cc, espátulas, picetas,
papel toalla.
 Equipos: Balanza, refractómetro, baño maría.

4. Procedimiento

4.1. Acondicionamiento de materiales:

 Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua destilada.
 En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con
calentamiento y agitación constante.
 Calibrar el baño de maría a 40ªC, para mantener dentro el agar licuado.
 Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en
refrigeración (aproximadamente 4ªC), por 30 minutos.
4.2. Inmovilización de la enzima:
 Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y
homogenizar.
 Tomar con una aguja hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar
caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.
 Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
 Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con
movimientos rotatorios suaves.
 Secar los pellets en papel toalla.

4.3. Fermentación de vinos.

Obtención del mosto de uva:

 Obtener por prensado 50 ml de mosto de uva.
 Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
 Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el
refractómetro.
Obtención de etanol:
 En un erlenmeyer de 4000 mL adicionar 2000 mL de agua destilada,
una barra de agitación y colocar sobre una plancha de agitación, iniciar
la agitación.
 Pesar en un vaso de precipitados 60 g de peptona, adicionar lentamente
al erlenmeyer mientras se mantiene la agitación. La peptona tendera a
absorber agua y quedarse en la superficie, aumentar la agitación si es
necesario para completa disolución.
 Pesar 30 g de levadura y agregar al erlenmeyer. Agregar 500 mL mas
de agua destilada y mantener la agitación hasta no observar turbidez
(esto puede tomar varios minutos).
 Con ayuda de un pH-metro o papel indicador apropiado, ajustar el pH
de la solución a 4.5 adicionando gota a gota solución de ácido sulfúrico
al 10% mientras se agita.

69
 En un erlenmeyer de 1000 mL, colocar 200 mL de agua destilada y 50
g de azúcar, agitar y calentar suavemente para completa disolución.
Agregar agua tibia hasta aforar a 450 mL aproximadamente y reservar.
 Agregar al erlenmeyer de 4000 mL el contenido del Erlenmeyer
preparado anteriormente, dejar en agitación suave y tapar la boca del
erlenmeyer con ayuda de un tapón de cauco con un orificio y un sello
de fermentación o Airlock lleno hasta la mitad de la capacidad con agua
destilada, una solución de hipoclorito de sodio al 5% o etanol al 70%.
 Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50 ml de mosto, (o
50ml de una solución de glucosa al 5%). Tomar una alícuota,
considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o
porcentaje de azúcar en el refractómetro.
 Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alícuotas cada 15 minutos.
Leer los grados brix en el refractómetro para cada alícuota.

 Otra alternativa para el sello de fermentación es utilizar un globo de

goma (como el empleado en fiestas) donde se le practica un pequeño
agujero. El globo se adapta a la boca del fermentador y se inflará
paulatinamente a medida que se genera el dióxido de carbono, y
cuando la presión es suficiente, comenzará a escapar por el agujero
realizado.
 Dejar que la fermentación ocurra. Observando el sello de fermentación
se puede observar la evolución de dióxido de carbono que indica que
la fermentación está sucediendo, lo que puede suceder por varios días.
En el momento en que no se observe más producción de gas, se puede
considerar que la fermentación ha terminado
 La concentración del alcohol obtenido se puede revisar empleando un
refractómetro manual o digital o empleando un alcoholímetro
adecuado. El alcohol obtenido después de la fermentación debe tener
un olor característico a etanol, aunque se pueden presentar otros tonos
como ácido acético, formaldehido entre otros, esto puede ser indicador
de la presencia de otros microorganismos en la fermentación

70
4.4. Producción de cerveza
Observar los siguientes videos

 https://www.youtube.com/watch?v=DrwpCHXhXTo
https://www.youtube.com/watch?v=s5WVzof3WSA

Molturado
Moler la malta varios días antes de la elaboración perjudicará los aromas finales de
la cerveza (es aconsejado el molido justo antes de la extracción). Con el molturado
se abre el grano sin romper su cáscara, de forma que esta sirva después como filtro
natural. Este proceso permite que el almidón alojado en el centro del grano y las
enzimas se puedan mezclar para su posterior reacción.

Maceración
Mezclar malta y agua caliente por un periodo mínimo de 60 minutos. La maceración
permite la acción de las enzimas que convierten los almidones de la malta en
azúcares, para producir una solución azucarada denominada mosto.
Para eliminar el cloro del agua, se puede hervirla durante 30 minutos, y luego dejar
la olla destapada para asegurarte que el cloro se evapore.

Dependiendo de la temperatura, se puede obtener distintos tipos de cerveza, ya que

las enzimas reaccionan de forma diferente. En general hay dos tipos de maceración:
la proteolítica y la amilolítica, esta a su vez puede hacerse a 3 temperaturas distintas
según las características deseadas. Existen cinco franjas de temperatura:
Pausa proteolítica: Periodo en el cual las moléculas de proteínas son
descompuestas en componentes pequeños (pétidos). La pausa proteolítica (Protein
rest) es importante para la clarificación y el cuerpo, pero especialmente para la
estabilidad de la espuma. Se hace a 52ºC manteniendo entre 5 y 20 minutos.
Maceración entre 62ºC-65ºC: tiene como resultado una proporción relativamente
alta de azúcares fermentables. El resultado será una cerveza con cuerpo más ligero
y seco, con menos dulzor. Se mantiene entre 60 y 90 minutos.
Maceración entre 66ºC-69ºC: produce una proporción normal de azúcares
fermentables. produce cerveza con cuerpo medio y dulzor normal. Se mantiene
durante 60 y 90 minutos.
Maceración entre 70ºC-72ºC: produce una proporción relativamente pequeña de
azúcares fermentables. Este tipo de cerveza tiene mucho cuerpo y dulzor. Se
mantiene durante 60 y 90 minutos.

71
 a. El nivel de pH del macerado y del mosto es un elemento clave para la
actividad de las enzimas, la adición de lúpulo o la fermentación de las levaduras.
La media ideal para que las enzimas realicen el proceso de maceración
correctamente es entre 5.2 y 5.5.
b. La maceración durará entre 60 y 90 minutos, en función de la receta.
Remueva constantemente la mezcla, cada 10 minutos aproximadamente.
c. Una vez empezada la maceración, la temperatura no debe disminuir de 60ºC
y no superar los 74ºC, el rango de actuación de las amilasas.
d. Para comprobar si quedan almidones sin convertir realiza el test de yodo.

Filtrado.
Este paso permitirá remover las harinas y los restos sólidos del grano, así como
disolver parte del azúcar que resta en la malta.
Repite este proceso unas 3 veces hasta que el mosto que salga por el grifo sea
cristalino y libre de partículas en suspensión.

Aclarado (sparging)
Una vez el mosto esté libre de partículas, se hace el sparging (enjuague). El objetivo
es añadir agua a 78ºC para conseguir más litros y seguir aprovechando los azúcares
aún presentes en el interior del grano.
Asegúrese que el pH del agua sea de 5.2 a 5.5.
Lo ideal sería echar agua a 74- 78°C cada vez que ésta estuviera al nivel de la malta.
De esta forma el grano no se secaría.
Repetir este proceso hasta que, con el densímetro, compruebe que la densidad del
mosto se ha reducido dos puntos por debajo de la D.O. (Densidad original). Estos
dos niveles se recuperarán luego, en la ebullición.

Hervido
La principal finalidad de la cocción es la adición del lúpulo, que dará amargor, sabor
y aroma al mosto (en función del momento de adición).
Antes de empezar el hervido, asegurarse que no quedan restos de cereal o de harina,
pues pueden causar astringencia y sabores no deseados en la cerveza.
Otra ventaja de este paso es la volatilización de sustancias, aromas o sabores no
deseados, como el DMS (sulfuro de dimetilo), formado durante el horneado de la
malta a partir de la metionina. (produce olor a maíz cocido y huevos podridos.
Durante el hervido, cuando el mosto se acerque a las temperaturas de ebullición, se
creará una capa de espuma. Retira parte de ella: son proteínas que podrían dificultar
el trabajo de la levadura. Una vez empieza el hervido, hay que estar pendiente de la
olla, ya que puede crearse mucha espuma y desbordarse; se debe ir ajustando la

72
temperatura para conseguir una ebullición constante y energética, manteniendo la
olla semitapada

Durante la ebullición se irá añadiendo la cantidad de lúpulo calculada, vigilando el

tiempo de ebullición para que no esté hirviendo más del necesario, esto daría como
resultado una cerveza mucho más amarga del necesario.
Los tiempos aproximados para conseguir las diferentes características del lúpulo
son:
• 60 minutos de hervor: amargor
• 5-20 minutos: sabor
• 5 minutos: aroma
Al final de la cocción también puedes medir la densidad de nuevo. Así sabrías si
has recuperado los dos puntos y alcanzado de nuevo la D.O.

Enfriado
Al terminar la cocción, llevar rápidamente el mosto a temperatura ambiente (20ºC)
para favorecer la formación del cold break, pequeños sedimentos de proteínas-
taninos que se depositan en el fondo de la olla cuando el mosto llega por debajo de
los 60ºC, y para limitar la formación de DMS.
Tapa después la olla, pues el mosto frío es muy vulnerable a contaminaciones

Whirpool
Una vez finalizado el enfriado, remover el mosto de forma circular, para crear un
remolino, que provoca que las partículas y los sólidos del mosto se acumulen en el
centro de la olla, ayudando a un mosto más limpio. Todas las herramientas deben
estar higienizadas.
Fermentación
Antes de añadir la levadura, oxigenar el mosto, por: splashing (travasa el mosto
salpicándolo en el fermentador), agita el mosto con una pala o mueve
enérgicamente el fermentador, etc.
Añadir la levadura, tapar el fermentador y colocar el airlock.
En 12-24 horas aproximadamente tendría que empezar la fermentación, aunque hay
cepas de levadura que son más rápidas que otras.
En general, la fermentación dura entre 4 y 15 días. Para cervezas de tipo ale, la
temperatura adecuada es de 16 y 22ºC. En cambio, para la lager es de 7 a 13ºC.
Colocar el fermentador en un lugar oscuro y fresco, con una temperatura estable.
Para saber si la fermentación ha terminado, fijarse si la formación de burbujas en el
airlock se ha ralentizado. Sin embargo, tomar muestras de densidad son el
parámetro más exacto para determinar la finalización de la fermentación. Si la
densidad no varía en 48h, la fermentación habrá terminado.

73
Una vez terminada la fermentación se puede calcular el volumen alcohólico con las
muestras de densidad tomadas por: (densidad inicial - densidad final) / 7,4 = __%

Envase y embotellado
Tan fácil como llenar botellas directamente desde el fermentador.
Antes, sin embargo, es necesario realizar el priming: acción mediante la cual se da
alimento a la levadura para que genere CO2. A nivel casero, puedes usar azúcar o
glucosa, unos 6gr por litro aproximadamente. Deberás dejar enfriar el compuesto,
añadirlo al fermentador y remover.
Tras media hora, proceder al embotellado. Para el llenado aconsejamos utilizar un
tubo de trasvase con válvula, para evitar oxigenar las botellas.
Una vez tengas toda tu cerveza embotellada, la maduración durará un mes, mas o
menos. Para ello mantener en un sitio oscuro y fresco, con temperatura estable entre
15-18ºC, en función de la receta.

4.5. Chicha de jora

La chicha de jora es una bebida alcohólica obtenida por fermentación del maíz
germinado. Esta bebida es oriunda del Perú y se consume en otros países de
América del Sur. Un maíz germinado, jora, también llamada wiñapu, desencadena
el proceso enzimático del malteado. Las enzimas de la malta desdoblan el almidón,
y preparan el futuro sabor de la chicha.

Tabla 1, Composición química de la chicha de jora.

Flora microbiana de la chicha de jora

En la fermentación de la chicha de jora intervienen diversas especies de bacterias
lácticas y levaduras que generalmente pertenecen al género Saccharomyces, en
donde la especie Saccharomyces cerevisiae, constituye la principal especie
responsable. Todas estas especies provienen del medio ambiente, pues la
fermentación se realiza sin añadir cepas obtenidas de laboratorios especializados.
Observan los siguientes videos
 https://www.youtube.com/watch?v=TDUqvRFd8kI

74
  https://www.youtube.com/watch?v=RybAASzX
wY8

Recepción de materia prima

Pesar 2 kilogramos de maíz morado germinado (wiñapo), y eliminar los granos no
germinados
Molienda
Disminuir el tamaño de grano con el fin de acelerar el proceso de cocción, por
molienda a tamaños inferiores 300um. (Sempértegui, 2013).
Mezclado
Mezclar la jora molida y agua en una proporción de 1:10 (grano germinado: agua).
Realizar en agua fría para evitar la formación de grumos en la cocción.
Cocción
Llevar a ebullición la mezcla, con el fin de gelatinizar los gránulos de almidón para
facilitar su hidrólisis, también para que los azucares y proteínas se solubilicen,
realizar el proceso de cocción por un tiempo de 90 minutos. Este proceso destruye
gérmenes patógenos o agentes tóxicos.
Enfriado
El enfriado del mosto de maíz morado germinado, se realiza hasta llegar a una
temperatura de 32°C.
Inoculación y fermentación
Es un proceso anaerobio donde actúan principalmente las levaduras.
Se realiza mediante la adición del iniciador natural (concho), el cual es el sedimento
de chicha de jora, que contiene las levaduras salvajes. Se adicionará una proporción
5 mL concho/100 mL bebida (5%), a una temperatura de 32±2°C durante 24 horas.
Terminada la fermentación se adicionó 9% de azúcar blanca con el fin de endulzar.
Filtrado I
En este proceso se separa el sedimento de la bebida, así como las partículas en
suspensión, con tela filtrante.
Filtrado II
Se adiciona las tierras de diatomeas en proporción 0,058% en 10 Lt. de muestra, a
temperatura ambiente (21°C), este proceso se realiza en una bomba de vacío para
obtener un producto clarificado y sin partículas en suspensión.
Envasado
La chicha de maíz se procede a envasar en botellas de color ámbar 330 ml
previamente esterilizados y se sellan con chapas metálicas. 36
Pasteurizado
Pasteurizar la chicha a 70°C y 80°C. La pasteurización emplea temperaturas y
tiempos de contacto relativamente bajos, consiguiendo una prolongación moderada
de la vida útil a cambio de una buena conservación del valor nutritivo y de las
cualidades organolépticas del alimento (Ayma y Cascire, 2012), la cerveza se
pasteuriza a temperaturas entre 65-85°C, tratamientos excesivos podrían alterar el
aroma (Hough, 1990).
Almacenamiento
Se realiza a temperatura ambiente (23ºC – 26ºC).

5. Cuestionario.

1. Indique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o células.

2. ¿Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?

75
 3. Explique las características coagulantes del agar-agar.
4. Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las células de levadura,
si estas están atrapadas en la matriz de agar-agar.
5. Explique en términos fisicoquímicos, como la refractometría puede cuantificar
la presencia de azucares en solución.
6. Indique cual es el sustrato de inicio en cada uno de los tres ensayos de
fermentación
7. Presente la ruta metabólica de bioconversión del azúcar usado hasta el etanol
8. Establezca semejanzas y diferencias entre los procesos de producción de
cerveza vs chicha

6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 Carretero Casado, F. (2006). Innovación Tecnológica en la Industria de Bebidas.

Universidad Politécnica de Catalunya. Tesis de Maestría. [10]
 Blouin, J., & Peynaud, E. (2004). Enología práctica: conocimiento y elaboración
del vino. Mundi mPrensa Libros.
 Hough S.J. (1990). ―Biotecnología de la Cerveza y de la Malta‖. Editorial
Acribia. p. 9 [21] López, A., García, G.M., Quintero, R.R., López-Munguía A.,
 López, A., García, G.M., Quintero, R.R., López-Munguía A., Canales, l. (2002).
―Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. México. pp. 263-312.Canales, l.
(2002). ―Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. México. pp. 263-312.

76
 PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN

1. Objetivo
 Extraer ADN de un tejido animal

2. Fundamento

El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el almacenamiento y la

transferencia de la información genética. Son componentes fundamentales de la
célula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco. Normalmente
no se encuentran solos, sino que se hallan formando núcleo proteínas, ya que
suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas. El ARN se localiza
tanto en el citoplasma celular como en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos,
mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula y
también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas cantidades. Poseen una
importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la síntesis
de proteínas, y por tanto de las enzimas necesarias para el funcionamiento celular.
Por otra parte, el ADN es el vehículo de la herencia que se transmite de padres a
hijos de generación en generación.

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en

primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los núcleos, para
ello se tritura el hígado de pollo en un mortero.

Al añadir una solución hipertónica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de

los núcleos, el detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del
ADN, El alcohol tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando para
dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se
pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado
de acridina.

3. Metodología.

Observar el siguiente video

Materiales
 Hígado de pollo 10 gr
 Una cebolla grande
 Cloruro de sodio 2M
 Etanol 96|°
 SDS 20%
 EDTA
 Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1%.
 Difenilalanina
 Etanol al 95%
 Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4)
 Arena

77
  Varilla de vidrio
 vasos de precipitados
 Mortero
 Embudo
 Pipetas
 Probetas
 Gasa
4. Procedimiento
Extracción de ADN de hígado de pollo
a. Triturar 10 gr de hígado de pollo, dentro de un mortero, con la adición de
5gr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas
celulares.
b. Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta obtener una
papilla.
c. Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos
de tejido que quedaron sin romper membranas.
d. Medir el volumen del filtrado final.
e. Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de
precipitados.
f. Añadir 1 ml de SDS 20%.
g. Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío, por las paredes,
logrando se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.
h. Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma dirección
tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas
fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la
agrupación de muchas fibras de ADN.

Extracción de ADN de cebolla

Preparación de los reactivos:
Soluciones Stock y buffer
1. Solución de lisis (Mezclar 0.1% de SDS con una solución 25mM de EDTA,
pH=8).
2. Reactivo de difenilamina (Disolver 1g de Difenilamina en 100 mL de ácido
acético glacial y adicionar 2,75 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).).
Procedimiento
a. Descascarar una cebolla de tamaño medio.
b. Rajar la cebolla, pesar 50 g y adicionar 100 mL de solución de lisis.
c. Mezclar a temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.
d. Filtrar la suspensión en un embudo que contenga algodón, recogiendo el filtrado
en una probeta. Anotar el volumen.

78
 e. Transferir 4 mL del filtrado y colocar en un tubo de ensayo. Adicionar 8 mL de
etanol al 95% (se debe adicionar gota a gota) procurando no mezclar ambas
soluciones. Observar la formación de un precipitado blanco. Con la ayuda de
una varilla de vidrio enrollar el precipitado.
f. Transferir el material de vidrio a otro tubo de ensayo y adicionar 0.5 mL de
agua. A esta solución adicionar 1.5 mL de reactivo de difenilamina.
g. En otro tubo de ensayo adicionar 0.5 mL de agua y 1.5 mL de difenilamina.
Colocar los dos tubos a baño de María fuerte por 10 minutos. Comparar los
resultados obtenidos.
h. El volumen restante del filtrado debe ser transferido a un vaso de precipitado y
adicionar dos volúmenes de etanol al 95%. El precipitado obtenido se transfiere
a un tubo de ensayo. Disolver el precipitado en 5 mL de agua con ayuda de la
varilla de vidrio. Dividir esta solución en dos tubos para observar las diferencias
de viscosidad en las diferentes condiciones
i. Pipetear la solución de uno de los tubos con una pipeta graduada de 0.2 mL y
cronometrar el tiempo de flujo de salida (dejar caer libremente el líquido por
gravedad) de la solución hasta extraer 0.15 mL.
j. El otro tubo debe ser calentado en baño de María por 10 minutos. Después del
período de calentamiento, proceder como en el ítem 10, anotando el tiempo de
flujo.
k. Enfriar esta solución en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 10.
l. Interpretar los resultados.
5. Cuestionario
1. ¿De qué está formada la cromatina?
2. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el hígado?, ¿para
qué añadimos arena al triturado?
3. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M?
4. ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que
finalidad.
6. ¿Cuál es la función de los dos componentes de la solución de lisis ?.
7. Como distingue la presencia del ADN
8. Que diferencias observa en la extracción de ADN de vegetales y animales.
Explique tales diferencias.

79
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 Universidade Federal Do Paraná; Departamento De Bioquímica. Bioquímica:

aulas práticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p. 2) Nelson, D.L., Cox,
M. M. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega. Capítulo 3 (2006).
3) Lewin, B. Genes VI. Oxford: Oxford University Press, 1997. Pág:1260

80
 PRACTICA 13
MICROSCOPIA

1. Objetivos

 Conocer la morfología de organismos unicelulares.

 Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

2. Fundamento

Microscopia
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no
pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio está
en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada.

Partes del microscopio compuesto

1. Parte mecánica:
 Pie
 Columna (pilar, charnela y brazo)
 Tubo: Revólver
 Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
 Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
 Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
 Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta
filtros, diafragma iris y soporte para el espejo

2. Parte óptica del Microscopio:

 Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
 Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
- Magnificación: Ej. x 25
- Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
- Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo
Planacromático
- Longitud del tubo: Ej. 160 mm
- Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
- Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador,
Diafragma

Uso del microscopio compuesto

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina
porque deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente
para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en
posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O.
para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean

81
 el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo”
debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de
aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el
revólver hasta que haga “clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la
platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si
tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al
fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la
máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje
ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla
cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del
observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el
objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento
se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor
aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-
objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el
tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el
descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente
suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en
estudio, de inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a
la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los mandos
coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo
micrométrico para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar
el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a
1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de
contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro
del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revólver,
teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y
NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo
micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro
no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el
riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el
elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el
objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que
pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe
girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte
con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular
y aclare la imagen solamente con el tomillo micrométrico.

82
 Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la
lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico
o metanol.

Aumentos del microscopio y cálculo aproximado de dimensiones celulares

1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del
objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer
el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo
que se usa.

Diámetro del campo microscópico

Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150

Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con

objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera
parte del campo microscópico, concluiremos que la
célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.

Uso del microscopio compuesto

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la
platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del
Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el
enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del
objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los
objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar
escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el
“campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de
menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre
éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz.

4. Metodología
Observe los siguientes enlaces
 https://www.youtube.com/watch?v=0tunrrm3olm
Manejo del microscopio óptico compuesto

 https://www.youtube.com/watch?v=cahttbvp45a
La vida en una gota de agua

83
 5. Procedimiento

 Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.

 Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.

6. Cuestionario

1. ¿Señale las partes de un microscopio óptico

2. ¿A qué se denomina campo óptico?
3. ¿Por qué decimos que un microscopio tiene sistema parafocal?
4. ¿Qué es el poder de resolución
5. Explique qué tipos de aberraciones se presentan en las lentes del
microscopio.
6. Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad.

7. Bibliografía

 Lanfranconi, M. 2001. Historia de la Microscopía. En: Introducción a

la Biología. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad
Nacional de Mar de Plata. 49-57.
 Locquin, M. y Langeron, M. 1985. Manual de Microscopía. Editorial
Labor S.A. Barcelona.

84
 PRACTICA 14
RECONOCIMIENTO DE ALGAS, PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS IN
VIVO, COLORACION VITAL

1. Objetivos

 Conocer la morfología de organismos unicelulares.

 Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

2. Fundamento.

Los protozoos y las algas pertenecen al reino Protista y son eucariotas unicelulares.
Los protozoos son incoloros y móviles con algunas excepciones; se alimentan por
ingestión de otros microorganismos o de partículas orgánicas. Las algas también
pueden ser pluricelulares talofíticos (no estructurado en tejidos). Las cianobacterias
pertenecen al dominio eubacteria e incluyen a un tipo de algas de organización
procariota denominadas cianofíceas o verdeazuladas que actualmente están
clasificadas dentro de las bacterias Gram-negativas (Rojas, 2011).

En la naturaleza los protozoos cumplen una función muy importante como eslabones
en la cadena alimentaria, en comunidades acuáticas y terrestres; así mismo, juegan un
papel importante en el equilibrio de muchas comunidades (Rojas, 2011).

Casi todas las algas son acuáticas, algunas se encuentran en el suelo, en rocas o sobre
los arboles cuando hay suficiente humedad. El agua es necesaria para el sostén físico,
la reproducción y la difusión de los nutrientes (Gerard, 2007). Algunas presentan
formas parecidas a las hojas, tallos y raíces de las plantas, pero estas estructuras
carecen de tejidos conductores internos y por lo tanto no se consideran verdaderas
plantas (Rojas, 2011). La identificación de las algas unicelulares y filamentosas
requiere observación microscópica.

Las cianobacterias son los únicos organismos capaces de realizar fotosíntesis

oxigénica y que también pueden fijar nitrógeno; muchos (no todos) son poderosos
fijadores de nitrógeno (Royer, 1992); estos microorganismos realizan fotosíntesis,
mediante pigmentos que les permiten usar la luz como fuente de energía, otras
dependen de compuestos orgánicos y algunas pueden utilizar incluso compuestos
inorgánicos como combustible para realizar los procesos celulares (Rojas, 2011).

El examen con coloración vital se obtiene usando soluciones muy diluidas de

colorantes no tóxicos, que se introducen por vía digestiva o por inyecciones, o que
actúan sobre células libres.

85
3. Metodología

Observe los siguientes enlaces

 https://www.youtube.com/watch?v=0tunrrm3olm
Manejo del microscopio óptico compuesto

 https://www.youtube.com/watch?v=cahttbvp45a
La vida en una gota de agua

4. Procedimiento.

Observación “in vivo” de organismos unicelulares

Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición
horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz
del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación
y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando
un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen
características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y
oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas
escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son
brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño
hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de
observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se
caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar
el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium
y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar
un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos
movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie
de su cuerpo.
6. También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo
y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada
de cilios.
7. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su
preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
8. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

86
Grafique la Observación y Resultados

87
Examen en fresco de microorganismos

1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su
examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Hay 2 tipos de técnicas:

a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre
una porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un
cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una
excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la
preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada
durante un tiempo más largo.

2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello,
determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja
concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación,
mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin
provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

Procedimiento experimental

Examen de microorganismos vivos

Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad
de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación, observación de
huevos y quistes de parásitos.
Examen en fresco

Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos

Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota
de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubre objeto.

88
 - Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de
suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de
kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.

Grafique la Observación y Resultados

Coloraciones vitales
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o
como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas.
Son montajes de materia viva teñidas.

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos,

Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes

Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de un asa de kolle
mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Grafique la Observación y Resultados

Observación de cianobacterias
Introducción
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas
propias de las células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está
rodeado por una membrana plasmática y una pared celular (como en las células

89
 vegetales), pero no hay membrana nuclear ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las
moléculas de ADN están en contacto directo con el citoplasma. Además, carecen
de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato de Golgi.
Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas
membranas llamadas tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos
fotosintéticos que utilizan para captar la energía de la luz solar y sintetizar
azúcares (fotosíntesis).

Objetivo: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio óptico

Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)

Procedimiento Experimental

1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.

2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado.
3.Agregar una gota de agua
4.Colocar el cubreobjetos.
5.Observar al microscopio.
6.Dibujar lo observado indicando aumentos.
7.Indicar las diferentes estructuras observadas.

Grafique la Observación y Resultados

5. Cuestionario

1. ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?

2. ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
3. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
4. Que tipos de células son las bacterias y cianobacterias.
5. Que estructuras comunes presentan las cianobacterias
6. Cuál es la importancia ecológica de las cianobacterias
7. Que problemas causas la presencia de cianobacterias en plantas de potabilización
de agua.
8. ¿Por qué los arroceros fomentan el crecimiento de Azolla carolininiana en los
cultivos de arroz?

90
6. Observaciones

7. Conclusiones

8. Bibliografía

 Gerard, J. 2007. Introducción a la Microbiología. Novena Edición. Panamericana

S.A. Madrid, España.

 Royer, Y. 1992. Microbiología 2. Editorial Reverte S.A. Madrid, España.

 Rojas-Triviño, A. 2011. Conceptos y Prácticas de Microbiología General.

Editorial Universidad Nacional de Colombia. Palmira. 160 p.

91
 PRACTICA N° 15
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO; COLORACIÓN SIMPLE Y
DIFERENCIAL; TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE HONGOS

1. Objetivos

 Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos

de coloración.
 Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de
los Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
 Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las
especies de Aspergillus, Penicilium y Rhizopus
 Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la
industria.

2. Fundamento.

Coloración simple y diferencial

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto

posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones
biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus
estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren
uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de
los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos
más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O,
NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales
cromóforos del compuesto.

Coloraciones diferenciales

Pared celular
El espesor oscila generalmente entre 0.150  m y 0.500  m de espesor, pudiendo
incluso alcanzar 0.8  m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son
más delgadas que las células de cultivo antiguo.

Gram positivas. La pared celular de las Grampositivas está constituida

principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes
peptídicos.
Sin embargo, estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos,
polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-
alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.

Gram negativas. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera

laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u

92
ondulante, que contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido
LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de
0.0075  m.

Preparaciones fijadas y coloreadas

Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente
a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o

sólidos.
Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de
vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda
del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. Puede prepararse una suspensión del material en una
gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola
con ayuda del asa de platino.

b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del

material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste
en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las
albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma
simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el
calor y alcohol en frío.

d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.

Clasificación de las coloraciones

La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los
cromóforos presentes.

a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico,

término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la
molécula es aniónica o catiónica.
 Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la
cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde
de Malaquita. Safranina.
 Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como
estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
 Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno
básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
 Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en
alcohol. Ej: Sudán III.

93
 Clasificación de las tinciones

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten

conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de
metileno, Tinción fucsina.

b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner

de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos
colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner

de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de
esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos

3. Metodología
o Https://www.youtube.com/watch?v=0xxd00f_ipi
Preparación de un frotis

o https://www.youtube.com/watch?v=IDGEoUU7ngo
Tinción para la observación de las bacterias del yogurt.
o Https://www.youtube.com/watch?v=bdlkr0bbcze
Tinción de Gram.wmv
o https://www.youtube.com/watch?v=fced8ffhuew
Prácticas de microbiología. Tinción de Gram. Vídeo 1

4. Procedimiento

Preparación de un frotis bacteriano: coloraciones: simple y diferencial

Preparaciones fijadas y coloreadas

Preparación del Frotis

 Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa
inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca
de la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
 Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en
posición plana en la superficie del líquido.
 Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de
éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
 Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando
una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la
muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
 Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera
bacterias que se encuentren en ella.

Fijación
 Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
 Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen,
con la muestra hacia arriba.
 Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.

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Tinciones simples

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución

acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes
diferentes, Aceite de inmersión.

Tinción de azul de metileno

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante
por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las
esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Procedimiento
 Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada
para hacer un frotis.
 Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva
en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua).
Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
 Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para
obtener la fijación del frotis.
 Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
 Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
 Secar al aire, a temperatura ambiente.
 Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

Tinción de safranina

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento
 Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada
para hacer un frotis.

95
  Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva
en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua).
Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
 Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para
obtener la fijación del frotis.
 Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja
actuar de unos 5 minutos.
 Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
 Secar al aire, a temperatura ambiente.
 Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

Coloraciones diferenciales
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram,
Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.

Tinción Gram
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular
bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente).
Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares,
poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con
un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales
bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared
celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con
el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina.
Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o
rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a
sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante
por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las
esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Reactivos
- Solución de Cristal Violeta (Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml,
Agua destilada csp=100 ml)

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 - Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua
destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina (Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, agua destilada csp=100
ml)

Procedimiento
 Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de
bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto
limpia.
 Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente
para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no
sea arrastrado durante el proceso de tinción.
 Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con
solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
 Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
 Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con
unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más
colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos. También
puede utilizar etanol comercial como decolorante, en este caso dar más
tiempo aproximadamente 1 minuto.
 Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de
caño.
 Secar al aire, a temperatura ambiente.
 Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

Fundamento de tinción y morfología de hongos

Aspergillus: Características microbiológicas

Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales,

Morfología de los conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de
Hulle y de esclerocios. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras
morfológicas del género Aspergillus:

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Penicillium
Las especies de penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de
la espora-cojinete. Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los
racimos de fíales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides,
con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes, la ramificación
es una característica importante para identificar especie del penicillium. algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. otros pueden
tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. un tercer tipo tiene ramas el
llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides.
estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate,
biverticillate y terverticillate respectivamente, colonias de crecimiento rápido, vellosas,
aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 °c (no crecen o crecen
pobremente a 37 °c) (figura 66). puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la
colonia. reverso habitualmente amarillento o cremoso. esporulación abundante. olor
aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).

Rhyzopus

Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo,
fruta que se decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del
Rhizopus son causas ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar
infecciones serias (y a menudo fatales) en seres humanos y animales debido a su tarifa de
crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de la planta, y uno, oligosporus del
Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado derivado de las
sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los
sporangiospores son el interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y
son genético idénticos a su padre, los zygospores se producen después de que dos mycelia
se fundan durante la reproducción sexual, y dan lugar a las colonias que pueden ser
genético diferentes de sus padres.

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 Mucor
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden
lentamente los medios de cultivo.

Procedimiento tinción y morfología de hongos

Materiales
 Asa de kolle  Láminas portaobjetos
 Mechero  Láminas cubreobjetos
 Azul de lactofenol  Microscopio
 Muestras de alimentos con hongos
 Cultivo de Aspergillus niger
 Cultivo de Penicillium

5. Cuestionario: coloración simple y diferencial

1. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
2. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
3. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las bacterias?
4. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
5. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
6. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos
grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
7. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos
gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos.
8. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.

6. Cuestionario: tinción y morfología de hongos

1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus
2. ¿Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium?
3. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus, y 4 aplicaciones del Penicillium
4. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del Penicillium
5. ¿Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
6. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes
7. Indique Ud. Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor,
Rhyzpopus y una Absidia
8. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos

7. Observaciones

8. Conclusiones

9. Bibliografía

- Vizcarrondo, M. Gutiérrez, S. 2001, laboratorio de microbiología- morfología y

tinción del microorganismo, trabajo practico [noviembre 2001] pag. 6.2 – 6.7

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- L.M Presscott, J.P. Harley, D.A Klein. Microbiology. s.l.: McGraw-Hill, 2002.
[3] T.D

- Brock, D.W. Smith, M.T Madigan. Microbiología. Barcelona: 4ta ed. Ed. Prentice
Hall, 1987.

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