UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE
PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERÍA QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA
BIOQUÍMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos
Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
Ing. T. Ross Mery Cuadros
Castillo
 PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto de hacer llegar al

interesado los alcances actuales de la bioquímica aplicada en el laboratorio.

Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el
desarrollo de la biología molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la
bioquímica como consecuencia natural.

La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica han determinado el

gran impulso que la bioquímica aplicada ha dado a la nueva tecnología de los
bioprocesos.

Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el conocimiento

previo de la biología y de la bioquímica aplicada.

La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de Ingeniería Química las

destrezas básicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el
estudio práctico de la bioquímica.

Los Autores

ÍNDICE

PROLOGO

ÍNDICE

Págs.
PRÁCTICA 1 SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS................3

PRÁCTICA 2 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS

PROTEÍNAS...................................................................................................................11

PRÁCTICA 3 SEPARACION Y CUANTIFICACION ESPECTROFOTOMÉTRICA DE

PROTEÍNAS...................................................................................................................18

PRÁCTICA 4 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL..............................30

PRÁCTICA 5 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS...............................35

PRÁCTICA 6 PRODUCCION DE BIODIESEL...................................................................................42

PRÁCTICA 7 INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE

ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA............................52

PRÁCTICA. 8 EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES..............................................................56

PRÁCTICA 9 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.........................61

PRACTICA 10 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.....................................................................67

PRACTICA 11 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS..................................................................74

PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO....................................................79

INSTRUCCIONES GENERALES

A. Busca los conceptos antecedentes y repórtalos, previo a la realización de

la práctica.

B. Construye la hipótesis de trabajo, antes de solicitar el material.

2
 C. Lee cuidadosamente los experimentos antes de ejecutarlos.

D. Recurre a tus libros de texto y/o de consulta para aclarar dudas y

comprender el porq ué de las operaciones que se han efectuado; o consulta
de inmediato al profesor responsable.

E. Realiza cuidadosamente tus experimentos, procurando entender el

porq ué de los hechos acaecidos.

F. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa

minuciosamente y anota los cambios ocurridos: (olor, color, gases,
liberación o absorción de calor, etc.), en tu manual o cuaderno.

G. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario para su

futura revisión.

H. Elabora tus conclusiones.

Material necesario para trabajar por alumno:

a) Individualmente: U n a bata de trabajo con manga larga.

b) Por equipo: Una cinta masking-tape de 1/2 pulgada, un paquete de
toallas de papel, un marcador indeleble, un lienzo para limpiar la mesa.

3
PRECAUCIONES EN EL DESARROLLO DE CADA EXPERIMENTO

Las medidas oportunas y la comprensión de las prácticas a seguir, hará del

laboratorio un lugar seguro como cualquier salón de clases. Para ello deberán
tenerse en cuenta, en forma general, las siguientes precauciones:

1. Observa dónde dejas el material caliente, cerciorándote de que esté frío

antes de tomarlo con la mano.

2. Cuando calientes un tubo de ensaye, no lo apuntes hacia ti o hacia tus

compañeros, puede proyectarse su contenido.

3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lávate inmediatamente con

agua abundante y llama a tu instructor.

4. Nunca pruebes una sustancia si no se te indica. Puede ser veneno.

5. Al detectar el olor de un líquido, no pongas la cara sobre la boca del

recipiente. Con tu mano abanica hacia ti el aroma.

6. Antes de usar un reactivo, lee dos veces la etiqueta para estar seguro de
su contenido.

7. Los aparatos o recipientes en los que haya desprendimientos gaseosos

no deben cerrarse herméticamente, pues las presiones formadas en su
interior pueden explotarlo.

8. Los tubos de ensaye no deben calentarse por el fondo sino por las paredes,
para evitar la expulsión de su contenido.

9. No arrojes cuerpos sólidos en los lavabos, a menos que estén

pulverizados y sean fácilmente solubles en agua. No viertas directamente
los ácidos en los lavabos, ya que los corroe.

10. Cuando interrumpas un experimento, coloca etiquetas con leyendas

apropiadas a los frascos y matraces que contengan sustancias, así te será
fácil identificarlos.

11. Cuando trabajes con fuego, mantén tu cabello recogido para evitar se
incendie.

12. Cuando necesites encender el mechero, nunca lo hagas con un papel,

puede iniciar un incendio.

4
El profesor indicará el uso adecuado y la ubicación de las instalaciones de
agua, luz, drenaje, gas, y otras que existen en el labora- torio. Se recomienda
que los alumnos realicen un croquis de dichas instalaciones y practiquen
simulacros de evacuación del edificio.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO

1. Tendrán derecho al acceso y uso de laboratorio únicamente los alumnos que

están matriculados en el curso respectivo o las personas debidamente
autorizadas por la Dirección.

2. Los alumnos respetarán durante todo el período de prácticas el horario

que tengan asignado.

3. Los alumnos se presentarán a la práctica en su horario asignado acompañados

de su profesor.

4. En las prácticas de la primera hora (7:00 a.m.), habrá una tolerancia máxima de
15 minutos para ingresar al laboratorio.

5. A partir de las 8:00 a.m., el alumno tendrá 10 minutos de tolerancia para

presentarse al laboratorio.

6. No se permitirá la entrada al laboratorio si el alumno no se presenta con su

bata.

7. En ningún caso el alumno podrá sustraer del laboratorio, aparatos o materiales

sin la autorización respectiva por escrito.

8. Es obligación de los alumnos conservar en buen estado las instalaciones,

materiales y equipo del laboratorio, así como mantenerlo aseado, depositando la
basura en los cestos que para tal efecto existen.

9. El material y equipo de laboratorio recibido deberá ser revisado de inmediato

y reportar cualquier anomalía o desperfecto al responsable de laboratorio.

10. Es obligación del alumno entregar al responsable de laboratorio el material y

equipo usado, limpio y en buen estado, 5 minutos antes del término de la sesión
de práctica

11. El material o equipo que se deteriore o se pierda será repuesto por los
responsables en un plazo no mayor de 5 días hábiles, de lo contrario se perderá el

5
derecho de uso de laboratorio.

12. Sin excepción de persona, está prohibido fumar e ingerir alimentos y bebidas
en el interior del laboratorio.

13. Las prácticas realizadas y reportadas en un curso no son transferibles a otros

alumnos.

14. Si por causas de fuerza mayor se suspendiera alguna práctica programada en el

curso, ésta se realizará en la sesión inmediata sin perjuicio para el alumno.

15. Las prácticas se evaluarán de acuerdo al criterio del profesor de cada asignatura.

16. Los alumnos que muestren indisciplina dentro del laboratorio serán sancionados
de acuerdo a la gravedad de su falta ya que este tipo de conducta puede originar un
accidente.

6
 PRÁCTICA 1
PRÁCTICA 1

SEPARACIÓN EN CAPA FINA

SEPARACIÓN EN CAPA FINA
DE UNA MEZCLA
DE UNA DE
MEZCLA DEAMINOÁCIDOS
AMINOÁCIDOS

7
I. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de
aminoácidos presentes en una muestra biológica.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o
alcalina; éste proceso rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los
cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por métodos
cromatográficos.
 Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para
formarlos son los a -aminoácidos.

 Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.

 In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
 El pKa de los grupos carboxilo y amino de los alfa -aminoácidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
 Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá
perdido un protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la
forma ZWITTERION.
 En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos
que se incorporan a las proteínas.
 Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
 Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos
modificados que se hallan en las proteínas.
 La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas,
básicas, neutras) permite una gran complejidad funcional en las
proteínas.
CROMATOGRAFÍA
Método de Separación

8
  Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente
relacionados presentes en mezclas complejas.
 En estos métodos se emplea:
- Fase estacionaria : Sólido/líquido
- Fase móvil : liquido/gas
 “Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase
estacionaria por medio de una fase móvil que fluye”.
 Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración
entre los componentes de la muestra.
Cromatografía en Capa Fina
 Tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
 El soporte o Fase Estacionaria.
Es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido pueden ser.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de

SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de
la migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.

III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.
 Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha
entre 1 y 2 mm de diámetro.

9
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusión

 Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de
un solvente de elusión.
 Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

“El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.

 El solvente comienza a subir por capilaridad.
 Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarán rápidamente otros no.

Tercer Proceso: Visualización o Revelado

El producto puede verse:
 Por sí mismo porque tiene color.
 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.
 Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dónde está la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.
 Usando métodos químicos, usando una sustancia química como revelado, ( en este
caso ninhidrina en butanol, acetona, etanol)

10
 Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo R F

que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una

sustancia patrón en idénticas condiciones.
“La razón de estas distancias se designa por Rf”

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

 Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
 Corrida cromatográfica. Elusión
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación
cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte
superior de la placa.
 Revelado del cromatograma
- Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.
- Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa
con ayuda de una secadora de cabello.

11
 - Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en solvente sobre la placa.
Secar la placa con una secadora.
 Identificación
Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a
aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rfde los estándares y
luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una
coloración azul violeta.

V. CUESTIONARIO:
5.1. Dibuje un esquema, que represente de los resultados observados. (indicar
distancias recorridas)

5.2. Calcular los Rf de los estándares y muestras, y complete la tabla.

Aminoácidos patrón Rf de patrón Rf en Muestra

5.3. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de

intercambio iónico y cuáles son sus aplicaciones.

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5.4. Qué métodos existen para identificar a los aminoácidos.

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5.5. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y
alúmina.
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5.6. Haga el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.

5.7. Explique el mecanismo por el cual, se separan los aminoácidos en la

cromatografía de capa fina..
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VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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 PRÁCTICA 2

PRÁCTICA 2

PROPIEDADES
DETERMINACIÓN DE LASQUÍMICAS
DE LAS PROPIEDADES PROTEÍNAS
DE LAS
PROTEÍNAS

15
I. OBJETIVOS:
Identificar propiedades de las proteínas, solubilidad y capacidad espumante.

II. FUNDAMENTO:

II.1. Punto isoeléctrico:

Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan
en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga
total que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga neta, dependiendo del pH del medio en el
que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas los
ligandos que se encuentren unidos a la proteína.

Según el tipo de aminoácido, estos pueden existir en tres formas dependiendo del pH
del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Las proteínas tienen carga neta positiva si se encuentran en un medio lo
suficientemente ácido, debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico
y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y
+
lysina estarían protonados (-NH3 ).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría
cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían
-
desprotonados (COO ) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su
carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI).

En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y

negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada
al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solución en
la cual se encuentran; cuando se neutralizan, precipitan.

II.2. Caseína:

La caseína es una fosfoproteína (conjugada) de la leche que se separa de la leche por

acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas
que están químicamente unidas con ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los
grupos fosfato están unidos a los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y
treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato
cálcico), y representa del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche bovina y
el 2,7% de la leche líquida.
Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones,
lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen
total de la leche.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la

leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y

16
 solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la
superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína
neutra precipita

2+
Ca Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2

La caseína es una proteína globular, con alto número de residuos de prolina, que
causan un especial plegamiento en la cadena de proteína. La caseína no contiene
puentes di sulfuro, y su estructura globular es importante para la estabilidad frente a la
desnaturalización por calor.
En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidos y en soluciones salinas
tales como oxalato sódico y acetato sódico.

II.3. Generación de espuma.

La funcionalidad de las proteínas ha sido definida como las propiedades físicas y
químicas de las moléculas de las proteínas que afectan a su comportamiento como
producto. Tres de las más importantes propiedades funcionales de las proteínas en
los alimentos incluyen la solubilidad, la emulsificación y la espumación.
- Las emulsiones pueden contener agua, aceite y proteína. El pH, la concentración
de sales, la temperatura, el tipo y cantidad de aceite, la concentración de
proteínas, el aporte de energía y la temperatura durante la formación de la
emulsión afectan las propiedades de la emulsión final. Estos parámetros deben
ser seleccionados antes de establecer un procedimiento.
En una emulsión de aceite en agua, la capacidad emulsionante es una medida de
la cantidad de aceite que puede ser emulsionada por una cantidad normalizada
de proteína en una disolución acuosa, antes de que colapse o “se corte” la
emulsión.
La estabilidad de la emulsión se ensaya agitando una emulsión a una velocidad
y durante un tiempo dados, y determinando la cantidad de aceite que se separa.
Otro método es medir la variación en la distribución de tamaño de partícula de
la fase dispersa, a lo largo del tiempo.
- Las espumas son dispersiones de burbujas de gas en una fase continua líquida o
semisólida. Las espumas requieren un aporte de energía durante su formación y
son inherentemente inestables. Tres métodos comunes para la formación de
espumas son el batido, la agitación y el rociado (la inyección de gas, o
“sparging”).
El volumen y estabilidad, son los parámetros utilizados para evaluar las
espumas.
El volumen de la espuma depende de la capacidad de una proteína para bajar la
tensión superficial entre la fase acuosa y las burbujas de gas. Se anota el
volumen de espuma generado durante un proceso de espumación, y se compara
con el de otras espumas formadas bajo condiciones idénticas. El esponjamiento
o expansión de la espuma se calcula como:

( peso 100 mL líquido− peso 100 mL espuma)

Esponjamiento(% )=
( peso de 100 mL de líquido)

La estabilidad de la espuma depende de las propiedades de la película de

proteína formada alrededor de las burbujas de gas.

17
 El volumen y la estabilidad de una espuma dependen del aporte de energía, del
pH, de la temperatura, del tratamiento térmico, y del tipo y la concentración de
los iones, los azúcares, los lípidos y las proteínas presentes en la espuma. Por lo
tanto, todas estas variables, con la excepción de aquella que se está ensayando,
deben estar normalizadas cuando se diseña un procedimiento para medir las
propiedades de la espuma.

III. MATERIALES
Para el experimento 1.
13 tubos de ensayo de 10 X 150 mm, Balanza analítica
1 pipeta de 10 ml, 5 pipetas de 5 ml, 1 pipeta de 5 ml, 1 gradilla
Caseína, agua destilada.
Para el experimento 2.
Probetas de 25 mL, Embudos
Claras de huevo, Azúcar común, Jugo de limón, Yema de huevo, Batidora,
Recipiente para el batido. Licuadora

IV. METODOLOGÍA:

Parte 1. Solubilidad de proteínas.

En esta práctica se provoca cambios de solubilidad en proteínas, mediante la
modificación las propiedades de los solventes.
A. Aislamiento de la caseína:
- Caliente en un vaso de precipitado 150 ml de agua destilada a 38ºC, añada
50 ml de leche y luego adicione ácido acético 1M, gota a gota agitando hasta
que se forme un precipitado (la leche se corta).
- Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
- Lave el precipitado con 20 ml de etanol en el mismo filtro.
- Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
- Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente
pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5 ml/g de
éter etílico.
- Filtre nuevamente.
- Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación
que es la caseína.
B. Preparación de la solución de caseína:
- Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50 ml.
- Agregue 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solución total de la caseína.
- Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione
5 ml de ácido acético 1N, diluya con agua destilada hasta 50 ml y mezcle
bien.
- La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.

18
- Preparar 10 tubos como se indica a continuación.
- Mezclar bien, esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad
de la caseína en cada tubo.

Tub p Agua Ac. Ac. Ac. Caseinat Solubilidad

o H destilad Acético Acético Acético o de
a 0.01N 0.1 1.0N Sodio
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0
4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0
10 5.8 0 0 3.2 1.0

Reportar el punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor

precipitación.

Parte 2. Capacidad espumante.

Separar la clara de la yema de 4 huevos. Agitar suavemente las claras para
homogenizar sin provocar espumado.
Pesar 30 g de clara y 10 g de agua destilada (control)
Colocar todo en el recipiente y batir, usando la batidora a velocidad 3 durante 3
minutos.
Colocar la espuma formada dentro del embudo y éste a su vez dentro de la probeta.
Medir el volumen escurrido a diferentes tiempos (5, 10, 15 y 20 minutos).
Tomar una pequeña muestra y observar al microscopio a tiempo 0 y 20 minutos.
Hacer foco utilizando un aumento de 10X y tomar foto.
Repetir el ensayo para las siguientes muestras:
a) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar al inicio
b) 30 g de clara + 10 g de agua + 25 g de azúcar a los 2 minutos de batido
c) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de sal al inicio
d) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de yema al inicio
e) 30 g de clara + 10 g de agua + 2 g de limón
Calcule la expansión o esponjamiento de las espumas obtenidas a tiempo 0.
Realizar una gráfica de volumen escurrido (ml) versus tiempo (min) para las
diferentes muestras y analizar los resultados.
Comparar la distribución de tamaño de burbujas.

V. CUESTIONARIO:
6.1. De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el agua.
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6.2. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca, en la caseina la

adición de un ácido, y la relación con su PI
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6.3. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca, en la caseína la

adición de una base fuerte.
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6.4. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

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6.5. Qué es el Saltingout y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

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6.6. Qué es la ecuación de Henderson - Hasselbach y en qué casos está indicado

utilizarse.

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6.7. Investigue la composición química y el pI de la clara de huevo y explique su

comportamiento con respecto a la formación de espuma.

6.8 Como afectan la temperatura, el pH, las sales, el azúcar (es) y la presencia de grasas
en las propiedades espumantes de las proteínas.

VI. OBSERVACIONES
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VII CONCLUSIONES

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VII. BIBLIOGRAFÍA
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PRÁCTICA 3

SEPARACION Y CUANTIFICACION
PRÁCTICA 3
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS
PROTEÍNAS

22
I. OBJETIVO
1. Determinar la concentración de una solución de proteínas mediante la reacción de
Biuret y el espectrofotómetro.
2. Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o solución que las
contenga..

II. FUNDAMENTO:

2.1. Espectrofotometría.

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la

reacción del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solución alcalina. La
reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares
de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos.

Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen un color

violeta
característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solución
alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir enlaces
químicos entre los pares de electrones libres del átomo de nitrógeno presente en
los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu+2 y las
diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo tanto, se puede
utilizar una proteína como patrón de calibración. La curva de calibración
obtenida por este método, se hará utilizando como patrón solución de extracto
de levadura, cuya concentración es de 8 mg/ml preparada con agua destilada.

Espectrofotometría. Principios básicos

La reacción de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentración de
proteínas, mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color

23
 formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones
colorimétricas.

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la

sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando
un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o
espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma
ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por
sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las
radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores
del arcoíris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una
longitud de onda específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que
emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y
atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad
de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se
utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz
( a la longitud de onda de máxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz

incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre luz
incidente (Io) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha
sido absorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs) ó
Densidad Óptica (DO)

Laley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Siendo e el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una

longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la
concentración de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayoría
de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor,
por lo que 1 se puede ignorar. Así la concentración desconocida de la sustancia
será:

C = Abs /e

2.2.- Diálisis.

La diálisis es una técnica que separa las moléculas de acuerdo a su tamaño usando
membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las
macromoléculas que se deseen separar como las proteínas, los poros permiten la
difusión de las moléculas de solventes, sales y otras moléculas pequeñas, pero
bloquean el paso de proteínas por su gran tamaño.
Se usan membranas de celofán (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodión, u otras
de naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusión por diferencia de concentración

24
III. MATERIALES Y EQUIPO

Para la parte 1.
Espectrofotómetro, Gradilla para tubos de ensayo, Tubos de ensayo. Vasos de
precipitado. Probetas, Pipetas
Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret.
Para la parte 2.
01 pliego de papel celofán.
1Kg de azúcar, Solución de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml., Vaso de precipitados, Piceta.

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Parte 1. Espectrofotometría.

Realización de una curva patrón: Como se desconoce el coeficiente de extinción

molar (€) de las proteínas coloreadas con el reactivo biuret, se procederá a construir
una curva patrón, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones
conocidas de proteína, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solución
problema y determinar su concentración gráficamente y también por regresión
lineal. Para ello se dispone de una solución de 10 mg/ml de proteína (extracto de
levadura) a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf
Dónde:
Ci = concentración de la solución madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial
Cf= concentración final de la solución a preparar
Vf= volumen total final de la solución a preparar

En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre (Ci=10 mg/ml) las

soluciones de la tabla.

25
 Conc. Volumen Volumen Volumen Volumen Abs.
Final. Sol. Sol. agua Rx. Final 570nm
a preparar Madre Biuret
inicial

Tubo Mg/ml ml ml ml ml

Blanco 0 0,0 4,0 4 8

1 0,5 3,5 4 8

2 1,0 3,0 4 8

3 1,5 2,5 4 8

4 2,0 2,0 4 8

5 2,5 1,5 4 8

6 3,0 1,0 4 8

7 3,5 0,5 4 8

8 4,0 0,0 4 8

Muestr 4,0 0,0 4 8

a

Al añadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia.

Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de máxima absorbancia para
la reacción del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo blanco, secarla y
limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las
soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentración.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye
una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de
abscisas y las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su
concentración.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentración y que la relación es lineal: Y = a + b X (Y = A + B x
Conc.). Utilizando regresión lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B
y se puede despejar concentración que en este caso es de la muestra
desconocida.

26
4.2. Parte 2. Diálisis.

- Preparar una bolsa con el papel celofán, de modo que no se presenten fugas al
llenarla con una solución.
- Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solución de proteína al 0.5%.
- Comprobar la concentración de proteína con el espectrofotómetro a 280 nm.
- Llenar la bolsa de celofán con 50 ml de solución proteica, usando para tal fin la
pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.
- Preparar un tazón con azúcar, y colocar allí la bolsa de celofán conteniendo la
solución proteica.
- Untar toda la bolsa de celofán, con el azúcar, cubriéndola por completo.
- Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azúcar, observando los cambios ocurridos.
- Medir el volumen de líquido que quedó en la bolsa de celofán y comparar con el
volumen inicial.
- Mediar nuevamente la concentración de proteínas en el espectrofotómetro a 280 nm.

V. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la concentración de proteínas de la muestra?

5.2 ¿Se podría determinar la concentración de cualquier muestra de proteínas con

esta curva patrón?

5.3 ¿Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la reacción del Biuret?

27
 5.4. Señale las principales técnicas de separación de solutos por membrana, y
las principales aplicaciones de cada una de ellas.

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______________________________________________________________
______________________________________________________________

5.5. Investigue la composición química de la membrana utilizada y explicar

las razones de su porosidad.

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______________________________________________________________
____________

5.6 Efectúe los cálculos de variación en el volumen y la concentración de la

proteína en solución.

5.7. Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solventes por

osmosis.
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VI. OBSERVACIONES
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. BIBLIOGRAFÍA
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29
 PRÁCTICA 4

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
PRÁCTICA 5
POR MICRO-KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL

30
I. OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en una muestra
desconocida.

II. FUNDAMENTO
El método de micro-kjeldahl es una simplificación hecha por HACH en el proceso
Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo análisis en un tiempo corto y con
pequeñas muestras.
Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las proteínas a nitrógeno
inorgánico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por acción del ácido sulfúrico en presencia
de oxidantes fuertes (peróxido de hidrógeno), de esta manera todo el carbono
presente se libera como CO2 y nitrógeno como NH3, luego este se combina
con el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la acción de un
álcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solución de ácido
débil en presencia de colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte cuantificando el nitrógeno
presente.
Luego se aplica la relación siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dónde: ml.N.fc.meq = peso de nitrógeno en la muestra
ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml)
N. normalidad del ácido
Fc. Factor de corrección del ácido
meq.= peso del miliequivalente del nitrógeno
Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples con 16% de N, el
porcentaje de proteínas será:
Proteína = 6.25xN

III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinación se hace en tres etapas:

DIGESTIÓN.
 Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es sólido) y colocar en el
matraz de digestión
 Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz
 Verificar que el control automático del digestor este en 440ºC y que haya
succión en la columna de fraccionamiento.

31
  Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado la temperatura
indicada.
 Añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de un
embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna
incoloro, añadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se
aclare.
 Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de
fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se
haya enfriado.
 Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.

DESTILACIÓN
 El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un balón de destilación.
 Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de ácido bórico al 4%
( en volumen) adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo,
dando una coloración violeta.
 El balón de destilación que contiene el digesto se añade 13 a 15 ml de
hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
 Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto durante unos 10 a
20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloración verdusca y su
volumen sea más o menos 3 veces del volumen inicial)

TITILACIÓN.
 Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y valorizarla.
 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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________

Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas simples y dos proteínas

conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el
proceso de determinación del nitrógeno

32
 Efectué los cálculos y determine el contenido de proteínas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante la etapa de digestión

Explique el objetivo de la etapa de destilación.

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Explique porque la titilación se hace con ácido sulfúrico y no con un álcali.

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V. OBSERVACIONES

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 ___________________________________________________________________
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VI. CONCLUSIONES

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VII. BIBLIOGRAFÍA

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34
 PRÁCTICA 5
PRÁCTICA 6
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
DE CARBOHIDRATOS

35
I. OBJETIVOS:
 Diferenciar experimentalmente monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
 Identificar la función y propiedades de los carbohidratos.
 Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono en reductores y no
reductores.
 Estudiar las propiedades del almidón.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Se denominan carbohidratos o glucósidos los derivados aldehídicos cetónicos,
reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensación
según la cantidad de glucósidos o azúcares sencillos que se obtengan por hidrólisis
de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacáridos (celulosa, almidón)
Trisacáridos (rafinosa)
Disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacáridos
Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o cetosas por el.
número de átomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa,
fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y
oxhidrilo y, además, algunas específicas. Todos son óptimamente activos. Por el
calor y la acción de ácidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados
del furfural.
Los ácidos fuertes inorgánicos calientes deshidratan a las hexosas formando
derivados furánicos como el hidroximetil furfural, que puede posteriormente
descomponerse y formar otros compuestos como el ácido levulínico y el ácido
fórmico. Por otra parte, a las pentosas las deshidratan produciendo furfural. Estas
reacciones son la base de las pruebas de Molish, Seliwanoff, Tollens y Bial para
caracterizar a los carbohidratos, ya que el producto deshidratado del carbohidrato se
condensa con el reactivo correspondiente, produciendo compuestos coloridos
característicos
Todos los tipos de almidón producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de
indicador cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidón.
La hidrólisis del almidón catalizada por ácidos lo convierte en varias clases de
dextrinas, en maltosa y por último en D (+) glucosa.
Los álcalis pueden inducir varias reacciones químicas en los monosacáridos que
dependen de la intensidad del tratamiento y de la concentración del álcali. A bajas
concentraciones (0.5 N) se favorece la isomerización y el equilibrio ceto-enólico
(aldosas cetosas). En condiciones fuertemente alcalinas se generan ácidos sacáricos.
Una reacción característica de los carbohidratos está basada en el poder reductor
que le confiere su grupo aldehído o cetona.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis puesto que la
coloración va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular
delcompuesto orgánico.

36
 Los grupos funcionales existentes en el almidón y en la celulosa son los grupos
hidroxilo y acetal. Estos polisacáridos tienen diferente configuración, siendo el
almidón un glucósido y la celulosa un f -glucósido. También difieren en el tamaño
teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidón.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

 Reactivo Molisch  Tubos de ensayo
 Reactivo Fehling  Pipetas
 Reactivo Tollens  Baño de agua hirviente
 Reactivo Seliwanoff  Pinzas
 Reactivo Barfoed  Baño hirviente
 Sol. glucosa 1%  Vaso de precipitados
 Sol. fructuosa 1%  Luna de reloj
 Sol. sacarosa 1
 Sol. lactosa 1%
 Sol. almidón 1%
 Sol. sacarosa 5%
 Sol. HCl 10%
 Sol. NaOH 10%
 Sol. yodo - yodurado

IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genéricas de los carbohidratos
 Reacción de Molisch
La prueba de Molish está basada en la formación de furfural o derivados de
éste a partir de los carbohidratos, que se condensan con el alfa-naftol, dando un
producto violeta.
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solución de glucosa
al1%, 1 ml. de solución de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solución de
sacarosa al 1%, 1 ml. de una solución de lactosa al 1%, 1 ml. de una solución
de almidón al 1% y en el último 1 ml. de agua (testigo). A cada una agréguele
2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml.
de ácido sulfúrico concentrado.
Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase entre los dos
líquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.
Reacciones Específicas
 Reacciones de Fehling
La reacción de Fehling está basada en la acción reductora que tienen los
azúcares sobre los iones cúpricos en medio alcalino.

37
 Carbohidrato + Cu2 + álcali_ Carbohidrato oxidado + Cu+
El reactivo de Fehling está constituido por dos soluciones que se mezclan al
momento de usarse (Solución A de sulfato de cobre y solución B de tartrato de
sodio-potasio en medio alcalino).
El poder reductor de los oligo y polisacáridos depende, del número de
carbonilos potencialmente libres que no estén involucrados en enlaces
glicosídicos
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solución A de Fehling
con 0.5 ml. de la solución B de Fehling, agrégueles 1 ml. de la solución de los
carbohidratos utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay cambios de color,
formación de precipitados.
 Reacción de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens
recientemente preparado, añadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de
carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay formación de espejo
de plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reacción.
Realice una comparación de estos resultados con los de la prueba de Fehling.
 Reacción de Seliwanoff
Es una reacción para diferenciar cetosas de aldosas; aunque ambas dan la
reacción, las cetosas la dan rápidamente y las aldosas lentamente. Está basada
en la formación de durfural o en un derivado de éste y su posterior
condensación con el resorcinol, dando un color rojo fuego para cetosas y rosa
para aldosas
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego añada 3
gotas de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los
tubos a baño hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color
adquirido.
 Reacción de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego añada 1 ml. de
solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a
baño hirviente y observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo,
lo que indicará la presencia de monosacáridos.
Los disacáridos también precipitan óxido cuproso, pero muy lentamente.
 Hidrólisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solución de sacarosa al 5%, llévelos a
baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes iguales de agua para el primer
tubo, ácido clorhídrico al 10% en el segundo tubo, e hidróxido sódico acuoso al
10% en el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuación la reacción
de una porción de cada mezcla con la solución de Fehling. ¿Qué conclusiones
deduce?

38
  Ensayo del Almidón frente al Iodo
El yodo es atrapado por los polisacáridos y dependiendo de la estructura de
éstos da una coloración característica; si el polisacárido es lineal se obtendrá
una coloración azul, pero si es ramificado, la coloración obtenida va del
púrpura al rojo.
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%, añada una
gota de solución de Iodo - lodurada, observe el color de la solución. Luego
caliente la solución coloreada a ebullición y observe el efecto, observe también
qué efecto produce el enfriamiento de la solución.
 Hidrólisis del Almidón
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de almidón al 1%, añada
1 ml de ácido dorhídrico concentrado. Hierva la solución y retire muestras de Y
ml. a intervalos próximos, ensayando su reacción frente al iodo. Anote el color
en los diferentes ensayos.
Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo, neutralícela y
ensaye la reacción de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente
los productos finales de la hidrólisis del almidón (un disacárido y un
monosacárido).

V. CUESTIONARIO:
5.1. Presente un resumen de los resultados en la tabla siguiente:
Molish Tollens Seliwanof Fehling Solubilidad Yodo
BLANCO
(AGUA)
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Fructuosa
Almidón

5.2. Indique la composición de los reactivos utilizados en la práctica (R. Molish,

R. Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

39
5.3. Elabore un diagrama de flujos del proceso de producción de la glucosa a nivel
industrial.

5.4. Porque las reacciones de Felhing y Tollens deben hacerse en medio alcalino?.

5.5. Si cuenta con una solución de sacarosa, indique como podría cuantificarla.

5.6. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras de almidón?
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______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

5.7. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis del almidón?
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40
VI. OBSERVACIONES
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. BIBLIOGRAFÍA
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41
 PRÁCTICA 6

PRODUCCION DE BIODIESEL

42
I.- OBJETIVO
Aplicar los conocimientos de estructura y reacciones de los glicéridos a la producción
de un biocombustible derivado.

II.- FUNDAMENTO

2.1. Características químicas de los aceites

Los aceites, y las grasas, son esteres triglicéridos de glicerol (propanotriol). El cual es
capaz de enlazar tres radicales de ácidos grasos, que pueden ser distintos entre sí;
pueden ser saturados o insaturados, formando un triacilglicérido. Los radicales grasos
pueden ser desde 12 carbonos de cadena hasta 24 carbonos de extensión de cadena, y
se pueden clasificar en insaturados y saturados.
Estos ácidos son los llamados ácidos grasos insaturados o ácidos grasos esenciales,
como:
Ácido linoleico C 18:2
Ácido linolénico C 18:3
Ácido oleico C 18:1
Ácido palmitoleico C 16:1
Los ácidos grasos saturados son los siguientes:
Acido estaearico C 18:0
Acido palmítico C 16:0

Los aceites y grasas pueden ser caracterizados según sus propiedades físicas (densidad,
viscosidad, punto de fusión, índice de refracción) o químicas (índice de acidez, índice
de yodo, índice de peróxido, índice de saponificación, índice de éster.

Densidad. La densidad de los aceites vegetales varía dependiendo de su tipo y de la

temperatura a la que se encuentre, la densidad estándar para los aceites vegetales va de
un mínimo de 0.90 g/ml a un máximo de 0.93 g/ml a una temperatura media de 15°C.

Viscosidad. La viscosidad es una medida de la fricción interna entre moléculas, o de la

resistencia a fluir de los líquidos. En general, la viscosidad de los aceites desciende con
un incremento en la insaturación y con un decrecimiento del peso molecular de sus
ácidos grasos

Porcentaje de ácidos grasos libres (AGL). Puede expresarse también como porcentaje de
ácido oleico, palmítico o láurico, según el ácido graso que predomine en la grasa en
cuestión. Los aceites y grasas refinados deben tener un nivel de ácidos grasos libres
inferior al 0,2% como ácido oleico para ser aptos para su uso en alimentación Sin
embargo, los aceites crudos y los usados previamente de frituras, comúnmente tienen un
contenido de ácidos grasos libres significativamente superior a éste (2% o más). Este
índice es particularmente importante para el proceso de producción de biodiesel
(transesterificación), ya que los ácidos grasos libres reaccionan con el catalizador de la
transesterificación (NaOH ó KOH) formando jabones (saponificación), lo cual lleva a
un menor rendimiento en la producción de biodiesel. La saponificación no sólo
consume el catalizador necesario para la transesterificación, sino que además los
jabones producidos promueven la formación de emulsiones que dificultan la
purificación de biodiesel.

43
Índice de refracción. El valor del índice de refracción está relacionado con el grado de
saturación y es un indicativo de la pureza del aceite.

Índice de peróxido. El índice de peróxido (IP) mide el grado de oxidación primaria que
ha sufrido la grasa o aceite. Los peróxidos son los productos de descomposición
primaria de la oxidación de las grasas, cualquiera sea su composición. Se forman en los
puntos de insaturación de las cadenas de carbonos de los ácidos grasos. La velocidad de
oxidación crece con un incremento en la temperatura, con la exposición al oxígeno del
aire, presencia de luz y contacto con materiales pro-oxidantes por ejemplo, el cobre
metálico, latón, bronce u otras aleaciones que contengan cobre.

II.2. El Biodiesel
El biodiesel es un combustible renovable derivado de aceites o grasas de origen vegetal
o animal. Como combustible, el biodiesel puede ser usado en forma pura o mezclado
con diesel de petróleo.
Es un monoalquil éster de un ácido graso de cadena larga derivado de aceites vegetales
o de grasas animales, que se utiliza en motores de ignición por compresión (llamados
Diesel).
Por transesterificación los aceites se combinan con un alcohol (etanol o metanol) y se
alteran químicamente para formar ésteres grasos como el etil o metil éster. Los
productos originados son: glicerina y metiléster.
En la reacción de transesterificación se sustituye el glicerol por etanol o metanol, se
forman así los metil o etil ésteres de los mismos ácidos grasos. Esto se puede lograr
tratando los triglicéridos con metanol o etanol en medio ácido o alcalino y la mezcla
obtenida se separa en dos fases correspondientes al biodiesel y al glicerol (glicerina). El
glicerol obtenido como subproducto tiene aplicaciones en otros sectores industriales,
contribuyendo a la rentabilidad del proceso.

44
 Se da la circunstancia de que los productos: glicerina (o glicerol) y biodiesel (o éster
metílico), son inmiscibles, lo que propicia que se separen de forma espontánea
forzando a que la reacción continué desplazándose hacia la síntesis de productos. Este
proceso no requiere aporte de energía lo cual es importante al hacer el balance global
del proceso.

La glicerina, en este caso, es un subproducto que puede venderse a las fábricas de

jabón.

II.3. Uso de aceites usados.

Calentar un aceite cambia sus características. Algunos aceites que son saludables a
temperatura ambiente pueden volverse perjudiciales cuando se calientan por encima de
ciertas temperaturas. Al elegir un aceite para cocinar, es por tanto importante tener en
cuenta su tolerancia al calor.
Un estudio del 2001 sobre grasa alimenticias en el Reino Unido, los Estados Unidos y
España halló que los aceites poli-insaturados como el de soja, colza, girasol y maíz se
degradan fácilmente a compuestos tóxicos cuando se calientan. El aceite de palma
contiene más grasas saturadas que los de colza, maíz, lino, soja y girasol. Por tanto, el
aceite de palma puede soportar mejor las temperaturas altas del proceso de fritura y la
oxidación respecto a los aceites muy insaturados. (Castro 2007)
El problema para procesar aceite residual es que suelen tener grandes cantidades de
ácidos grasos libres, gomas, humedad y otras impurezas que afectan el proceso de
transesterificación alcalina.
El aceite para producir biodiesel debe ser refinado, con el objetivo de:
Eliminar ácidos grasos libres (AGL)
Eliminar ceras, para mejorar el desempeño en frío del biodiesel.
Eliminar otros contaminantes, y obtener una mejor calidad de la glicerina.
Eliminar sólidos que interrumpan el proceso de transesterificación

2.4. Procesos industriales.

En la actualidad existen diversos procesos industriales mediante los cuales se pueden

obtener biodiésel. Los más importantes son los siguientes:

1. Proceso base-base, mediante el cual se utiliza como catalizador un hidróxido. Este

hidróxido puede ser hidróxido de sodio (sosa cáustica) o hidróxido de potasio (potasa
cáustica).

2. Proceso ácido-base. Este proceso consiste en hacer primero una esterificación

ácida y luego seguir el proceso normal (base-base). Se usa generalmente para aceites
con alto índice de acidez.

3. Procesos supercríticos. En este proceso ya no es necesario la presencia de

catalizador, simplemente se hacen a presiones elevadas en las que el aceite y el alcohol
reaccionan sin necesidad de que un agente externo, como el hidróxido, actúe en la
reacción.

45
 4. Procesos enzimáticos. En la actualidad se están investigando algunas enzimas
que puedan servir como aceleradores de la reacción aceite-alcohol. Este proceso no se
usa en la actualidad debido a su alto coste, el cual impide que se produzca biodiésel en
grandes cantidades.

5. Método de reacción ultrasónica. En este método, las ondas ultrasónicas causan

que la mezcla produzca y colapse burbujas constantemente. Esta cavitación
proporciona simultáneamente la mezcla y el calor necesarios para llevar a cabo el
proceso de transesterificación. Así, utilizando un reactor ultrasónico para la
producción del biodiésel, se reduce drásticamente el tiempo, la temperatura y la
energía necesarias para la reacción. Y no sólo reduce el tiempo de proceso sino
también de separación. De ahí que el proceso de transesterificación puede correr en
línea en lugar de utilizar el lento método de procesamiento por lotes. Los dispositivos
ultrasónicos de escala industrial permiten el procesamiento de varios miles de barriles
por día.

2.5.- Purificacion del biodiesel.

A nivel industrial se puede recuperar el metanol que se encuentra en esta fase por
destilación, además, refinar la glicerina, o venderla, a alguna industria jabonera, de
cosméticos, etc.
Para utilizarlo formalmente en vehículos, es recomendable implementar
controles de calidad, para hacer cumplir el producto con las normas
internacionales de calidad de combustibles. Además, es necesario cambiar ciertas
mangueras plásticas ó caucho del vehículo, empaques, sellos, diafragmas, etc.,
pues el biodiesel podría dañarlas.
El poder limpiador del biodiesel puede arrastrar suciedad existente en el sistema
de diesel causando problemas en la ignición del vehículo.
Pero hay una serie de usos que aceptan la calidad obtenida sin mayores parámetros
de calidad química, así por ejemplo: lavado de piezas de equipos, lubricante industrial
excelente (afloja piezas, limpiador, protector, etc), combustible para el quemador
de calderas y otros.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS.

Vasos de precipitados, probetas, embudos, pera de decantación, soporte universal,

agitador magnético, balanza analítica.
Papel filtro, aceite de cocina.
Hidroxido de sodio, agua destilada, metanol.

IV.- PROCEDIMIENTO
.
4.1. Acondicionamiento de los aceites vegetales.

Acondicionar los aceites vegetales para obtener los mejores resultados.

Lavarlos (eliminación de impurezas y ácidos grasos libres).
Climatizarlos (para evitar cristales a bajas temperaturas).
Desecarlos (elimine la humedad, agua).
Determinación de la cantidad de ácidos grasos libres

46
Es necesario titular el aceite para determinar qué cantidad de ácidos grasos libres
contiene.
Para medir la cantidad de ácidos grasos libres del aceite: mezclar 1 ml de aceite con 10
ml de alcohol isopropílico, mas 2 gotas de solución de fenolftaleina
Gota a gota, añada solución de sosa al 0,1% mediante agitación vigorosa hasta que la
solución se queda rosácea durante 10 segundos y registre los mililitros de solución de
sosa al 0,1% usados.

a. Lavado.
Acidos grasos libres en el aceite vegetal:
Si el aceite escogido tiene un grado muy alto de ácidos grasos libres, puede causar
problemas en la separación del biodiesel y la glicerina formada en la reacción
(transesterificación).
Estos ácidos grasos libres forman jabón con el metóxido de sodio que tendrá que
adicionar, emulsionando la grasa y la glicerina formada, obteniendo una masa
gelatinosa sin fases posibles de separación. Es necesario asegurarse que no tenga acidez
libre, esto lo puede lograr de la siguiente manera:
Antes de iniciar el proceso, lave el aceite con agua cáustica.
Para diez (10) litros de aceite vegetal liquido adicione dos (2) litros de solución
cáustica. La solución cáustica es: 250 gramos de soda cáustica en escamas disueltos
en 2 litros de agua El aceite vegetal y la solución cáustica se ponen en contacto,
se calienta y agita levemente y se deja reposar por 24 horas. Esto hará que los ácidos
grasos libres reaccionen con la soda cáustica formando jabón, que ira al fondo del
recipiente.
Esta solución jabonosa la drena del fondo, podrá utilizarla para lavar equipos,
pisos, etc. y el aceite flotante quedara sin ácidos grasos libres.

b. Climatización del aceite vegetal

El biodiesel, debe mantenerse fluido, sin pequeñas partículas sólidas (cristales) o

gelatinoso, en temperaturas ambientales bajas, porque de lo contrario obstruirá el filtro
del combustible.
Esto también pasa con el diesel, al cual le adicionan anticongelantes para evitarlo. Por lo
que es necesario escoger bien el aceite vegetal a utilizar, ó adicionarle aditivos que
evitan la formación de cristales.
Calentar el aceite, luego coloque el aceite a la temperatura de 5 grados
centígrados, por unas 24 horas, observará dos fases, la parte baja, son los cristales que a
esa temperatura son sólidos (grasas saturadas) y en la parte superior quedarán los
aceites líquidos (grasas insaturadas), que son los que utilizará para elaborar el
biodiesel.
La parte sólida la puede utilizar como grasa lubricante.
Otra forma de evitar cristales o incremento de la viscosidad en el Biodiesel en
bajas temperaturas ambientales es combinar, al final de la producción, Diesel y
Biodiesel, aprovechando las características del combustible diesel que se encuentra en
el mercado.
Se sugiere una mezcla del 20 % de biodiesel y 80 % de diesel (B20) para
empezar el ensayo en donde lo vaya a utilizar y luego ir subiendo el contenido
de biodiesel a conveniencia, hasta llegar al 100% de biodiesel.

47
Desecado -Agua en aceite vegetal

Para comprobar la existencia de agua, colocar el aceite en un frasco de vidrio.

Debe estar completamente cristalino. Si lo ve algo opaco, translucido, es porque
posee agua.
Es necesario evitar que el aceite pueda contener agua en solución, ya que genera
problemas en la separación del biodiesel y en la calidad del mismo.
Es necesario retirar cualquier agua presente en el aceite usado. Para ello se calienta el
aceite a 104ºC durante una hora o hasta que no se puedan ver burbujas. Se deja enfriar

b.- Proceso de transesterificaciòn.

Se toman 150 ml de aceite vegetal y se colocan en un vaso de precipitados de 250 ml y

se calienta a 60 ºC.
En un vaso de precipitados de 100 ml se colocan 27 ml (25% en volumen) de metanol a
los que se añaden 1.37 g (1% en peso) de hidróxido sódico remover vigorosamente (la
mezcla debe ser ligeramente nublosa y se denomina metóxido sódico). Observe el
incremento de la temperatura.
Tome las precauciones del caso (guantes de hule, anteojos, etc).

Se añade la mezcla metanol-sosa al aceite caliente, poco a poco mientras los agita
vigorosamente, utilizando un agitador. Agítelo durante 60 minutos. La mezcla es al
principio espesa y luego se vuelve más fina que el aceite original.
Al inicio es viscoso y luego menos viscoso.
Dejar reposar el producto, si todo fue bien, en unos 30 minutos se observa dos fases; en
la parte superior una fase liquida y dorada (biodiesel) y en la inferior una parte café
(glicerina y jabón)

Deje que la mezcla sedimente, por 39 minutos. El biodiesel flota en la parte superior
(color dorado), y la glicerina y el jabón van al fondo.

Recomendaciones.

Tener precaución al manipular el aceite caliente, ya que este puede ocasionar graves
quemaduras.
Usar un cubre bocas al preparar la solución del alcohol con la sosa caustica, ya que esta
desprende vapores, que dañan el sistema respiratorio.

c.- Tratamiento del biodiesel

El biodiesel debe secarse, para ello se calienta el aceite a 104ºC durante una hora o hasta
que no se vean burbujas. Se deja enfriar.
Este biodiésel claro puede contener una muy pequeña cantidad de jabón. Si se quiere
usar en un vehículo, puede que no tenga mayor importancia. No obstante, si se quiere
fabricar en grandes cantidades o para la venta, las especificaciones europeas requieren
que se retire el jabón por lavado o utilizando otros medios efectivos.

d.- Determinación de los parámetros físicoquímicos.

48
Determinar la densidad, la viscosidad y punto de inflamación del producto obtenido y
compararlo con datos de diesel comercial.

Determinar la densidad.

Tomar muestra del biodiesel y determinar la densidad mediante picnómetro. Seguir los
siguientes pasos:
1. Lavar y secar el picnómetro
2. Pesar el picnómetro vacío
3. Llenarlo con agua destilada hasta que rebose y taparlo
4. Secar el exterior del picnómetro y volverlo a pesar
5. Vaciar, lavar y secar el picnómetro
6. Llenarlo con el biodiesel obtenido y volverlo a pesar
Para determinar el volumen del picnómetro, primero hay que calcular el volumen del
picnómetro mediante los datos obtenidos con el agua destilada sabiendo la densidad del
agua a temperatura ambiente.
La densidad es igual a la masa del biodiesel dividido por el volumen del biodiesel que
será igual al volumen del picnómetro. Una vez calculado el volumen del picnómetro, y
sabiendo la masa de biodiesel, se puede calcular la densidad del biodiesel.

Determinar la viscosidad cinemática

Cargar el viscosímetro tipos Ostwald y colocarlo en el baño de la forma obligada por el

diseño del aparato.
Mantener el viscosímetro cargado en el baño el tiempo suficiente para que alcance la
temperatura del ensayo (38 ºC).
A menos que se indique otro valor en el manual de instrucciones del viscosímetro,
ajustar el nivel superior de la muestra en el capilar a unos 7 mm por encima de la
primera marca de cronometraje, bien por aspiración (si la muestra no contiene
componentes volátiles) o bien por presión. Cuando la muestra fluya libremente, medir
en segundos el tiempo necesario para que el menisco pase de la primera a la segunda
marca.

Cálculos:
viscosidad cinemática (mm2/s) = Constante de calibración del viscosímetro (mm2/s2) ·
tiempo (s)

V.- CUESTIONARIO

1. Calcular el rendimiento de la reacción (l de biodiésel/l aceite usado).

49
2.- Presentar los resultados de análisis e interpretar los resultados.

3.- Presentar la composición química (Ácidos grasos) del aceite usado.

4. Ventajas y desventajas ambientales, técnicas y sociales del uso de biodiésel frente a

un combustible fósil tradicional (gasoil).

5. Pasos a seguir para la obtención de biodiésel a escala industrial.

6. Comparar los parámetros fisicoquímicos obtenidos con los reales de un diesel

comercial.

7.- Describa las acciones requeridas para la producción de biodiesel a partir de aceites
usados.

50
VI.- OBSERVACIONES.

VII.- CONCLUSIONES.

51
 PRÁCTICA. 7
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y
CELULAS. PRODUCCION DE
ETANOL POR SACCHAROMYCES
cerevisiae INMOVILIZADA.

52
I.- OBJETIVOS
1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3) Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación

II.- ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se
puede medir la fermentación por la producción de CO 2 y por la concentración del
producto formado o por la disminución de la concentración del sustrato (en grados
Brix)

III.- MATERIALES.

- Material biológico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas

- Reactivos: Agar-agar, solución de glucosa 5%
- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodérmicas de 20cc, espátulas,
picetas, papel toalla.
- Equipos: Balanza, refractómetro, baño maría.

IV.- PROCEDIMIENTO

Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento
y agitación constante.
Calibrar el baño de maría a 40ªC, para mantener dentro del agar licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeración
(aproximadamente 4ªC), por 30 minutos.
Inmovilización de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y
homogenizar.
Tomar con una hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota
en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios
suaves.
Secar los pellets en papel toalla.
Obtención del mosto de uva:
Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
Obtención de etanol:

53
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de
una solución de glucosa al 5%). To0mar una alícuota, considerando la muestra a tiempo
cero y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alícuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix
en el refractómetro para cada alícuota.

V .- CUESTIONARIO.

1.-Indique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o células.

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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
2- Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?.
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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
3.- Explique las características coagulantes del agar-agar.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las células de levadura, si
estas están atrapadas en la matriz de agar-agar.
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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

5- Presente al menos un caso detallado de aplicación de la inmovilización de enzimas.

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_____________________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________________________

6- Qué otros métodos para la inmovilización se utilizan?

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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

54
VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VI.- CONCLUSIONES

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______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
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VIII.- BIBLIOGRAFÍA
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_____________________________________________________________________________________
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55
 PRÁCTICA 9

PRÁCTICA 9

EXTRACCIÓN
EXTRACCIÓN DE ENZIMAS
DE ENZIMAS VEGETALES

VEGETALES

56
I. OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su actividad
catalítica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son proteínas con acción catalítica.
Las proteínas se encuentran en el interior de las células en un estatus particular, a
pH fisiológico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de
sustancias.
La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven las características
estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica, debido a la enzima
ureasa presente en la cáscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato úrea provoca la hidrólisis de esta con
la consiguiente liberación de amoniaco y anhídrido carbónico, según la siguiente
reacción.
NH2
O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2
NH2
La actividad ureásica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco
liberado con el Reactivo de Nessler (K 2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de
Mercurio y Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da
productos de color amarillo-anaranjado (complejo cuya fórmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a
420 nm.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 150 gr. De cubierta de frejol, solución de úrea0.3 M, agua destilada
 Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
 Espectrofotómetro, Baño María, Balanza, Equipo de filtración, papel filtro,
Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Balón de
500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.

IV. PROCEDIMIENTO.

Extracción de la Enzima.
 Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fría)
, después de 24 horas remover la cáscara por fricción, y proceder a
escurrir el agua.
 Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO 4HNa2) , y
200ml. De solución EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua
destilada fría, mezclar ambas soluciones, y enfriar a 4ºC. En un balón de
500 ml.

57
  Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de
500 ml.
 Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar
cuidando se mantenga baja la temperatura.
 Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.
 Centrifugar la suspensión a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solución por
un filtro rápido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.
 Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido,
llevar a refrigeración.
 Preparar un cuadro de resultados.
CASCAR BUFFER AGUA EXTRACTO FINAL (ml)
A

Determinación de presencia de proteínas en el extracto por

espectrofotometría.
Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.
Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml
de reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar
la presencia de proteínas.
Anotar la lectura de Absorbancia.

Comprobación de La actividad enzimática.

 Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro
como tubo de blanco.
 En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
 Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
 Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo
blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
 Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.
 Después de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos;
(0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8 ml.
 Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
 Calibrar el espectrofotómetro a 420 nm.
 Medir la absorbancia. La muestra de extracto dará coloración y un alta
absorbancia por el amoniaco liberado.

V. CUESTIONARIO.

58
 Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la extracción de la enzima
ureasa.
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Diga que pruebas se tienen de haber extraído realmente enzimas vegetales.

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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y la refrigeración.

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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
____________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extracción utilizado en

laboratorio.

VI. OBSERVACIONES

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VII. CONCLUSIONES

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__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA

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__________________________________________________________________
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__________

60
 PRACTICA 9

PRACTICA 10

DETERMINACIÓN
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE
ENZIMATICA EN UREASA

ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA

61
I. OBJETIVO
Determinar la capacidad catalítica o actividad enzimática de la enzima ureasa.(enz.
Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico de la enzima y se
obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza.
La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1
ml de solución que transforma o produce 1 mg de sustrato ó producto por minuto
medidas en las condiciones optimas de operación de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en
el organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cáscara de
frejol.
La ureasa cataliza la descomposición de la úrea según la reacción:
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de cualquier reacción
puede ser determinada midiendo:
1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reacción
2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo
la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 ó
NH3) producidos en un tiempo determinado.
Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por
medios espectrofotométricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble
de mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma
un complejo de color anaranjado castaño.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O
La intensidad del color formado será directamente proporcional a la cantidad de
amoniaco presente en cada tubo y se medirá la absorbancia de cada tubo a 420 nm
(filtro morado).

III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

Materiales.
 Preparar 50 ml de solución de urea 0.3 M.
 Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M
 Reactivo Nessler.
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4ºC)

62
  100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-
4milimoles/ml)

Material de vidrio.
 02 fiolas de 50 ml.
 02 fiola de 100ml.
 08 tubos de ensayo.
 01 gradilla para tubos.
 01 espectrofotómetro.
 baño de hielo.
 Incubadora a baño maría.

Determinación de la curva de calibración.

Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio según la tabla
siguiente:

Patrón Concentració SO4(NH3) ml de Buffe Nessle Volume Absorbanci

Nº n (NH3) 2 nmol/ml SO4(NH3) r (ml) r (ml ) n final a
mol/ml 2 ml 420 nm.
Blanc 00 0.0 0.0 7.50 0.5 8.0
o
1 5.0 0.01 7.49 0.5 8.0
2 10 0.02 7.48 0.5 8.0
3 15 0.03 7.47 0.5 8.0
4 20 0.04 7.46 0.5 8.0
5 25 0.05 7.45 0.5 8.0
6 30 0.06 7.44 0.5 8.0
Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de
calibración.

Medida de la actividad ureasica.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como
tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solución de ureasa y 4.8 ml de agua, al
tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.

63
 Después de incubar los tubos, sacar el tubo de incubación e introducir en baño
de hielo para detener la reacción.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen
total 8 ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.

IV. CUESTIONARIO
1.- Efectúe los cálculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reacción enzimática.

3.- Calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa en nmol de NH3

producido/min.

4.- Explique por qué durante la reacción debe incubarse a 37ºC

5.- Realizar los cálculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada
tubo patrón usados en la construcción de la curva de calibración.

64
 6.- Encontrar la equivalencia por el cálculo del factor de equivalencia y por la
determinación analítica de la ecuación de la curva.

7.- Diga si la curva de calibración obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por
qué.

8.- Explique por qué es necesario contar con un blanco en las determinaciones de
actividad enzimática.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad específica.

65
V. OBSERVACIONES
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VI. CONCLUSIONES
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VII. BIBLIOGRAFÍA
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 PRACTICA
PRACTICA 11 10
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA

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I. OBJETIVO.
Verificar la variación de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la
concentración del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa, para formarse
amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente ecuación.
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometría a
l = 420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.
Cinética de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimáticas varían con la concentración del
sustrato según una cinética autosaturante que se describa por la Ec.
DeMichaelis-Menten.

V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma:

La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la

Linearización de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

68
 Donde los parámetros anteriores se relacionan por la ecuación de una recta.
1 = 1 + [S]
VVmaxKs

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.
 20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA,
0.5 nM.
 Agua destilada.
 reactivo Nessler.
 Baño de hielo.
Equipos y material de vidrio.
 fiolas de 50 y 100 ml.
 07 tubos de ensayo de 10 ml.
 02 matraz de 100 ml.
 pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
 Equipo de baño maría.
 01 espectrofotómetro Espectronic 20D+
 01 termómetro de 0- 100 ºC

IV. PROCEDIMIENTO.
Preparación de muestras.
 Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de amonio al
5x10-4 M
 Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0.3 M

Calibración del Espectrofotómetro.

A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de
concentración del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la

69
enzima se trazará una curva de equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs.
Concentración. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentración conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para
obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se
usará soluciones de sulfato de amonio.
 Preparar solución madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

 Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de

Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su
equivalencia con nmol de úrea. Completar la siguiente tabla.

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Tabla Nº 1
PATRON nº Sol. de Contenido nmol Contenido nmol Equivalencia en
sulfato(ml) de sulfato de NH3 nmol de úrea
1 50
2 100
3 150
4 200
5 250
6 300

 Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de la práctica

anterior.
 Completar la siguiente tabla.
Tabla Nº 2
Muestra Nº Volumen de sulfato NH3 en la muestra Absorbancia
tomado ( ml) (nmol)
Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación que relaciona DO
vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadísticos que sean necesarios.
Pruebas cinéticas.
 A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un
blanco para completar la tabla 3 como se muestra.
 Preparar solución madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

71
 Tabla Nº 3

Tubo Urea Urea Buffer Incuba Ureas Incuba Bañ Nessle Reposa Volume Ab
o.3 fosfat r 37°C a r 37°C o r r n final s
µMo
M o ml hielo
l 3 min ml 15 ml 5 min. ml 420
ml min nm.
Blanc 0 0 7.0 0.5 0.5 8
o
1 60 0.2 6.8 0.5 0.5 8
2 120 0.4 6.6 0.5 0.5 8
3 180 0.6 6.4 0.5 0.5 8
4 240 0.8 6.2 0.5 0.5 8
5 300 1.0 6.0 0.5 0.5 8
6 360 1.2 5.8 0.5 0.5 8

 Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la

curva de calibración), y completar la tabla 4

Tabla Nº 4
Muestra [urea] en Densidad óptica Nmol de NH3 Nmol de urea
-2
nmol/ml x10 (Abs) producidos que reaccionan
1 0.1
2 1.0
3 3.0
4 4.0
5 5.0
6 6.0
Blanco -
Tratamiento de datos.
 Para cada muestra calcular la velocidad de reacción mediante la relación
v = P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de
reacción enzimática ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

72
 Tabla 5
Muestra [S] nmol/ml. 1/[S] V(nmol/min.) 1/v
1
2
3
4
5
6
 Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

 Estimar el valor de Vmax.

 Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una línea recta.

 Determinar gráficamente los valores de Vmax. Y Ks.

 Escribir la ecuación que representa a esta reacción enzimática.

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V. OBSERVACIONES
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VI. CONCLUSIONES
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VII. BIBLIOGRAFÍA
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 PRÁCTICA 11

METABOLISMO
PRÁCTICA 7 DE
CARBOHIDRATOS:
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.
FERMENTACIÓN.

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I. OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica
(fermentación) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la respiración celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no
competitivos, oxido-reducción, modificación de pH e inhibidores en la
interpretación de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se
puede medir la fermentación por la producción de CO2.

III. PROCEDIMIENTOS.
3.1. Complete la siguiente batería de tubos:

Tubos 1 2 3 4
Suspensión de 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
levadura 7%
Sol. Glucosa 0 1 ml 1 ml 1 ml
Sol. NaF 0 0 1 ml 0
Agua 2 ml 1 ml 0 0
destilada(43°C)
Sol.Rojo 0 0 0 1 ml
Neutro

Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionándolo girar
rápidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar
el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elástico
los 4 frascos, ponerlos a incubar en un baño de agua a 43°C.
3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solución en el tubo y mida el
volumen de gas producido con una pipeta con agua.
3.4. Cuál es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.
3.5. Anote y discuta sus resultados.

76
 Soluciones:

1. Solución de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de

agua destilada a 43°C y completar a 100 ml con agua destilada a 43°C.
2. Solución de glucosa 0,1 M
3. Solución de NaF0,1 M
4. Solución rojo neutro 0,02 M
Papel pH.

IV. CUESTIONARIO.

1.-Presente el esquema de la via EMP, indicando los puntos de inhibición

enzimática.

77
 2.- Explique la razón metabólica del uso de NaF.

3.- Indique cual es el papel de la glucosa en el ensayo.

4.- Explique la razón de uso del rojo neutro.

5.- Indique que otros indicadores acido-base existen, y en que caso se usa cada
uno de ellos.

6.- Explique la razón de la variación de la acidez en los tubos con fermentación

positiva.

7.- Explique cómo determina la existencia o no de metabolismo positivo.

V. OBSERVACIONES

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___________________________________________________________________
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VI. CONCLUSIONES

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VII. BIBLIOGRAFÍA

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 PRACTICA 12

EXTRACCION
PRACTICA DE 12 ADN DE

EXTRACCION DEHIGADO DEDE

ADN DE HIGADO POLLO
POLLO

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I. OBJETIVO

Extraer ADN de un tejido animal

II. MARCO TEORICO

El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el almacenamiento y la

transferencia de la información genética. Son componentes fundamentales de la
célula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.

Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando núcleo

proteínas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.

El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo ,

mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en
el núcleo de la célula y también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas
cantidades.

Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a
cabo la síntesis de proteínas, y por tanto de las enzimas necesarias para el
funcionamiento celular.

Por otra parte el ADN es el vehículo de la herencia que se transmite de padres a

hijos de generación en generación.

III. FUNDAMENTO:

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en

primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los núcleos, para
ello se tritura el hígado de pollo en un mortero.

Al añadir una solución hipertónica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de

los núcleos, el detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del
ADN, El alcohol tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando
para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista, que
se pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el
anaranjado de acridina.

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IV. MATERIALES

 Hígado de pollo 10 gr
 Cloruro de sodio 2M
 Etanol 96|°
 SDS 20%
 Arena
 Varilla de vidrio
 vasos de precipitados
 Mortero
 Embudo
 Pipetas
 Probetas
 Gasa

V. METODOLOGÍA

1.- Triturar 10 gr de hígado de pollo, dentro de un mortero, con la adición de

5gr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas
celulares.

2.- Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta obtener una

papilla.

3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de
tejido que quedaron sin romper membranas.

4.- Medir el volumen del filtrado final.

5.- Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de
precipitados.

6.- Añadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío, por las paredes,
logrando se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.

8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma dirección

tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas
fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la
agrupación de muchas fibras de ADN.

82
83
VI. CUESTIONARIO
1. ¿De qué está formada la cromatina?
2. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el hígado?, ¿para
qué añadimos arena al triturado?
3. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M?
4. ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que
finalidad

VIII. OBSERVACIONES
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IX. CONCLUSIONES
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X. BIBLIOGRAFÍA
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