LABORATORIO BIOTECNOLÓGICO V

PRÁCTICO N° 1
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

Importancia de la vida microbiana

Si bien los microorganismos son las formas de vida más pequeñas, en conjunto constituyen el grueso
de la biomasa de la Tierra, y llevan a cabo muchas reacciones químicas necesarias para los
organismos superiores. Sin los microorganismos, las formas de vida superiores no habrían aparecido
nunca y no serían capaces de sobrevivir. De hecho, incluso el oxígeno que respiramos es el resultado
de la actividad microbiana en el pasado. Además, tanto los humanos como los animales y las plantas
dependen completamente de la actividad microbiana para reciclar los nutrientes fundamentales y
degradar la materia orgánica. Así pues, podemos afirmar que no hay ninguna otra forma de vida
más importante que los microorganismos para el mantenimiento de la vida en la Tierra.

Cultivo microbiano
Para cultivar microorganismos en el laboratorio es necesario suministrarles todos los
nutrientes que precisan. Los organismos diferentes necesitan nutrientes diferentes, y no todos los
nutrientes se necesitan en las mismas cantidades. Algunos, llamados macronutrientes, son
necesarios en gran cantidad, y otros, llamados micronutrientes, solamente en cantidades traza.
Todos los nutrientes microbianos están formados a partir de elementos químicos. No obstante, solo
un pequeño grupo de elementos domina los sistemas vivos y son esenciales: hidrógeno (H), oxígeno
(O), carbono (C), nitrógeno (N), fósforo (P), azufre (S) y selenio (Se). Además de estos, hay al menos
otros cincuenta elementos que, aunque no son necesarios, son metabolizados por los
microorganismos. Asimismo, el agua que constituye el 70-80 % del peso húmedo de una célula
microbiana.

Tipos de medios de cultivo

En microbiología se utilizan dos grandes clases de medios de cultivo: los definidos y los
complejos. Los medios definidos se preparan añadiendo cantidades precisas de productos orgánicos
o inorgánicos puros a agua destilada. Por tanto, en un medio definido se conoce la composición
exacta (tanto en sentido cualitativo como cuantitativo). En cualquier medio de cultivo es
fundamental la fuente de carbono, porque todas las células necesitan grandes cantidades de este
elemento para elaborar nuevo material celular. La fuente concreta de carbono y su concentración
dependen del organismo que se va a cultivar. Algunos medios, se consideran «simples» porque
contienen una sola fuente de carbono. En este medio, las células sintetizan todas sus moléculas
orgánicas a partir de glucosa. Si se desea cultivar muchos microorganismos, no es esencial conocer
la composición exacta de un medio. En estos casos, es suficiente con un medio complejo, e incluso
puede resultar ventajoso. Los medios complejos están hechos con hidrolizados de productos
microbianos, animales o vegetales, como caseína (proteína láctea), carne (extracto de carne), soja
(caldo tríptico de soja), células de levadura (extracto de levadura), o algún otro de una larga serie
de sustancias altamente nutritivas. Estos hidrolizados están disponibles comercialmente en forma
deshidratada y solo hay que rehidratarlos para obtener el medio de cultivo. No obstante, la
desventaja de los medios complejos es que se desconoce su composición nutricional exacta. Un
medio enriquecido empieza como medio complejo y después se va complementando con sustancias
de alto poder nutritivo como suero o sangre. Este medio se utiliza para el cultivo de
microorganismos nutricionalmente exigentes, muchos de los cuales son patógenos. A veces se
preparan medios de cultivo selectivos o diferenciales (o ambos), especialmente los medios que se
utilizan en microbiología diagnóstica. Un medio selectivo contiene compuestos que inhiben el
crecimiento de algunos microorganismos, pero no de otros. Por ejemplo, existen medios selectivos
para el aislamiento de determinados patógenos, como cepas de Salmonella o Escherichia coli que
provocan infecciones de transmisión alimentaria. En un medio diferencial se añade un indicador,
normalmente un colorante, que mediante un cambio de color nos señala que durante el crecimiento
se ha producido una reacción metabólica determinada. Los medios diferenciales son útiles para
distinguir las bacterias, y se usan mucho en los diagnósticos clínicos y en microbiología sistemática.

Caracterización Bioquímica
En muchas áreas distintas de la microbiología, la capacidad de identificar microorganismos tiene
una aplicación importante. Por ejemplo, en la microbiología de los alimentos es importante poder
identificar con precisión los contaminantes que deterioran los alimentos. En ecología microbiana, la
identificación de microorganismos nos ayuda a caracterizar la biodiversidad. En el campo de la
microbiología médica, una rama de la microbiología que investiga los microorganismos patógenos,
el objetivo principal es aislar, identificar y estudiar los microorganismos responsables de las
enfermedades infecciosas. Así, los microbiólogos pueden evaluar las actividades bioquímicas
características para identificar más específicamente las especies bacterianas, o bien para
seleccionar algún microorganismo de acuerdo a alguna cualidad de interés.Algunas propiedades
bioquímicas/fisiológicas utilizadas para la identificación de bacterias incluyen: utilización de
nutrientes (utilización de carbohidratos, degradación de aminoácidos, degradación de lípidos),
resistencia a sustancias inhibidoras (alta sal, antibióticos, etc.), producción de enzimas (catalasa,
coagulasa, hemolisinas, etc.) y la motilidad.

✓ Medio Triple sugar iron: En 1940, Sulkin, Willett y Hajna

describieron un medio de sulfato ferroso de triple
azúcar para la identificación de bacilos entéricos. El
agar TSI se utiliza para la identificación presuntiva de
Enterobacterias basándose en la fermentación de
glucosa, lactosa, sacarosa y la producción de gas y H2S.
Cuando se fermenta uno de los carbohidratos, la
disminución del pH hará que el medio cambie de
naranja rojizo (el color original) a amarillo. Un color rojo
oscuro indica alcalinización de las peptonas. Algunas
bacterias reducen el tiosulfato de sodio en el medio a
sulfuro de hidrógeno (precipitado negro insoluble).
✓ Medio agar Macconkey: es un agar sólido, selectivo y
diferencial que solo cultiva especies bacterianas
gramnegativas, puede diferenciar aún más los
organismos gramnegativos en función de su
metabolismo de la lactosa; fermentadores de lactosa
(colonias rojas o rosadas). Los no fermentadores no
cambian de color. La tasa de crecimiento, la tasa de
fermentación de la lactosa y la presencia o ausencia de
una cápsula también son formas de diferenciar aún más
los organismos en el agar Macconkey.

✓ Medio agar lisina hierro (LIA): medio diferencial utilizado para evaluar la capacidad de los
organismos para desaminar o descarboxilar la lisina. La desaminación de lisina, un proceso
aeróbico, ocurre en los medios. La descarboxilación de
lisina, un proceso anaeróbico que ocurre en el extremo del
medio. Las bacterias que descarboxilan la lisina provocan un
color púrpura en todo el medio. Bacterias que pueden
desaminar la lisina producen un color rojo. La producción de
sulfuro de hidrógeno provoca un ennegrecimiento en el
medio debido a la formación de sulfuro ferroso. La aparición
de un color amarillo evidencia fermentación de la glucosa.

✓ Medio Motility Indole Ornithine (MIO): Medio utilizado en la identificación de miembros de la

familia Enterobacteriaceae en base a la movilidad, producción de indol y actividad enzimática
ornitina descarboxilasa. La presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra
es positivo para la movilidad. La aparición de color púrpura es positiva para Ornitina
descarboxilasa y negativo si el color es amarillo. En cuanto al Indol se considera positiva si el
medio cambia a color rojo y si permanece incoloro-amarillento.
✓ Medio citrato de Simmons: es un medio selectivo y diferencial basado en la
utilización de citrato. El medio prueba la capacidad de los organismos para
utilizar el citrato y sal de amonio inorgánica, como única fuente de carbono y
nitrógeno (respectivamente). Una reacción positiva está indicada por un
crecimiento de color azul intenso.

✓ Prueba de la catalasa: La actividad de catalasa es específica de ciertas cepas

bacterianas como Staphylococci, Micrococci, E. coli y otras Enterobacteriacaea y Salmonella spp.
Se sabe que otros no realizan esta actividad, como las bacterias Streptococcus y Enterococcus.
La prueba de catalasa consiste en inducir la actividad de catalasa agregando peróxido de
hidrógeno a un raspado bacteriano colocado en un portaobjetos de microscopio. Las burbujas
que aparecen en el portaobjetos indican actividad de catalasa y sugieren la presencia de
bacterias catalasa positivas.

Actividad

Objetivo:

- Diferenciar y caracterizar el metabolismo bioquímico de microorganismos en diferentes

tipos de medios

Materiales
- 3 placas Petri con agar MacConkey. - 1 mechero de alcohol
- 3 tubos con medio MIO. - Parafilm.
- 3 tubos con medio Citrato. - Gradilla.
- 3 tubos con medio LIA. - Marcador indeleble (deben traerlo los
- 3 tubos con medio TSI. alumnos).
- Portaobjetos. - Etanol 70% v/v.
- 1 gotario. - Guantes.
- Peróxido de hidrógeno 3% v/v. - 3 Microorganismos a analizar.
- 1 asa de siembra. - Incubadora
- 1 asa de punción. -Rack de puntas

Metodología

Siembra en medio MacConkey

1. Asegúrese de tener todos los materiales necesarios en su mesón. Despeje completamente el
área donde trabajará (sin cuadernos, lápices, etc.)
2. Una vez puestos los guantes, pulverice la superficie de trabajo con etanol 70% y seque con una
toalla de papel, frotando vigorosamente para desprender partículas contaminantes.
3. Sobre la superficie limpia, coloque los materiales a utilizar y rotule
todas las placas por la cara inferior de ésta, SIN ABRIRLAS. Por ejemplo:
MacConkey - Nombre de un integrante del grupo- Fecha.
4. Con el marcador divida la cara inferior de la placa en 4 secciones
iguales indicando en cada área el microorganismo a inocular.
5. Pulverice sus manos con etanol y frótelas vigorosamente hasta que la
solución se evapore completamente. Encienda el mechero. El calor
irradiado por la llama genera un área estéril en la cual Uds. trabajarán.
6. Tome el asa de siembra, flaméela y deje enfriar. Mientras tanto, retire el parafilm de las placas
con agar MacConkey, dejándolas boca abajo para evitar contaminación.
7. Abra la placa que contiene cultivo de una de las especies a estudiar, tome un poco de inóculo y
extiéndalo sobre una de las secciones. Repita este paso con las otras dos especies restantes.
8. Deje la cuarta área disponible sin inocular.
9. No olvide sellar la placa con parafilm.
10. Repita los pasos 4 al 9 con las dos placas con Agar MacConkey restantes.
11. Finalizado el ensayo lleve todas las placas a incubación a 30°C por 48 h.

Siembra Medio Citrato de Simmons

1. Rotule los tubos con el nombre de los microrganismos a inocular.
2. Flamee el asa de siembra y deje enfriar. Mientras tanto, retire la tapa del tubo y flamee la boca
de este.
3. Tome un poco de inóculo de uno de los microorganismos a estudiar, introduzca el asa en el tubo
y siembre sobre el medio de cultivo inclinado.
4. Flamee nuevamente el tubo y coloque la tapa.
5. Repetir los pasos 2 al 4 con los otros microorganismos.
6. Finalizado el ensayo lleve todos los tubos a incubación a 30°C por 48 h.

Siembra en medio MIO

1. Rotule los tubos con el nombre de los microrganismos a inocular.
2. Flamee el asa de punción y deje enfriar. Mientras tanto, retire la tapa del tubo y flamee la boca
de este.
3.Tome un poco de inóculo de uno de los microorganismos a estudiar, introduzca el asa en el tubo
y pinche el medio de cultivo de forma perpendicular.
4. Flamee nuevamente el tubo y coloque la tapa.
5. Repetir los pasos 2 al 4 con los otros microorganismos.
6. Finalizado el ensayo lleve todos los tubos a incubación a 30°C por 48 h.

Siembra en medio LIA y TSI

1. Rotule los tubos con el nombre de los microrganismos a inocular.
2. Flamee el asa de punción, el asa de siembra y deje enfriar. Mientras tanto, retire la tapa del tubo
y flamee la boca de este.
3.Tome un poco de inóculo de uno de los microorganismos a estudiar, introduzca el asa en el tubo
y pinche el medio de cultivo de forma perpendicular.
4. Con el asa de siembra tome un poco de inóculo (mismo microorganismo) y extienda la muestra
sobre la superficie inclinada.
5. Flamee nuevamente el tubo y coloque la tapa.
6. Repetir los pasos 2 al 4 con los otros microorganismos.
7. Finalizado el ensayo lleve todos los tubos a incubación a 30°C por 48 h.

Prueba de la catalasa

1. En un portaobjetos limpio coloque 2 gotas de peróxido de hidrógeno.

2. Con una punta de micropipeta tome un poco de inóculo de uno de los microorganismos a estudiar
y resuspenda en el peróxido.
3. Observe durante unos minutos la posible aparición de burbujas.
4. Repita con los microorganismos restantes.

Referencias

1. Madigan, M. T., Martinko, J. M. & Parker, J. Brock; Biología de los micro-organismos. (2014).

2. Al-Dhabaan FA. Morphological, biochemical and molecular identification of petroleum

hydrocarbons biodegradation bacteria isolated from oil polluted soil in Dhahran, Saud Arabia. Saudi
J Biol Sci. 2019 Sep;26(6):1247-1252. doi: 10.1016/j.sjbs.2018.05.029. Epub 2018 May 31. PMID:
31516354; PMCID: PMC6733695.