CONTROL DE CALIDAD INTERNO

ANTIBIOGRAMA PASO A PASO

DOCENTE:
Licda. María de la Paz Rodríguez V.

Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 1

Objetivos del Control de Calidad
interno
Precisión y exactitud en el
procedimiento
Calidad de los reactivos equipos
e instrumentos
Desempeño del personal

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 ¿Qué son las cepas ATCC?
 Son una herramienta para el control de
calidad en los laboratorios de
Bacteriología.
Son microorganismos certificados para el
control de calidad. Sus características
genotípicas y fenotípicas garantizan la identidad
del microorganismo.
  En conclusión, las cepas ATCC tienen diferentes
utilidades, entre las que se destacan:
 Evaluar la calidad de los medios de cultivo usados
en los procedimientos en el laboratorio de
bacteriología.
 Asegurar la calidad de los resultados de ensayos de
laboratorio de bacteriología.
 También son útiles para validar métodos
microbiológicos usados dentro del laboratorio
Cepas Control de Calidad
 ATCC 25922 Escherichia coli
 ATCC 25923 Staphylococcus aureus
 ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa
 ATCC 29212 Enterococcus faecalis
 ATCC 35218 Escherichia coli
 ATCC 49247 Haemophilus influenzae
 ATCC 49766 Haemophilus influenzae
 ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae

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ANTIBIOGRAMA
 CONCEPTO: El antibiograma define la actividad in
vitro de un antibiótico frente a un microorganismo
determinado y refleja su capacidad para inhibir el
crecimiento de una bacteria o población bacteriana.

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 EXISTEN 3 MÉTODOS PARA REALIZAR LA
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
ANTIMICROBIANA (ATB)

1. Método de difusión en agar o M. Kirby Bauer

2. Método Epsilon Test
3. Métodos de dilución (CIM)
ANTIBIOGRAMA
 METODOS DE DIFUSION:

1. METODO DE ANTIBIOGRAMA DISCO PLACA

El fundamento de este método consiste en depositar, en

la superficie de agar de una placa M-H previamente
inoculada con el microorganismo discos de papel
secante impregnados con los diferentes antibióticos.

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 METODO DE EPSILON TEST

FUNDAMENTO:
- El fundamento de este método es una expansión de la técnica
de difusión en disco. (M-H)
- El método de E-TEST ( AB-BIODISK SUECIA) puede
mediante una lectura directa detectar la concentración
inhibitoria mínima (CIM).
- Consiste en una tira de plástico no poroso de 6 cm de largo por
5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de
antimicrobianos equivalente a 15 diluciones.
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MÉTODO DE DILUCIÓN (CIM)

 Fundamento:
 La cuantificación de la actividad in-vitro
de los antimicrobianos se evalúa
habitualmente mediante de algunas de las
variantes de los métodos de difusión
 MÉTODO DE DILUCIÓN (CIM)
Métodos automatizados

La mayoría de estos métodos utilizan sistemas

de microdilución en medio líquido sobre
microplacas con pocillos en "U" e interpretan el
crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos
por medio de un autoanalizador (mediciones por
turbidez o fluorescencia).Midiendo las diversas
concentraciones de antibióticos que contiene
cada palaca para inhibir el crecimiento
bacteriano.
 PRUEBA DE
DIFUSION EN DISCO
M. K-B.
Test de Difusión o Kirby Bauer
 Útil para bacterias de rápido desarrollo
 Puede usarse para bacterias de crecimiento
fastidioso
 Lectura e Interpretación bajo normas de
CLSI=ATCC
 Control de Calidad

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 ¿Cómo realizar la prueba?
 Una vez que se han aislados colonias de un
organismo que ha sido identificado como
patógeno potencial, es necesario proceder de
la siguiente manera para realizar la prueba de
susceptibilidad.
1. Seleccionar la colonia
2. Preparar una suspensión del inoculo
3. Estandarizar la suspensión del inoculo
4. Inocular la placa
5. Colocar discos de antimicrobiano
6. Incubar la placa
7. Medir las zonas de inhibición
8. Interpretar los resultados
¿qué organismos probar?
Síntesis proteica
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• En Sitios Estériles
Dr. Esteban Riera

¿qué organismos probar?

(LCR, liq.• Pleural, Liq. Pericardico, Liq. Ascitico,
En Sitios Estériles
abcesos (LCR,
cerrados, sangre,Liq.
liq. Pleural, liquidos de puncion, …)
Toda bacteria aislada
Pericardico, puede
Liq. tener valor clinico
Ascitico,
abcesos cerrados, sangre,
• En Sitios No-Estériles:
liquidos de puncion, …)
(sec. Vaginal, orina, oido,
Toda bacteria nariz,
aislada heces,
puede
sec. Traqueal, heridas
tener valor abiertas, …)
clinico;
Diferenciar `colonizacion’
• En Sitios No-Estériles:de ‘infeccion’.
(sec. Vaginal, orina, oido, nariz, heces,
’.

Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 17

1-SELECCIONAR COLONIAS

Uno de los pasos más importantes en el

proceso de la prueba es la preparación del
inoculo. Esto involucra la selección de
colonias apropiadas para la prueba, su
suspensión en s.s. y la estandarización de la
suspensión.
2-COMO PREPARAR Y ESTANDARIZAR
LA SUSPENSIÓN DEL INOCULO?
Existen dos métodos para la preparación de inoculo:
suspensión directa de colonias y fase logarítmica
del crecimiento. En ambos métodos, la turbidez de
la suspensión debe ser estandarizada al estándar 0.5
de McFarland. Las suspensiones así ajustadas deben
utilizarse como inoculo dentro de los 10 a 15
minutos siguientes.
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 Suspensión directa de colonias.
M. DIRECTO

Para el método de suspensión directa de

colonias, las colonias no deben sobrepasar
las18-24 horas de aislamiento y no partir de
un medio selectivo. Estandarice el inoculo al
mismo tiempo que prepara la suspensión.
Suspenda las colonias en solución salina o
caldo T. S.
Método de fase logarítmica o Método de
crecimiento previo.

El método de fase logarítmica se usa con la

mayoría de organismos que crecen
rápidamente en medios selectivos. excepto
estafilococos(cocos). Una vez que se han
inoculado las colonias en solución salina,
incube a 35ºC de 2 a 8 horas para lograr un
crecimiento en fase logarítmica.
3-COMO PREPARARSE PARA LA
INOCULACION DE LA PLACA?
Retire el contenedor de discos del congelador o
refrigerador. Permita que los discos se equilibren a la
temperatura ambiente durante una a dos horas para
minimizar la condensación y reducir la posibilidad de
que la humedad afecte la concentración de los
agentes antimicrobianos.
 ¿COMO INOCULAR LA PLACA?
Empezando en la parte superior de la placa MHA inocule la
superficie con el hisopo. Cubra toda la placa frotando de ida y
vuelta de un borde al otro. Rote la placa aproximadamente 60º
y repita el procedimiento de frotado. Rote otra vez la placa 60º
y frote toda la placa por tercera vez. Esto garantizara que el
inoculo sea distribuido homogéneamente y por ultimo por los
bordes.
 5-COMO APLICAR LOS DISCOS DE
ANTIMICROBIANOS?
Coloque los discos con los agentes antimicrobianos
dentro de los 10 a 15 minutos siguientes a la
inoculación de la placa MHA. Luego coloque los
discos de antibióticos con una pinza estéril, dejando
un espacio de 20 a 24 mm entre uno y otro.
Puntos que hay que recordar sobre los
discos de antimicrobianos
 No use discos después de su fecha de
caducidad.
 No almacene discos en un congelador
libre de escarcha
 Use productos aprobados por la FDA
¿Como incubar la placa 35°C?
 Invierta las placas e incúbelas
 Para las bacterias fastidiosas
 6-COMO MEDIR LAS ZONAS DE
INHIBICION-LUZ REFLEJADA
 Examine detenidamente la placa para
verificar que el crecimiento sea uniforme y
confluente de tal modo que puede identificar
zonas sin crecimiento bacteriano.
 Para medir las zonas de inhibición desde la
parte posterior de la placa usando luz
reflejado.
 Sostenga la placa unos pocos centímetros
sobre una superficie de color negro que no
refleje la luz.
Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 29
 ¿COMO INTERPRETAR LOS
RESULTADOS?

1-Sensible: cuando el crecimiento bacteriano es inhibido

in vitro por una cantidad del antibiótico que
correspondería a una dosis habitual en humanos.

Intermedio: cuando el crecimiento bacteriano es

2-

parcialmente inhibido por una concentración del

antibiótico correspondiente a una dosis habitual en
humanos; o cuando para alcanzar un resultado efectivo
se necesitan dosis muy altas con riesgo de toxicidad.

Resistente: cuando el crecimiento bacteriano no es

3-

inhibido por una concentración usual del antibiótico. Se

asocia a un alto porcentaje de fracaso en el tratamiento.
 COMO MEDIR ZONAS DE
INHIBICION INUSUALES
 Doble zona: mida la zona más interna
 Colonias dentro de la zona: esto puede
deberse ya sea a un cultivo mixto, que por
lo general es obvio, o a una subpoblación
resistente de la bacteria analizada.
 ¿QUÉ CONTROLAR
EN EL
ANTIBIOGRAMA?

- Factores que afectan

el halo de inhibición

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 Control de calidad del medio
de cultivo
Apertura de un nuevo frasco:
 Fecha de expiración
 Humedad
 Preparación
 Composición: pH, cationes, timina
Cuando se prepara un nuevo lote de medio:
 V olumen
 Esterilidad
 Crecimiento
 Conservación
 Humedad
Medios
 Agar Mueller Hinton
 Agar MH+5% de sangre de carnero
 Agar HTM
 GC suplementado

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1-Control de calidad en medio Mueller-Hinton.
pH del medio
7,2 – 7,4
pH. ácido:
 Menor actividad de:
Macrólidos, Aminoglucósidos
Quinolonas
 Mayor actividad de:
Penicilina, Tetraciclinas
pH básico: efecto contrario
Control:
ATCC Escherichia coli 25922
frente a: Gentamicina
mayor 24 mm
Tetraciclina
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 2-Concentración de Cationes
Bivalentes
 Ca : 20 – 25 mg/L
 Mg : 10 – 12,5 mg/L
Concentración mayor se afectan:
- Colistin, tetraciclinas,
- Aminoglucósidos
- Exceso de Zn afecta Carbapenemes
Control: P.aeruginosas aeroginosa ATCC 27853
frente a: Gentam = 16 – 21 mm

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 Concentración de Timina M-H
 Escasa o nula
 Mayores concentraciones :
FALSA RESISTENCIA de TMS, Sulfonamidas
 Control : E.nterococcus faecalis ATCC 29212 frente a:
(cotrimoxazol).SXT = Halo mayor a 20 mm
Exceso: Corregir con suero de caballo al 3% que contiene
timidina fosforilasa

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3-Profundidad del Agar
Verificar antes de cada procesamiento 4 mm
Mayor profundidad falsa resistencia
Menor profundidad falsa sensibilidad

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1) MH: espesor del AMH

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Escalimetro o pie de Rey Lectura tapa cerrada

Lectura en milímetros

Lectura tapa abierta

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Profundidad de 4 mm

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Control de Humedad del Medio

 Superficie húmeda
 No contener gotas de condensación
antes de ser utilizado
 Corregir colocar en estufa a 35o C por
lapso de 30 minutos aproximadamente.

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Control de Esterilidad
 Del lote de placas
preparadas separar
aproximadamente
el 2%
 Incubar a 35oC
durante 24 - 48
hrs.
 Presencia de
contaminación
significativa.

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Control de Crecimiento
 Del lote preparado separar
aprox. el 2 cajas
 Sembrar cepa específica
 Control: Cepas ATCC
Agar Mueller Hinton: Ej.?
Agar sangre bases Mueller
Hinton. Ej?
Agar GC suplementado.
Ej?

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Densidad del inóculo
 Preparación a partir de cultivo de 24 hrs. en medio no
selectivo, bien aislado e identificado.
 Estándar de turbidez:
 O,5 MAC FARLAND 0.5%- 1,5 x108 UF/ml
Espectrofotómetro: 0.08 – 0.10
a 625 nm
Mayor densidad falsa
RESISTENCIA
Menor densidad falsa
SENSIBILIDAD

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 Estandarización del Inóculo

PATRON DE TURBIDEZ
O,5 de la ESCALA Mc
FARLAND

1,5 x 108 UFC/ml

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 Preparación de inóculo

Método de crecimiento previo: ¿Cuándo?

Cepas con más de 24 horas
Cepas en medio selectivo :Mac Conkey
 Método de suspensión directa: ¿Cuándo?
Cepas con 18- 24 hrs. de incubación
 Preparar en la solución adecuada: FSL,
Caldo Mueller Hinton, Caldo BHI
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 Características de Crecimiento

 Bacterias de rápido desarrollo

 Bacterias de desarrollo fastidioso

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 Control de discos de
Antimicrobianos
Verificar:
 Fecha de expiración
 Evitar Humedad
 Almacenar a 4 ºC y -20ºC
 Controlar actividad

Cepas ATCC:

Escherichia coli 25922

Staphylococcus aureus 25923
Escherichia coli 35218

Cuando se adquiera un nuevo lote, repetir cada

tres meses
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TIEMPO DE APLICACIÓN DE DISCOS
 Sacar los ATB dos horas antes
 No usar más de 6 discos por placa de
l00mm
 Verificar carga de discos de acuerdo al
microorganismo
APLICAR DENTRO DE LOS 10 a 15 MINUTOS
POSTERIORES A LA INOCULACION
Tiempos mayores dan: FALSA RESISTENCIA

Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 49

 Temperatura de incubación
35 ºC
Temperaturas mayores y menores:
dan halos de inhibición con
FALSA SENSIBILIDAD
SAMR pueden ser detectados a Tº mayores

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Atmósfera de incubación
 Aérea
18-24 hors sin CO2

 5 a 7 % de CO2 solo en:

- Estreptococos
- Haemophilus
- Neisseria

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Tiempo de incubación

Mayoría 16 –18 horas

Casos particulares 24 horas o más:
Staphylococcus aureus MTR
Staphylococcus coagulasa negativos
Enterococcus spp Vanco R

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|

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Interpretación de Resultados

Tres categorías:
- Sensible
- Intermedio
- Resistente
- No - sensible

Documento M 100- S 16

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Interpretacion del antibiograma:
halo vs mec. de resistencia
Lectura del halo T abla CLSI
Interpretacion

Modifica?

FENOTIPO Mecanismos Interpretación por mec de R

de Resistencia

Lectura interpretativa

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Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 56
Fuentes comunes de error
 En el medio de cultivo
 No control de calidad del medio de cultivo
 Cepas control ATCC
 Cepas contaminadas
 Inóculo bacteriano
 Patrón de turbidez
 Antimicrobianos
 Temperatura y atmósfera
 Lectura e interpretación
 Transcripción de resultados
Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 57
MUCHAS GRACIAS!!!

Licda. Maria de la Paz Rodriguez V. 58