Informacion Biología

INFORMACION BIOLOGÍA
NORTHERN BLOT
(INTRO EN EL PPT)
PROCEDIMIENTO
El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una muestra
de tejido homogeneizado. El ARN se puede aislar mediante cromatografía para
retener solamente los ARN con colas de poli(A). Las muestras de ARN se separan
entonces mediante electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la
dificultad para que las sondas penetren en la matriz, las muestras de ARN,
separadas por tamaño tras la electroforesis, se transfieren a una membrana de
nailon, bien por capilaridad o empleando un sistema de vacío.
Una membrana de nailon cargada positivamente es el soporte más eficaz para
realizar la hibridación en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están
cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El
tampón de transferencia que se usa en el ensayo suele contener formamida, dado
que esta reduce la temperatura de interacción de las muestras, lo que evita la
utilización de altas temperaturas que podrían desnaturalizar las moléculas de
ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza
mediante enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por
medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida
con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar
la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las
condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de ARN
bicatenario, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente, la
membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma
específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma. Estas
señales pueden cuantificarse mediante densitometría. Para crear controles y
poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se
puede realizar posteriormente la determinación empleando chips de ADN o RT-
PCR.
SOUTHERN BLOT
(INTRO EN EL PPT)
PASOS
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del
delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras
de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que
es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es
HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según
su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis,
las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más
deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado,
se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su
tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia
con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución
alcalina. Tras la neutralización de esta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o
"calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es
"secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como
método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual
que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una
réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la
membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN
conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de
hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la
molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el
"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern
resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de
sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse esta, se lava el exceso de
sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de
nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del
ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X
dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde
hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el
registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en
varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la
primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda
radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una
misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN"
WESTERN BLOT
(INTRO EN EL PPT)
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un tampón de extracción.

Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes
volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o
por sonicación. Por último, se centrifuga para obtener las proteínas en el
sobrenadante, la fracción no precipitada.
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden

usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las
proteínas. Este proceso debe realizarse a baja temperatura (~4 °C) para evitar
la desnaturalización proteica y con la adición
de inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la digestión de las proteínas y
de las fosfoproteínas por las enzimas celulares. Para separar proteínas de
compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas -
como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.
2. Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel
en función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos
criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la
separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de
gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las
proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida
de las estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipéptidos en este
estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las
proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en
función del tamaño.
3. Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o
de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción
de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su
capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas
las proteínas con idéntica afinidad).
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son
también más frágiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no
pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas. 7
También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
4. Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las proteínas de forma
inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras
la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica)
empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción
del complejo antígeno-anticuerpo que se forma con la proteína que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente
de albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés,
BSA), leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente,
como Tween 20 o Tritón X-100. Las proteínas en solución se unirán a todos
aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las
transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su
antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos.
5. Detección
En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada
proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima
que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce
color). De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así
como su localización.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es
posible la detección en un único paso, lo cual es útil en ciertos campos.
6. Análisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de
aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.
7. Exploraciones secundarias
Una característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de
nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la
membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo
mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la
eliminación de los anticuerpos, permitiendo una mayor reutilización antes de que
el ruido de fondo sea tan grande que impida continuar con los experimentos. Otra
diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en
etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Además, las
membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a los daños
durante su uso.
EASTERN BLOT
(INTRO EN EL PPT)
Se utiliza con mayor frecuencia para detectar epítopos de carbohidratos.
Por tanto, la transferencia oriental puede considerarse una extensión de la técnica

bioquímica de la transferencia occidental.
Se han descrito múltiples técnicas con el término transferencia oriental, la mayoría

usa proteínas transferidas de gel SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa.
Las proteínas transferidas se analizan en busca de modificaciones

postraduccionales utilizando sondas que pueden detectar lípidos, carbohidratos,
fosforilación o cualquier otra modificación proteica.
La transferencia oriental debe usarse para referirse a métodos que detectan sus
objetivos a través de la interacción específica del PTM y la sonda, distinguiéndolos
de una transferencia occidental estándar.
En principio, la transferencia oriental es similar a la transferencia de lectina (es

decir, detección de epítopos de carbohidratos en proteínas o lípidos).

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Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un tampón de extracción.

Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden

Se utiliza con mayor frecuencia para detectar epítopos de carbohidratos.

Por tanto, la transferencia oriental puede considerarse una extensión de la técnica

Se han descrito múltiples técnicas con el término transferencia oriental, la mayoría

Las proteínas transferidas se analizan en busca de modificaciones

En principio, la transferencia oriental es similar a la transferencia de lectina (es

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