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    7.8 Marcaje Sondas PCR

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    Adrián Joya Jiménez
    Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas. Explica los diferentes tipos de marcaje como el uso de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas en la PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. También cubre métodos específicos como nick translation, random primer extension y marcaje terminal por relleno, así como el uso de sondas marcadas en la detección de secuencias.

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    7.8 Marcaje Sondas PCR

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    Adrián Joya Jiménez
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    Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas. Explica los diferentes tipos de marcaje como el uso de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas en la PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. También cubre métodos específicos como nick translation, random primer extension y marcaje terminal por relleno, así como el uso de sondas marcadas en la detección de secuencias.

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    7.8 Marcaje Sondas PCR

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    Adrián Joya Jiménez
    Este documento describe los procedimientos para el marcaje molecular de fragmentos de DNA utilizando sondas. Explica los diferentes tipos de marcaje como el uso de nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o radiactivas en la PCR, o el marcaje de oligonucleótidos en los extremos 3' y 5' con enzimas. También cubre métodos específicos como nick translation, random primer extension y marcaje terminal por relleno, así como el uso de sondas marcadas en la detección de secuencias.

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    Marcaje molecular por sonda.

    Presenta: Elier soto.


    Objetivos de aprendizaje
     Explica los procedimientos para el marcaje
    de fragmentos de DNA utilizando la
    tecnología de PCR.
     Reconoce los tipos y características de
    sondas moleculares y los fundamentos del
    marcaje, asi como la importancia de su
    utilización.
     Conoce y explica generalidades de
    diferentes métodos de marcaje.
    Errores mas frecuentes.

     La mala traducción de algunos libros de


    textos, tienden a cambiar la idea general de
    los conceptos.
     Confundir las técnicas de los distintos tipos
    de marcaje molecular.
     No saber de donde proviene el fragmento
    de Klenow.
     Casarse con la idea de que solo existe un
    solo tipo de marcaje de DNA por sonda
    ¿Qué es una sonda de DNA?

     Son moléculas de DNA de cadena sencilla


    marcadas mediante radiación o agentes
    químicos, con el fin de ser utilizadas para la
    detección de secuencias complementarias
    de DNA.
    Importancia.
     La capacidad de encontrar en un genoma
    las secuencias de DNA de interes mediante
    sondas especificas siendo usado
    principalmente en el campo de la medicina.
    marcaje de fragmentos de DNA
    utilizando la tecnología de PCR.

     Se usan nucleotidos modificados con


    moleculas fluorescentes o atomos
    radiactivos (la molecula fluorescente solo
    debe de fijarse a la base de uno de los
    cuatro nucleotidos usados como
    precursores en la sintesis de DNA)
     Los nucleotidos se marcan radiactivamente
    con 32P y el 35 S.

     Tambien se pueden marcar los nucleotidos


    con biotina o dixogigenina
    marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser
    Usados en la macarcion de sondas por la
    la tecnología de PCR.
    oligonucleotidos degenerados.
    MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
    EN EL EXTREMO 3’

     SE MARCAN USANDO LA ENZIMA


    TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO
    TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA
    ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN
    EL EXTREMO 3’
    Marcación de oligonucleotidos
    con TdT
    MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
    EN EL EXTREMO 5’

    • SE MARCAN USANDO LA ENZIMA


    POLINUCLEOTIDO CINASA QUE
    AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32
    EN EL EXTREMO 5’ DE CADA CADENA
    DE DNA
    RNAm
    RT-PCR

    Plantilla para PCR cDNA

    oligonucleotidos
    Degenarados marcados

    PCR

    Sondas DNA marcadas.


    SONDAS MOLECULARES
    CONVENCIONALES.
    DNA.

    SONDAS.

    RNA.
    Sondas convencionales, DNA
    obtenido por clonacion celular.

    •EXTRACCION DEL DNA


    PLASMIDICO

    •RESTRICCION DEL
    INSERTO

    •DESNATURALIZACION
    DEL DNA
    Sondas convencionales, RNA obtenido
    por clonación celular.
    Método El marcador se detecta
    Directo. unido a la sonda.
    Marcaje
    de
    sondas

    Método El marcador para poderse


    Detectar debe unirsele una
    Indirecto. Proteina detectora.
    MARCAJE DE SONDAS,
    METODO INDIRECTO
    Generalidades de diferentes tipos de
    marcaje.
     NICK – TRANSLATION.

     RANDOM PRIMER EXTENSION.

     MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.

     MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito


    en marcaje de fragmentos de DNA utilizando
    PCR, se usa un nucleotido marcado con α–
    32P–d NTP, α-35S–d NTP.
    Marcación de SONDAS
    NICK trasnlation.

     ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y


    DNApolimerasa 1

     SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA

     SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE


    LAS DNAasas.

     PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS


    NICK TRANSLATION.
    Marcación de SONDAS
    RANDOM PRIMER

     SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE


    OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.

     SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA


    POR CALOR).

     SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA


    GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
    Metodo de cebador al azar
    Marcaje terminal por relleno
    Bibliografia.
     Biologia celular y molecular. Lodish, Berk,
    Zipursky, 4ta. Edicion, editorial
    panamericana.

     Biología molecular e Ingeniería Genética.


    Luque, José Ángel. ; Editorial Harcourt.

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