TAREA PARA BMC TEMA 04

Actividad 1: haz una tabla que permita comparar las diferencias y similitudes entre los tres
tipos de transferencia de ácidos nucleicos a soporte sólido que se estudian en la unidad. En
la tabla deben figurar los siguientes aspectos:

Tabla comparativa de los tipos de hibridación de ácidos nucleicos en soporte sólido.

SOUTHERN NORTHERN DOT

Tipo de muestra ADN ARN ADN O ARN
Digestión enzimática SI NO NO
Tampón de Tampón TBE Tampón MOPS No hay
electroforesis electroforesis
Composición del gel AGAROSA Agarosa con No hay transferencia
formaldehido desde un gel
Tratamiento de la Hay que Re suspender las Se desnaturalizan las
muestra (ADN o ARN desnaturalizar el muestras en un muestras de ADN o
previo a la ADN en cadenas tampón con ARN por incubación
transferencia) simples, poniendo el formaldehido y con NaOH y EDTA
gel en contacto con formamida y
una solución de calentadas a 65ºC
hidróxido sódico, unos minutos. Se
neutralizar en PH y colocan en hielo
lavar. hasta ser cargadas
en el gel
Transferencia (tipo y Blotting. Se Se transfiere el ARN Se utiliza membrana
tampón) transfieren los a una membrana de de nailon o
fragmentos de ADN nailon o nitrocelulosa, a la
a una lámina de nitrocelulosa que se transfieren
nitrocelulosa o mediante directamente los
nailon con carga transferencia ácidos nucleicos
positiva. Tampón capilar.
SSC.
Fijación del gel al Mediante calor o Mediante calor o La membrana se
soporte radiación radiación coloca en un sistema
ultravioleta ultravioleta con una bomba de
vacío que succiona
la muestra colocada
en un pocillo y la
pasa a la membrana.
Tipo de sondas Enzima peroxidasa ADNc o ARN Sondas específicas
de alelo (ASO), son
oligonucleótidos
sintéticos
Marcaje sondas Radiactivo o no Radioactivo o no biotina
radiactivo
 Revelado Sustrato Radioactivo Radioactivo
quimiolumiscente

Actividad 2: imagina que hay un sitio en el cromosoma 2 que es polimórfico en la población,

de tal modo que algunos individuos tienen en ese lugar una diana para la enzima Xmn I y
otros no.

El Alelo B tiene un fragmento en la sonda de 20 Kb y el Alelo A tiene un fragmento de 15 Kb ya que

tiene una diana de restricción más que el Alelo A.

El ADN de varios individuos cuyos genotipos son AB, AA, BB y BA, se corta con la enzima
Xmn I. Realiza un dibujo semejante al propuesto en la imagen inferior, donde esté
representado el patrón de bandas que obtendrías en la membrana tras hibridar el resultado
de la digestión con la sonda utilizada.
Actividad 3: consultando la información suministrada en los contenidos de la unidad,
incluidos los enlaces "Para saber más" y otras fuentes de internet, redacta un protocolo de
trabajo lo más completo posible, que permita realizar el procedimiento de Southern blot.
Incluye en él los reactivos que se utilizan, sus concentraciones y tiempos de incubación.
Comienza el protocolo después de haber realizado la digestión de las muestras de ADN.
Termina el protocolo dejando la membrana preparada para su revelado en función del
marcaje de la sonda.

1. ELECTROFORESIS DEL GEL DE AGAROSA

a) Preparar el gel Preparar un gel de agarosa al 0,8% para la electroforesis de las muestras
lista para ser sembradas. Utilizar un gel de 7x7 cm o 7x10 cm. Se necesitan 6 pocillos con
una capacidad de 40 µl.
b) Antes de la siembra de las muestras En un baño calentar un vaso a 65ºC para calentar las
muestras que contienen el ADN antes de su siembra. A 65ºC las agregaciones no específicas
que se pueden generar por los extremos cohesivos generados por los enzimas de restricción
son eliminadas. Calentar las muestras A-E a 65ºC durante 2 minutos. Permitir enfriar las
muestras otros 2 minutos.
c) Sembrar las muestras Sembrar las muestras A-E en pocillos consecutivos. La cantidad de
muestra a siembra debe ser de 35-38 µl.
d) Correr el gel Después de la siembra, configurar la fuente de electroforesis al voltaje
requerido. Una vez terminada la electroforesis proceder con el análisis de Soutern Blot. La
electroforesis debería pararse cuando el colorante naranja de carga haya migrado
aproximadamente 4,5 cm desde el pocillo de siembra del gel de agarosa.
2. ANÁLISIS DE SOUTHERN BLOT
Durante este proceso se transferirán los fragmentos de ADN desde el gel de agarosa a la
membrana de nylon. Después de la trasferencia, la membrana será incubada durante un
periodo corto de tiempo para fijar el ADN a la membrana. Para evitar reactivos TOXICOS, y
especialmente los radioactivos, que son utilizados en el Southern, en este experimento se
utilizará un sistema de detección no isotópico especialmente diseñado para su uso escolar.
a) Despurinización/Desnaturalización Después de la electroforesis, el gel es secuencialmente
tratado con HCl y NaoH. El HCl introduce sitios apurínicos en el ADN lo cual produce uniones
fosfodiester e introduce “nicks” en el ADN de doble cadena. El tratamiento con NaOH
rompe los puentes de hidrógeno entre las bases. El secuencial tratamiento ácido/base
resulta en la formación de pequeños fragmentos que facilita la trasferencia de los
fragmentos de ADN en la membrana de nylon.

1. Después de la electroforesis colocar el gel de agarosa en una cubeta con 100 ml de 0,25 N
HCl. Incubar a temperatura ambiente durante 8 minutos (no sobrepasar este tiempo). El gel
debe estar completamente cubierto con la solución y agitar periódicamente. Eliminar con
cuidado la solución, que no se podrá reutilizar. Lavar el gel con diversos cambios de 100 ml
de agua destilada.
2. Colocar el gel durante 15 minutos en la solución de Desnaturalización del ADN (0,5 M
NaOH/0,6 M NaCl). El gel debe estar completamente cubierto con la solución y agitar
periódicamente. Eliminar la solución.

3. Utilizar otros 100 ml de Solución de Desnaturalización e incubar otros 15 minutos.

Conservar está solución para el punto 6.
b) Configurar la transferencia del Southern Blot
4. Colocar unas hojas de papel de plástico, de aluminio o papel “whatman” en una superficie
plana del laboratorio. Sacar el gel e invirtiendo el gel (los pocillos hacia abajo), colocar la
superficie lisa de forma que quede en contacto con la membrana de transferencia.
5. Utilizando siempre guantes, con pinzas y tijeras ajustar la membrana de nylon al tamaño
del gel. Aquellas zonas de la membrana tocadas sin guantes dejarán residuos de aceite y no
permitirán unir el ADN durante la transferencia. Muchos guantes contienen polvo lo que
aumentará el “background” en la membrana, colocarse los guantes y lavarse con agua para
eliminar el polvo.
6. Recoja con mucho cuidado la membrana por los extremos con 2 pinzas y ligeramente
doblada en el centro y lentamente humedecer (desde la mitad hacia afuera) con la solución
de Desnaturalización del punto 4.
7. Liberar la membrana y sumergir suavemente durante 5 minutos en la solución de
Desnaturalización. Utilizando unas pinzas sacar la membrana saturada de la Solución de
Desnaturalización y colocarla encima del gel de agarosa. Es muy importante que entre los
diferentes elementos del dispositivo no queden burbujas de aire.
8. Recorte el papel de filtro de blotting del mismo tamaño del gel y la membrana de nylon.
Colocar el papel de filtro encima de la membrana. Cuidadosamente, colocar un montón de
papel absorbente 4-5 cm de grosor encima del filtro de “blotting”. Colocar una bandeja o
placa de cristal y colocar por ejemplo un vaso de 400 ml vacío como peso.
9. Permitir que la transferencia progrese durante 4 horas o toda la noche.
10. Eliminar la placa de vidrio, vaso y papeles absorbentes.
11. Con guantes enjuagados y pinzas voltear el conjunto (gel-nylon-papel de filtro) de forma
que descanse sobre el papel de filtro.
12. Utilizando un rotulador dibujar los 6 pocillos de muestra y rastrear sus posiciones en la
membrana de nylon 13.
Utilizando pinzas retirar el gel de la membrana. El gel puede ser descartado y se observará
que está deshidratado.

14. Poner la membrana encima de un montón de papel seco con el ADN hacía arriba (el lado
que estuvo en contacto con el gel).
15. Marcar la membrana por el lado del ADN con el N.º de grupo o nombre.
16. Para unos resultados óptimos, secar y fijar el ADN completamente a la membrana. Para
ello colocar la membrana entre dos hojas de papel de filtro y colocar a 80ºC durante 30
minutos.

Actividad 4: técnica de hibridación in situ.

-Escribe un protocolo detallado en el que se contemplen todos los pasos de la técnica de

FISH cuando se emplea sobre núcleos en interfase en muestras de líquido amniótico.
Comienza el protocolo a partir de que las células están ya fijadas al portaobjetos.
Una vez tenemos las células colocadas en el portaobjetos colocamos un cubreobjetos sobre
la gota y dejamos que la sonda se distribuya por toda la extensión del cubreobjetos.
Nos aseguramos de que no quedan burbujas entre el portaobjetos y cubreobjetos,
empujándolas con una pinza hacia los extremos si fuera necesario.
Marcamos la zona de hibridación con un rotulador o un lápiz de punta de diamante.
Colocamos la preparación en el hibridador, previamente calentado a 73ºC durante 3
minutos y medio. Así el ADN se desnaturalizará.
Sellamos la zona de hibridación cubriéndola con Parafilm que quedara sellado al estar el
portaobjetos caliente.
Preparamos una cámara húmeda y colocamos en ella la preparación para su incubación en
la estufa a 37ºC de 18 a 24 horas.
Colocamos en el baño termostatizado la solución de lavado 0,4XSSC para que alcance
los 72ºC que requiere la técnica.
Retiramos el Parafilm y el cubreobjetos y lavamos el portaobjetos en tampón SSC al 0,4x a
72ºC y lo dejamos actuar por 2 minutos.
Sacamos el portaobjetos del baño y continuamos lavándolo 2 minutos más a temperatura
ambiente, con tampón SSC al 2x.
Realizamos el secado al aire del portaobjetos y colócalo en la placa calefactora del
hibridador a 37ºC dos minutos para acabar de secarlo. Asegurándonos que este bien seco
antes de añadir el contracolorante (DAPI), cogiendo con una micropipeta 30ul del mismo y
añadiéndolo en el centro de la zona de hibridación que previamente habíamos marcado.
Colocamos un cubreobjetos sobre la preparación y lo distribuimos uniformemente por la
zona de hibridación procurando no dejar burbujas.
Finalizamos la hibridación colocando el portaobjetos en una caja oscura a -20ºC durante 30
minutos, para intensificar la señal fluorescente.

-Imagina que llegan al laboratorio 3 muestras de líquido amniótico en las que solicita la
realización de diferentes estudios de diagnóstico prenatal.
Muestra N.º 1: Se solicita estudio para descartar una posible trisomía Down.

Muestra N.º 2: Se solicita descartar un posible Síndrome de Edwards.

Muestra N.º 3: Se solicita descartar las aneuploidías de los cromosomas 21, X e Y.
Indica para cada caso, qué sondas de las que se muestran en la imagen utilizarías para
realizar los análisis que se solicitan. Justifica por qué has elegido cada una de las sondas,
señalando a qué cromosoma y región cromosómica se unirán y el color del fluorocromo que
llevan asociado. Ten en cuenta que en las hibridaciones dobles los espectros de emisión no
deben superponerse, de otro modo no se podría identificar la alteración.
Muestra 1: sonda LSI 21 SpectrumOrange. Es una sonda muy útil para detectar anomalías
numéricas o estructurales. El color del fluorocromo se verá naranja al microscopio.

Muestra 2: sonda CEP 18 SpectrumAqua (también podría ser Green u Orange si sólo se va a
utilizar una). Es una sonda centromérica del cromosoma 18, que es el causante del
síndrome de Edwards cuando existen 3 copias. Si existe la trisomía, se mostrarán 3 puntos o
manchas de color azul correspondiente a los centrómeros de cada uno se los cromosomas
18.

Muestra 3: sonda LSI 21 SpectrumOrange para observar los cromosomas 21, CEP X
SpectrumAqua para los cromosomas X, cuyos centrómeros se visualizarán en azul y CEP Y
SpectrumGreen, que permitirá observar los centrómeros de los cromosomas Y de color
verde.

- Indica los resultados que se pueden esperar en cada uno de los estudios, en el caso de que
el feto presente las alteraciones buscadas. Puedes realizar dibujos que muestren lo que
verías en las observaciones al microscopio.
Muestra 1

Los tres puntos naranjas en la imagen demuestran que existe trisomía, en este caso del par
21 por lo tanto hay síndrome de Down.

Muestra 2
Los tres puntos azul claro en la imagen demuestran que existe trisomía en el par 18 y hay
síndrome de Edwards.

Muestra 3

Si existiera la trisomía 21, se visualizarían 3 puntos o manchas naranjas, correspondientes a

los 3 cromosomas 21, y en caso de que sea varón, podrían observarse 2 puntos azules
correspondientes a 2 cromosomas X y uno verde, correspondiente al cromosoma Y
(XXY, Síndrome Klinefelter). Se trataría de una doble aneuploidía de los cromosomas 21 y X,
aunque en este caso no del Y.

Actividad 5: analiza y comenta las siguientes imágenes.

Imagen 1: técnica de FISH en un caso de Distrofia muscular de Duchenne enfermedad ligada

al sexo asociada a una deleción del gen de la distrofina localizado en el cromosoma X.
En la imagen se han empleado dos sondas, una con fluorocromo rojo especifica de locus y la
segunda sonda con fluorocromo verde que es centromerica.

Hay dos cromosomas X, así que el paciente es una mujer con un cromosoma X normal y otro
que presenta una alteración.
La Distrofia muscular de Duchenne afecta a los músculos por la carencia de distrofina, pero
en una mujer, el segundo cromosoma, si no contiene la deleción como el caso de análisis,
posibilitará una suficiente producción de ésta. Sin embargo, tiene un 50% de posibilidad de
transmitir en el gen, siendo portadora de esta deleción, aunque no desarrolle la enfermedad
(herencia recesiva ligada al cromosoma X).
Por tanto, se considera que, con los resultados de la imagen, la mujer será portadora.

Imagen 2: en este caso se trata de un diagnóstico prenatal en el que se ha realizado un

estudio utilizando sondas centroméricas para los cromosomas 13 y 21. Comenta la
fotografía e interpreta los resultados obtenidos.
En la imagen vemos que se han empleado dos sondas, una con fluorocromo verde y la otra con
fluorocromo rojo. Teniendo en cuenta que aparecen dos cromosomas teñidos de verde y dos de
rojo, podemos descartar trisomía del par 13(síndrome de patau) y en el par 21 (síndrome de Down).