[TÍTULO

DO DOCUMENTO]
[Subtítulo do documento]
I – Introdução:

A formação de profissionais que sejam realmente criativos, ao invés de repetitivos, só se

pode lograr sobre uma base sólida nas ciências relacionadas com a especialidade. Esta base
permite compreender, ao invés de memorizar, raciocinar ao invés de aplicar receitas,
continuar aprendendo e progredindo durante toda a sua vida profissional em lugar de
estagnar e vegetar.
Os médicos, biomédicos, farmacêuticos, bioquímicos, etc., formados onde se realiza
investigação fundamental em alto nível em ciências são os verdadeiros profissionais
criativos.
Entre as vantagens num curso com laboratório destacamos a visualização de
conceitos ou fenômenos que são demasiadamente abstratos: o desenvolvimento de
habilidade e técnicas experimentais: a utilização correta de instrumentos, desenvolvimento
correto de técnicas padronizadas, bem como a interpretação de resultados obtidos, o que
sedimenta a base sólida da disciplina no contexto do curso.
O trabalho experimental é um dos alicerces para o ensino e para a compreensão
físico-química dos fenômenos. As experiências descritas nesta apostila procuram dar ao
aluno uma visão dos principais fenômenos relacionados com o aprendizado da hematologia,
incluindo as técnicas básicas e noções gerais sobre segurança no laboratório.

IV – Laboratório:

A fim de tornar o trabalho laboratorial no curso de Hematologia tão proveitoso quanto

possível, sugerimos o seguinte:
a) Leia, com atenção, a atividade que lhe cabe realizar. Tenha bem claro, o objetivo principal da
atividade. Evite executar as atividades, frase por frase, com a mão à apontar as instruções
impressas, e a outra a segurar os instrumentos a utilizar. Esta técnica de “livro de cozinha” é
muito deficiente e imprópria.
b) Registre todos os dados principais (pesagens, leituras, aferições e outros dados de
observações), num caderno, nunca em folhas soltas.
c) No final de cada atividade, poderá ser realizado um relatório ou não.
d) Finalmente, o trabalho no laboratório deverá trazer a você novas perspectivas e dimensões
que ajude à compreender os conceitos tratados em aulas teóricas.
e) FAÇA POPS DE SEUS PROCEDIMENTOS!
1 - Leitura dos instrumentos
Nesta prática, serão feitas medidas de massa e volumes a fim de se verificar a sensibilidade de
cada um dos instrumentos mais comuns de uso no laboratório. Todos os valores deverão ser
apresentados, de maneira correta, ou seja, mostrando a incerteza inerente a cada medida
efetuada.

Modo apropriado de leitura de volumes:

O observador deve posicionar de modo que

seja evitado o erro de paralaxe. Para tal, a leitura
deve ser feita com os olhos no nível do menisco
da solução.

4 – Utilização correta da micropipeta:

A micropipeta é uma ferramenta regulável, aonde ajustamos o volume a ser captado

por ela. Ela apresenta dois estágios, o primeiro e o segundo, além do cilindro
regulador.

1- Para captar o liquido em questão, pressionamos o primeiro estágio, inserimos a

ponteira no líquido e soltamos este estágio.

2- Não pode ter nenhum tipo de bolha dentro da ponteira.

3- Solte o referido líquido apertando o primeiro e o segundo estágio em um único

movimento.

4- A ponteira deve ser, quando solicitado, lavada em no líquido contido no tubo ou

vidraria específica.
CONTAGEM DE LEUCÓCITOS EM CÂMARA DE NEUBAUER

1 – OBJETIVOS

Determinar a contagem total dos leucócitos de uma determinada amostra.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A câmara de neubauer é uma ferramenta utilizada para contagens celulares, o que é feito por
determinada amostragem. A contagem de leucócitos consiste em evidenciá-los na câmara de
contagem. Este procedimento é possível com a solução de turk, responsável por lisar todas as
células anucleadas, deixando assim os leucócitos mais evidentes e com núcleo com coloração
característica.

3 – CÂMARA DE NEUBAUER

Também conhecida como hemocitômetro. É similar a uma lamina, porém com um rebaixamento
no centro, e este rebaixamento é separado por duas valetas. A parte central da câmara contem
o reticulo de contagem. Este reticulo é gravado a laser. O reticulo é formado por 9 quadrados
de 1 mm2 de área, portanto o total é 9 mm2 de superfície. Estes quadrados estão divididos
internamente. A profundidade da câmara é de 0,1mm. O volume total da câmara é de 0,9mm3.
Cada um dos 9 quadrados são subdivididos. Os quadrados externos são subdivididos em 16
pequenos quadrados(A,B,C,D).

O quadrado central é subdividido em 25 pequenos quadrados(E). cada um destes é dividido por

sua vez em 16 quadrados menores.

4 – SOLUÇÃO DILUENTE

Para diluição da amostra para contagem, é utilizado a solução de Turk. Esta solução tem por
função a lise de todas as células anucleadas do sangue, ou seja, todos os eritrócitos serão lisados
restado apenas os leucócitos e com o núcleo evidenciado pela violeta de genciana.

Solução de turk:

-Ácido Acético Glacial 1,5 ml

-Violeta de genciana 1:100 1,0 ml

-Água destilada q.s.p. 100 ml

5 – PROCEDIMENTO

1-Pipetar 0,38 ml (380 uL) de solução diluente de Turk em um tubo de ensaio.

2-pipetar rigorosamente 0,02 ml (20 uL) de sangue com anticoagulante bem

homogeneizado e transferir para o tubo contendo o diluente. Diluição 1:20 / lavar a
ponteira da pipeta varias vezes na solução.

3-Inverter o tubo várias vezes por 2 minutos.

4-preparar a câmara de contagem

5-transferir com o auxilio de uma micropipeta ou pipeta pasteur uma amostra do

liquido para a câmara de contagem.

6-Deixar sedimentar por 3 minutos e contar com objetiva de 40X.

7-Contar os 4 quadrados externos. Células que ficarem em cima da linha da direita e

da linha baixa serão contadas, e células que ficarem a esquerda e na linha alta não
serão contadas.

6 – CÁLCULO DO TOTAL DE LEUCÓCITOS

Aplica a formula

Leucócitos = n.g.v. 4 quadrados/4 mm2 x profundidade x diluição

Leucócitos = n.g.v /mm contado nos 4 quadrados x 10 x20

Leucócitos = contagem nos 4 quadrados x 50

O resultado é expresso em leucócitos por mm3

7 – VALORES DE REFERÊNCIA

Valores de referência:

Homem/Mulher: 4.000 – 10.000/ mm3

CONTAGEM DE PLAQUETAS EM CÂMARA DE NEUBAUER

1 – OBJETIVOS

Determinar a contagem total das plaquetas de uma determinada amostra.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A câmara de neubauer é uma ferramenta utilizada para contagens celulares, o que é feito por
determinada amostragem. A contagem de plaquetas consiste em evidenciá-las na câmara de
contagem. Este procedimento é possível com a solução de oxalato de amônio. Existem outros
métodos com outros diluentes, mas a solução de oxalato é a mais indicada.

3 – SOLUÇÃO DILUENTE

Para diluição da amostra para contagem, é utilizado a solução de OXALATO DE AMÔNIO.

Solução oxalato de amônio:

-Oxalato de amônio 1,0g

-Água destilada 100ml

Guardar em geladeira, filtrar sempre após o uso

4 – PROCEDIMENTO

1-Pipetar 2 ml de solução diluente de Oxalato de amônio em um tubo de ensaio.

2-pipetar rigorosamente 0,02 ml (20 uL) de sangue com anticoagulante bem homogeneizado e
transferir para o tubo contendo o diluente. Diluição 1:100 / lavar a ponteira da pipeta varias
vezes na solução.

3-Inverter o tubo várias vezes por 2 minutos.

4-preparar a câmara de contagem

5-transferir com o auxilio de uma micropipeta ou pipeta pasteur uma amostra do liquido para
a câmara de contagem.

6-Deixar sedimentar por 13 a 15 minutos em câmara úmida, (placa de petri com algodão no
interior úmido com água) contar com objetiva de 40X.

7-Contar o quadrante central. Este é subdividido em 25 quadrados menores, cada qual

subdividido em 16 outros quadrados.
OBS: Este procedimento deve ser realizado com muita cautela, pois qualquer partícula
estranha presente na câmara pode ser confundida com plaquetas, o que levaria a um resultado
errôneo.

As luvas dever ser lavadas antes da montagem da câmara, bem como a câmara e a lamínula
devem ser rigorosamente limpas e o líquido diluente deve ser filtrado antes do uso.

6 – CÁLCULO DO TOTAL DE PLAQUETAS

Plaquetas = n.p.v. 25 quadrados x 10 x 100

Plaquetas= n contado no quadrante central x 1000

7 – VALORES DE REFERÊNCIA

Valores de referência:

Homem/Mulher: 140.000 – 440.000/ mm3

CONTAGEM DE ERITRÓCITOS EM CÂMARA DE NEUBAUER

1 – OBJETIVOS

Determinar a contagem total dos eritrocitos de uma determinada amostra.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A câmara de neubauer é uma ferramenta utilizada para contagens celulares, o que é feito por
determinada amostragem. A contagem de eritrócitos consiste em evidenciá-los na câmara de
contagem. Este procedimento é possível com a solução de gower. Existem outros métodos com
outros diluentes, mas a solução de gower é a mais indicada.

3 – SOLUÇÃO DILUENTE

Solução de Gower / Solução de citrato de sódio 0,106M

Sulfato de sódio anidro 62,5g,

Ácido acético glacial 166,5 ml

Água destilada q.s.p. 1000 ml

4 – PROCEDIMENTO

1-Pipetar 4 ml de solução diluente de gower em um tubo de ensaio.

2-pipetar rigorosamente 0,02 ml de sangue com anticoagulante bem homogeneizado e

transferir para o tubo contendo o diluente. Diluição 1:200 / lavar a ponteira da pipeta varias
vezes na solução.

3-Inverter o tubo várias vezes por 2 minutos.

4-preparar a câmara de contagem

5-transferir com o auxilio de uma micropipeta ou pipeta pasteur uma amostra do liquido para
a câmara de contagem.

6-Deixar sedimentar por 3 minutos e contar com objetiva de 40X.

7-Contar 5 quadrados grandes. Os 4 externos e o central. Células que ficarem em cima da linha
da direita e da linha baixa serão contadas, e células que ficarem a esquerda e na linha alta não
serão contadas.
6 – CÁLCULO DO TOTAL DE ERITRÓCITOS

Aplica a formula

Eritrócitos = n.g.v. / mm2 x profundidade x diluição

Eritrócitos = n.g.v /mm contado nos 5 quadrados x 10.000

7 – VALORES DE REFERÊNCIA

Homem : 5.147.000 + - 360.000 / mm3

Mulher : 4.515.000 + - 415.000 / mm3

DOSAGEM DE HEMOGLOBINA - CIANOHEMOGLOBINA

1 – OBJETIVOS

Determinar a dosagem total de hemoglobina de uma determinada amostra.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Existem dois métodos para dosagem de hemoglobina, ambos combinando moléculas com a
própria hemoglobina. Estes métodos tem por finalidade a lise dos eritrócitos e a combinação da
molécula de hemoglobina com moléculas previamente definidas. Os métodos mais utilizados
são os da cianometahemoglobina e oxihemoglobina. Estes são analisados em
espectrofotômetro e comparados com padrões rigorosamente preparados.

O espectrofotômetro é o aparelho utilizado para esta análise. Determina a absorbância da

amostra em um determinado comprimento de onda, que relacionado com sua concentração
nos fornece um padrão de cálculo.

A solução padrão é fornecida pela indústria, com uma concentração rigorosamente estipulada
e aferida. Esta concentração corresponde à absorbância padrão, determinada pelo
espectrofotômetro. Estes dois parâmetros são utilizados para a confecção do fator de
multiplicação.

A célula é lisada, ficando a hemoglobina livre para ligação com o cianeto. Este complexo formado
tem uma coloração característica, o que perfaz totalmente o critério para analise no
espectrofotômetro.

3 – SOLUÇÃO DILUENTE

Solução de Drabkin – Esta solução é encontrada pronta no comércio, mas podemos

confecciona-la sem problemas, pois é um procedimento simples.

Bicarbonato de sódio 1g

Cianeto de potássio 0,05g

Ferrocianeto de potássio 0,20g

Água destilada 1.000ml

Esta solução deve ser armazenada em frascos escuros, e manuseada com cuidado devido à
toxicidade do cianeto. Nunca pipetar com a boca esta solução, e tampar o frasco logo após o
seu uso.
4 – PROCEDIMENTO

Fator de multiplicação:

O padrão de cianohemiglobina ou cianometahemoglobina vem com uma concentração

conhecida.

O comprimento de onda para esta análise é de 540nm

-Calibrar o espectrofotômetro com água destilada (o padrão é diluído em água

destilada).

-Fazer a leitura da absorbância do padrão.

A concentração do padrão é programada para estar dentro da lei de Lambert-Beer,

não precisando fazer a curva de absorbância do padrão.

Fator = concentração do padrão g/dl

Absorbância do padrão

Amostra:

-Diluir a amostra em sol. Drabkin. 20uL sangue para 5 ml sol. Drabkin

-Calibrar o espectrofotômetro com solução de Drabkin (a amostra é diluída em sol.

Drabkin).

-Medir a absorbância da amostra em 540 nm

Multiplicando pelo fator obtido temos a concentração exata de hemoglobina/dl do

paciente.

6 – CÁLCULO DA DOSAGEM DE HEMOGLOBINA

Hb paciente = Abs paciente x fator

7 – VALORES DE REFERÊNCIA

Homem: 14 – 18 g/dl

Mulher: 11,5 – 16 g/dl

DETERMINAÇÃO DO VG – VOLUME GLOBULAR – hematócrito

1 – OBJETIVOS

Determinar a porcentagem do volume celular por volume de sangue total.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A razão entre o volume dos eritrócitos e o volume total é expressa em % V/V, e corresponde
ao VG – Volume Globular

3 – PROCEDIMENTO

É necessário uma centrifuga de microhematócrito para realização desta prática.

-Encher um tubo capilar com sangue colhido com EDTA.

-Com o bico de Bunsen queimar uma das pontas do capilar até esta ficar totalmente fechada

-Colocar o capilar na microcentrífuga, com a parte fechada para fora.

-Centrifugar a 3000rpm por 30min

-Analisar o capilar por comparação com a tabela

4 – VALORES DE REFERÊNCIA

Homem: 41-51%

`Mulher: 37-47%
ÍNDICES HEMANTIMÉTRICOS

1 – OBJETIVOS

Determinar os índices hemantimétricos de um paciente.

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Os índices hemantimétricos são de suma importância para avaliação de um hemograma. Através

deles, podemos nos situar quanto a forma dos eritrócitos, percentual de hemoglobina, volume
ocupado pelas células entre outros parâmetros.
Estas informações fornecidas pelos índices, são confirmadas na extensão sanguínea, corada com
coloração MGG.

3 – INDICES:

VCM – VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO

É o volume médio ocupado pelos eritrócitos. É calculado dividindo o hematócrito ou VG pelo

numero de eritrócitos presentes neste volume.

VCM = hematócrito x 10

Eritrócitos em milhões

Exemplo: VG: 45%, eritrócitos 5 milhões

VCM = 45 X 10 VCM = 90 u3

O VCM é dado em micra cúbica (u3) ou fentolitros

Os valores de referência estão em fentolitros, ou fl. 80 – 90 fl são os valores normais.

Valores abaixo de 80 correspondem à uma microcitose, ou seja, células menores.

Valores maiores que 90 correspondem à uma macrocitose, ou seja, células maiores.

HCM – HbCM – HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA

É a quantidade de hemoglobina existente dentro de um eritrócito. Calcula-se dividindo a

concentração de hemoglobina em gramas pelo número de eritrócitos em milhões

HCM = hemoglobina X 10

Eritrócitos em milhões

Exemplo: Hb: 16 g/dl; eritrócitos = 5.000.000

HCM = 16 X 10 HCM = 32 pg

O valor é expresso em picogramas ou pg.

Referencial é de 26-34 pg.

Valores abaixo de 26 correspondem à uma hipocromia.

Valores acima de 34 não é hipercromia, pois é um valor absoluto e depende do tamanho da

célula.

ESSE É O ÍNDICE MAIS ADEQUADO PARA SE DETERMINAR UMA HIPOCROMIA!

CHCM – CHbCM – CONCENTRAÇÃO DA HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA

É a relação entre o valor da hemoglobina contida em um determinado volume e o volume

globular. Varia de 33 à 36%

CHCM = hemoglobina X 100

VG

Exemplo: hemoglobina = 16 mg/dl VG=45%

CHCM = 16 X 100 CHCM = 35%

45

Este valor nos diz que 35% da hemácia está representado pela hemoglobina.

O valor de referência é expresso em porcentagem.

Valores abaixo de 32 % refletem em uma hipocromia visualizada em lâmina

Valores acima de 36 cristaliza esta proteína, fazendo com que o eritrócito perca a elasticidade.

O CHCM DIMINUÍDO PRÉ-DIZ UMA HIPOCROMIA VISÍVEL NA LÂMINA!

ESSA APOSTILA É UM FRAGMENTO DO MANUAL DE PRÁTICAS
HEMATOLÓGICAS DA HEMOCLASS, NÃO SENDO PERMITIDA SUA
REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO