“UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS”

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

INFORME DE LA PRÁCTICA 6

“TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA”

ASIGNATURA:

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR (MVZ 101)

PRESENTADO POR:

EDWART MELGAREJO HUCHARO (CODIGO. EST. 211224)

ASESOR GUÍA:

NILTON CESAR GOMEZ URVIOLA

Abancay, 16 de Agosto del 2021

"AÑO DEL BICENTENARIO DEL PERÚ: 200 AÑOS DE

INDEPENDENCIA"
I. INTRODUCCIÓN

Para que el alumnado de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAMBA

pueda visualizar en los laboratorios de la UNAMBA, debe conocer las técnicas para la
observación microscópica, como ejemplo una técnica esencial para observar las bacterias de
manera adecuada y demostrar los finos detalles de sus estructuras internas en general se
requieren tinciones biológicas. La introducción de las tinciones a mediados del siglo XIX
fue en gran parte responsable de los principales avances que tuvieron lugar en la
microbiología y en otros campos de la microscopía de diagnóstico durante los últimos 100
años.

Es por ello por lo que debemos saber que la tinción o coloración es una técnica auxiliar
utilizada en microscopia para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Hoy
día dependemos tanto de las tinciones biológicas que es difícil darse cuenta como hubiera
progresado el estudio de las bacterias sin su implementación. Las tinciones consisten en
preparaciones acuosas u orgánicas de colorantes o grupos de columnas que proporcionan
una variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras
sustancias de importancia biológica.

El objetivo de la práctica fue el desarrollar técnicas para la elaboración de extendidos o frotis

a partir de un cultivo de tejido (muestras espécimen), de igual formar realizar montajes para
la observación microscópica de bacterias y finalmente la identificación de las diferentes
técnicas de tinción de microrganismos, en el cual antes de ello daremos a conocer ¿Qué son
las técnicas de microscopía?, principales técnicas microscópicas de caracterización de
materiales y las ventajas de las técnicas de caracterización microscópicas, así como las
Técnicas y tipos de tinción, tres (03) formas de preparar un portaobjetos (lamina) para
microscopio, un mapa conceptual para entender mejor el uso de la tinción de GRAM en los
microscopios y como ultimo las Técnicas fundamentales de observación en microscopia, las
cuales son importantes en los laboratorios de la UNAMBA.

II. OBJETIVOS

2.1 Objetivos específicos, al finalizar el alumno de MVZ, dentro de los laboratorio de la

UNAMBA, será capaz de:

● Entender el concepto que necesitamos saber del ¿Qué son las técnicas de
microscopía?, principales técnicas microscópicas de caracterización de materiales y
las ventajas de las técnicas de caracterización microscópicas.
● Saber los tipos y formas de preparar un portaobjetos (lamina) para microscopio,
asimismo comprender mediante un mapa conceptual el mejor el uso de la tinción de
GRAM en los microscopios y como ultimo las Técnicas fundamentales de
observación en microscopia, las cuales son importantes en los laboratorios de la
UNAMBA.
● Auto instruirse adecuadamente para llegar a conocer las Técnicas y tipos de tinción,
del uso común en los laboratorio de la UNAMBA.
● Adquirir la experiencia adecuada para el manejo de los materiales y técnicas básicas
que se deben utilizar a lo largo del curso de Biología Celular y Molecular en los
trabajos a realizarse presencialmente en la UNAMBA.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

3.1 Materiales y Equipos:

- Cuaderno de apuntes.
- Laptop conectado al internet.
- Microscopio Óptico Compuesto.
- Tinciones y/o Colorantes (Alcohol 96, Cristal Violeta, Lugol, Safranina, otros)

- Aceite de inmersión.

- Agua.
- Mechero.

- Muestra espécimen.
- Portaobjetos y Cubreobjetos (laminas)
 - Yodo
- Papel absorbente y entre otros.
- Libros magnéticos.

IV. PROCEDIMIENTO

a) El docente mediante un informe nos enseñó que antes debemos saber los conceptos
esenciales, antes de realizar las practicas usando técnicas para la observación
microscópica: ¿Qué son las técnicas de microscopía?, principales técnicas microscópicas
de caracterización de materiales y las ventajas de las técnicas de caracterización
microscópicas, como se indica:

¿Qué son las técnicas de microscopía?

Las técnicas de microscopía son el conjunto de procedimientos de investigación que

utilizan un microscopio para obtener imágenes de determinadas estructuras, las
cuales, por ser demasiado pequeñas, resultan inapreciables a simple vista para el ojo
humano. Debido a su gran potencial para identificar propiedades de los materiales, se
usan con fines variados, que van desde la microbiología molecular hasta el análisis de
metales y otros compuestos industriales.

Principales técnicas microscópicas de caracterización de materiales. - Existen dos

grandes grupos de técnicas microscópicas de caracterización de materiales: la
microscopía óptica y la microscopía electrónica. En la primera, los microscopios
utilizan fotones de luz para amplificar las muestras, mientras que, en la segunda, las
imágenes se generan por la interacción entre electrones y las diferentes sustancias. Al
emplear partículas con una longitud de onda inferior, la microscopía electrónica tiene
mayor poder de resolución. Además, también hay que contar con la microscopía de
sonda de barrido, que produce imágenes mediante una sonda que recorre la superficie
de las muestras. A continuación, repasamos las técnicas microscópicas de caracterización
de materiales más habituales:

1. Microscopía óptica avanzada (MOA). - Es la evolución de la técnica microscópica

tradicional, en la que los objetos son amplificados mediante lentes ópticas y un haz de
luz. Hoy en día, la microscopia óptica avanzada (MOA) utiliza equipos como los
microscopios confocal, con una resolución nanométrica que proporciona información
detallada sobre las formas de los materiales y su textura.

2. Microscopía electrónica de barrido (SEM). - Las técnicas de caracterización de

materiales mediante microscopía electrónica de barrido funcionan con lentes
electromagnéticas, bobinas deflectoras, detectores de radiación y un haz de electrones
móvil y concentrado que va recorriendo toda la muestra punto por punto. La
 imagen resultante se visualiza en una pantalla e incluye información morfológica,
cristalográfica, topográfica y de composición.

3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM). - La microscopía electrónica de

transmisión se diferencia de la de barrido en que mide la mayor parte de las muestras
a la vez (no punto por punto) y construye la imagen a partir de los electrones que
atraviesan el objeto analizado, y no de los que se dispersan o rebotan contra la
superficie. Además, la TEM usa muestras más finas y tiene una resolución más
potente, de nivel atómico.

4. Microscopía electrónica de transmisión con barrido (STEM). - Esta técnica

incorpora bobinas electromagnéticas adicionales con las que lanza un has concentrado
de electrones que barre la muestra píxel a píxel, pero al contrario que la SEM genera
la imagen con los electrones que traspasan las sustancias. La pérdida de energía
posibilita la caracterización de la composición química de los materiales.

5. Microscopía de efecto de túnel (STM). - Los microscopios de efecto de túnel operan

con una sonda de punta fina a la que se le aplica un determinado voltaje. Cuando se
acerca a la superficie de la muestra, se produce un intercambio de electrones entre
los puntos más cercanos del material y el borde de la sonda. De este modo, se
reconstruye átomo por átomo el relieve de la superficie.

6. Microscopía de fuerzas atómicas (AFM). - La AFM proporciona imágenes

superficiales y con resolución nanométrica de muestras en aire y líquido. Funciona con
una sonda de contacto en forma de palanca con punta fina. La sonda va recorriendo
las sustancias y su deflexión se mide con un láser que incide sobre ella y es
capturado por un fotodetector. Finalmente, un software reconstruye un mapa
topográfico con colores que representan las alturas de la superficie.

Ventajas de las técnicas de caracterización microscópicas

Las técnicas de microscopía son muy útiles para analizar la textura y la composición
química de los distintos elementos, ya que permiten obtener información precisa sobre
todo tipo de compuestos. Conocer su comportamiento ayuda a los fabricantes a elegir
los mejores materiales y optimizar los procesos de diseño y fabricación de nuevos
productos.

Asimismo, las técnicas microscópicas de caracterización de materiales facilitan el

diagnóstico de fallos y patologías mediante el estudio de las superficies de fractura y el
resto de las zonas afectadas, ayudando así a prevenir averías y accidentes. Todos estos
beneficios hacen de las técnicas de microscopía una herramienta fundamental dentro de
los servicios de ingeniera forense especializados en la caracterización de las
propiedades físicas, químicas y funcionales de los materiales.

b) Asimismo, el docente mediante informe y video YouTube nos enseñó que antes de
realizar las practicas usando técnicas para la observación microscópica, debemos saber
también las Técnicas y tipos de tinción, como se indica:

Técnicas y tipos de tinción:

En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a
simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.

Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición,

estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio
microscópico el facilita notablemente la observación; principalmente en las bacterias se
facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación de
ciertas estructuras celulares.

Tinción. - Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para
mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son
sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en
tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de
microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición
y examinar grandes cortes de tejido o poblaciones celulares.

1. Tipos de tinciones:

1) Tinción Simple. - Utiliza un solo colorante.

2) Tinción Ácido Resistente. - Esta tinción sirve principalmente para clasificar

microbacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lipídico y en ácidos
micólicos y que no pueden ser clasificadas por la tinción de GRAM. Una vez
teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido. En
esta tinción las bacterias ácido-resistentes conservan el colorante primario color
rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el
color azul.

3) Tinción de Giensa. - La tinción de Giensa es un método habitual para el examen

de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este
método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas
dentro de las células huéspedes. El colorante se aplica a un frotis de sangre y se
utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos
de las células.

4) Tinción de Esporas. - Se usa verde de malaquita en contraste con safranina. La

envuelta de la endospora es más compleja e impermeable que la envuelta de las
células vegetativas en las que se forma. Sólo se puede teñir el contenido de la espora
alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las
endosporas se decoloren una vez teñidas. El verde de malaquita es un colorante
débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a
la bacteria. Penetra en las células vegetativa. Cuando se calienta la preparación
también penetra las endosporas.

5) Tinción de Cápsula. - La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o

mucoide. El tamaño de estas cápsulas está influenciado por el medio en el que crece
la bacteria. En algunos casos el grosor de la cápsula es sólo una fracción del
diámetro de la célula, en otros casos la cápsula es mucho mayor que la célula. Las
cápsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros
organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y además
sirven de reservorio de alimento almacenado.
 6) Tinción de Flagelos o leifson. - Es una tinción para lograr observar flagelos de
bacterias. Es usada en laboratorios, pero no de rutina. Los pasos que sigue son el de
usar pararosanilina sirve como tinción principal, y ácido tánico es agregado a la
solución como mordiente. Los componentes de la tinción son: Fucsina básica en
Alcohol etílico al 95%, en 1.27%; ácido tánico en agua destilada, en 3%; Cloruro
de sodio en agua destilada, 1.5%. Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del
microorganismo.

2. Técnicas de tinción:

1) Tinción de Wright. - La tinción de Wright es una técnica que se emplea

generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es
clasifica cada como una tinción policromática, dado que puede teñir compuestos
ácidos básicos presentes en una célula.

2) Tinción de azul algodón de lactofenol. - El examen microscópico es de gran

importancia en micología para la observación de las diferentes especies de hongos
de interés clínico. Se deben utilizar tinciones que logren preservar la integridad de
las estructuras fúngicas.

3) Tinciones diferenciales. - Se utilizan para distinguir entre tipos de

microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción
simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro
colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante.
Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología.

4) Tinciones específicas. - Se utilizan para incrementar el contraste en las células

microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen en los
flagelos y las cápsulas.

5) Tinción adecuada. - En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción

puede implicar la inmersión de la muestra en la solución colorante, seguido del
aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación.
Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución
de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada
permanece.

6) Tinción negativa. - Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es

un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de
tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido
simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente
sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra
humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser
observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones
claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea

7) Tinción indirecta. - Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un
mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.
 8) Tinción directa. - Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona
directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.

9) Tinción GRAM. - La tinción de GRAM es uno de los métodos de tinción más

importantes en el laboratorio bacteriológico. Su utilidad en la práctica de
referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos,
etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM:

1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.

2. Se añade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol.
En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero
las Gram positivas retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias
Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram
positivas les proporciona un color violeta más intenso.

Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:

1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante
en el interior de la célula.
3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las células excepto de las microbacterias, que la
retienen debido a su superficie cérea.
4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de
Mycobacterum, aún teñidas de rojo, y las células restantes del espécimen.

10) Tinción Rodamina-Auramina. - Los ácidos micólicos de las paredes celulares de

las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina.
Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como
contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-
 alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos
colorantes.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis

pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente
sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De
esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones
tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

11) Tinción Naranja de Acridina. - El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido

nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de
naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH
y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital,
que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto.
De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen
viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

c) Por otro lado, mediante la realización de análisis y resúmenes obtenidas por los diferentes
medios virtuales (internet y libros magnéticos), escritos mediante apuntes, se determinó
tres (03) formas de preparar un portaobjetos (lamina) para microscopio, las cuales son
importantes en los laboratorios de la UNAMBA, por lo que de manera rutinaria y
obligatoria se debe realizar los siguientes procedimientos:

Cómo preparar un portaobjetos para microscopio

Los portaobjetos para microscopio se utilizan para examinar a los organismos

unicelulares, y para observar de cerca a las plantas pequeñas y organismos. Existen dos
tipos de portaobjetos preparados: el montaje en seco y el montaje húmedo. Cada tipo de
método de preparación se utiliza para realizar el análisis de los distintos tipos de células.
Si vas a realizar el montaje húmedo de un espécimen particularmente pálido o translúcido,
es posible que necesites teñir el espécimen, de forma que este se vuelva visible bajo el
microscopio.

1) Preparar un montaje en seco:

1. Elige un portaobjetos limpio. Sostén el portaobjetos en frente de una fuente de luz

y mira a través de este para asegurarte de que no tenga manchas o suciedad. La
mayoría de los portaobjetos para microscopio son planos en la parte superior e
inferior, y cuentan con una forma rectangular. Son transparentes, lo cual permite
que la luz del microscopio pase a través de ellos e ilumine la muestra transparente
del espécimen. Si el portaobjetos se encuentra sucio, o tiene manchas, no podrás
examinar con eficacia el espécimen.

Si descubres que el portaobjetos para microscopio se encuentra contaminado de

alguna forma, así sea con tus huellas dactilares, lávalo rápidamente utilizando jabón
líquido y agua. Seca el portaobjetos usando un trapo limpio. No utilices pañuelos o
papel absorbente para limpiarlo, ya que estos podrían dejar rastros de pelusa en el
portaobjetos.
2. Revisa el espécimen y determina si necesita rebanarse. La muestra del espécimen
deberá ser translúcido (o semitransparente), o llegar a ser transparente por
completo, para que la luz pueda atravesarlo. Si la luz no es capaz de atravesar por
completo el espécimen y dirigirse hacia dentro del ocular del microscopio, entonces
no podrás observar el espécimen a través del microscopio. Algunos de los
especímenes (por ejemplo, una hebra de cabello o el ala de un insecto) son delgados
y translúcidos por cuenta propia, así que no necesitarás rebanarlos con una cuchilla
de afeitar.

3. Rebana un pedazo delgado de la muestra del espécimen. Utiliza una cuchilla de

afeitar para cortar el material del espécimen hasta obtener una rebanada delgada y
translúcida. Los montajes en seco son los más sencillos de preparar, debido a que
no requieren del uso de ningún líquido que vaya entre el portaobjetos y el
espécimen. Un montaje en seco resulta ideal para el análisis de aquellas muestras
que no se encuentren en riesgo de secarse por completo. Entre los materiales que se
utilizan comúnmente en los montajes en seco, tenemos: (corcho o madera para
balsas, pétalos u hojas de flores, patas o alas de insectos, cabello, pelaje, o plumas.
4. Coloca la muestra del espécimen sobre el portaobjetos. Utiliza un par de fórceps
para recoger la rebanada delgada de la muestra del espécimen. Recuéstala de una
manera delicada sobre uno de los lados del portaobjetos. Si vas a utilizar un
portaobjetos cóncavo (el cual tiene un lado hundido), coloca el espécimen en el
centro de la zona cóncava.

Si te preocupa que el espécimen se mueva de un lado a otro, o se deslice fuera del

lado plano, entonces realiza el montaje del espécimen sobre un portaobjetos
cóncavo. Por ejemplo, si vas a preparar el pétalo de una flor rizada, y este se mueve
hacia un lado o el otro, entonces utiliza un portaobjetos cóncavo. Un portaobjetos
plano funcionará bien con todos los demás tipos de especímenes.

5. Coloca un cubreobjetos encima de la muestra del espécimen. El cubreobjetos

evitará que la muestra del espécimen se deslice fuera del portaobjetos. El
cubreobjetos también protegerá a la muestra del espécimen, en el caso de que uno
de los usuarios del microscopio baje accidentalmente el lente, y termine
presionando el espécimen. Los cubreobjetos son unas piezas transparentes de
vidrio, o más comúnmente, de plástico, las cuales son bastante delgadas. Cada
cubreobjetos tiene una dimensión aproximada de 2 cm (3/4 de pulgada), tanto de
 ancho como de longitud. El portaobjetos se encontrará preparado y listo para su
inspección bajo el microscopio.

2) Preparar un montaje húmedo:

1. Vierte 1 gota de agua sobre el portaobjetos. Utiliza un gotero para verter 1 gota de
agua, exactamente sobre el centro de un portaobjetos plano o cóncavo. La gotita de
agua es la razón por la cual se le llama montaje húmedo. El líquido mantendrá
húmeda a la muestra del espécimen, y evitará que las muestras de los especímenes
húmedos y orgánicos se sequen por completo y distorsionen su forma. El agua
también preservará a los especímenes vivos, tales como los organismos
unicelulares.

Si te gustaría preparar un portaobjetos permanente utilizando un material orgánico

que se encuentre muerto, puedes utilizar una capa delgada de esmalte de uñas
transparente, en lugar de una gotita de agua.

2. Raspa o rebana una sección de la muestra húmeda del espécimen. Las muestras de
espécimen que se utilizan para preparar los montajes húmedos son, por lo general,
 material orgánico vivo o húmedo. Utiliza una cuchilla de afeitar o un mondadientes
para cortar o raspar una pequeña cantidad del espécimen húmedo. Entre los
materiales que se utilizan comúnmente para realizar los montajes húmedos en los
portaobjetos, tenemos: Células de las mejillas o placa dental (se realiza un raspado
dentro de tu boca utilizando un mondadientes), Una sección transversal delgada del
tallo de una planta (cortado con una cuchilla de afeitar) y si vas a realizar el estudio
de los organismos unicelulares (como, por ejemplo, una ameba o un paramecio), el
uso de unas pinzas no resultará efectivo. En lugar de eso, utiliza un cuentagotas
limpio para recoger un par de gotas de agua, en las cuales se encuentren sumergidos
los organismos unicelulares o las algas.

3. Coloca la muestra del espécimen en la gota de agua. Según el tipo de material que
vayas a utilizar como la muestra del espécimen, deberás utilizar un par de fórceps,
pinzas, o un mondadientes para trasladar el espécimen hacia el portaobjetos. Coloca
el espécimen en el centro de la gotita de agua, de manera que este se encuentre
suspendido en el líquido.

Si vas a utilizar un cuentagotas para recoger organismos unicelulares, entonces

vierte 1 o 2 gotas sobre la gota que ya se encuentra en el portaobjetos.
 4. Coloca un cubreobjetos encima del espécimen húmedo. Sostén el cubreobjetos en
un ángulo de 45 grados. Coloca uno de los bordes exactamente al costado del
espécimen sobre la gota de agua. Luego, desciende el otro lado del portaobjetos
hasta que se encuentre en una posición completamente horizontal encima del
espécimen. Verás la(s) gota(s) de agua esparcirse debajo del cubreobjetos hasta
alcanzar los bordes.

No des golpes o hagas alguna presión sobre el cubreobjetos una vez que se
encuentre en posición. Si lo haces, corres el riesgo de apretar la muestra del
espécimen junto con el agua, y hacer que se desprendan del portaobjetos.

3) Realizar una tinción de los especímenes celulares:

1. Coloca una lámina de papel absorbente sobre uno de los bordes del
cubreobjetos. Coloca el papel sobre el borde del cubreobjetos sin alterar el material
que se encuentra debajo de este. El poder de absorción del papel absorbente extraerá
un poco del agua de la parte interior del cubreobjetos, y arrastrará el agente de
tinción que se encuentre debajo del cubreobjetos, hacia el espécimen.

En el caso de que el espécimen, sobre el cual vas a realizar un montaje húmedo en

el portaobjetos, sea de un color pálido o incoloro (por ejemplo, la sección
transversal del tallo de una planta incolora), es posible que resulte difícil de observar
a través del microscopio.

Realizar una tinción del espécimen te permitirá observar su forma y textura, de una
mejor manera. Por lo general, este paso se realiza luego de que ya se examinó el
espécimen húmedo en el portaobjetos, sin haberlo teñido. Es posible que el
portaobjetos ya se encuentre preparado, incluso si no se realizó la tinción.
2. Vierte 1 gota de yodo o azul de metileno sobre el otro lado del cubreobjetos. Utiliza
un cuentagotas y vierte el químico de tinción encima del portaobjetos, directamente
al costado del cubreobjetos. Sé cuidadoso y vierte solamente 1 gota. Es posible que
un exceso del agente de tinción pueda llegar a deslizarse fuera del portaobjetos.

Puedes comprar el yodo o el azul de metileno en cualquier tienda de materiales

educativos, o tienda de suplementos de biología. Una manera alternativa de realizar
este paso es verter la gota del agente de tinción en el agua que se encuentra en el
portaobjetos del montaje húmedo, cuando recién lo vas a preparar. En este caso, no
necesitarás utilizar el papel absorbente.

3. Espera hasta que el agente de tinción se esparza debajo del cubreobjetos. El agente
de tinción comenzará a filtrarse por debajo del cubreobjetos mientras el papel
absorbente extrae el agua del otro lado. Es posible que proceso llegue a tardar hasta
5 minutos para que el yodo o el azul de metileno se sumerjan por debajo del
cubreobjetos, y empapen el espécimen.

Una vez que el yodo o el azul de metileno se hayan esparcido en toda el área del
cubreobjetos, entonces se habrá realizado la tinción completa del espécimen.
 4. Limpia el exceso del agente de tinción utilizando un papel absorbente
limpio. Elimina las impurezas de la superficie del portaobjetos, de manera que
ningún líquido suelto se derrame por el costado. La tinción en el montaje húmedo
estará lista para observarse bajo el microscopio.

d) Los videos de auto instrucción y ayuda brindado por el docente para evaluar las técnicas
para la observación microscópica, es por ello por lo que se hizo un mapa conceptual para
entender mejor el uso de la tinción de GRAM en los microscopios de la UNAMBA.
 La Figura 1. Fotografías tomadas de la práctica de tinción. A: tinción de Gram (Gram
negativas de color rosa), B: tinción simple.

El azul de metileno permite visualizar las bacterias de manera adecuada y demostrar en

algunos casos los detalles finos de sus estructuras internas, así mismo ofrece orientación
sobre la concentración y modo de agrupación bacteriana (Tortora et al., 2007). La razón
por la cual se le aplica el azul de metileno luego de haber fijado las muestras al fuego es
porque las células vivas contienen enzimas capaces de reducir el azul de metileno a
compuestos incoloros. Cuando las células están inmersas en azul de metileno, este penetra
dentro de las células y las enzimas de las células vivas lo decoloran. Pero cuando las
células están muertas, la enzima es inactivada y por consiguiente, permanecen azul.

e) Asimismo, mediante la realización de análisis y resúmenes obtenidas por los diferentes

medios virtuales (internet y libros magnéticos), escritos mediante apuntes, se determinó
Técnicas de observación en microscopia, las cuales son importantes en los laboratorios
de la UNAMBA, por lo que de manera rutinaria y obligatoria se debe realizar los
siguientes procedimientos:

Debido a la gran diversidad de muestras a observar se han desarrollado diferentes

técnicas de microscopia y gran diversidad de microscopios para ello se tiene lo
siguiente:

1) OBSERVACIÓN A CAMPO CLARO. - La observación a campo claro es la

técnica de microscopia más simple. En este sistema la luz pasa a través o es reflejada
por la muestra, sin ninguna alteración, más allá de la que provoca la propia muestra.
Toda la luz desde el espécimen y alrededores es colectada por el objetivo para
formar una imagen contra fondo totalmente brillante.

Este tipo de observación es la más adecuada para muestras teñidas o con pigmentos
naturales y que resultan altamente contrastadas. Es muy utilizada en patología e
histología vegetal y animal, para la observación de cortes finos de tejidos, sonde
bajo un fondo brillante aparece la muestra contrastada. En cambio, no es demasiado
útil para la observación de células vivas.
19

2) OBSERVACIÓN A CAMPO OSCURO. - La técnica de observación a campo

oscuro es una técnica de contraste, sin luz directa, dónde solo la luz difractada desde
el espécimen se usa para formar la imagen. En esta técnica, las muestras deben ser
transparentes y no presentar tinción. Se debe controlar la luz de la muestra, para que
la luz central se bloquee.

3) La iluminación (gracias al condensador) forma un cono hueco, solo con luz de

forma oblicua, la cual refleja en la muestra y alrededores. La imagen se forma con
los rayos de luz dispersados por la muestra y platina, que son capturados por el
objetivo. Es una técnica adecuada para la observación de células y organismos
vivos. Esto es así, porque el contraste se crea por un organismo brillante sobre fondo
oscuro, así revelamos fondos, bordes y contornos del organismo. Uno de los usos
principales es en hematología, sobre células de sangre vivas.
20

4) OBSERVACIÓN CON CONTRASTE DE FASES. - La técnica de contraste de

fases, también corresponde a una técnica de observación por contraste, valga la
redundancia. Eso quiere decir que el resultado de la imagen sera el fruto del paso
de la luz a través de la muestra, normalmente viva, y los diferentes índices de
refracción que resulten de esto.

5) La luz desde una lámpara/bombilla de halógeno-tungsteno es dirigida a través de

un lente colectora y enfocada hacia anillos especializados del condensador. Los
frentes de onda pasando a través del anillo iluminan al espécimen y pasan
directamente ( o difractados) a través de la muestra y son retardados por los
gradientes de fase de la muestra. La luz sin desviar, difractada y colectada por el
objetivo es separada por un plato de fases y enfocada en el plano intermedio de la
imagen para formar la imagen final. Esta técnica se usa en observación de células
vivas o en estudio de materiales con láminas muy finas.

6) OBSERVACIÓN CON FLUORESCENCIA. - El microscopio de fluorescencia

se basa en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud
de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética
emitida por las moléculas que han absorbido la radiación primaria y reemitido una
luz con mayor longitud de onda. Es decir, se han excitado. Para dejar pasar sólo
la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del
condensador y encima del objetivo. Así podríamos determinar esta técnica de
observación como indirecta, ya que la observación o resultado es gracias a la
reacción de determinadas moléculas o células sobre un primer tipo de luz o
radiación que han absorbido.

La microscopia de fluorescencia se utiliza para detectar sustancias determinadas

como la vitamina A o sustancias marcadas con fluorocromos. Además, permite
determinar la distribución de una sola especie de molécula, su cantidad y
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ubicación en el interior de la célula. Es una técnica muy específica y evolucionada,

pero a la vez muy utilizada en el análisis biomolecular.

V. RESULTADOS

● Aprendí a reconocer, las principales técnicas microscópicas de caracterización de

materiales y las ventajas de las técnicas de caracterización microscópicas, así como
las Técnicas y tipos de tinción, las cuales fueron diseñados para facilitarnos
específicamente para cada procedimiento científico, a realizarse en los laboratorios
de la UNAMBA.
● Aprendimos que existen tres (03) formas de preparar un portaobjetos (lamina) para
microscopio, el uso adecuado de la tinción de GRAM en los microscopios, siendo
la más utilizada en los laboratorios de la UNAMBA.
● Y como último, se aprendió Técnicas fundamentales de observación en microscopia,
las cuales son importantes en los laboratorios de la UNAMBA, para poder realizar
un buen trabajo e investigación.

VI. CONCLUSIONES

- Podemos concluir que, en el laboratorio de la UNAMBA, se emplean portaobjetos

(lamina), para el cultivo de tejido (muestras espécimen), haciendo el uso de la
tinción de GRAM la cual hoy en día es la más utilizada en los laboratorios, ya que
permite de acuerdo con la estructura y grosor de la pared bacteriana agrupar las
bacterias en GRAM negativas y GRAM positivas. De igual forma esta tinción
permite correlacionar con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a
antibióticos, sensibilidad o resistencia a diversos compuestos, punto isoeléctrico y
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tensión superficial. Finalmente, la tinción de GRAM es un procedimiento

engañosamente simple. Puede realizarse de forma rápida y fácil. Sin embargo, la
preparación de los frotis es otro tema. Es esencial una considerable experiencia y
cuidadoso entrenamiento para su ejecución correcta por el alumnado de la Facultad
de MVZ de la UNAMBA.
- Podemos entender que un buen estudiante de la Facultad de MVZ de la UNAMBA,
debe conocer bien los tipos de tinción que existen, las cuales son especificas para
cada prueba a realizarse, no solo eso, sino que también, existen diversas formas de
preparar un portaobjetos (lamina) para el uso en los microscopios, así como diversas
para la observación en los microscopios de la UNAMBA.
- Se debe continuar reiterando que el orden y responsabilidad son cruciales en este
curso.

VII. RECOMENDACIONES

- Que el docente proporcione más información teórica y videos educativos para

realizar investigaciones, experimentos, prácticas y trabajos de carácter científico,
tecnológico o técnico; en un laboratorio de la UNAMBA.
- Que los alumnados de la Facultad de MVZ de la UNAMBA, cooperen entre sí e
intercambien los informes realizados las cuales fue dejado por el docente para así
aprender más.
- El alumnado de la Facultad de MVZ de la UNAMBA, antes de trabajar con equipos
técnicos como microscopios y muestras de enfermedades, en un laboratorio de la
UNAMBA, debe concientizar y aprender en las practicas, dictadas por el docente
especialista.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

✓ Centro de Bachillerato Tecnológico e Industrial y de servicios No. 128, la

MICROBIOLOGIA, Tema: Técnicas y Tipos de Tinción,
https://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-site/t-cnicas-y-tipos-de-tinci-n.
✓ RAIG, Meteorología - Óptica – Precisión, Tema: Técnicas de Observación en la
Microscopia, https://www.raig.com/blog/tecnicas-de-observacion-en-
microscopia-27/.
✓ WIKIHOW, Carreras, Educación y Ciencias, Tema: Como preparar un Portaobjetos
para un Microscopio, https://es.wikihow.com/preparar-un-portaobjetos-para-
microscopio.
✓ Prácticas de Microbiología, Tema: Tinción de GRAM,
https://classroom.google.com/u/0/c/MzU3MjUzNzExOTU5/a/MzA0OTcyMDQ
1MzE3/details.
✓ José Kobo, Elianeth Romero, Ketty Pérez Melendres & Luis Ángel Tamara Polo, de
la Universidad de Sucre, Tema: PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA (MONTAJES Y TÉCNICAS DE
COLORACIÓN),
https://www.academia.edu/40048973/Informe_2_MICROBIOLOG%C3%AD
A_-
_PREPARACI%C3%93N_DE_MUESTRAS_PARA_OBSERVACI%C3%93
N_MICROSC%C3%93PICA_MONTAJES_Y_T%C3%89CNICAS_DE_CO
LORACI%C3%93N.