LABORATORIO Nº 7

ESCALA BIOQUIMICA
FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la Familia

Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de
ellos móviles mediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica
fenotípica común tienen la capacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos.
Tienen como hábitat el intestino de animales inferiores y del hombre.
Tienen además una amplia distribución en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas
y algunas especies de esta familia, como Proteus spp., cumplen una función ecológica
importante: inician en el ambiente la degradación de la materia orgánica y por este
comportamiento se relaciona con un ciclo de vida netamente ambiental, son saprófitos.
Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en
su relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli, un
constituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de la
porción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En esta
localización la presencia de E. coli resulta en un beneficio para el hospedero, pues como parte
de su metabolismo se sintetizan vitaminas y también participa en la degradación de ácidos y
sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, su detección se utiliza
como marcador de contaminación fecal, por ejemplo se ha establecido un “Índice coli” para
evaluar la calidad microbiológica del agua potable o de alimentos. Si el índice coli sobrepasa la
norma considerada aceptable significa que existe contaminación fecal e indirectamente se
deduce que el agua o el alimento, según sea el caso, puede contener patógenos intestinales.
Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como son géneros
Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicos que
afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o géneros
bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como

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diarrea acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome
disentérico) y en algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al
torrente sanguíneo y se puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por
ejemplo la fiebre tifoidea (Salmonella enterica serovar Typhi)
En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por lo
general, la siguiente secuencia:
a) Toma de muestra
b) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)
c) Observación de morfología macroscópica
d) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.
e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería bioquímica
convencional y Sistema estandarizado API 10S
f) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.

La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos

medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios. Estas
alteraciones, son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que no
todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas rutas
metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa principalmente en la detección
de:
a) Utilización de distintas fuentes de carbono.
b) Formación de productos finales.
c) Presencia de enzimas.
d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.

La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos
bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para
demostrar en forma clara una característica bioquímica como la presencia o ausencia de una
determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a una
determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

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Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de
cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si
se trata de distintos microorganismos.
Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar
la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio
es exigente.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de

identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las
pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de
filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para
sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de
resultados.

I. Batería bioquímica convencional para diagnóstico

microbiológico

1. Agar tendido corriente: medio sólido nutritivo, que permite observar posible
pigmentación en las colonias.

2. Agar Urea de Christensen: medio sólido en el que se puede observar la presencia

de la enzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos:
• Triptona.

• Urea.

• Indicador de pH fenolftaleina.

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa,
de degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable, porque el
pH varía hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje
del indicador de pH como Fenolftaleína (Figura 1)

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Figura 1: resultados medio Urea Figura 2: resultados medio Citrato

3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, además de sales

minerales:
• Fosfato de amonio.
• Citrato de sodio, como única fuente de carbono.

• Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).

En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima
Citrato

Permeasa, la que les permite transportar el citrato a través de la membrana

citoplasmática.

Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los
ácidos tricarboxílicos (Figura 2)

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de varias
rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada
bacteria, del azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán
ácidos (fórmico, pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de
cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la producción de ácido y gas a partir
de distintos azúcares.

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El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de
azúcares. Contiene además de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura,
peptona, etc:
• Glucosa al 0,1%

• Lactosa al 1,0%

• Sacarosa al 1,0%
• Citrato de amonio.

• Hierro.

Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino)

a. Si la bacteria inoculada es fermentadora sólo de glucosa usará ésta y se obtiene

sólo una pequeña cantidad de ácido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubación es
suficiente para convertir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo.
Dentro de las próximas horas, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente
agotada y la bacteria comienza la degradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido
del tubo, donde hay oxígeno, lo que lleva a la liberación de aminas que neutralizan las
pequeñas cantidades de ácido presente en el tendido, y en 18 a 24 horas este tendido
cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo.

En la porción profunda (anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es

insuficiente para neutralizar el ácido formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI
es inoculado con un organismo fermentador de glucosa y lactosa o sacarosa, aún cuando
la glucosa se agota en las primeras 8 a 12 horas, la fermentación continúa ya que el
organismo es capaz de usar lactosa o sacarosa. Así, a las 18 a 24 horas, ambas porciones
están amarillas.
• b. Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna
de agar del fondo del tubo.
• c. Para la detección de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El

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 tiosulfato de sodio es la fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para
la producción de H2S. Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal)
incorporadas en el medio de cultivo reaccionan con sulfuro de hidrógeno para producir
un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando
sulfato ferroso, un compuesto insoluble de color negro. (Figura 3)

Figura 3: resultados medio TSI

C:Control negativo

1: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).

2: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-).
3: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (+).
4: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (-).
5: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (+)

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5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre
algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reacciones
enzimáticas son: decarboxilación de Lisina y desaminación de Lisina.
Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH2,
produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).
Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de
levadura:
• Aminoácido lisina
• Aminoácidos azufrados
• Glucosa
• Citrato de hierro y amonio
• Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH alcalino).

a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el indicador
vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá esta
coloración amarilla (reacción K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina
decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO2 y una
diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte
el

viraje de amarillo a morado (reacción K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de desaminar a la

lisina, la superficie se verá roja y el fondo amarillo (reacción R/A).
b. Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso

(negro).

(Figura 4

Figura 4: resultados medio LIA

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6. Medio MIO: Permite observar motilidad, presencia de la enzima ornitina descarboxilasa y
producción de indol.

a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, la

reacción es positiva. Si sólo se limita al pinchazo, es negativa.

b. La enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminoácidos

en algunas bacterias. La reacción positiva se observa por el color morado del tubo; en cambio,
si la reacción es negativa el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).

c. La presencia de indol, se evalúa agregando una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la
reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio (Figura 5).

Figura 5: resultados medio MIO (Los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs)

1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia)

2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo)

3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Objetivos
1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias
Gram negativo. (desde su placa de coprocultivo)

2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de

productos intermediarios o finales, debido a la acción bacteriana.

Actividades

1. Observe las placas de Agar Mc Conkey sembradas y describa las colonias

bacterianas. Verifique si se trata de cultivos puros.

2. Realice una tinción de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.

3a. Pruebas bioquímicas convencionales

Cada grupo preparará una batería convencional compuesta por 5 tubos. Para sembrar
la batería se debe seguir las siguientes indicaciones:
a. Flamear el asa para su esterilización.

b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mc Conkey con la muestra a estudiar.

c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado
y agitar. Repetir hasta una densidad igual a 0.5 Mc Farland.

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d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como inóculo
para sembrar toda la batería.

e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer una
comparación con el resultado final.

f. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las
paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta

que:

1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en

superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por
la superficie.

2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la
superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).

3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.

4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta,
pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.

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 LECTURA DE ANTIBIOGRAMA

En este tiempo se produce la difusión del antimicrobiano en el agar y si la bacteria es sensible,

se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria es resistente habrá
desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición disminuidos.
Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán clasificar a
las bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.
Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos diferentes
para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo:
un halo de inhibición de 30mm para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20
mm para Tetraciclina

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA.

Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan
y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se
comparan con las Tablas de Resultados adjuntas.

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 LECTURA BATERÍA BIOQUÍMICA

Agar Urea

Reacción positiva : El agar se torna fucsia.

Reacción negativa : El agar no cambia de
color.

Agar Citrato

Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).

Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).

Agar TSI

Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K

Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A
Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A
Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.
Producción de gas : Ruptura de la columna de agar. Indica reacción positiva

Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva

Agar LIA

Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K

Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como
K fondo amarillo (ácido). Se anota como A
Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R

fondo amarillo. Se anota A

Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A

Producción de H2S : ennegrecimiento del agar. Indica reacción
positiva

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Medio MIO

Motilidad positiva : crecimiento bacteriano produce opalescencia del

medio. Motilidad negativa : crecimiento bacteriano limitado al pinchazo
con el asa.
Presencia de indol : reacción positiva, aparición de un aro rojo en la superficie del medio,
al agregar el reactivo de Kovacs.
Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reacción positiva

: el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo), indicando reacción negativa.

Agar Corriente : reacción positiva si existe coloración de las colonias

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14
Resultados más frecuentes de algunas pruebas bioquímicas para la familia Enterobacteriaceae

Gl L Sac M So Ge C H Mot I V R Pig U

2
uc ac aro an rbi lati it ilida n - - men r
Escherichia coli A + V + + - - -S +/- + - + - -
os to sa ito tol na r d d P M to e
G
Shigella flexneri A
a -sa V V
l - - -a - - -o - + - -a
t- l+
Shigella dispar - V - - - - - - - + - -
o
Salmonella typhi A - - + + - V + + - - + - -
A - - + + - - - + - - + - -
Salmonella G
paratyphi A - - + + - + + + - - + - -
Salmonella G
Salmonella
paratyphi A - - + + - + + - - - + - -
gallinarum /
Citrobacter A + +/- + + - + + + - - + - -
-
freundii G /
Klebsiella A + + + + - + - - - + - - +
-
pneumoniae G
A + + + + - + - + - + - - -
Enterobacter G /+
Enterobacter A V V + - - V - + - + - - -
hafniae G / /
Serratia V - + + + + + - + - + - + V
- +
marcescens /
Serratia rubidae A + + + - + + - +/- - + - + V
+
V /
Proteus vulgaris A - + - - + V + + + - + - +
+
V
Proteus mirabilis A - V - - + ( + + - - + - +
G + /
Pseudomonas ) +
- - - - - + + - + - - - + -
aeruginosa*
Alcaligenes - - - - - - V - + - - - - -
faecalis*
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
AG = Acido-Gas (utilización del substrato y producción de gas) V =
Variable
(+) = Positivo después de 3 ó 4 días
+/- = Generalmente positivo
-/+ = Generalmente negativo

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