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    La Tinción de Gram y Ziehl Neelsen

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    Marjorie Cejas Poblete
    La tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar bacterias ácido-alcohol resistentes como las micobacterias. El método involucra la fijación de una muestra, tinción con fucsina caliente, decoloración con ácido-alcohol y tinción de contraste con azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo mientras que otros organismos se tiñen de azul, permitiendo su identificación al microscopio.

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    La Tinción de Gram y Ziehl Neelsen

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    La tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar bacterias ácido-alcohol resistentes como las micobacterias. El método involucra la fijación de una muestra, tinción con fucsina caliente, decoloración con ácido-alcohol y tinción de contraste con azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo mientras que otros organismos se tiñen de azul, permitiendo su identificación al microscopio.

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    La tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar bacterias ácido-alcohol resistentes como las micobacterias. El método involucra la fijación de una muestra, tinción con fucsina caliente, decoloración con ácido-alcohol y tinción de contraste con azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo mientras que otros organismos se tiñen de azul, permitiendo su identificación al microscopio.

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    La tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar bacterias ácido-alcohol resistentes como las micobacterias. El método involucra la fijación de una muestra, tinción con fucsina caliente, decoloración con ácido-alcohol y tinción de contraste con azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo mientras que otros organismos se tiñen de azul, permitiendo su identificación al microscopio.

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    LA TINCIN DE GRAM

    Es la tincin diferencial ms utilizada en Bacteriologa pues permite separar las bacterias en dos
    grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro
    soluciones:
    1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
    negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta.
    2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los
    mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una
    solucin diluida de yodo.
    3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol acetona (1:1).
    4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como,
    por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referamos
    difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul
    por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram
    negativas perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de
    rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura
    celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa,
    mientras que las bacterias gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan
    una membrana externa que envuelve toda la clula.
    Prcticas de Microbiologa Clnica
    El mtodo de tincin es el siguiente:
    1. Se prepara el frotis, se seca y se fija.
    2. Se cubre con cristal violeta durante un minuto.
    3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
    4. Se traza con lugol un minuto. El lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del
    colorante por la bacteria.
    5. Lavar con agua el exceso de lugol.
    6. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de perder color y se
    lava enseguida con agua abundante.
    7. Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina, durante un minuto.
    8. Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el objetivo de inmersin.
    3) Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio. Las bacterias Gram-positivas
    presentarn una coloracin violeta mientras que las Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La
    identificacin de las bacterias Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las
    bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es
    clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gramnegativas.

    Tincin May-Grnwald/Giemsa
    en frotis sanguneo

    Componentes de la tincin:
    Esta tcnica combina los principios de coloracin desarrollados por May Grunwald y Giemsa,
    usando 2 soluciones colorantes:

    Solucin May Grunwald: Contiene eosina (colorante aninico) y Azul de metileno


    ( colorante catinico), disueltos en metanol.

    Solucin Giemsa: Contiene Eosina, Azul de metileno y productos de oxidacin de este


    segundo compuesto.

    Principio de la tincin
    Los componentes celulares se clasifican por esta tincin en:

    Componentes aninicos ( cidos): Al unirse a los tintes catinicos se tien en tonos azules.
    Son llamados Basfilos. Ej: DNA, RNA, protenas, mitocondrias, ribosomas.

    Componentes catinicos (bsicos): Se unen a Eosina, tiendo en variados tonos rojos y


    naranja. Se les llama acidfilos o eosinfilos. Ej: Hemoglobina.

    Fases de la tincin May Grunwald-Giemsa:


    1 Fijacin: Sumergir los frotis secos por 2 minutos en solucin de May Grunwald.
    2 Lavado y rehidratacin: Dejar por 1 minuto en agua destilada y escurrir el agua.
    3 Tincin con Giemsa: Sumergir por 15 minutos en Giemsa. Luego retirar y escurrir.
    Posteriormente se retiran los frotis montados y se dejan secar para su posterior lectura al
    microscopio ptico con aumento 100X.

    Observacin al microscopio
    Una vez teidos los frotis y observados con objetivo de inmersin con aceite (aumento 100X) al
    microscopio se puede distinguir:

    Ncleos: Azul-prpura

    Citoplasma: Violeta plido-marrn

    Eritrocitos: Rosado

    Grnulos de neutrfilos: Violeta-marrn

    Grnulos de eosinfilos: Naranja

    Grnulos de basfilos: Azul-negro

    Grnulos de linfocitos: Prpura

    Principales cuadros identificables

    Anemia: Concentracin disminuida de eritrocitos en sangre. Debe ser complementado para


    informarse con niveles de Fierro srico y hematocrito para conocer su causa.

    Microcitosis: Disminucin del tamao normal de los eritrocitos, observable en anemia


    ferropnica.

    Hipocroma: Eritrocitos de tonalidad plida, con aumento de la claridad central.

    Leucocitosis: Aumento de leucocitos en sangre, originada principalmente en caso de


    infecciones.

    Identificacin de cuadros malignos en frotis sanguneo


    Si el Tecnlogo identifica en el paciente alguna clula sospechosa, como en el caso de observar
    Blastos en sangre perifrica, y se sospecha de algn tipo de leucemia u otra enfermedad
    hematolgica se informa al clnico para solicitar nuevamente un examen o indagar con otro tipo de
    procedimientos, como mielograma o biopsia medular o linftica segn sea el caso. Estos datos
    deben ser complementados con el estado del paciente y evaluacin gentica.
    Es fundamental informar hallazgos de este tipo con la mayor precisin y rapidez posible
    para atender de forma oportuna al paciente.
    Parsitos identificables en frotis
    Tambin se puede identificar por frotis enfermedades parasitarias como:

    Enfermedad de Chagas

    Malaria

    Toxoplasmosis

    Dengue

    En este caso el Tecnlogo informa inmediatamente al mdico el hallazgo identificado y se


    solicitan exmenes serolgicos para confirmar el cuadro que padece el paciente, para tomar
    medidas rpidamente para iniciar un pronto tratamiento y cuidado en estos casos que pueden ser
    muy graves.

    USO Equipo para coloracin de bacilos cido-alcohol resistentes en muestras


    clnicas y/o a partir de cultivos microbianos.
    FUNDAMENTO La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la
    decoloracin con cidos fuertes despus de ser coloreadas con solucin de
    fucsina caliente, permite reunirlas bajo la denominacin general de bacterias
    cidoresistentes o cido-alcohol resistentes. La cido-alcohol resistencia es
    la capacidad de incorporar ciertos colorantes y retenerlos despus de
    someterlos a la accin de cidos y alcohol y est determinada por la presencia
    en la pared celular de los cidos miclicos que son cidos grasos de cadenas
    ramificadas de alto peso molecular (60 a 70 tomos de carbono). Las
    micobacterias son bacilos cido-alcohol resistentes, cortos, ligeramente curvos.
    El gnero Mycobacterium, incluido en esta clasificacin, comprende especies
    patgenas para el hombre, animales y especies saprfitas. El grado de cidoalcohol resistencia es variable entre las especies de este gnero y est
    relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo
    utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre s. Los bacilos cido-alcohol
    resistentes (BAAR) se observan de color rojo al ser coloreados con los
    colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que otros grmenes y clulas toman
    distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se utiliza como colorante
    de contraste. La coloracin de Ziehl Neelsen consituye una tcnica sencilla
    rpida y econmica, de baja sensibilidad pero es una valiosa herramienta para
    detectar los casos de tuberculosis pulmonar.
    Contenido y composicin Ziehl Neelsen
    Equipo Cdigo B1446182
    Fucsina para Ziehl Neelsen: Carbolfucsina: envase x 100 ml.
    Decolorante para Ziehl Neelsen: solucin de alcohol cido: envase x 100 ml.
    Azul de Metileno para Ziehl Neelsen: envase por 100 ml
    Fijado del extendido:
    Mediante calentamiento suave, flamendolo sobre la llama. Esto se efecta
    pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparacin sobre la
    llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de
    aproximadamente 80 C.
    Coloracin: Colocar un pequeo trozo de papel de filtro un poco ms largo
    que el tama- o del preparado sobre el portaobjeto.
    Importante: el papel de filtro tiene que estar por encima del extendido. Cubrir el extendido con Fucsina para Ziehl Neelsen (carbolfucsina). Flamear por
    debajo del portaobjeto hasta el desprendimiento de vapores blancos (evitar

    que se produzca la ebullicin por exceso de calor). Dejar enfriar 5 minutos y


    repetir el flameado hasta nuevo desprendimiento de vapores blancos. Dejar
    enfriar 5 minutos. Cuando est frio, mediante el uso de pinzas, quitar y
    descartar el papel de filtro. - Lavar con agua corriente. - Cubrir con Decolorante
    para Ziehl Neelsen. Dejar 2 minutos. Realizar sucesivos lavados hasta que no
    se desprenda mas colorante (aproximadamente 2 minutos; pero en el caso de
    preparados ms gruesos, puede requerirse mayor tiempo). - Lavar con agua
    corriente. - Cubrir con Azul de Metileno para Ziehl Neelsen. Dejar 30 segundos.
    - Lavar con agua corriente durante 30 segundos. - Secar el extendido.
    Interpretacin de los resultados Cubrir el extendido con una gota de aceite
    de inmersin y observar al microscopio ptico, con aumento 1000X. Observar
    al microscopio no menos de 100 campos. Los bacilos cido-alcohol
    resistentes (BAAR) aparecen de color rojo sobre un fondo azul claro, mientras
    que otros grmenes o clulas toman distintas tonalidades de azul.

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