Métodos Separativos en el Análisis Químico

Introducción

Se entiende por separación el proceso por el cual se aíslan entre sí los constituyentes de una
muestra. En muchos análisis, particularmente aquellos de productos complejos naturales y
sintéticos, la interferencia de otros constituyentes impide la determinación directa de un
constituyente dado. Entonces se hace necesario separar el constituyente de interés antes de
proceder a su determinación cuali-cuantitativa.

En esta separación de constituyentes hacemos uso de una propiedad física o química adecuada
de los constituyentes presentes. Para nuestro propósito será suficiente la siguiente clasificación
de los métodos de separación:

1. Métodos que utilizan precipitación (por ejemplo, las marchas sistemáticas de cationes)
2. Extracción líquido-líquido
3. Métodos cromatográficos

Cromatografía
Entre las distintas técnicas empleadas en la Química Analítica, en la actualidad, una técnica muy
utiliza es la Cromatografía.

Su difusión, particularmente en el análisis orgánico y bioquímico se debe a que su empleo

presenta notables ventajas: a) Constituye una técnica sencilla y rápida que en muchos casos no
requiere equipos complicados. b) se puede utilizar desde la escala microanalítica (del orden del
microgramo) hasta la industrial. c) Se puede obtener un registro permanente del análisis
(cromatograma). d) es una técnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias
lábiles.

Fig. 2. Experiencia desarrollada por

Tswett

La palabra cromatografía (kromatos, color, graphos, escrito) fue utilizada por primera vez por el
botánico ruso M. Tswett en 1906 para designar una técnica empleada por él para separar
pigmentos vegetales; hizo pasar por una columna de vidrio, rellena con carbonato de calcio, un

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extracto de hojas verdes en éter de petróleo; adicionando posteriormente el disolvente puro
por la parte superior de la columna obtuvo una serie de bandas horizontales diversamente
coloreadas, debido a la diferente adsorción por el carbonato de calcio de los colorantes de la
planta. Así logró separar dos tipos de clorofila, cuatro xantofilas y caroteno.

Teniendo en cuenta las diversas variantes de la técnica, posiblemente la definición más correcta,
aplicable a todas ellas, sea la dada por M. Keulemans: “[La cromatografía es un] método físico
de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las
cuales constituye un lecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa
a través o a lo largo del lecho estacionario (fase móvil)”.

En la separación de pigmentos realizada por Twsett la fase estacionaria es el relleno de

carbonato de calcio, el éter de petróleo es la fase móvil y los pigmentos son los componentes a
separar que se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrar a
los compuestos hacia la salida de la columna y el carbonato de calcio, adsorbiéndolos, tiende a
retenerlos; como este último efecto es diferente en intensidad para los diferentes pigmentos el
resultado es que se desplazan a diferente velocidad por la columna, pudiendo llegar a separarse.

En todo proceso cromatográfico la fase móvil es, normalmente, la que provoca el movimiento
de las diferentes especies para que abandonen el soporte y la fase estacionaria la que suministra
el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona que cada uno de ellos se
desplace con distinta velocidad.

Clasificación de los métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en base al mecanismo de la separación y al

tipo de soporte o al equipo utilizado.

En cuanto al estado físico de las fases se clasifican como

Fase estacionaria
Líquido Sólido
Gas Cromatografía Cromatografía
gas-líquido gas-sólido
Fase móvil

(CGL) (CGS)
Líquido Cromatografía Cromatografía
Líquido-líquido Líquido-sólido
(CLL) (CLS)

Los mecanismos por los que los diferentes componentes se separar en el proceso
cromatográfico son variados y en algunos casos participa más de un mecanismo en un mismo
proceso de separación.

Los principales mecanismos que intervienen son:

✓ Adsorción: gases o líquidos contenidos en la fase móvil son retenidos por una adsorción
selectiva en la superficie del sólido que constituye la fase estacionaria. En la interfase
sólido-fase móvil hay un aumento de la concentración respecto a la del seno de la fase
móvil. Es el mecanismo que controla la cromatografía gas-sólido y líquido-sólido.
✓ Reparto: los componentes de la fase móvil (gases o líquidos) son retenidos por la fase
estacionaria, líquida, en función de su solubilidad en ella. Si las dos fases son líquidas se
tiene realmente un proceso de extracción en continuo.

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 ✓ Intercambio iónico: la fase estacionaria está constituida por un sólido que puede
intercambiar sus propios iones contenidos en la fase móvil, líquida. El intercambio de
iones sólido-solución está regulado por la afinidad química de los iones con ambas fases
y por sus respectivas concentraciones.
✓ Tamaño molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser separadas en
virtud de su tamaño. La fase estacionaria está formada por un gel hidrofílico altamente
poroso que retiene las moléculas de tamaño inferior al de los poros, que difunden
dentro de los mismos. Las moléculas de tamaño superior solo son retardadas en su paso
por pequeñas fuerzas de adsorción de la superficie externa del gel, por lo que
rápidamente son excluidas de la fase estacionaria.

Fig. 3. Principales mecanismos que intervienen en las técnicas cromatográficas

En cuanto a los métodos cromatográficos más utilizados podemos mencionar: cromatografía de

adsorción en columna, cromatografía de reparto en columna, cromatografía sobre geles
porosos, cromatografía en papel, cromatografía en capa fina, cromatografía de gases y HPLC
(high pressure liquid chromatography).

La técnica de capa delgada o capa fina fue estudiada anteriormente en el curso de Química
Orgánica al igual que la cromatografía en columna.

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Para nuestra materia en función del tiempo disponible y de las técnicas más empleadas en los
laboratorios analíticos actualmente, nos abocaremos al estudio de la cromatografía en columna
para luego avanzar sobre la cromatografía en fase gaseosa y HPLC.

Cromatografía en columna

La fase estacionaria está constituida por un sólido adsorbente que se empaqueta en la columna,
usualmente de vidrio o bien un líquido que es poco miscible con la fase móvil.

Los componentes a separar se añaden en forma soluble y por la parte superior, quedando
retenidos en la misma. Posteriormente los componentes se desplazan arrastrados por una fase
móvil líquida. Dependiendo de la adsorción selectiva de cada uno por la fase estacionaria se
desplazan a distinta velocidad, efectuándose la separación.

Para que haya una separación efectiva de los componentes su velocidad a través de la columna
debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna adecuada.

En el caso de que la fase estacionaria sea un líquido, éste es soportado (por adsorción) por
pequeñas partículas de solido inerte en relación con las especies a separar. El fenómeno en el
cual se basa la separación es la extracción. El sólido soporte, recubierto de una fina capa de fase
estacionaria, se empaqueta en la columna de forma que permita un flujo adecuado de fase
móvil.

Los sólidos soportes más utilizados son el silicagel, el polvo de celulosa y las tierras de diatomeas.

En el análisis por elución, la muestra se coloca en la parte superior de la columna fluyendo la

fase móvil desde arriba produciéndose el equilibrio de partición o adsorción para cada
componente de la muestra, de forma tal que el compuesto menos afín con la fase estacionaria
sale primero, es decir, junto con las primeras fracciones del eluyente.

Fig. 4. Ejemplo de cromatografía

en columna. Análisis por elución.

a) Dispositivo experimental
b) Señal del detector en función
del tiempo

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 Cromatografía gaseosa

La cromatografía gas-solido o gas-liquido es un método para separar componentes de mezclas

de compuestos volátiles. En la mayoría de las aplicaciones se utiliza la para identificar y
determinar el número de componentes de una mezcla.

Para fines analíticos se utilizan entre 0,1 y 10 µL de solución de la muestra en un solvente

apropiado.

En la actualidad la cromatografía de fases a escala preparativa se aplica fundamentalmente en

los laboratorios de Química Orgánica, donde es muy grande su utilidad como método de
separación o purificación de sustancias desconocidas para su posterior estudio o de patrones de
alta pureza. De todas formas, los volúmenes que se manejan en estas operaciones inducen a
calificarla como una técnica “semipreparativa”.

A escala industrial, la cromatografía gaseosa se utiliza excepcionalmente en escala preparativa

para la obtención de productos puros y que serán utilizados en cantidades pequeñas (por
ejemplo, en industria farmacéutica y perfumería).

La aplicación analítica es sin duda la más desarrollada, conjuntamente con la espectrometría de

masa acoplado a cromatografía gaseosa.

El término cromatografía gaseosa se aplica a los procesos en los que la fase móvil es un gas y en
los que la distribución de los componentes de una mezcla se logra mediante cualquiera de los
procesos cromatográficos de adsorción selectiva o partición.

Si el principal mecanismo que produce la distribución es la adsorción en un sustrato sólido, el

método se llama “Cromatografía gas-solido”. Si el mecanismo principal involucra la partición
entre la fase gaseosa y una fina película de un líquido depositado sobre un sólido inerte, el
método es una cromatografía de partición “gas-líquido”.

Mediante esta técnica se pueden separar docenas de constituyentes empleando muestras de

menos de un microgramo. Se aplica a un amplio rango de sustancias por la cual se puede variar
la fase fija y la temperatura puede llegar a los 500° para la separación de alto peso molecular.

Los aparatos que se emplean en cromatografía gas-líquido y gas sólido son iguales en su
construcción. Difieren en la naturaleza del material de relleno a través del cual pasa la muestra.

La condición esencial para poder analizar una mezcla por CG es que sus componentes sean
vaporizables. Si las sustancias a analizar tienen presiones de vapor despreciables, se fijarán a la
fase estacionaria pero difícilmente podrán ser eluídas por el gas portador.

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 Fig. 5. Esquema básico de un
cromatógrafo de gases

Descripción del proceso de separación en CGL y de los componentes del cromatógrafo.

La muestra a analizar se introduce en el seno de la corriente del gas portador a la entrada de la

columna. Los componentes generales de la mezcla se separan por migración diferencial a lo
largo de la columna y cada uno es eluido por medio del gas portador, pasando el fluido a través
de un detector. El detector proporciona una señal eléctrica de respuesta que es interpretada
por un aparato registrador, el cual dibuja un gráfico llamado cromatograma.

El grado de separación que se alcanza depende de las diferencias de los coeficientes de partición
de los componentes de la mezcla y el sistema bifásico particular que se ha usado. Si las sustancias
a analizar tienen puntos de ebullición superior a los 60°C, la columna y el detector deben ser
termostatizados a una temperatura relativamente alta.

• Gas portador: El gas portador es el gas a presión que transporta la muestra a través del
sistema. Se lo denomina también gas carrier. Los gases usados como fase móvil son
elegidos de acuerdo a la naturaleza de la muestra a separar y al tipo de detector. El gas
portador debe ser inerte respecto a la muestra. Los gases más usados son nitrógeno,
hidrógeno, helio, argón y dióxido de carbono. Antes de ingresar al equipo pasar por
reguladores de presión y flujo (control electrónico).
• Inyector: Permite la introducción de la muestra en la corriente de gas portador.
Normalmente se trata de un inyector de líquidos, que puede ser utilizado para solidos
(en solución) y gases.
Se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada
independientemente de esta a temperatura de ebullición superior al compuesto menos
volátil de la muestra y si se trata de una corrida con temperatura programada la
temperatura del inyector será, como mínimo la temperatura final programada
La muestra se inyecta a través de una microjeringa o de inyectores automáticos que
pasan a través de una membrana de caucho (septum) que hace de cierre.
En el caso de muestreo de gases se emplean válvulas.
• Columna cromatográfica: Es un tubo de vidrio o metal (acero inoxidable, cobre,
aluminio, etc) de longitud que oscila entre 1 y 200 m cuyo diámetro puede ser desde 0,1
a 50 mm, según el tipo de columna. La naturaleza de la columna es fundamental en la
realización de una cromatografía gaseosa. Actualmente se conocen dos clases de
columna:

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 a) Columna rellena: una columna con carga consiste en un tubo en forma de U, o en
espiral que está llena uniformemente con un polvo bien empacado que actúa como
adsorbente. También la carga puede ser un sólido inerte (perlas de vidrio)
conteniendo una película en la cual se va a efectuar la partición de la sustancia
arrastrada por el gas.
b) Columna capilar: una columna capilar consiste en un
espiral de 0,25-0,50 mm de diámetro interno, que
puede tener una longitud de tubería de 30 a 100 m.
Las paredes internas de este capilar están cubiertas
por una fina capa líquida no volátil con la cual se va
a producir la partición de la sustancia arrastrada por
el gas.

Fig. 6. Columna capilar.

• Fase estacionaria: es un líquido que a la temperatura de trabajo debe ser estable, inerte
y no volátil.
La fase fija o carga de la columna puede ser un polvo inerte, donde ocurrirá la adsorción
de la muestra a separar o bien un soporte inerte, revestido con una película líquida
delgada de baja viscosidad y alta capacidad diferencial para disolver los componentes
de la muestra. La materia prima para la mayoría de los soportes de cromatografía de
gases es la tierra de diatomeas (celite), que está formada por esqueletos de
diatomáceas, algas uniceluares microscópicas que son fundamentalmente sílice
hidratada y microamorfa.
Si se utiliza fase fija líquida, ésta debe ser estable a la temperatura máxima de
funcionamiento de la columna.
Si se excede la temperatura límite, se produce una vaporización de la fase líquida,
alterándose la línea de base del cromatograma.
Como fases líquidas se emplean generalmente siliconas, polieteres y poliésteres.
• Detectores: El detector es un dispositivo que permite medir de manera continua una
propiedad física del gas portador, que se modifica sensiblemente por la presencia de
muy pequeñas cantidades de la sustancia a analizar (por ejemplo, conductividad
térmica, corriente de ionización, etc.) y que da por registro gráfico una curva que sea
una función simple entre esa propiedad y la concentración del analito.
El detector está acopado a un sistema electrónico de amplificación y medida de la señal
eléctrica enviada, que, a su vez, regula a un aparato registrador, con el cual se grafica la
variación de la propiedad medida en función del tiempo. Al área cubierta por el pico de
cada sustancia en el gráfico que se obtiene en pantalla, da una medida de la proporción
en que la misma se encuentra en la muestra.
Estos detectores deben tener ciertas características deseables: adecuada sensibilidad,
respuesta lineal para varios ordenes de magnitud, selectividad, buena estabilidad y
reproducibilidad y en lo posible no destruir la muestra. Si bien hay distintos tipos de
detectores, solo veremos el uso del detector de ionización de llama.

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 Detector de ionización de llama (FID): En un
quemador, tal como se muestra en la
siguiente figura, el efluente de la columna se
mezcla con hidrógeno y aire para luego
encenderse eléctricamente. La mayoría de
los compuestos orgánicos cuando se
someten a pirólisis a la temperatura de la
llama aire/hidrógeno producen iones y
electrones que pueden conducir la
electricidad a través de la llama. Cuando se
aplica una diferencia de potencial de unos
pocos cientos de volts entre el extremo del
quemador y un electrodo colector situado
por encima de la llama, la corriente que
resulta se dirige hacia un amplificador.

Fig. 8. Esquema de un FID

El detector de ionización de llama responde al número de átomos de carbono que entra en el

detector por unidad de tiempo, por ello es un detector más sensible a la masa, que un
sistema sensible a la concentración.

Este detector ioniza a compuestos orgánicos y no da respuesta con aire, agua, CO, CO2, CS2, NO,
SO2 y SH2.

Cromatografía líquida de alta performance (HPLC)

La cromatografía líquida de alta performance (HPLC, por sus siglas en inglés), es

conceptualmente similar a la cromatografía líquida tradicional. La diferencia fundamental radica
en que el soporte (sobre la que se deposita la película de fase fija) es de material especialmente
pulverizado, cuyas partículas tienen un tamaño homogéneo, que puede ser sólo 5.10 micrones
de diámetro. Este tipo de fase fija es muy eficaz, pero por estar densamente empaquetada,
ofrece gran resistencia al flujo de la fase móvil, es decir que se requiere hacer presión (hasta 400
atm), para que solvente fluya a una velocidad razonable a través de la columna (generalmente
entre 0,1 a 5 cm/segundo de flujo lineal).

La cantidad de fase estacionaria dentro de la columna es pequeña, por lo que se requiere que la
muestra también sea pequeña (menos de 50 mg). Es una técnica con alta eficiencia separativa.

Una diferencia con la cromatografía gaseosa estudiada anteriormente es que la muestra no

necesita ser volátil ni incrementarse su presión de vapor para poder realizar el análisis.

HPLC solo requiere que la muestra sea algo soluble en la fase móvil y esto hace posible el análisis
de compuestos de alto peso molecular: orgánicos o inorgánicos, iónicos o covalentes. El
inconveniente es encontrar un par de fases (fija y móvil) que separe selectivamente a los
componentes de la muestra.

En la siguiente figura se muestra un esquema de las partes de un equipo de HPLC convencional.

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 Fig. 9. Esquema básico de un equipo de HPLC

Desde el reservorio del solvente la bomba entrega un flujo continuo. Desde la salida, el sistema
ya tiene alta presión y sus válvulas, deben ser de seguridad.

Desde el módulo amortiguador, la fase móvil fluye a través de la cámara de inyección hacia la
columna.

La presión interna de la columna se mide con un manómetro. La salida de los componentes de

la muestra se hace sensible con el uso de un detector, el que está conectado al registrador y a
un colector de fracciones, cuando se necesitan efectuar el aislamiento de un componente.

Descripción de las partes del equipo

El reservorio para el solvente

Suele ser un recipiente de un litro, construido en vidrio, acero inoxidable o plástico.

Es importante desgasificar el solvente antes de introducirlo en el reservorio, así como filtrarlo

para eliminar cualquier impureza sólida. Sino se elimina el gas del solvente, las burbujas se
disolverán dentro del aparato, debido a la alta presión, pero al salir de la columna volverán a
formarse, arruinando la señal del detector.

Si se utiliza una mezcla de solventes, el reservorio debe mantenerse a temperatura constante

para evitar cambios de composición.

Sistema de bombeo

El solvente que atraviesa la columna debe tener alta presión, continua y sin pulsos.

Las bombas que se utilizan para aplicaciones analíticas deben ser capaces de entregar 20 mL/min
de solvente a una presión entre 300 y 400 atm. Si se utiliza una bomba que le imprima pulsos al
solvente, se necesitará un modulador que suavice los pulsos y un flujo constante, e lo contrario
se afectará la respuesta del detector y puede deteriorarse el empaquetamiento de la columna.

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Cámara de inyección

El diseño de los sistemas de inyección debe ser tal que permita trabajar con altas presiones,
volúmenes pequeños y que sea fácilmente lavable con la fase móvil. La muestra se debe inyectar
líquida.

Hay dos tipos principales:

a) Inyección con jeringa: similar a las utilizadas en cromatografía gaseosa. Se requieren

jeringas con muy buen cierre. La muestra se inyecta a través de un tapón que a su vez
debe resistir altas presiones, ser penetrable y resistente a la acción de los solventes de
la fase móvil.
b) Uso de válvulas inyectoras: Este método implica colocar la muestra, a presión ambiente,
dentro de un capilar (loop) colocado a la entrada de la columna, mientras el flujo de
solvente a presión sigue su curso.
Para inyectar se mueven las válvulas de tal forma de desviar el flujo de solvente para
que transite a través del capilar que contiene la muestra. Esto causa en el detector una
señal adicional debida al solvente de la muestra pero que no afecta a la resolución
posterior.

Columnas

Las columnas utilizadas en HPLC, están constituidas de material inerte, generalmente de acero
inoxidable, ya que el vidrio no es adecuado para las altas presiones que requiere la técnica. Las
dimensiones son mucho menores que las columnas capilares utilizadas en cromatografía
gaseosa.

El pulido de las paredes interiores debe ser perfecto pues rugosidades impedirán el
empaquetamiento perfecto del relleno, con la consiguiente pérdida de resolución. La forma de
las columnas está en relación con el tamaño y dimensión del termostato que se utilizará. En
general son rectas.

Fig. 10. Columna comercial utilizada en

HPLC.

Fases estacionarias

Los materiales de relleno para HPLC, deben ser estables a altas presiones. La mayoría de los
materiales de soporte inorgánicos son estables, aunque si la estructura es muy porosa, pueden
colapsar al incrementarse la presión.

En HPLC se utilizan fundamentalmente 2 tipos de soporte:

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 a) Materiales totalmente porosos como la sílica gel y la alúmina, que poseen gran
superficie activa (50 a 500 m2/g) como las que se emplean en cromatografía de columna
clásica, pero con un tamaño de partícula menor.
b) Materiales peliculares depositados como una delgada capa sobre un centro sólido
esférico. Las capas pueden ser de sílica gel o alúmina u otros materiales.

Fase reversa: En contraposición a los métodos comunes de adsorción, en fase reversa la fase
estacionaria es no polar (hidrofóbica) y la fase móvil es polar (hidrofílica). Esta inversión en las
fases implica la inversión en el orden de salida de los componentes de la muestra, es decir,
aquellas sustancias menos polares, serán más retenidas que las polares.

Detectores

Se utilizan principalmente 2 tipos de detectores:

✓ Detector de índice de refracción: Este detector mide los índices de refracción del
solvente puro y de la solución que emerge de la columna. Como la respuesta del
detector es universal y su sensibilidad es moderada (del orden de microgramos o partes
por millón). No se lo puede utilizar para polaridad programada de fase móvil.
Este detector es sensible a los cambios de flujo y temperatura. No es destructivo.
✓ Detector de luz ultravioleta: Se funcionamiento se basa en la absorción de luz
ultravioleta que pasa a través de la solución emergente de la columna. La respuesta es
selectiva ya que sólo se detectarán los compuestos que absorban la luz de la longitud
de onda a la que opera el detector. Este detector es insensible a los cambios de flujo y
temperatura y es posible efectuar programaciones de fase móvil.

Los resultados: El cromatograma

Luego de realizado un análisis por cualquier de estas técnicas instrumentales explicadas

anteriormente (GC y HPLC) el resultado del análisis se presenta en forma de un gráfico que
muestra la respuesta del detector en función del tiempo. Este grafico se denomina
cromatograma. A partir de su interpretación se pueden obtener información cualitativa y
cuantitativa acerca de la mezcla en estudio.

Fig. 11. Cromatograma

simplificado

Analicemos algunos aspectos de esta figura:

El pico pequeño de la izquierda corresponde a una especie que no es retenida por la fase
estacionaria. El tiempo tM entre la inyección de la muestra y la aparición del primer pico se lo
llama “tiempo muerto”. Este tiempo muerto proporciona una medida de la velocidad media de

11
migración de la fase móvil y es un parámetro útil para identificar los picos de la sustancia que se
desea analizar.

El pico grande al lado derecho corresponde al analito. El tiempo requerido para que este llegue
al detector, después de que este se ha inyectado, se denomina “tiempo de retención” (tR). El
analito ha sido retenido porque pasa un tiempo ts en la fase estacionaria.

La relación entre estos parámetros es la siguiente:

tR = t S + tM

El mejor método para el análisis cualitativo de los componentes de la mezcla es la comparación

de los tiempos de retención de los picos de la muestra con los de sustancias patrón, trabajando
en ambos casos con las mismas condiciones experimentales.

Para un análisis cuantitativo se emplea la medición del área del pico o la altura. Este último
parámetro es de gran comodidad, pero solo sirve para aquellos casos en los que el pico es agudo,
claro, estrecho y simétrico.

El área o la altura de un pico será una indicación de la cantidad de ese analito presente en la
muestra.

Una última consideración sobre los cromatogramas en cromatografía gaseosa

En cromatografía gaseosa la columna cromatográfica está situada en un en un compartimento

termostatizado denominado horno. La temperatura adecuada de columna depende del punto
de ebullición de las muestras y del grado
de separación necesarios. En términos
generales una temperatura un poco
mayor que el punto de ebullición medio
de las muestras permite una duración
razonable del análisis (20-30 minutos).
En el caso de muestras con intervalo de
ebullición amplio, frecuentemente es
aconsejable utilizar una corrida con
temperatura programada, en la que se
incrementa la temperatura de forma
continua o escalonada, a medida que
avanza la separación.

Figura 12. Efecto de la temperatura

sobre la cromatografía de gases. A)
Programación isotérmica a 45°C b)
Programación isotérmica a 145°C c)
Temperatura programada de 30°C a
180°C.

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