La química detrás del ADN vegetal

Protocolos de aislamiento
Jina Heikrujam, Rajkumar Kishor y Pranab Behari Mazumder

Varias especies de plantas son de naturaleza bioquímicamente heterogénea,

por lo que un único protocolo de aislamiento del ADN puede no ser adecuado.
Siempre ha existido una modificación continua y estandarización en los protocolos
de aislamiento de ADN. La mayoría de los protocolos de aislamiento de ADN de
plantas que se utilizan en la actualidad son versiones modificadas del
procedimiento de extracción con bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB). La
modificación generalmente se realiza en la concentración de productos químicos
utilizados durante el procedimiento de extracción de acuerdo con la especie
vegetal y la parte de la planta utilizada. Por lo tanto, comprender el papel de cada
químico (es decir, CTAB, NaCl, PVP, etanol e isopropanol) utilizado durante el
procedimiento de extracción de ADN, beneficiará para establecer o modificar
protocolos con mayor precisión. Una revisión de los productos químicos utilizados
en el método de extracción con CTAB de ADN y sus probables funciones para
estudiantes e investigadores se ha resumido en este artículo.
Palabras claves: extracción de ADN, tampón CTAB,
polisacárido, fase orgánica, RNasa A

1. Introducción
El aislamiento de ADN de buena calidad es un requisito previo para la
investigación molecular. Mantener el rendimiento y la calidad durante la extracción
del ADN de la planta es una de las tareas más difíciles en comparación con los
animales, debido a su rígida pared celular, que está compuesta de celulosa junto
con otros niveles variables de componentes químicos, tales como polisacáridos,
polifenoles, proteínas y lípidos que actúan como contaminantes durante la
extracción del ADN. La cantidad de estos componentes varía según la especie de
la planta, la parte de la planta utilizada, las condiciones ambientales y la etapa de
crecimiento, y es muy problemático aislar el ADN. Por ejemplo, los cereales son
ricos en carbohidratos, mientras que las plantas medicinales son ricas en
polifenoles, las plantas recalcitrantes tienen polifenoles más altos. Estos
contaminantes pueden eliminarse durante la extracción de ADN estandarizando.
Por lo general, se prefieren las hojas frescas de 15 a 20 días para los tejidos
vegetales (frescas, liofilizadas, y membrana nuclear para liberar el ADN altamente
intacto en solución, seguido de precipitación del ADN y eliminación de las
biomoléculas contaminantes como las proteínas, polisacáridos, lípidos, fenoles y
otros metabolitos secundarios por métodos enzimáticos o químicos.
El ADN de la planta se extrae mediante métodos basados en CTAB o dodecil
sulfato de sodio (SDS). La mayoría de los protocolos desarrollados para la
extracción de ADN son versiones modificadas de la extracción con bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB). El papel de varios productos químicos implicados
en el método de extracción de CTAB se ha descrito en la presente comunicación.
Búfer CTAB
El tampón CTAB incluye principalmente CTAB, cloruro de sodio (NaCl) y
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Tris2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol
(TRIS), polivinilpirrolidona (PVP) y β mercaptoetanol.
CTAB
Las células vegetales se encierran en una pared celular polisacárida
compleja, de la cual la celulosa es el componente principal, que es de naturaleza
cristalina, debido a la estructura en forma de cadena y los enlaces de hidrógeno
intermoleculares. Esto se puede debilitar para abrir la pared celular, mediante la
aplicación de la fuerza mecánica ejercida durante la molienda junto con tampón
CTAB o nitrógeno líquido.
La membrana celular se encuentra junto a la pared celular y la celulosa y
está compuesta por un diverso conjunto de moléculas de fosfolípidos y proteínas.
Se disuelve en detergentes tensioactivos que son anfipáticos (cola hidrofóbica y
cabeza hidrofílica) por naturaleza, muy similar a las membranas de fosfolípidos.
Los tensioactivos se caracterizan en función de su grupo hidrófilo, es decir, iónico,
no iónico y bipolar. El agente tensioactivo iónico siempre ha sido mejor para
desnaturalizar moléculas de proteínas y, por lo tanto, para disolver las
membranas.
CTAB, un detergente catiónico, constituye una larga cadena de
hidrocarburos hidrófobos y una cabeza hidrofílica. Forma micelas en el agua
debido a su naturaleza anfipática. Durante la extracción de ADN, en condiciones
acuosas, CTAB entra en contacto con la membrana biológica, captura los lípidos
(Figura 1) y da como resultado la liberación del núcleo, que carece de membrana.
El tejido vegetal es rico en complejos polisacáridos y metabolitos secundarios que
interfieren y coprecipitan con el ADN; CTAB junto con algunos otros productos
químicos como PVP se utiliza para minimizar el efecto de estos metabolitos.
CTAB funciona de manera diferente según la fuerza iónica de la solución. En
un baja fuerza iónica, precipita ácido nucleico y polisacáridos (pectina, xilano y
carragenano), mientras que las proteínas y los polisacáridos neutros (dextrano,
goma algarroba, almidón e inulina) permanecen en la solución. Sin embargo, a
alta concentración iónica, se une a los polisacáridos y forma complejos que se
eliminan durante la posterior extracción con cloroformo. También desnaturaliza o
inhibe la actividad de proteínas y / o enzimas.
NaCl
 El NaCl ayuda a eliminar las proteínas que están unidas al ADN. También
ayuda a mantener las proteínas disueltas en la capa acuosa para que no se
precipiten en el alcohol junto con el ADN al neutralizar las cargas negativas en el
ADN para que las moléculas puedan unirse.

Figura 1.

Papel de CTAB en la eliminación de la membrana. (A) CTAB es de naturaleza anfipática. Tiene una
larga cadena de hidrocarburos (cola hidrófoba) y un grupo trimetilamonio cargado positivamente
(cabeza hidrófila); (B) CTAB la micela en la solución acuosa. Las cabezas polares (hidrofílicas)
miran hacia afuera y las no polares (hidrofóbicas) cola de hidrocarburo se esconde en el interior
haciendo micelas; (C) membrana biológica formada por lípidos anfipáticos con proteína integral; y
(D) CTAB captura los lípidos de la membrana y forma la micela híbrida.

La ósmosis ocurre cuando la célula se somete a una solución hipo o

hipertónica. Si las células se mantienen en una solución hipotónica, el agua entra
en el interior de la célula y provoca hinchazón, aumento de la presión interna y,
finalmente, estalla. Por otro lado, en una solución hipertónica, el agua tiende a
salir de la célula y, finalmente, la célula vegetal se contrae y se arruga, lo que
conduce a la plasmólisis. Por tanto, la concentración de sal juega un papel
importante en la lisis celular.
La concentración de sal de más de 0,5 M proporciona la fuerza iónica
necesaria para que el CTAB precipite polisacáridos. En varios protocolos, se ha
sugerido una concentración de 1,4 M de NaCl; Sin embargo, en los protocolos
desarrollados para eliminar los polisacáridos, se ha observado una mayor
concentración de NaCl y/o CTAB recomendado.
Tris
Tris es un (hidroximetil) aminometano con la fórmula molecular
(CH2OH)3CNH2, que tiene tres alcoholes primarios y un grupo amino, con un pKa
de 8.1, es un tampón eficaz con pH entre 7 y 9. Cuando se ajusta el pH a 8, con
HCl, contiene una mezcla de base débil y su ácido débil conjugado (Figura 2), que
puede actuar como amortiguador y aumenta aún más la permeabilidad de la pared
celular. Cuando la pared celular y las membranas se rompen durante la trituración
de tejidos, termina la compartimentación, se libera material citoplasmático, por lo
que el pH se altera y, en consecuencia, la estabilidad de biomoléculas como el
ácido nucleico se reduce. El tampón juega un papel importante en tales
situaciones y el tampón Tris mantiene el pH de la solución.
EDTA
EDTA (C10H16N2O8) cationes quelatos divalentes, como Mg +2 y Ca+2 (Figura
3), que está presente en las enzimas y reduce la actividad enzimática DNasa y
RNasa. Los cationes divalentes son los cofactores de muchas enzimas que
aumentan la actividad de la enzima. Por ejemplo, la enzima DNasa requiere iones
Mg+2 como cofactor para su actividad. La quelación de iones de Mg +2 con EDTA
hace que la enzima DNasa no funcione y, por lo tanto, protege el ADN. Los iones
Mg+2 también son necesarios para la agregación de ácido nucleico con proteína;
mientras que los iones Ca+2 son necesarios para cementar las paredes celulares
estabilidad de la capa intermedia y la membrana. Por lo tanto, aprovecharlos
mediante EDTA da como resultado la desestabilización de la integridad de la
enzima.
β-mercaptoetanol
Las plantas son ricas en compuestos fenólicos y para obtener un ADN de
calidad, estos deben eliminarse. El β mercaptoetanol (HOCH 2CH2SH) se agrega la
mayor parte del tiempo en tampones de extracción y es un agente reductor fuerte
para limpiar los taninos y otros polifenoles presentes en el extracto crudo de la
planta. Las proteínas globulares se disuelven en agua. Para hacerlos insolubles,
una de las alternativas es su desnaturalización que se puede realizar en estructura
terciaria y cuaternaria nivel de proteína mediante la reducción de enlaces disulfuro
intermoleculares β-mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro de la proteína
(Figura 4) y así las proteínas se desnaturalizan.
PVP
Se agrega PVP para eliminar los compuestos fenólicos del extracto de ADN
de plantas. El polifenol es un componente importante en plantas medicinales,
plantas leñosas y partes de plantas maduras. Está presente en la vacuola,
mientras que su enzima oxidante, la polifenol oxidasa (PPO) se encuentra en el
plastidio. Durante la trituración del tejido, el compartimiento se rompe y la PPO
convierte los polifenoles en quinona, lo que da color marrón. Los polifenoles se
unen al ADN y dificultan el procesamiento posterior se coprecipitan con el ácido
nucleico. El PVP elimina la contaminación polifenólica uniéndolo a través de un
enlace de hidrógeno. Por lo tanto, previene la oxidación con polifenol y, por lo
tanto, pardeamiento de las muestras de ADN. Cuando se centrifuga el extracto
con cloroformo, los complejos de PVP se acumulan en la interfase. La mezcla de
lisado celular con tampón CTAB debe mantenerse en el baño de maría a 65 °C,
que inhibe irreversiblemente la enzima DNasa. Después de sacar la muestra del
baño de agua, se debe dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se agregará
una mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1) ó fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25: 24: 1). También se puede utilizar cloroformo: octanol (24:1) en
lugar de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1).
Fenol
El fenol es un solvente orgánico, por lo que no es miscible con agua y se usa
junto con cloroformo y alcohol isoamílico para la purificación del ADN para eliminar
proteínas y contaminantes polisacáridos. Cuando se agita fenol con el extracto
celular, los componentes apolares de la célula se fraccionarán en fenol, dejando
las partes polares en agua. El ADN es insoluble en fenol porque el fenol es una
solución apolar. Por otro lado, la proteína tiene grupos polares y apolares
presentes en ella debido a la cadena larga de diferentes aminoácidos. Los
diferentes aminoácidos tienen diferentes grupos en su cadena lateral. Además, el
plegamiento de la proteína en la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria
depende de la polaridad de los aminoácidos. Los enlaces entre los aminoácidos se
rompen mediante la adición de fenol y la proteína se desnaturaliza y finalmente se
desdobla. La centrifugación después con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico en
proporción 25: 24: 1 da tres capas, es decir, acuosa, en interfase y en la fase
inferior orgánica con pH neutro a alcalino, los ácidos nucleicos tienen carga
negativa y son polares. Por lo tanto, es hidrófilo y permanece en la fase acuosa.
En solución acuosa, el aminoácido forma un núcleo protector, sin embargo,
después de la desnaturalización, los núcleos no polares (hidrófobos) se exponen,
provocando la precipitación de proteínas y algunos polisacáridos en la interfase.
La combinación de fenol-cloroformo reduce la partición de poli (A) y ARNm
en la fase orgánica y reduce la formación de complejos de proteína de ARN
insoluble en la interfase. El fenol retiene alrededor del 10-15% de la fase acuosa,
lo que resulta en una pérdida similar de ARN; el cloroformo previene esta
retención de agua y mejora así los rendimientos. Solo se debe usar fenol neutro,
ya que el fenol ácido disuelve el ADN en el interior, se convierte en quinonas por
oxidación y forma radicales libres, degradando el ácido nucleico. La simple
observación del color rosa del fenol indicará su naturaleza ácida. La centrifugación
después del paso de cloroformo: alcohol isoamílico debe realizarse a temperatura
ambiente, porque por debajo de 15 °C, CTAB/ácido nucleico forma agregados
irreversibles y puede precipitar. Durante este paso, el ADN estará en fase acuosa.
Cloroformo
El cloroformo (CHCl3) o el triclorometano es un disolvente no polar
(hidrófobo), en el que las proteínas no polares y los lípidos se disuelven para
promover la partición de lípidos y detritos celulares en la fase orgánica, dejando el
ADN aislado protegido en la fase acuosa. El cloroformo asegura la separación de
fases de los dos líquidos porque tiene una densidad más alta (1,47 g / cm3) y una
fuerza de separación más aguda de las fases orgánica y acuosa, ayudando así a
la eliminación de la fase acuosa con contaminación cruzada mínima de la fase
orgánica. Como el cloroformo es volátil en la naturaleza, no obstaculiza el proceso
posterior.
Alcohol isoamílico
El cloroformo entra en contacto con el aire y forma gas fosgeno (COCl 2,
cloruro de carbonilo), que es dañino. Si simplemente usamos cloroformo, el gas
origina espuma, entre la interfase durante el proceso de extracción y dificulta la
purificación del ADN, lo que se evita cuando se usa cloroformo junto con alcohol
isoamílico o isopentanol {(CH3) 2CHCH2CH2OH} u octanol {CH3(CH2)7OH} evitando
la emulsificación de una solución. El alcohol isoamílico o isopentanol no es
miscible en la solución acuosa porque es un compuesto alifático de cadena larga,
que contiene cinco átomos de carbono y estabiliza la interfase entre la capa
orgánica y la acuosa. La fase acuosa contiene ADN y la fase orgánica contiene
lípidos, proteínas y otras impurezas. El alcohol isoamílico ayuda a inhibir la
actividad de la ARNasa y a prevenir la solubilización en la fase fenólica de
moléculas largas de ARN con porciones largas de poli (A). Esto aumentará la
pureza del ADN.
Ribonucleasa A
El ADN genómico debe tratarse con Ribonucleasa A (RNasa A) para eliminar
la contaminación del ARN para la purificación del ADN. La RNasa A es una
endoribonucleasa que cataliza la hidrólisis del enlace 3 ′, 5′-fosfodiéster del ARN
en el enlace 5′-éster en una reacción de dos pasos. El primer paso es una
transfosforilación para dar un oligonucleótido que termina en una pirimidina 2', 3'-
fosfato cíclico. El segundo es la hidrólisis del fosfato cíclico para dar un 3'-fosfato
terminal. Numerosos estudios químicos han sugerido que la histidina 12, la
histidina 119 y la lisina 41 están involucradas en el sitio activo de la enzima y el
ADN carece del grupo 2'OH (desoxi), permanece seguro (Figuras 5 y 6) [20].

Isopropanol / etanol
El alcohol se usa para precipitar el ADN de la solución de extracción, por lo
que podemos lavar todas esas sales y químicos y luego disolverlo en nuestro
solvente final, generalmente agua o alguna variante de solución de Tris-EDTA. El
ADN permanece disuelto en solución acuosa porque el ADN tiene un esqueleto de
fosfodiéster, que es en naturaleza hidrófilo. La molécula de agua forma una capa
de hidratación alrededor del ADN al formar puentes de hidrógeno. El isopropanol /
etanol se utiliza en la precipitación de ADN, que rompe la cáscara de hidratación.
El isopropanol es una buena opción para la precipitación de ADN. La cantidad del
requerimiento de isopropanol es menor (0.6-0.7 volumen de sobrenadante), como
isopropanol tiene una mayor capacidad para reducir la constante dieléctrica del
agua que el etanol (2-3 volúmenes) y también requiere una buena cantidad de sal
para funcionar. ARN que tiene extra el 2'OH sigue siendo hidrógeno unido al agua
con más fuerza de lo que tiende a hacerlo el ADN, que permanece soluble en él,
por lo que se puede realizar una precipitación selectiva del ADN. Isopropanol
también disuelve disolventes no polares como el cloroformo, por lo que las
impurezas que se forman se pueden eliminar. Generalmente se practica el uso de
isopropanol helado, pero muchos investigadores dicen que debe usarse a
temperatura ambiente, de lo contrario precipitará polisacáridos también [21].
Aunque el rendimiento de ADN aumentará a baja temperatura, puede aumentar
las impurezas.
Acetato de sodio / acetato de amonio / acetato de potasio / sodio cloruro /
cloruro de litio / cloruro de potasio
El papel de la sal en el protocolo de extracción es neutralizar las cargas en la
espina dorsal del grupo fosfato del azúcar del ADN. El acetato de sodio con pH 5.2
es comúnmente utilizado para la precipitación de ácido nucleico junto con el
etanol. En solución, el acetato de sodio se disocia en Na + y [CH 3COO] -. Los
iones de sodio cargados positivamente neutralizan la carga negativa en los grupos
PO−3 en la columna vertebral del fosfato de azúcar de los ácidos nucleicos,
reduciendo la repulsión entre las moléculas de ADN, lo que hace que el ADN sea
menos hidrófila y, por tanto, mucho menos soluble en agua. La atracción
electrostática entre los iones Na + en solución y los iones PO −3 en el ácido
nucleico está dictada por la Ley de Coulomb, que se ve afectada por la constante
dieléctrica de la solución. El agua tiene una constante dieléctrica alta, lo que
dificulta bastante que se unan el Na + y el PO3−. Esto es útil en la agregación y
formación de redes. También se le llama salazón. Sin embargo, no se ve cuando
se usa solo sal. Requiere la solución con baja constante dieléctrica, lo que permite
esta interacción. Esto se ve afectado por el etanol o el isopropanol, que tiene una
constante dieléctrica mucho más baja, lo que hace que sea mucho más fácil para
el Na + interactuar con el PO3−, proteger su carga y hacer que el ácido nucleico
sea menos hidrófilo, lo que hace que el ADN se salga de la solución. (Figura 7).
Etanol
El precipitado de ADN se vuelve a lavar con etanol al 70% para enjuagar el
exceso de sal que podría venir junto con los tampones de extracción del
sedimento [24], se centrifuga, y se descarta el etanol, dejando ADN en el
precipitado. El precipitado se seca al aire o al vacío. Se debe evitar el secado
excesivo, ya que el ADN convierte la forma B en la forma D, que es difícil de
disolver más tarde [25].
Tampón Tris-EDTA (TE) / agua esterilizada
 En tiempos más antiguos, en los métodos de aislamiento de ADN, el ADN
solía almacenarse seco y diluido cuando fuera necesario. Hoy en día, para el
almacenamiento a largo plazo, es prudente almacenar el ADN en un tampón que
mantiene su pH y evita que se degrade. El búfer TE contiene Tris (10 mM) y EDTA
(1 mM), donde Tris es el componente amortiguador y EDTA el componente
quelante. Para el aislamiento de ADN, el pH generalmente se establece en 7.5-
8.5, la leve alcalinidad del tampón TE también previene las posibilidades de
hidrólisis ácida que puede interrumpir la estabilidad del ADN almacenado en agua.
Tris amino constituyente del tampón TE tiene la capacidad de proteger las hebras
de ADN del daño por radiación, tanto en estado sólido y solución fluida. Como la
radiación produce radicales libres, puede romper cadenas de ADN. Por lo tanto,
en la solución fluida a temperatura ambiente, Tris actúa eliminando radicales
hidroxilo. El propósito del EDTA es quelar los iones Mg +2 en la solución necesaria
para la acción DNasa o RNasa, protegiendo así el ADN de DNasas o RNasas. Se
puede utilizar agua esterilizada para el almacenamiento de ADN de corta duración.
Si el búfer TE es utilizado para el almacenamiento de ADN, debe diluirse más con
agua estéril para disminuir la concentración de EDTA y hacer que los iones de
magnesio estén disponibles para la actividad de la polimerasa durante la PCR,
porque si el ADN tiene que enviarse para secuenciar posteriormente, obstaculiza
el proceso. El mismo EDTA quela los iones para degradarlos. El magnesio
también dificulta la acción de las ADN polimerasas durante la PCR, que puede
superar agregando más magnesio a la mezcla maestra, o tal vez diluyendo la
muestra de ADN para que las concentraciones ya bajas de EDTA no interrumpan
realmente la PCR. De hecho, en un gran número de casos no es así.