PROTOCOLO DE LABORATORIO CURSO

BIOQUIMICA

Código 151030

https://www.google.com/search?q=imagenes+laboratorio+quimica&rlz

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD

Tunja, Junio 2022

INTRODUCCIÓN

La guía de prácticas de laboratorio introduce al estudiante en los

procedimientos experimentales más ampliamente usados en
bioquímica. Incluye análisis de macromoléculas como carbohidratos,
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. El estudiante también se
familiarizará de las instalaciones y los equipos usados en las prácticas
de bioquímica. Es de gran importancia la lectura y compresión del
documento con anterioridad a la asistencia de las prácticas, además
del desarrollo de las consultas que permitan entender cada
procedimiento.

Los objetivos de las prácticas del curso de bioquímica son:

1. Que el estudiante sea capaz de comprender e integrar los
conceptos teóricos con la actividad práctica incluyendo una adecuada
manipulación de las técnicas de laboratorio, desde la actividad
procedimental hasta la entrega de resultados o informe final.
2. Que el estudiante adquiera una preparación en Bioquímica que le
permita comprender la transversalidad que tiene la actividad práctica,
tanto en otros cursos del programa de estudio como en las actividades
profesionales que él desempeñará, así mismo que le permitan
desarrollar una actitud de pensamiento crítico y de liderazgo en el
trabajo que se de en el grupo.
3. Que el estudiante realice las a actividades las practicas, teniendo
en cuenta las normas de seguridad y las indicaciones que del docente
responsable de la práctica considere.
4. Que el estudiante adquiera los elementos formativos que incluye:
lectura previa de esta guía, planeación de la actividad, asistencia a las
prácticas, resolución de problemas con la metodología empleada,
interpretación de resultados y presentación de resultados en el informe
de laboratorio.
La bioquímica es una rama de la ciencia encargada de descifrar los
mecanismos esenciales de los seres vivos, con una fase teórica y una
fase práctica, la primera se da a través de los distintos referentes
bibliográficos y el segundo se apoya en el desarrollo de la guía de
prácticas de laboratorio del curso de bioquímica.
 El desarrollo del trabajo práctico se apoya en una serie de pasos que
van describiendo el progreso de una técnica a través de mediciones,
cálculos, observaciones cualitativas y cuantitativas de los
procedimientos planteados en la guía. La práctica de laboratorio
integra, en el estudiante la habilidad de trabajar en el laboratorio,
utilizando las técnicas más habituales de un laboratorio bioquímico y
aprendiendo a interpretar los resultados experimentales.

Generalidades.
En la composición de los seres vivos predominan cuatro elementos:
carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno. La capacidad del átomo de
carbono para formar enlaces covalentes es la base a partir de la cual
se forman moléculas orgánicas que tienen la propiedad de formar
macromoléculas de un mayor grado de complejidad. Estas
biomoléculas pueden pertenecer a cuatro grupos que se separan con
base en la proporción relativa de sus elementos constitutivos, el tipo
de enlaces que mantienen estables, su estructura y sus propiedades
físicas y químicas (Tabla 1). La diversidad estructural y química de las
biomoléculas hace posible identificar su presencia en una muestra,
mediante el uso de pruebas cualitativas o cuantitativas que se basan
en reacciones química específicas entre uno o más agentes o reactivos
y la biomolécula en cuestión. Como resultado se pueden generar
cambios de coloración, formación de anillos coloreados, precipitados,
que indican la presencia de determinado compuesto orgánico en la
muestra.

Tabla 1. Principales características de las biomoléculas

CARBOHIDRATOS O GLÚCIDOS LÍPIDOS PROTEÍNAS ÁCIDOS
NUCLEICOS
Definición Término general para definir las Moléculas orgánicas Moléculas orgánicasMoléculas orgánicas
moléculas orgánicas solubles en constituidas constituida por la
correspondientes a solventes
azúcares y compuestos orgánicos, principalmente por C, polimerización de
relacionados. compuestos H, O y N (también S, nucleótidos, los
principalmente por en menor cuales están
C, proporción). Son conformados por

H, O y en algunospolímeros de una base

casos, P. aminoácidos nitrogenada, un
unidos por enlaces azúcar pentosa y un
peptídicos, con la ácido fosfórico y
capacidad de formar están unidos
estructuras mediante enlaces
tridimensionales. fosfodiéster.
Característica Polialcoholes que poseen un No forman polímeros. Sus características Poseen cargas
s químicas grupo aldehído o cetona Las moléculas químicas varían de lipídicas negativas que le
constan, ya acuerdo con el tipo de sea de confieren acidez,
largas cadenas aminoácidos que las de
son moléculas
carbono e conformen. Los
hidrógeno como en los aminoácidos puedenpolares y son
ser ácidos grasos e hidrofílicos.

2. Práctica 1. SEGURIDAD Y NORMAS DE LABORATORIO

Referente teórico seguridad y normas de laboratorio

Se entiende la práctica de laboratorio, como la estrategia pedagógica
que facilita la consolidación del aprendizaje y el desarrollo de
competencias disciplinares. La práctica de laboratorio puede
desarrollarse en una sesión o en varias sesiones de acuerdo a las
indicaciones que se den en la programación de cada periodo
académico.
En el laboratorio se realiza, para el caso del curso de bioquímica,
prácticas experimentales: en donde se aprenden a manipular equipos,
reactivos químicos, conformándose pequeños grupos de trabajo para
el desarrollo de la actividad. Para llevar a cabo las prácticas de
laboratorio se requiere que el estudiante tenga un conocimiento teórico
básico sobre el tema y lea detenidamente la guía de laboratorio.

2.1 NORMAS PERSONALES

La vestimenta deberá ser apropiada y cómoda, que facilite la movilidad
para la actividad que se desarrolla en los laboratorios. Debe cubrir
áreas considerables de la piel con pantalones (jeans), blusas con
mangas, la bata y guantes.
Use calzado cerrado que cubra completamente el pie. El alumno debe
portar en todo momento Bata blanca de Laboratorio.
Nunca ingerir alimentos, beber o masticar chicle dentro del laboratorio,
igualmente evitar tocar partes del rostro y llevar las manos a la boca o
introducir lapiceros u otros en boca nariz y oídos.
Asistir puntualmente en la fecha y hora programada, igualmente al
entrar a las instalaciones del laboratorio se recomienda que se haga
cuando esté presente el docente encargado de la práctica, así como no
ausentarse antes de terminar la práctica.
El área del laboratorio es exclusivamente para realizar el trabajo de la
práctica; cualquier tipo de acción social como cortejar, charlas ajenas
a la práctica e igual que las bromas pueden causar pérdida de tiempo
y posibles incidentes de alta gravedad.

2.2 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Cuando se tiene que hacer una reacción química se debe escoger el
recipiente adecuado a la cantidad que se va a usar. Los ensayos se
hacen en tubos de ensayo o en placas de gotas, nunca en vasos,
matraces, etc.
No usar recipientes alimenticios para contener productos químicos e
igualmente cualquier recipiente que se utilice para la recepción
productos es necesario rotular, brindando la mayor información sobre
la sustancia contenida.
De los materiales de laboratorio No utilice vidrio agrietado, el material
de vidrio en mal estado aumenta el riesgo de accidente. No deben
utilizarse para pipetear jeringuillas provistas de aguja hipodérmica o
aspirar con la boca pipetas de vidrio. Compruebe la temperatura de los
materiales antes de cogerlos directamente con las manos.
Si cuenta con sistemas de extracción y renovación mecánica de aire
activados, manténgalos siempre en funcionamiento. Utilizar las
campanas extractoras siempre que sean posible.
Para detectar el olor de una sustancia, no se debe colocar la cara
directamente sobre el recipiente: utilizando la mano abierta como
pantalla, es posible hacer llega una pequeña cantidad de vapor hasta
la nariz. Los frascos deben cerrarse inmediatamente después de su
uso.
Al momento de trabajar con ácido, para diluirlos vierta el ácido sobre
el agua, nunca, al contrario.
No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los
productos utilizados. Nunca debe sacar sustancias químicas del
laboratorio sin autorización.

2.3 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE INSTRUMENTACIÓN

Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza se
utilizará un recipiente adecuado.
Se debe mantener perfectamente limpio y seco el lugar dónde se
encuentre situado cualquier instrumento con contactos eléctricos. Leer
las instrucciones de uso de los instrumentos.
Debe revisarse el material de vidrio para comprobar posibles fisuras,
especialmente antes de su uso a vacío o presión.

2.4 NORMAS DE EMERGENCIA

En caso de tener que evacuar el laboratorio, cerrar la llave del gas y
salir de forma ordenada siguiendo en todo momento las instrucciones
que haya impartido el Profesor. Localizar al iniciar la sesión de prácticas
los diferentes equipos de emergencia en el correspondiente
laboratorio: Duchas y lavaojos, Botiquín, Absorbente para derrames,
Alarma de emergencia, Salida de emergencia y Recipiente para el vidrio
roto.
Al finalizar la práctica, limpia el área de trabajo y entrega los materiales
utilizados limpios y en buenas condiciones. Por último esperar las
indicaciones para retirarse de las instalaciones del laboratorio.

2.5 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS.

El estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes materiales:

1. Documento protocolo de laboratorio

2. Elementos de bioseguridad (bata, guantes, tapabocas, gorro,
zapatos cerrados).
3. Marcador Sharpie negro, toallas de papel absorbente, jabón de
manos, fósforos.
4. Material solicitado por el docente de prácticas.
 5. Previamente debe observar el vídeo de Prevención en el
laboratorio. Instituto Asturiano de Prevención en el siguiente
link: https://www.youtube.com/watch?v=KwpVi8yfroY
6. Ver video de Reglamentación Normas de Bioseguridad
Laboratorio UNAD, en el siguiente link:
https://academia.unad.edu.co/laboratorios-normas-debioseguridad
Se hará la discusión sobre las normas de seguridad antes descriptas y
las que encuentran en el Reglamentación y Normas de Bioseguridad en
los Laboratorios de la UNAD y Otras Disposiciones.
Identifique la señalización que encuentra en el laboratorio, fotografié o
dibuje los pictogramas y describa en el informe de laboratorio que
significan con que elementos de seguridad se cuenta. (Duchas,
extintores, cámaras extractoras, etc.)
Desarrolle las siguientes Preguntas:
a) Escriba el nombre del reactivo y la formula química de los
productos usados en la práctica.
Ejemplo, Nitrato de plata (AgNO3)
c) Escriba una propiedad física de la sustancia.

Ejemplo, Son cristales blancos Densidad: (20/4): 4,352

d) Mencione posibles riesgos que representa la sustancia para

la salud.

En contacto con la piel y ojos puede provocar irritación y quemaduras. Por

ingestión puede causar irritaciones en las mucosas de la boca, garganta,
esófago y tracto intestinal.

e) Indique cual es el equipo o la vestimenta de seguridad

necesaria para manipular la sustancia.

Usar equipo respiratorio adecuado. Utilizar guantes y gafas apropiadas.

Utilizar ropa de trabajo adecuada (bata de laboratorio) y lavarse
las manos y la cara antes y al finalizar el trabajo.

f) Resuma la información obtenida en el área de reactividad

del símbolo de diamante

En cuanto a la salud (rombo azul), el número 2 indica que es un reactivo

peligroso. En cuanto a inflamalidad (rombo rojo), el número 0 indica que no
es inflamable. En cuanto a la reactividad (rombo amarillo), el número 0
indica que es estable. En cuanto a algún riesgo específico (rombo blanco), no
presenta alguno.
 3. Practica 2: PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LOS
AMINOÁCIDOS.

Referente teórico de aminoácidos

Los aminoácidos se denominan así por tener un grupo amino (-NH2) y
un grupo carboxilo (-COOH).
Es posible agrupar los aminoácidos en clases principales basadas en las
propiedades de sus grupos R, en especial de su polaridad, o tendencia
a interaccionar como el agua a pH biológico (cerca del pH 7.0). La
polaridad de los grupos R varía enormemente desde totalmente apolar
o hidrofóbico (insoluble en agua) hasta altamente polar o hidrofílico
(soluble en agua).

Tabla 2. Clasificación de los aminoácidos.

Grupos R Propiedades de los aminoácidos

Apolares Los grupos R de esta clase de aminoácidos son apolares e

alifáticos hidrofóbicos.
Las cadenas laterales de la alanina, valina, leucina e
isoleucina tienden a agruparse entre sí en las proteínas,
estabilizando las estructuras proteicas a través de
interacciones hidrofóbicas.
Otros aminoácidos que conforman este grupo son: glicina,
metionina y prolina.

Aromáticos Fenilalanina, Tirosina y Triptófano, con sus cadenas

laterales aromáticas, son relativamente apolares
(hidrofóbicos). Todos ellos pueden participar de interacciones
hidrofóbicas.
Polares sin Los grupos R de estos aminoácidos son más solubles en
carga agua, que los aminoácidos apolares, debido a que contienen
grupos funcionales que forman puentes de hidrógeno con el
agua.

Incluye este grupo la serina, treonina, cisteína,

asparagina y glutamina.

Cargados Estos aminoácidos pueden tener el grupo R cargado

positivamente (básicos) o negativamente (ácidos), siendo
más hidrofílicos que los demás aminoácidos.

Los aminoácidos en los que los grupos R tienen una carga

neta positiva significativa a pH 7.0 Lisina, arginina e
histidina

Con una carga neta negativa a pH 7.0 son: aspartamo y el

glutamato.

La cadena R es de estructura variable y es la responsable de las

características particulares de los AA y de su clasificación, en función
de ésta podemos agrupar a los 20 aminoácidos, en diversas
categorías así mismo, la nomenclatura puede hacerse utilizando un
código de tres letras o de una, tal como se observa en la siguiente
tabla:
Tabla 3. Aminoácidos proteicos con nomenclatura clásica sistema de
tres letras y sistema de una sola letra, impuesto en genética
molecular.
Nomenclatura

Una Tres Nombre Clasificación

letra letras

A Ala Alanina Apolares alifáticos

 G Gly Glicina

I Ile Isoleucina Ae

L Leu Leucina Ae

V Val Valina

F Phe Fenilalanina Ae Apolares aromáticos

W Trp Triptófano Ae

C Cys Cisteina Apolares con azufre

M Met Metionina Ae

N Asn Asparagina

Q Gln Glutamina Polares alifáticos y sin

carga
S Ser Serina

T Thr Treonina Ae

Y Tyr Tirosina Polar aromático y sin

carga

R Arg Arginina Polar con carga positiva

H His Histidina Ae

K Lys Lisina

D Asp Ac. Aspártico o Aspartato Polar con carga

negativa
E Glu Ac. Glutamico o Glutamato

P Pro Prolina Iminoacido

Ae = Aminoácido esencial
Tomado de: Manual de Prácticas de Laboratorio de bioquímica,
Universidad Nacional Autónoma de México
Tabla 4. Pruebas bioquímicas para identificar aminoácidos.
Prueba bioquímica Descripción de la reacción química entre los
aminoácidos y los reactivos.

Reacción con la El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma

ninhidrina complejos coloreados con la ninhidrina: violeta
azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo
(Hidrato de
amino es primario, amarillo para la prolina e
tricetohidrindeno)
hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un
grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción
también identifica los grupos alfa-amino libres
presentes en péptidos y proteínas

Reacción de Millón El anillo fenólico tiene un comportamiento

característico frente a las sales de Mercurio a pH
ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el
anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la
contienen.

Reacción Los anillos aromáticos presentes en algunos

Xantoprotéica aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado
formando nitroderivados de color amarillo o
anaranjado por lo cual esta reacción permite
reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y
Triptófano.

Reacción de El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de

Sakaguchi la Arginina reacciona con soluciones de alfa naftol en
presencia de Bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos.

Reacción de Ehrlich La presencia de anillos aromáticos fenólicos o

nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos
se puede identificar mediante la reacción con ácido
sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales
de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así
detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o
formando péptidos y proteínas.
 Reacción de El anillo indólico presente en la cadena lateral de los
Adamkiewick o alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de péptidos
Hopkins Cole y proteínas se puede reconocer mediante reacción
con el ácido glioxílico a pH ácido, puesto que forma
complejos de coloración violeta o

Reacción con acetato Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteína

de Plomo alcalino y Cistina se reconocen por la formación de
precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro
o negro que se forman cuando reacciona con Acetato
de Plomo en medio alcalino.

3.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

El estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes materiales:

1. Documento protocolo de laboratorio

2. Elementos de bioseguridad (bata, guantes, tapabocas, gorro,
zapatos cerrados).
3. Marcador Sharpie negro, toallas de papel absorbente, jabón de
manos, fósforos.
4. Material solicitado por el docente de prácticas.
5. Previamente debe observar el vídeo de identificación de
aminoácidos y proteínas de la Universidad Politécnica de
Valencia, en el siguiente link:
https://www.youtube.com/watch?v=xubq3xOssWU
6. Ver video de identificación de aminoácidos y proteínas realizado
en el Laboratorio de la Universidad Politécnica de Valencia en el
siguiente link:
https://www.youtube.com/watch?v=V6TV6aeJQQA

Tabla 5 Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantidad

Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15

NaOH Gradilla 2

Sulfato cúprico Pinza para tubos 2

(CuSO)

Ácido Pipetas Pauster con bulbo 4

acético(CH3COOH)

Cloruro de sodio Beaker o vasos de precipitados de 500 mL 5

(NaCl)

albúmina Estufa 1

Ácido nítrico Cámara de flujo laminas 1

(HNO3)

Hidróxido de sodio Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 4

(NaOH) ml.

Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4

α Naftol

Hipoclorito de sodio

Reactivo de
Hopkins- Cole

Ácido sulfúrico
(H2SO)

Reactivo de Millón

Aminoácidos:
Glicina, tirosina,
triptófano,
fenilalanina y
arginina

Fenol

Albumina de huevo
 Procedimiento
3.2 REACCIÓN CON LA NINHIDRINA
El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados
con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos
cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e
hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en
la cadena lateral.
Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres
presentes en péptidos y proteínas. Precauciones la ninhidrina es
toxica.

Tabla 6 Procedimiento a realizar para la reacción de ninhidrina.

Tub Cantidad Reacti Procedimiento Cada tubo
os vo

1 con 1.5 mL Ninhid Preparar los tubos de Agregar 2 ml de

de Glicina1% rina ensayo. solución de
ninhidrina (0.3%)
2 con 1.5 mL Ninhid
de rina Agregue a cada tubo de
Albúmina1% ensayo 1.5mL de la
solución correspondiente.
3 con 1.5 mL Ninhid
de Tirosina rina
1%
2 ml de solución (0.3%)
1.5 ml de solución
4 con 1.5 mL de Ninhid de ninhidrina a cada
respectiva
Glicina 1% rina tubo.
+
5 con 1.5 mL Ninhid
Baño de agua
de Triptófano rina Tubos de ensayo en un
hirviente por 10
1% baño de agua hirviente
minutos.
por unos 10 minutos.
6 con 1.5 mL Ninhid
de Leucina al rina
1%
Observar y tomar
apuntes de los cambios.
 3.3 REACCIÓN DE BIURET
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los
aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH
que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva
sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino,
se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta
(Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de
proteínas.

Tabla 7 Procedimiento a realizar para la reacción de Reacción de Biuret.

Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
s

1 con 1.5 NaOH 2,5N

ml de
+ Preparar los tubos de 1 ml de
solución
ensayo.
de sulfato NaOH 2,5N
Leucina cúprico o
+
al 1%
1ml Reactivo Agregue a cada tubo
3 gotas de
biuret de ensayo 1 ml de
preparado solución de sulfato
NaOH 2,5N de la cúprico al 1% o
solución
correspondiente. 1ml Reactivo
2 con 1.5 NaOH 2,5N Biuret preparado
mL de
+
Albúmina Agregue 3 gotas de
1% sulfato solución de sulfato
cúprico o cúprico al 1% a cada
1ml Reactivo tubo de ensayo.
biuret
preparado
3 con 1.5 NaOH 2,5N Agite cada tubo de 1.5ml de solución
mL de ensayo respectiva
+
Tirosina
1% sulfato
cúprico o Observar y tomar
apuntes de los
cambios.

1ml Reactivo
biuret
preparado

4 con 1.5 NaOH 2,5N

mL de
+
Glicina
1% sulfato
cúprico
o
1ml Reactivo
biuret
preparado

5 con 1.5 NaOH 2,5N

mL de
+
Triptófan
o 1% sulfato
cúprico
o
1ml Reactivo
biuret
preparado

3.4 REACCION XANTOPROTEI

CA.
 Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan
con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color
amarillo o anaranjado por locual esta reacción per mite reconocer la
presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano.

Tabla 8 Procedimiento a realizar para la reacción Xantoprotéica.

Tub Cantidad Reacti Procedimiento Cada tubo
os vo

1 con 1.5 ml HNO3 Agregue, 0,5 ml de

de solución +
Preparar los tubos de HNO3
de
ensayo.
Triptófano NaOH +
1%

2 con 1.5 mL HNO3 Agregue, 0,5 ml de

de + HNO3 concentrado en cada
Albúmina1% tubo, en la
NaOH campana de extracción.

3 con 1.5 mL HNO3 Retire los tubos del baño y

de Metionina +
déjelos enfriar.
1% 1.5 ml de solución
NaOH respectiva
Agregue lentamente 1 ml
+
de Amoniaco
4 con 1.5 mL HNO3 (NH4OH) concentrado en Baño de agua
de +
la campana de hirviente por 10
Fenilalanina extracción o 1.5 mL. de minutos.
1% NaOH NaOH al 40%,
+
Agregue 1 ml de
Observar y tomar apuntes Amoniaco (NH4OH) ó
de los cambios. 1.5 mL de NaOH al
40%.
+
observe el cambio de
color

3.5 REACCION DE MILLON

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las

sales de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo
con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen.

Tabla 9 Procedimiento a realizar para la reacción de millón.

Tub Cantida Reactivo Procedimiento Cada tubo
os d

1 con 1.5 Reactivo Agregue 2 ml

ml de de Millón gotas del Reactivo
Preparar los tubos de
solución de Millón +
ensayo.
de
Tirosina
1%

2 con 1.5 Reactivo de agregue 2 ml del

mL de Millón Reactivo de Millón a cada
Albúmin tubo de ensayo
a1%
3 con 1.5 Reactivo de
mL de Millón
Caliente en baño de agua
Leucina
en ebullición por 10
1%
minutos.

Observar los colores 1.5 ml de solución

desarrollados y tomar respectiva
apuntes de los cambios. +
Baño de agua en
ebullición por 10
minutos
+
Observar y tomar
apuntes.

3.6 REACCION DE SAKAGUCHI

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina

reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en
medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos
Tabla 10 Procedimiento a realizar para la reacción de Sakaguchi.
Tub Cantida Reactivo Procedimiento Cada tubo
os d
1 con 1.5 Hidróxido Enfríe en baño de
mL de de Sodio hielo por 10
Preparar los tubos de
solución (NaOH minutos.
ensayo.
de
+ +
Arginina
1% alfa-naftol 1 ml de Hidróxido
Enfríe en baño de hielo
de Sodio (NaOH) al
+ por 10 minutos.
5%
hipoclorito
+
de Sodio o

Reactivo 1 ml de Hidróxido de Dejar enfriar 10

Sakagushi Sodio (NaOH) al 5% a minutos.
preparado cada tubo de ensayo.
+
2 con 1.5 Hidróxido 2 gotas de alfanaftol
mL de de Sodio Dejar enfriar 10 al 1%.
Albúmin (NaOH minutos.
a1% +
+
2 gotas de
alfa-naftol Agregue con un gotero, hipoclorito de
+ 2 gotas de alfa-naftol al Sodio al 10%. o
1% a cada tubo de
hipoclorito ensayo. 1.5 ml Reactivo
de Sodio o Sakagushi
preparado
Reactivo
Sakagushi Agregue 2 gotas de
preparado hipoclorito de Sodio al
10% a cada tubo.
3 con 1.5 Hidróxido o
mL de de Sodio
proteína (NaOH
de trigo 1.5 ml Reactivo
+
1%. Sakagushi preparado
alfa-naftol
+ 5 ml de solución
Observar y tomar respectiva
hipoclorito apuntes de los cambios.
de Sodio o
Reactivo
Sakagushi
preparado

4 con 1.5 Hidróxido

mL de de Sodio
Leucina (NaOH
+
alfa-naftol
+

hipoclorito
de Sodio
o
Reactivo
Sakagushi
preparado

Tabla 11 Resumen de las reacciones de aminoácidos en las diferentes

técnicas.

NINHIDRINA
(-) incolora (+) Violeta o (+) Rojo o
amarillo amarillo
No es
claro fuerte
proteína ni
proteína, Hidroxiprolin
aminoácido
polipéptido o a o prolina
aminoácido

BIURET

(-) Azul o (+) Violeta

amarillo Proteínas y
aminoácidos polipéptidos

XANTOPROTÉICA
COAGULACIÓN

(-) Incoloro (+) Amarillo, (-) No (+) Coagula

naranja o coagula
Otros Albúminas o
verde
aminoácidos Histonas, globulinas
Tirosina,
protaminas o
fenilalanina
polipéptidos
o triptófano

ADAMKIEWICK o
HOPKINS COLE
SULFATO DE AMONIO

(+) Azul o (-) Incoloro (+) Precipita (-) No

violeta
Globulinas Precipita

Triptófano Tirosina o Albúminas

Fenilalanina

MILLÓN

(+) Rojo (-) Incoloro

Grupo SH Tirosina Fenilalanina
 SAKAGUCHI

(-) Incolora (+) Rojo (+) Negro o

gris
Otros Arginina
aminoácidos Cisteína,
cistina,
metionina

3.7 PREGUNTAS:

Escriba la reacción para cada una de las pruebas realizadas.

Proponga de acuerdo a las pruebas una clasificación de los
aminoácidos utilizados y relacione la importancia de la aplicación de
algunas de estas pruebas aplicadas a otras áreas del conocimiento
como: microbiología, química de alimentos entre otras.
Para el siguiente pentapéptido, diga cuales pruebas y porque serán
positivas. (ALA- VAL-GLY-GLU-LYS)
Defina los siguientes términos: aminoácidos, proteínas, análisis
cualitativo, cuantitativo.

4. Practica 3. BIOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Referente teórico de proteínas y aminoácidos.

Las proteínas son uno de los principales componentes de todas
nuestras células. Los aminoácidos (compuestos orgánicos) son los
ladrillos de construcción de las proteínas. Los aminoácidos se agrupan
de acuerdo con su comportamiento químico. La síntesis de las proteínas
ocurre mediante la unión entre sí de las cadenas de aminoácidos. Los
distintos aminoácidos imparten diferentes comportamientos químicos
en la estructura de las proteínas. Debido a la presencia de diferentes
aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas reaccionan con una
variedad de compuestos formando productos coloreados.
Los aminoácidos tiene tres tipos de reacciones químicas importantes:
(1) reacciones debido a la presencia del grupo carboxilo (COO- ), (2)
reacciones debidas al grupo amino (NH), y (3) reacciones debido al
grupo R.
Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son
generales y se dan para todos los aminoácidos. Las reacciones del
radical R son reacciones específicas; por ejemplo, cisteína da una
reacción para azufre, triptófano da ciertas reacciones de color debido a
que su molécula contiene el grupo indol, tirosina da otras reacciones
de color debido a su grupo fenólico, etc.

Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos

de esas proteínas y son importantes tanto para la detección como para
el dopaje de aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones
generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a todas las
proteínas como grupos amino o uniones

Tabla 12 Descripción de reactivos y métodos.

Método Descripción Desventajas

Biuret Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. El método se usa para

DAVID. Determination of serum soluciones que tienen de
proteins by means of the biuret. 0.5 a 10 mg proteína/ml.
reaction. J. BioZ. Chem. 177:
751766, 1949
 Se basa en la reacción de sales de Es un método poco
Cu+2 con moléculas que contienen sensible. Es útil cuando
más de dos enlaces peptídicos en un se quiere analizar
medio alcalino; el cobre es reducido grandes lotes de
a Cu+ formando complejos color proteína.
púrpura que tienen un máximo de
absorción a 540 nm.

Lowry Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr,

and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193:
265. 1951
Este es un método muy
sensible, por lo que
Resulta de la reacción de Biuret permite trabajar con
sobre los enlaces peptídicos, además soluciones muy diluidas
de la reducción del reactivo de de proteínas (0.02 - 0.5
fosfomolibdato-fosfotungstato mg proteína/ ml)
(FolinCiocalteu) por las proteínas
pretratadas con cobre en medio
alcalino, dando una coloración azul,
determinado a 650 nm.

El Cu+ y los grupos R de la tirosina,

triptofano y cisteína reaccionan con
el reactivo de Folin, produciendo un
producto inestable que es reducido a
azul de molibdeno/tungsteno.
 Bradfor Bradford, M. M. (1976) Anal. Muestra interferencias
d Biochem. 72, 248 con detergentes

Basado en el Azul Brillante de

Coomasie G-250 cambia de rojo a
azul, al unirse a residuos aromáticos
y arginina en las proteínas.
La reacción entre el colorante y la
proteína es muy rápida
(aproximadamente 2 min), y el
completo proteína-colorante
permanece disperso en solución por
un tiempo relativamente largo.

Rango de detección: 0.5-10 mg

proteína/ml.

4.1 PROCEDIMIENTO Y MATERIALES

El estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes materiales:

1. Documento protocolo de laboratorio

2. Elementos de bioseguridad (bata, guantes, tapabocas, gorro,
zapatos cerrados).
3. Marcador Sharpie negro, toallas de papel absorbente, jabón de
manos, fósforos.
4. Material solicitado por el docente de prácticas

Tabla 13 Materiales y Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantida
d

Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15

NaOH Gradilla 2

Sulfato cúprico (CuSO) Pinza para tubos 2

Ácido Pipetas Pauster con bulbo 4

acético(CH3COOH)

Cloruro de sodio (NaCl) Beaker o vasos de precipitados de 500 5

mL

Albúmina Estufa 1

Ácido nítrico (HNO3) Cámara de flujo laminas 1

Hidróxido de sodio Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 4

(NaOH) ml.

Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4

α Naftol Vidrios reloj grandes

Hipoclorito de sodio Probeta 100 ml

Reactivo de Hopkins- Balón aforado de 25 ml

Cole

Ácido sulfúrico (H2SO) Agitador de vidrio

Reactivo de Millón Balanza analítica

Aminoácidos: Glicina, Espectrofotómetro

tirosina, triptófano,
fenilalanina y arginina

Fenol Micropipeta 10 μL

Albumina de huevo Micropipeta 20- 200 μL

Agua destilada Micropipeta 20- 200 μL

Ácido fosfórico Micropipeta 200-1000 μL

L
 Etanol 1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)
para micropipeta

1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)

para micropipeta

1 caja con puntas de 1000 μL (azules)

para micropipeta.

Agitador vórtex múltiple para tubos

4.2 REACCIÓN DE BIURET

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven

por tanto para su identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta
reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los
aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH
que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva
sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino,
se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta
(Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de
proteínas.

Tabla 14 Procedimiento a realizar para la reacción de Biuret.

Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

o
1 con 3 mL de CuSO4 al Preparar los tubos de
solución de 1% ensayo.
4 a 5 gotas de
Albúmina de
+ solución de CuSO4
huevo 1%
al 1%
hidróxido Añadir de 4 a 5
sódico gotas de solución de +
CuSO4al 1%
o 2 ml

Reactivo hidróxido
biuret Añadir 2 ml de sódico o
preparado solución de hidróxido
2ml Reactivo
sódico al 20%.
2 con 3 mL de CuSO4 al biuret preparado
solución de 1% o
aminoácidos 2ml Reactivo biuret
+
Tirosina, preparado
Triptófano o hidróxido
Fenilalanina. sódico
o Agitar para que se
mezcle.
Reactivo
biuret
preparado
Observar y tomar
3 con 3 mL de CuSO4 al apuntes de los
con 3 mL de
Leche 1% 1% cambios. solución
respectiva
+
+
hidróxido
sódico Agitar y observar
color violeta, azul
o
o amarillo.
Reactivo
biuret
preparado
4 con 3 mL de CuSO4 al
Aceite de 1%
cocina
+
hidróxido
sódico

o
Reactivo
biuret
preparado

5 con 3 mL de CuSO4 al
Glucosa 1%
+
hidróxido
sódico
o
Reactivo
biuret
preparado

4.3 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de

sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separa
álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al re
solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de ploción mediante un
accionar con una
mo. s SH.
Tabla 15 Reacción De Aminoácidos Azufrados, Grupo

Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 mL de hidróxido Preparar los tubos de 2 ml
solución de sódico ensayo. hidróxido
Albúmina de sódico
+
huevo 1%
acetato de Añadir 2 ml de solución +
plomo de hidróxido sódico al
solución de
20%.
acetato de
plomo al 5%
2 con 3 mL de hidróxido +
solución de sódico
aminoácidos
+
Tirosina,
Triptófano o acetato de Añadir 10 gotas de
Fenilalanina. plomo solución de acetato de
plomo al 5%

3 con 3 mL de hidróxido
Leche 1% sódico Calentar el tubo hasta
ebullición.
+
con 3 mL de
acetato de
plomo solución
Observar y tomar apuntes
respectiva
de los cambios.
+
4 con 3 mL de hidróxido
Calentar el tubo
Aceite de sódico
hasta ebullición.
cocina
+ El precipitado de color
negruzco indica que se ha
acetato de
formado sulfuro de
plomo
5 con 3 mL de hidróxido Plomo, utilizándose el
Glucosa sódico azufre de los
aminoácidos
+
acetato de
plomo

6 Con 3ml de hidróxido

extracto de sódico
carne res
+
cruda
acetato de
plomo

4.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS:

MÉTODO DE BRADFORD.

Práctica sugerida de acuerdo a la disposición de los recursos.

INTRODUCCION

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas

de una muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280
nm, o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas,
base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma
un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método
de Lowry, además del complejo anterior también se forma un derivado
de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total.

El método de Bradford se basa en el empleo de emplea un colorante

hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico
tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico
del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede
medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción
relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las
proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de
contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos
como el metanol.

La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en

la cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie
G-250, a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes
cantidades de una proteína estándar (Albúmina de Suero Bovino
(BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un
espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs la
concentración de proteínas, obteniendo una curva de calibración de la
proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar
la concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia
a 595 nm.

1- Reactivo de Bradford
Azul de coomasie G-250 5 mg
Etanol 2.5 ml
Ácido fosfórico 5 ml
Agua Hasta 50 ml
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación
filtrar

2-Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de

agua destilada, con lo que tenemos una disolución madre con una
concentración de 1 mg/ml.

1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0

hasta 60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de
300 µl.
Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de
albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen
necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.

METODO
1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0
hasta 60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de
300 µl. Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre
de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen
necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.

Tabla 16 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango

desde 0 hasta.
µg (prot) 0 10 20 30 40 50 60

µl (alb) 0 10 20 30 40 50 60

µl 300 290 280 270 260 250 240

(agua)

µl total 300 300 300 300 300 300 300

2-Preparación de tres diluciones de la muestra problema:

Hacer una dilución 1:20 de la leche comercial; a continuación realizar

las diferentes diluciones de acuerdo con la siguiente tabla.
Tabla 17 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango
desde 0 hasta
Leche diluida A B C

V. leche (µl) 20 25 30

V. agua (µl) 280 275 270

 V. total 300 300 300

Finalmente añadir 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto

a las diluciones que contienen la albúmina como a las que contienen la
leche diluida. Agitar los tubos y a continuación proceder a la lectura de
la absorbancia a 595 nm en el colorimetro.

RESULTADOS
1- Elaboración de la recta patrón. Para ello representar en el papel
milimetrado adjunto la absorbancia de cada uno de los tubos que
contenían albúmina bovina frente a la cantidad de proteínas
correspondiente. Si se dispone de una calculadora con capacidad para
hacer rectas de regresión, compruebe el coeficiente de correlación de
la recta obtenida. En cualquier caso determine la pendiente de la recta.

2- Para las tres diluciones del problema, interpolar la absorbancia

obtenidas sobre la recta representada para saber la cantidad de
proteínas presentes en cada una de ellas. Alternativamente, haga el
cálculo mediante la pendiente de la recta.

3- Teniendo en cuenta los volúmenes de muestra usados en cada

caso y teniendo en cuenta la dilución realizada, calcúlese la
concentración de proteínas en la muestra analizada. Dar el resultado
en gramos de proteínapor 100 ml de leche.

4.5 PREGUNTAS:
¿Cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la
determinación de proteínas?
¿Cuál es la reacción de un alfa-aminoácido y ninhidrina?
¿Cuál es la reacción con el reactivo de Biuret?
¿Qué proteínas dan positivas con la prueba de Hopkins-cole?
¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo? 2. ¿Cuál
de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización?
3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una
proteína? 4. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret? 5. ¿Una proteína
coagulada podría dar la reacción del Biuret? 6. Si se realiza la reacción
del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa?
¿Por qué?
5. Práctica 4: IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Referente teórico.
Los hidratos de carbono constituyen el grupo de biomoléculas más
abundante sobre la superficie terrestre, representando
aproximadamente el 75 % de la materia orgánica existente. En
ocasiones, se denominan también carbohidratos, azúcares, sacáridos o
glúcidos. Todos son términos que hacen referencia a su sabor dulce, o
a que poseen la composición Cn (H2O)n. Estas moléculas usualmente
contienen carbono, hidrógeno y oxígeno en una proporción de
1:2:1. Los carbohidratos se clasifican como monosacáridos, disacáridos
o polisacáridos, dependiendo del tamaño y la complejidad de la
molécula. Los monosacáridos se componen de una sola molécula de
azúcar. Cuando dos monosacáridos se unen se produce un disacárido,
y cuando dos o más se unen se produce un polisacárido.

En los animales los carbohidratos son esenciales desde el punto de vista

energético, ya que muchos órganos y células del cuerpo humano, como
el cerebro y los glóbulos rojos, obtienen su energía principalmente de
la glucosa. Pero sus funciones no se restringen a ser únicamente fuente
de energía, sino que también pueden desarrollar funciones
estructurales, de reconocimiento celular y adhesión. Estructuralmente,
un hidrato de carbono típico es una cadena hidrocarbonada con varios
grupos alcohol y un carbono más oxidado, en forma de grupo carbonilo.
Este grupo oxidado puede situarse en el extremo de la cadena
(aldehído), o adyacente, en posición 2 (cetonas)
Ilustración 1 Clasificación de carbohidratos.

Todos los monosacáridos y los disacáridos con enlace monocarbonilo,

cuando se encuentran en solución a pH alcalino, tienen la capacidad
de reducir otros compuestos. Esta capacidad reside en las
características del grupo carbonilo (C anomérico en formas cicladas)
libre. Esta propiedad, y por tanto, la presencia de un azúcar reductor,
se ponen de manifiesto mediante las reacciones de:

Tabla 18 Diferentes ensayos para reconocimiento en carbohidratos.

Ensayo Descripción del ensayo

Molisch: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de

carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se
hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos
y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural
los cuales reaccionan con α-naftol formando un color púrpura
violeta.
Fehling -Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O
-Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disueltos en agua

(Detecta la presencia de azúcares reductores) Los azúcares

reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el ión
Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo
carbonilo del azúcar se oxida a grupo carboxilo. En medio
fuertemente básico, como es en este caso el NaOH, el ión Cu2+
formaría Cu (OH)2 insoluble, por eso se añade tartrato sódico
potásico en el Fehling B (el reactivo de Fehling consta de dos
componentes: Fehling A y Fehling B) que actúa como
estabilizador al formar un complejo con el Cu2+.

NaO +Cal
H or
+R

CuSO ➔ Cu(OH)2 ➔ Cu2O (rojo

2 (azul) ladrillo)

Reacción

Benedict (Detecta la presencia de azúcares reductores) Se basa en la

reducción de Cu2+ a Cu+ en medio básico débil. Aunque es
similar a la reacción de Fehling, el medio básico débil y el
estabilizante (citrato sódico) utilizados hacen que este test sea
más sensible y estable.

-Sulfato cúprico.
-Citrato de sodio.
-Carbonato anhidro de sodio
 Barfoed Ácido acético
Acetato cúprico
(Detecta la presencia de monosacáridos) El reactivo de Barfoed
es débilmente ácido y es reducido solamente por
monosacáridos, formándose como producto de reacción óxido
cuproso.
En medio ácido, tan sólo los monosacáridos son capaces de
reducir el Cu2+ a Cu+. El Cu+ así producido reduce al ácido
fosfomolíbdico a un complejo de intenso color azul oscuro.

Ioduro Los polisacáridos sin ramificar forman complejos característicos

cuando reaccionan con yodo. Los ramificados también lo hacen,
pero los complejos formados tienen menos intensidad de color.

Seliwano Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de

ff la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensación con
resorcinol formando así complejos coloreados.
Bial El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma
complejos de coloración sólo con las pentosas.
Lugol El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro,
permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la
formación de una coloración azul violeta intensa y el glicógeno y las
dextrinas por formación de coloración roja.

Rotación óptica

Es una propiedad importante que permite identificar los carbohidratos,

y determinar el grado de pureza de los mismos, particularmente
monosacáridos, ocasionada por la presencia de centros asimétricos o
quirales en la estructura molecular, los cuales desvían el plano de luz
polarizada. Esta propiedad no es exclusiva de los carbohidratos pues la
presentan todas aquellas sustancias denominadas óptimamente
activas, por tener en su estructura centros quirales.

Para la medición de la rotación óptica los factores importantes a tener

en cuenta son: La longitud de onda de luz polarizada, la cantidad de
material óptimamente activo, y la naturaleza del solvente cuando se
usa. Los cambios en la temperatura ocasionan solo pequeñas
variaciones en las medidas de la rotación.

Los datos de rotación óptica se representan como |α] = rotación

específica o | M] = Rotación molecular, donde:
|α| = α/LC α: Rotación observada en
grados angulares
L: Longitud en decímetros del paso de luz polarizada a través de la
muestra
C: Concentración en gramos por mililitro.
M: Peso molecular

| M | = M x | α |/100 cuando el plano de luz polarizada se desvía en el

sentido de las manecillas del reloj se antepone un signo positivo al
número de grados que fue rotado el plano de luz.
El plano de luz polarizada hacia la derecha se llaman dextrógiros o
dextro rotatorios, y esa característica se indica anteponiendo el signo
(+) al nombre del compuesto. Los compuestos que desvían el plano de
luz polarizada hacia la izquierda se llaman levógiros o levo rotatorios,
y esa característica se indica anteponiendo el signo (-) al nombre del
compuesto.

O H O H Los prefijos D y L no tienen nada que ver

C C con el carácter dextro/levo rotatorio de
H – C – OH HO – C – H la molécula, sino que indican la posición
HO – C – H H – C – OH del OH del penúltimo carbono en la
H – C – OH HO – C – H representación de Fischer. Para indicar
H – C – –C
OH
H HO
su poder rotatorio hay que utilizar los
CH2OH CH2OH
signos (+) y (-). Da la casualidad de que
D- L- el D-gliceraldehído es dextrógiro (D-
glucose glucose
(+)gliceraldehído) y de que
el L-
gliceraldehído es levógiro (L-(-)-gliceraldehído), pero pueden existir
compuestos que pertenecen a la serie D y que son levógiros, como la
D-(-)-fructosa.

Ilustración 2 Molécula de glucosa.

5.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO.

El estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes materiales:

1. Documento protocolo de laboratorio

2. Elementos de bioseguridad (bata, guantes, tapabocas, gorro,
zapatos cerrados).
3. Marcador Sharpie negro, toallas de papel absorbente, jabón de
manos, fósforos.
4. Material solicitado por el docente de prácticas.

Tabla 19 Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantida
d

Reactivo de Benedict Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15

Reactivo Fehling A y Gradilla 2

reactivo Fehling B

Lugol Pinza para tubos 2

Glucosa Pipetas Pauster con bulbo 4

Sacarosa Beaker o vasos de precipitados de 500 5

mL

Almidón Estufa 1

Fructosa Cámara de flujo laminas 1

 Reactivo Fehling A y B Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 4
10 ml.

α-naftol Pera de goma para pipetas 4

Vidrios reloj grandes

Probeta 100 ml

Balón aforado de 25 ml

Agitador de vidrio

Balanza analítica

5.2 PRUEBA DE BENEDICT

Es similar a la reacción de Fehling, el medio básico débil y el

estabilizante (citrato sódico) utilizados hacen que este test sea más
sensible y estable.

Tabla 20 Prueba de Benedict (detecta la presencia de azúcares

reductores)
Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os

1 con 3 ml reactivo de
de Benedict
Preparar los tubos de Agregue a cada
Glucosa al
ensayo. tubo de ensayo
1%
2
2 con 3 mL reactivo de
ml de reactivo de
de Benedict Agregue a cada tubo
Benedict
sacarosa al de ensayo 2
1% +
3 con 3 mL reactivo de ml de reactivo de Baño de agua
de Benedict Benedict. hirviente por
almidón al 10 minutos.
1%

4 con 3 mL reactivo de Tubos de ensayo en un

de jugo de Benedict baño de agua
cebolla al hirviente por unos 10
1% minutos.

5 con 3 mL reactivo de
de Benedict
Agite cada tubo de
Fructosa
ensayo
al 1% 3 ml de solución
respectiva
6 con 3 mL reactivo de
de agua Benedict Observar y tomar
apuntes de los
cambios. Positiva
aparece un precipitado
rojizo, verde o
amarillo.

5.3 REACCIÓN DE FEHLING

Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el

ión Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo carbonilo
del azúcar se oxida a grupo carboxilo.

Tabla 21 Reacción de Fehling (detecta la presencia de azúcares

reductores)
Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os
1 con 3 Reactivo
mL de Fehling A
Preparar los tubos de Añadir reactivo
Glucosa al
Reactivo ensayo. Fehling A y reactivo
1%
Fehling B Fehling B

2 con 3 Ml Reactivo +
Añadir 1 ml del
de Fehling A
reactivo Fehling A y Baño de agua
sacarosa al
Reactivo 1 ml del reactivo hirviente por
1%
Fehling B Fehling B
10 minutos.
3 con 3 mL Reactivo
de Fehling A

almidón Reactivo Tubos de ensayo en

al 1% Fehling B un baño de agua
hirviente por unos
4 con 3 mL Reactivo
10 minutos.
de jugo Fehling A
de
cebolla al Reactivo
Fehling B Baño de agua
1%
hirviente por
3 ml de solución
5 con 3 mL Reactivo 10 minutos. respectiva
de Fehling A
Fructosa
Reactivo
al 1%
Fehling B Observar y tomar
apuntes de los
6 con 3 mL Reactivo cambios.
de Fehling A
Lactosa
Reactivo
al 1%
Fehling B

Reactivo Fehling A: disolver 7 g CuSO4 · 5 H2O en 100 ml de agua destilada.

Reactivo Fehling B: 35 g de tartrato de sodio y potasio + 12 g NaOH en

100 ml de agua destilada

5.4 REACCIÓN DE MOLISCH

 La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto
por la reacción de Molisch, que a cierto punto es la reacción universal
para cualquier carbohidrato. Se basa en la acción hidrolizante y
deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En
dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces
glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las
pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se
condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de
Molisch) dando un producto coloreado.
Tabla 22 Reacción de Molisch.
Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os

1 con 3 mL reactivo de
de Glucosa Molisch
al 1%

+ Preparar los tubos de reactivo de

ensayo. Molisch
H2SO4
+
2 con 3 mL reactivo de
de Molisch Agregue dos gotas de Incline el tubo y
Sacarosa al reactivo de Molisch deposite 1 mL de
+ H2SO4
1%
H2SO4
Mezcle bien
3 con 3 mL reactivo de No mezcle
de Molisch
Galactosa Incline el tubo y
+
al 1% deposite 1 mL de
H2SO4 H2SO4 concentrado
deslizándolo
4 con 3 mL reactivo de
lentamente por la
de Ribosa Molisch
pared del tubo.
1%
+

H2SO4
 5 con 3 mL reactivo de No mezcle. Sólo 3 ml de solución
de Fructosa Molisch coloque el tubo en respectiva
al 1% posición vertical y
+ +
observe la formación
H2SO4 del anillo rojo violeta coloque el tubo
que aparece en la en posición
6 con 3 mL reactivo de zona de contacto de vertical y observe
de maltosa Molisch los dos líquido la formación del
al 1% anillo rojo violeta
+

H2SO4

5.5 PRUEBA DE TOLLENS

En primer lugar, hemos de limpiar el tubo de ensayo donde se realizará
el experimento, hirviendo en éste NaOH al 10%. Entonces, se añaden
3 gotas de la muestra problema (o bien 50 mg de sólido), y 2,5 ml de
reactivo de Tollens recién preparado. Agitar el tubo y dejarlo estar
durante 10 minutos. Si al cabo de éste tiempo no se observa reacción,
se calienta el tubo en un baño de agua caliente.

Tabla 23 Prueba De Tollens.

Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os
1 con 3 mL de NaOH al 5% Preparar los tubos de
solución ensayo.
+ dos gotas de
Glucosa al
solución de
1% AgNO3 al 5%
añadir 2 gotas de una NaOH al 5%
o
disolución de
+
Reactivo de
NaOH al 5%
Tollens 1 mL de AgNO3
preparado
o
1 ml de disolución
1ml reactivo
2 con 3 mL de NaOH al 5% acuosa de AgNO3 al
Tollens preparado
solución de 5%
+
Sacarosa al
1% AgNO3 al 5%
Agitar el tubo y añadir
o
gota a gota y con
Reactivo de
agitación NH4OH 2N,
Tollens
hasta que se consiga
preparado 3 ml de solución
disolver el precipitado
respectiva
de AgOH (este
3 con 3 mL de NaOH al 5% procedimiento aplica
solución de cuando no se tiene
+ preparado el reactivo)
Galactosa al
1% AgNO3 al 5% o
o 2ml Reactivo de
Reactivo de Tollens preparado
Tollens
preparado
Mezcle el tubo y deje
reposar por 10 minutos.
4 con 3 mL de NaOH al 5%
solución de La aparición de un
+ espejo de plata o
Lactosa 1%
AgNO3 al 5% precipitado negro, es un
resultado positivo.
o
 Reactivo de
Tollens
Si luego de los 10
preparado
minutos, no ha
5 con 3 mL de NaOH al 5% ocurrido reacción
solución de alguna, puede
+
Fructosa al calentar en baño
1% AgNO3 al maría a 35ºC por
5% cinco minutos.
o
Reactivo de
Tollens
preparado

6 con 3 mL de NaOH al 5%
solución de
+
maltosa al
1% AgNO3 al
5%
o
Reactivo de
Tollens
preparado

5.6 REACCIÓN DE LUGOL (YODO)

La prueba de yodo se da como consecuencia de la formación de cadenas de
poliyoduro a partir de la reacción entre el almidón y el yodo presente en el
reactivo de lugol.

La amilosa y la amilopectina son componentes del almidón pero la amilosa

es de estructura lineal, con enlaces α (1-4), que forma hélices en donde se
juntan las moléculas de yodo formando un color azul oscuro; mientras que
la amilopectina es de estructura ramificada, con enlaces α (1-4) (1-6), que
 forma hélices mucho más cortas y las moléculas de yodo son incapaces de
juntarse presentando un color intermedio entre anaranjado o amarillo.

Tabla 24 Reacción de almidones con lugol (yoduro potásico).

Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os

1 con 3 ml de Lugol
solución
Preparar los Agregar 1 ml de
Glucosa al
tubos de Lugol
1%
ensayo.
2 con 3 mL de Lugol
solución
sacarosa al Agregar 1 ml de
1% Lugol

3 con 3 mL de Lugol
solución Observar y
almidón al tomar apuntes
1% de los cambios.
3 ml de solución
4 con 3 mL de Lugol respectiva
solución jugo
de cebolla al
1% Observar y tomar
apuntes de los
5 con 3 mL de Lugol cambios.
solución de
almidón de
papa al 1%

6 con 3 mL de Lugol
agua

5.7 PREGUNTAS
Explique por qué el monosacárido gliceraldehido da negativa la prueba
Molish.
¿Cuáles son las aplicaciones prácticas de las pruebas estudiadas?
Defina los siguientes términos: carbono anomérico, centro quiral,
levorrotatorio.
Dibuje los monosacáridos glucosa, galactosa, ribosa y fructosa,
clasifíquelos según el número de átomos de carbono y la función
principal
Defina los siguientes términos: azúcar reductor y azúcar no reductor,
cite ejemplos.

La prueba de Lugol sirve para identificar la presencia de un

carbohidrato de reserva como es el almidón. Que otros carbohidratos
de reserva existen?
Existen diferencias entre las pruebas de Fehling y Benedict? Cuáles
son?.
6. Practica 5. CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS GRASOS

Los lípidos (del griego lypos, grasa) son biomoléculas orgánicas

formadas básicamente por
C, H y O, aunque este último elemento se encuentra en proporciones
mucho más bajas que los dos primeros. Además, pueden contener P,
N y S. Constituyen un grupo de sustancias muy heterogéneas con
características químicas diversas, pero con algunas propiedades físicas
comunes, que podrían resumirse en estas dos:
_ Son mayoritariamente insolubles en agua.
_ Son solubles en disolventes orgánicos, tales como éter, cloroformo,
alcanos (ej: hexano), benceno, acetona y alcoholes.

De acuerdo a la estructura química los lípidos se clasifican en dos

grupos, de acuerdo al contenido en su composición ácidos grasos
(Lípidos saponificables) o no lo posean
(Lípidos insaponificables).

La saponificación consiste en una hidrólisis alcalina de la preparación

lipídica (con KOH o NaOH). Los lípidos derivados de ácidos grasos
(ácidos monocarboxílicos de cadena larga) dan lugar a sales alcalinas
(jabones) y alcohol, que son fácilmente extraíbles en medio acuoso.

Tabla 25 Clasificación de lípidos.

Lípidos saponificables Simples Acilglicéridos

Céridos

Complejos Fosfolípidos

Glucolípidos

Lípidos Terpenos
insaponificables
Esteroides
 Prostaglandinas

6.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO.

El estudiante debe llevar al laboratorio los siguientes materiales:

1. Documento protocolo de laboratorio

2. Elementos de bioseguridad (bata, guantes, tapabocas, gorro,
zapatos cerrados).
3. Marcador Sharpie negro, toallas de papel absorbente, jabón de
manos, fósforos.
4. Material solicitado por el docente de prácticas.
5. Previamente debe observar el vídeo Laboratorio experimental
Lípidos de la Universidad Nacional en el siguiente link:
https://www.youtube.com/watch?v=Dsx00q1voC4

Tabla 26 Materiales y Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantida
d

Aceite de girasol Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15

Agua destilada Gradilla 2

Hexano Pinza para tubos 2

Acetato de etilo Pipetas Pauster con bulbo 4

Etanol Beaker o vasos de precipitados de 500 5

mL

NaOH Estufa 1

KOH Cámara de flujo laminas 1

Reactivo Sudán III Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 4

10 ml.

Pera de goma para pipetas 4

Vidrios reloj grandes

 Probeta 100 ml

Balón aforado de 25 ml

Agitador de vidrio

Balanza analítica

6.2 SOLUBILIDAD EN LÍPIDOS

Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en
ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una emulsión de
aspecto lechoso, que es transitoria, puede sepárese en reposo, por
reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor
densidad se sitúa sobre la de agua. Por el contrario, las grasas con
solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, benceno,
xilol, cloroformo, etc.

Tabla 27 Determinación de solubilidad en lípidos.

Tub Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
os

1 con 3 ml 4 mL de Preparar los tubos de 4 mL de hexano

de Aceite agua ensayo.
vegetal destilada

2 con 3 ml 4 mL de 4 mL de hexano
de Aceite hexano
vegetal
 Agite los tubos.
3 ml de Aceite
vegetal
deje reposar unos
minutos +
Agite los tubos

Observar y tomar +
apuntes de los
Dejar en reposo.
cambios.
+
Observar y tomar
apuntes de los
cambios.

6.3 SAPONIFICACIÓN
Muchos lípidos, como por ejemplo: los ácidos grasos, reaccionan con
bases fuertes, NaOH o KOH, dando sales sódicas o potásicas que
reciben el nombre de jabones. Esta reacción se denomina de
saponificación. Son saponificables los ácidos grasos o los lípidos que
poseen ácidos grasos en su estructura.

Tabla 28 Ensayo de Saponificación.

Tub Cantida Reactivo Procedimiento Cada tubo
os d

1 3 mL 3 mL de Agregar manteca en
de NaOH un tubo de ensayo.
Preparar los tubos de
aceite
(1 N) ensayo.
vegetal
2 3 mL 3 mL de Agregar 3 mL solución
de KOH de NaOH
aceite
(1 N).
vegetal

Agitar.
3 ml de la solución
de NaOH (1 N).
Baño de agua hirviente
por +

10 minutos. Baño de agua

hirviente por
10 minutos.
Dejar enfriar.
Observar y tomar
apuntes de los
Observar y tomar cambios.
apuntes de los cambios.

Repetir el mismo
procedimiento con KOH

6.4 REACCIÓN CON EL SUDÁN III

El Sudán III es un colorante que se utiliza para detectar
específicamente las grasas, porque es insoluble en agua y en cambio
es soluble en las grasas. Al ser de color rojo, cuando se disuelve tiñe
las grasas de color rojo anaranjado.

Tabla 29 Tinción: Reacción con el Sudán III.

Tub Cantida Reactivo Procedimiento Cada tubo
os d
1 con 3 Sudan III 3 ml de Aceite
ml de vegetal
Preparar los tubos de
Aceite
ensayo.
vegetal

2 con 3 Agregar 3mL de aceite

mL de vegetal.
Aceite Tinta roja
vegetal 8 gotas de Sudan
Agregar 8 gotas de III
Sudan III

Observar y tomar
apuntes de los
cambios.
Observar y tomar
apuntes de los cambios.

Repetir el mismo
procedimiento con tinta
roja

6.5 PREGUNTAS:

¿Qué son los jabones? ¿Cómo se pueden obtener los jabones?

¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa?
¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?
Indica lo que ocurre con la mezcla aceite – sudan III y aceite-tinta y
explica a qué se debe la diferencia entre ambos resultados.
¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos
minutos de reposo? ¿Y con la de los otros compuestos empleados? ¿A
qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones?

¿Qué ocurre con la emulsión cuando se le añade detergente?