Actualidades en las pruebas de

susceptibilidad a los antibióticos.

(Antibiograma)
Uso y abuso del
antibiograma.
Antibiograma

Retar a la bacteria
vs
un antimicrobiano
 Antimicrobiano

Antimicrobiano: fármaco
que actúa contra algún (os)
microbios
Antibiótico

Antibiótico: Compuesto producido total o

parcialmente por un microbio que actúa contra con
otro (s)
a. Conocer y definir el perfil de un microorganismo
determinado.

b. Facilitar la caracterización de los mecanismos de

resistencia.

c. Ofrecer opciones terapéuticas para la correcta

selección del tratamiento antimicrobiano.

d. Evaluar los cambios en los comportamientos

habituales de sensibilidad.
Tipos de antibiograma
Métodos para realizar Antibiogramas

•Difusión en Agar (Bauer-Kirby)

•Dilución en Agar (Replicador stirrs)

•Dilución en Caldo (Concentración Inhibitoria Mínima CIM)

•Dilución en caldo a 2 concentraciones (Break-point)

•Gradiente de difusión (E-Test)

 Ventajas y Desventajas

Método de difusión en Agar (Kirby-Bauer)

V:
•Simple de realizar y muy reproducible
•Poco oneroso
•No requiere equipo especial
•Provee la clase de resultados que el clínico necesita conocer.
•Es flexible en el uso de los antimicrobianos.

D:
El espectro de organismos que puede retarse.
Genera resultados cualitativos
Selección de medios de
cultivo
 Un buen medio de cultivo
debe estar hecho, para:

 Recuperar los microorganismos

para los que fue diseñado su uso.
 METODOS DE EVALUACION
 Método “casero”:
Siembra de una cepa que crezca y evaluación de su
morfología.
También debe sembrarse (en su caso) una cepa que no
crezca, o que presente diferente característica.

Realizarlo cada ves que se preparen los medios

Método Ecométrico:

Sembrar la placa de la manera siguiente:

1 2
5

3 4
Consiste en hacer crecer la bacteria y después
hacer dilución, de ésta sembrar en la forma ya
señalada, incubar y observar en que parte de
la placa hubo crecimiento (1, 2, 3, 4 ó 5).

El medio más adecuado para la bacteria

permitirá su desarrollo aún en la porción 5

El medio no adecuado o inhibitorio no permitirá

el crecimiento del microbio.
La acción se repite en 6 placas 3
sembradas con cepas que sí deban
desarrollar y las restantes con 3 cepas
que deban ser inhibidas.

El medio ideal sería:

555 000.

Este medio no existe, pero un buen medio

podría ser:
333 000
Este método se debe
emplear cada vez que se
abra un nuevo bote o lote
de medio de cultivo.
 Método de Miles y Misra
Consiste en:
Crecer una cepa en caldo, toda la noche
16 – 24 hs.

Diluir: 10 -6 Dividir una placa del

10 -7 Medio a probar en 6
10 -8

Verter en placa En cada división colocar 20 uL del

Medio no selectivo Cultivo. (Repetir el ensayo en 6 placas)

Incubar Incubar y contar

Contar No. Total

de microbios
 1
6

6 + 3 + 5 + 4 + 2 + 4 = 24  6 = 4
4 multiplicado x 50 = 200
200 multiplicarlo por la dilución
(inverso recíproco) = 200 millones de bacterias.
200 millones se comparan con el # total de
bacterias contadas en el agar NO selectivo.

Ej. No. de colonias crecidas en el agar no

selectivo.

30x107 = 300 millones

Comparar: 300 crecidas en medio no

selectivo y 200 millones crecidas en el
medio selectivo la recuperación es:

x % = 66.6 %
200
300

¿Será bueno el medio?

 Medios de cultivo
 Agar Mueller-Hinton (AMH)
 Agar Mueller-Hinton con sangre (AMHS)
 Agar Gonococo (GC)
 Agar libre de Cistina (CF)
 Caldo Mueller-Hinton.
 Caldo nutritivo.
 Caldo soya triptícasa.
Metodología del
antibiograma
Pasos críticos del Antibiograma

• Medio de cultivo

•Inóculo

•Antimicrobiano

•Ambiente

•Tiempo

•Lectura

•Informe
 Agar Mueller - Hinton

• Lote a lote ha demostrado tener reproducibilidad.

•Tiene bajas concentraciones de inhibidores de sulfonamidas,

trimetoprim y tetraciclinas.

•Mantiene el crecimiento adecuado de bacterias no fastidiosas.

•Ha superado la prueba del tiempo.

pH 7.2 – 7.4
Medio

Composición de Cationes y pH
 El Estándar de Mc Farland

Se prepara con Ac. Sulfúrio y Cloruro de Bario. (1N)

Se estandariza a una absorbancia entre 0.80 a 0.10

Se guarda en tubos con tapón de rosca de 4 a 6 mL.

Estos se guardan en lugar fresco y oscuro.

Antes de usarse, deben agitarse para su homogeinización.

Se descartan mensualmente.
 Cuidados con Discos Antibióticos

•Temperatura de almacenaje.

•Temperatura de uso.

•Dispensador en refrigeración y con humedad controlada.

 Postura de los discos

•Colocar no más de 6 en placas de 100 mm.

•Colocar no mas de 12 en placas de 150 mm.

•La distancia entre discos es al menos 24 mm.

•Procurar no juntar discos de antibióticos bactericidas con

bacteriostáticos.

•Incubar durante los siguientes 15 minutos

Métodos de obtención del
inóculo.
 Suspención directa de la colonia (SD)
 Suspención del crecimiento logarítmico (CL)
Microorganismo Agar Método de Tiempo de Atmósfera de
inoculación incubación (h) incubación
Enterobacteriacea AMH SD/CL 16 - 18 Aerobiosis
Pseudomonas aeruginosa y AMH SD/CL 16 - 18 Aerobiosis
Acinetobacter sp
Otras Pseudomonas sp AMH SD/CL 16 - 18 Aerobiosis
Haemophilus sp HTM SD 16 - 18 CO2
Neisseria gonorrhoeae GC, CF SD 20 - 24 CO2
Neisseria meningitidis AMH SD 18 - 24 CO2
Staphylococcus sp AMH SD 16 - 18 Aerobiosis
Enterococcus sp AMH SD/CL 16 – 18 Aerobiosis
Streptococcus pneumoniae AMHS SD 20 – 24 CO2
Streptococcus sp AMHS SD 20 – 24 CO2
Branhamella catarrhalis AMH SD 16 – 24 Aerobiosis
Otras AMHS SD 16 – 24 Aerobiosis (CO2
si es necesario
E-Test
E-Test
Antibiograma bien hecho
Criterios para la selección de
antibióticos.
Normativa para la puesta en práctica del
estudio de susceptibilidad antimicrobiana;
octavo suplemento informativo. Documento
M100-S8 del NCCLS
Criterios de la NCCLS para el estudio de la
susceptibilidad antimicrobiana de las normas M2-A6
y M7-A4

 La selección de los agentes antimicrobianos más apropiados

para las pruebas y para los informes es una decisión que
deben de tomar en el mejor de los casos cada laboratorio
clínico en consulta con los especialistas en enfermedades
infecciosas, la farmacia y el comité de control de infecciones.
Se recomiendan agentes de eficacia probada y de
funcionamiento in vitro aceptable.

 La lista de drogas juntas en un mismo cuadro designa un

grupo de agentes comparables que no necesitan ser
probados en duplicado porque los resultados interpretativos
son habitualmente similares y su eficacia clínica comparable.
Todos los agentes que se informan deben ser probados, a
menos que el informe sea basado en la prueba de otro
agente que proporcione un resultado más preciso.
Grupos de Prueba
 Grupo A. Son agentes que son considerados apropiados para ser incluídos en las
pruebas e informes de rutina.

 Grupo B. Comprende a agentes que son importantes clinicamente, especialmente en

infecciones intrahospitalarias y ellos podrían ser probados primariamente. Sin
embargo, ellos deben de ser informados en forma selectiva, como cuando un
organismo es resistente a los otros agentes de la misma clase, tal como en el grupo A.

 Grupo C. Comprende agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios que

pueden requerir ser probados en aquellas instituciones que tienen cepas endémicas o
epidémicas resistentes a varias de las drogas primarias, o para el tratamiento de
pacientes alérgicos a las de primera línea, o para el tratamiento de organismos poco
usuales, o para informar al acomíte de control de infecciones como ayuda
epidemiológica.

 Grupo U (“orina”) . Ennumera ciertos agentes que tienen un uso límitado como
tratamiento de infecciones urinarias. Estos agentes no se deben de informar en
patógenos alislados de sitios de infección a las vías urinarias.

 Grupo O (“Otros”). Incluye agentes que tienen un indicación clínica para un

determinado grupo de organismos pero que habitualmente no son candidatos para las
pruebas e informes de rutina en E.U.

 Grupo Inv (“Investigación”). Incluye agentes que se encuentran bajo investigación

para ese grupo de organismos y no han sido aprobados por la FDA.
Recomendaciones del grupo MENSURA
para la selección de antimicrobianos en
el estudio de la sensibilidad y criterios
para la interpretación del antibiograma

Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y

Resistencia a los Antimicrobianos (MENSURA)*
 RESUMEN
En este documento se recogen las recomendaciones del grupo MENSURA
(Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los
Antimicrobianos), auspiciado por la Sociedad Española de Quimioterapia y la
Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, para
la selección de los antimicrobianos en el estudio de la sensibilidad. Asimismo,
se actulizan, en tablas independientes, los puntos críticos de sensibilidad y
resistencia ofrecidos con anterioridad y se comparan con los propuestos por
otros comités, como NCCLS, CA-SFM y BSAC. El criterio de sensibilidad tiende
a identificar la población totalmente sensible que, con elevada probabilidad,
carece de mecanismos específicos de resistencia. Su formulación se sustenta
en el análisis de la distribución de los valores de CMI para las distintas
poblaciones (homogéneas en cuanto a especie). El punto crítico de resistencia
se fundamenta en los datos farmacológicos y clínicos que se obtienen tras la
administración del antimicrobiano con una dosificación convencional. El principal
objetivo del grupo español MENSURA es contribuir al proceso de convergencia
international para la enunciación de los puntos críticos de sensibilidad y
resistencia.
En la practica, cuando se produce la realización de un
antibiograma se seleccionan unos pocos
antimicrobianos como representantes de las diferentes
familias y clases. La información que se obtenga debe
permitir.

A. Conocer y definir el perfil de sensibilidad de un

microorganismo determinado
B. Facilitar la caracterización de los mecanismos de
resistencia
C. Ofrecer opciones terapéuticas para la correcta
selección del tratamiento animicrobiano
D. Evaluar los cambios en los comportamientos
habituales de sensibilidad.
Los grupos establecidos para el estudio de los
antimicrobianos son:
• Grupo 1: antimicrobianos que deben estudiarse e
informarse como norma

• Grupo 2: antimicrobianos que deben estudiarse de

manera habitual pero que no deben informarse
selectivamente

• Grupo 3: antimicrobianos que deben estudiarse en un

segundo nivel dependiendo del tipo de paciente, las
características de la infección. El mecanismo de
resistencia, etc., e informarse selectivamente.

• Grupo 4: antibióticos que deben estudiarse siempre en

los patógenos aislados en orina y muestras
relacionadas.
Elección de antimicrobianos para la realización del antibiograma en microorganismos gram
positivos (hoja 1 de 2)
Esteptococ
Streptococcus
Staphylococ cus ß Enteroco Listeriasp Corinebacte
pneumoniae, estrep.
Antimicrobianos cusspp. hemolítico ccusspp. p. rias
grupo viridans
s
Penicilina 1a 1 1 1
Amipicilina
1 1
Amoxicilina
Oxacilina 1 1b
Amox.-ác. clavulánico
2 2
Amp.-sulbactam
Cefazolina
1 1
Cefalotina

Cefaclor Cefuroxima
2 :
Cefpodoxina

Cefotaxima Ceftriaxona 3 1c,2

Cefepima 3 3
Imipenem
3 2 2 2 2
Meropenem
Estreptomicina 1d
Gentamizina 1 1d 1 1
Amikacina 3

1: estudiar e informar por norma. 2: estudiar por norma e informar selectivamente. 3: estudiar en un segundo nivel e informar
selectivamente. 4: estudiar e informar en patógenos urinarios. aDeterminar la producción de betalactamasas, en particular en
aislamientos con valores de CMI entre 0,03 y 0,12 mg/I. bDisco de 1mg, sólo para S. pneumoniae. CEn infecciones del SNC.
d
Alto grado de resistencia. eEn particular en S.areusresistentes a la meticilina. fExclusivamente con fines de identificación.
Elección de antimicrobianos para la realización del antibiograma en microorganismos gram
positivos (hoja 2 de 2)
Streptococcus Esteptococc
Staphylococ Enterococ Listeri Corinebact
pneumoniae, estrep. us ß
Antimicrobianos cusspp. cusspp. aspp. erias
grupo viridans hemolíticos

Norfloxacino
2 2
Ciprofloxacino Ofloxacino

Levofloxacino Moxifloxacino 3 1 2 3 1

Nitrofurantoína 4 4 4
Cotrimoxazol 1 2 2 1 1
Cloranfenicol 3 2 3 2

Tetraciclina Doxiciclina 3 2 2 3 2 1

Fosfomicina 2 3 3,4 2f
Rifampicina 2 3 3 2 2
Eritromicina Diritromicina
1 1 1 2 1
Claritromicina Azitromicina
Clindamicina 2 2 1 1

Quinupristinadalfopristina 3 3 3

Vancomicina 1 2 2 1 1 1
Teicoplanina 2 1
Mupirocina 3e

1: estudiar e informar por norma. 2: estudiar por norma e informar selectivamente. 3: estudiar en un segundo nivel e informar
selectivamente. 4: estudiar e informar en patógenos urinarios. aDeterminar la producción de betalactamasas, en particular en
aislamientos con valores de CMI entre 0,03 y 0,12 mg/I. bDisco de 1mg, sólo para S. pneumoniae. CEn infecciones del SNC.
d
Alto grado de resistencia. eEn particular en S.areusresistentes a la meticilina. fExclusivamente con fines de identificación.
Elección de antimicrobianos para la realización del antibiograma en microorganismos gram negativos
(Hoja 1 de 2)
Enterobacteria Pseudomonas
Haemphil Maraxella
Antimicrobianos ceae aeruginosa y otros Neisseriaceae
usspp catahhhalis
Vibrionaceae BGNNF
Penicilina 1

Amipicilina Amoxicilina 1 1a 1a

Piperacilina Ticarcilina 2 1b

Amox.-ác. clavulánico
1 1 1 1
Amp.-sulbactam 2b
Pipe.-tazobactam 2 2
Cefazolina 1
Cefaclor 2 2 :
Cefuroxima 2 2 2 1
Cefoxitima 2
Cefotaxima
1 2 2 1
Ceftriaxona
Ceftazidima 2 1
Cefta-ác. clavulánico 3
Cefepima 2 2
Imipenem 2 1 3
Meropenem 2 1 3

*BNNF: bacilos gramnegativos no fermentados

1: estudiar e informar por norma. 2: estudiar por norma e informar selectivamente. 3: estudiar en un segundo nivel e informar
selectivamente. 4: estudiar e informar en patógenos urinarios. aDeterminar la producción de betalactamasas. bExclusivamente
ampicilina-sulbactam o sulbactam en Acinetobacter spp. cSólo para Neisseria gonorrheae. dUtilizar el resultado como predictivo
de resistencia de bajo grado a ñas fluoroquinolas. eEn Stenotrophomas maltophilia y Burkholderia cepacia. fEn Neisseria
Elección de antimicrobianos para la realización del antibiograma en microorganismos gram negativos
(Hoja 2 de 2)
Penicilina 1
Gentamicina 1
Tobramicina 3 1
Amikacina 2 1
Espectinomicina 1c
Claritromicina
2 2
Azitromicina
ácido nalidíxico 2d
2d 2d
ácido pipemídico 4
Norfloxacino 4
Ciprofloxacino
Ofloxacino 1 1 2 2 2
Levofloxacino
Nirtrofurantoína 4
Cotrimoxazol 2,4 1e 2 2
Cloranfenicol 3 2 2 2f
Tetraciclina
3 3 2 2 2
Doxiciclina
Fosfomicina 2,4 2 2 2
Rifampicina 3 3 2
Colistina 3 2
*BNNF: bacilos gramnegativos no fermentados
1: estudiar e informar por norma. 2: estudiar por norma e informar selectivamente. 3: estudiar en un segundo nivel e informar
selectivamente. 4: estudiar e informar en patógenos urinarios. aDeterminar la producción de betalactamasas. bExclusivamente
ampicilina-sulbactam o sulbactam en Acinetobacter spp. cSólo para Neisseria gonorrheae. dUtilizar el resultado como predictivo
de resistencia de bajo grado a ñas fluoroquinolas. eEn Stenotrophomas maltophilia y Burkholderia cepacia. fEn Neisseria
 Elección de antimicrobianos para la realización del antibiograma en Campylobacter spp. y
Helecobacter pylori

Compylobacter spp. Helicobacter pylori spp.

Antimicrobiano
Ampicilina
1 1
Amoxicilina
Amoxicilina ácido
1
clavulánico
Gentamicina 2
Ciprofloxacino
Ofloxacino 1 2
Levofloxacino
Eritromicina 1
Claritromicina 1
Metronidazol 1
Cloranfenicol 2
Tetraciclina 2 1

1: estudiar e informar por norma.

2: estudiar por norma e informar selectivamente.
3: estudiar en un segundo nivel e informar selectivamente
 ¿Cuáles marcas y
presentaciones de antibióticos
son las mejores?
Control de calidad en
antibiogramas.
 Cepas control para un Antibiograma

Cepa ATCC USO

E. COLI 25922 Comprobar halos de

P. AERUGINOSA 27853 inhibición
S. AUREUS 25923

E. FAECALIS 29212 Como control para

E. COLI 35218 inhibidores de beta
lactamasa.
Medios para probar susceptibilidad
de bacterias anaerobias

Método Medio Tiempo

Dilución en Agar A. Brucella 48 h

Sangre

Microdilución C. Cerebro 48
En tubo corazón

E- Test A. Brucella 48
sangre
 Control de calidad de la sensibilidad a los antibióticos
en los sistemas computarizados

Entre las cepas ATCC ( American Type Culture

Collection ) recomendadas están:

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Escherichia coli ATCC 25922 y 35218
( La E coli 35218 como organismo de control para
combinaciones con inhibidor de betalactamasa, como
aquellos que contienen ácido clavulánico, sulbactam o
tazobactam ).
Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Enterococcus faecalis ATCC 29212
CONSIDERACIONES GENERALES:

a) Se debe tener especial cuidado en la preparación del

inóculo. Fallas en su preparación, tienen efecto sobre el
funcionamiento de todo el instrumento.
b) Siempre tener presente que el sistema no puede
examinar todos los grupos relevantes de bacterias.
c) El uso de colonias absolutamente aisladas es clave en
el aprovechamiento de los sistemas computarizados.
d) Algunos de los organismos sugeridos por el fabricante
para control de calidad, podrían no detectar deterioro en el
instrumento o la calidad de los reactivos.
e) Es relevante utilizar métodos alternos de sensibilidad a
los antibióticos en aquellos casos en que la literatura que
acompaña las tarjetas indique que el sistema falla en
detectar resistencia.
f) Se han reportado casos de falsa sensibilidad o resistencia,
particularmente debido al lector del instrumento o a un corto periodo de
incubación durante la prueba de sensibilidad. Un periodo de 3.5 a 6
horas podría no ser adecuado para expresar todos los mecanismos de
resistencia de las bacterias.
Tal es el caso de algunos bacilos Gramnegativos que inducen resistencia
mediada por ß-lactamasa a algunos antimicrobianos enzimáticamente
lábiles a la ß-lactamasa, como ocurre con el Citrobacter freundii,
Enterobacter sp, Serratia sp, Morganella morganii, Providencia sp y Ps.
aeruginosa.
g) Se ha observado una falsa resistencia a Aztreonam, especialmente
por Proteus y Morganella sp por problemas de detección fotométrica del
crecimiento.
h) Se han reportado falsa resistencia a Imipenem para varias especies
en periodos largos y cortos de incubación. Esto no es común y se debe a
la degradación del antibiótico o la concentración de Zinc en el medio.
i) Una baja o moderado nivel de resistencia a la Vancomicina frente a
Enterococcus sp se ha detectado, especialmente del tipo VanB, ya que
podría no ser detectado en periodos cortos de incubación.
j) Se han observado o problemas en la detección de
resistencia a altos niveles de Gentamicina o Estreptomicina
frente a Enterococcus sp en incubaciones largas y cortas.
k) Tener presente colocar las marcas externas en la tarjeta,
antes de meterla a la incubadora/lector.
l) No deje pasar más de 15 minutos después de prepara el
inóculo, para llenar las tarjetas y colocarla en la incubadora.
m) Chequear la solución salina por esterilidad. Para ello
inocule en caldo de cultivo e incube a 35°C por 24 horas.
n) Con cada lote de preparación de inóculo, estandarizar
primero el calorímetro.
o) Haga que el Departamento de Servicio técnico de Vitek
revise periódicamente el lector del aparato para calibrarlo.
p) Lleve un récord de cualquier discrepancia en la
identificación de cepas estándar de control. Igualmente el tipo
de tarjeta, lote, fecha de expiración, etc.
 Conservación de microorganismos
utilizados en control de calidad
 Mantenimiento durante periodos
cortos.
Refrigeración simple
 Mantenimiento durante periodos
largos.
Crioconservación
Liofilización
Medio de conservación Tiempo de conservación
Condiciones

Agar nutritivo 1 a 2 meses almacenar en

refrigeración

Agar Cistina Tripticasa hasta un año almacenar en

refrigeración

Agar Soya tripticasa 2 a 3 meses temperatura

ambiente

Medio con antibioticos No. 2 6 meses

congelación – 20°C

Agar sangre 2 semanas almacenar en

refrigeración

Agar chocolate 15 días almacenar en

refrigaración
 Medio de conservación
fórmula para 1000 mL

 Peptona de caseína 15 g
 Cloruro de sodio 5 g
 Agar bacteriológico 15 g
 Extracto de carne 2 g
 Glicerol 20 mL
pH final 7.1 +/- 0.2
Almacenar en refrigeración
Tiempo de conservación de cepas 6 a 12
meses
 Métodos automatizados
Sistema Panel de
control

MicroScan GN, GP

Pasco BD GN

Sceptor BD GN,
GP

Sensititre GN, GP

Vitek GN, GP
 Informe del
antibiograma.
 Informe Selectivo de
Resultados
Cada laboratorio debe de decidir cuales
de los agentes va a informar de rutina
y cuales podrían informar en forma
selectiva, estos ayudan a mejorar la
relevancia clínica de los informes de
las pruebas y ayuda a minimizar la
selección de cepas nosocomiales
multiresistentes debido al abuso de
agentes de amplio espectro.
 Informe de resultados.
 Susceptible (S). Implica que una infección debida a
una cepa puede ser apropiadamente tratada con la
dosis de agente antimicrobiano recomendadas para
este tipo de infección y para la especie infectante.
 Intermedia (I). Incluye a las cepas que presentan
una CIM de agentes antimicrobianos semejantes a
los niveles que habitualmente se consiguen en
sangre y en tjidos y para los cuales la magnitud de
respuesta puede ser inferior a la de las cepas
susceptibles.
 Resistente (R). Las cepas resistentes no son
inhibidas por las concentraciones sistémicas
habitualmente alcanzables por el agente cuando se
administra en dosis normales.