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    Purificacion de Plamidos 2

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    Lindas2014
    La práctica tiene como objetivo obtener bacterias de E. coli resistentes a kanamicina mediante la transformación con un plásmido. Esto involucra tres sesiones: 1) transformar E. coli con un plásmido que confiere resistencia a kanamicina, 2) aislar el plásmido usando lisis alcalina, y 3) cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa.

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    La práctica tiene como objetivo obtener bacterias de E. coli resistentes a kanamicina mediante la transformación con un plásmido. Esto involucra tres sesiones: 1) transformar E. coli con un plásmido que confiere resistencia a kanamicina, 2) aislar el plásmido usando lisis alcalina, y 3) cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa.

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    La práctica tiene como objetivo obtener bacterias de E. coli resistentes a kanamicina mediante la transformación con un plásmido. Esto involucra tres sesiones: 1) transformar E. coli con un plásmido que confiere resistencia a kanamicina, 2) aislar el plásmido usando lisis alcalina, y 3) cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa.

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    Purificacion de Plamidos 2

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    La práctica tiene como objetivo obtener bacterias de E. coli resistentes a kanamicina mediante la transformación con un plásmido. Esto involucra tres sesiones: 1) transformar E. coli con un plásmido que confiere resistencia a kanamicina, 2) aislar el plásmido usando lisis alcalina, y 3) cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa.

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    ESQUEMA GENERAL

    SESIN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plsmido


    para que adquieran resistencia a un antibitico
    SESIN 3: FUNCIN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN
    Cortar el plsmido aislado con enzimas de restriccin y visualizarlo
    en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio
    SESIN 2: AISLAR el plsmido mediante la tcnica de
    Lisis alcalina
    OBJETIVO DE LA PRCTICA:
    OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
    KANAMICINA
    Medio LB + KANAMICINA
    Escherichia coli
    Se introducir el vector pET-TEM

    Sitio mltiple de
    restriccin
    Origen de
    replicacin
    Gen que confiere
    resistencia a kanamicina:
    kanamicina
    fosfotransferasa
    PURIFICACIN PLSMIDOS

    Niveles de impurezas aceptados por la FDA
    Ccc: supercoiled circular covalently closed
    Oc: open circular
    Plsmidos
    La diferencia en TAMAO entre el DNA
    cromosomal y el DNA plasmdico permite
    desarrrollar estrategias de purificacin
    TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
    diferentes formas de enrollamiento
    TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
    diferentes formas de enrollamiento
    TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
    diferentes formas de enrollamiento
    PURIFICACIN PLSMIDOS

    Niveles de impurezas aceptados por la FDA
    Ccc: supercoiled circular covalently closed
    Oc: open circular
    Purificacin de plsmidos
    1. Lisis
    Qumica
    Mecnica
    Cambios en la Tempratura
    2. Remover partculas grandes
    Centrifugacin
    Filtracin (uso de membranas)
    3. Purificacin intermedia
    Precipitacin fraccionada
    Adsorcin a membranas
    4. Purificacin alta resolucin
    Mtodos cromatogrficos:
    Intercambio inico
    Filtracin en gel
    Afinidad
    Disolver
    Liofilizar
    Formular
    5. Conservar
    ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE
    PLSMIDOS POR LA TCNICA DE LISIS
    ALCALINA
    Aislamiento de plsmidos por el
    mtodo de lisis alcalina
    Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
    Solucin GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9
    La glucosa no tiene carga pero es un osmolito
    El EDTA une cationes divalentes como Mg
    2+
    y Ca
    2+
    en
    la membrana celular, debilitando la membrana.
    Tambin el Mg
    2+
    es cofactor de Dnasas
    Componentes de la solucin GTE
    Tris-HCl
    Glucosa
    Solucin de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%
    Esta solucin disuelve los fosfolpidos y los
    componentes protecos de las membranas celulares.
    SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CLULAS
    Solucin de
    lisis
    El NaOH
    desnaturaliza el
    DNA plasmdico y
    cromosomal
    Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con
    protenas y lpidos.

    El DNA cromosomal que se renaturaliza se atrapa en
    el precipitado SDS/protenas/lpidos. Slo el DNA
    plasmdico y molculas de RNA escapan del
    precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL
    SOBRENADANTE
    El isopropanol precipita los cidos nuclecos
    Incubar por 20 min a -20C
    Lavar el botn con etanol al 70%: remueve sales y
    remanentes de SDS. Tambin remueve el
    isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
    evapora ms rpido
    Purificacin de plsmidos
    Por ejemplo unin al ptido 16mer
    NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-
    Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-
    Gln-COOH
    Cmo podramos monitorear el progreso de la purificacin
    de plsmidos?
    1. Absorbancia 260 nm
    2. Electroforesis en geles de agarosa
    Por la electroforesis en geles de agarosa se debe
    monitorear la purificacin de plsmidos
    DNA cromosomal
    Plsmido abierto
    Plsmido superenrrollado
    1 Precipitacin con
    isopropanol
    2 Cromatografa
    intercambo aninico
    3 Filtracin con
    membrana de
    nitrocelulosa
    4 Lo que se retuvo en
    la membrana de
    nitrocelulosa
    Microscopia
    de polmero de
    agarosa
    Uso de colorantes
    Tincin con Syber Safe

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