MICROBIOLOGIA CLÍNICA UD12.

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UD.12

LOS HONGOS EN EL
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
CLÍNICA

MICOLOGIA Xuse Ferragut Ferris

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ÍNDICE

1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS HONGOS

2. CLASIFICACIÓN DE LAS MICOSIS Y PATOLOGÍA ASOCIADA.
3. TRATAMIENTO DE LAS MICOSIS
4. DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES FÚNGICAS POR EL
LABORATORIO

4.1. Examen macroscópico

4.2. Microscopía

4.3. Cultivo
4.3.1. Temperaturas de incubación
4.3.2. Tiempo de incubación
4.4. Técnicas inmunológicas
4.5. Técnicas moleculares
4.6. Técnicas bioquímicas
4.6.1. Auxonograma
4.6.2. Zimograma

5. DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS EN HONGOS

FILAMENTOSOS Y LEVADURAS

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1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS HONGOS

Los hongos son organismos eucariotas heterótrofos, con pared celular diferente
a plantas y bacterias, núcleo y membrana nuclear. No poseen clorofila y se ven
obligados a vivir saprofita o parasitariamente. Pertenecen al reino Fungi.
Podemos encontrar:
 Hongos unicelulares: formados por una sola célula redonda u
ovalada que se reproducen por gemación o bipartición.
 Hongos pluricelulares: mohos y setas. Compuestos por células
alargadas que crecen en forma de filamentos denominados hifas.
Definiciones importantes:
Hifa: unidad estructural de los hongos en forma de filamento cilíndrico.
Pseudohifa o
pseudomicelio de
Candida albicans en
muestra de esputo

Micelio: cuerpo vegetativo del hongo. Está formado por un conjunto de hifas.
Pseudomicelio o pseudohifa: micelio que forman algunas levaduras que no
presenta tabicaciones o septos verdaderos, sino estrangulamientos.
Conidióforos: estructura donde se forman los conidios.
Conidio: espora formada por división asexual.
Blastospora: célula que se forma por el proceso de gemación
Clamidoconidio: conidio que se forma por transformación de una hifa. Se puede
encontrar en regiones intermedias de las hifas o al final de las mismas. Se
denominan intercalares o terminales, respectivamente.

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La clasificación de los hongos se realiza de acuerdo con sus características

reproductoras:
 reproducción sexual: Intervienen dos células que se fusionan durante el
proceso. Estos hongos se denominan hongos perfectos o teleomorfos.

Si provienen de
Reproducción
un mismo
homotálica
individuo

Si provienen de
Reproducción
dos individuos
heterotálica
diferentes

 reproducción asexual: los que se reproducen de ésta forma se llaman

hongos imperfectos o anamorfos. Durante la reproducción asexual se
forma una célula hija, una gema o una espora cuyo material genético es
igual al de la célula progenitora. Es típica de levaduras.
En ocasiones si la bipartición no es completa se forman pseudohifas o
pseudomicelios.
Hongos dimorfos o dimórficos: algunas especies pueden presentar una fase
levaduriforme y otra en forma filamentosa.
La llegada al organismo de los hongos puede ser por vía aérea, digestiva,
cutánea, endovenosa etc. Por ello afectan al organismo por vía respiratoria
produciendo alergia fúngica, intoxicación alimentaria y parasitación directa del
organismo.

2. CLASIFICACION DE LAS MICOSIS Y PATOLOGÍA ASOCIADA.

Las micosis son las enfermedades producidas por hongos. Sólo son capaces
de producir enfermedad en humanos 50 especies de las 100.000 que existen.
Las micosis se clasifican en:
 Superficiales: únicamente afectan al extracto queratinizado.
 Cutáneo-mucosas: afectan a la piel y a las mucosas sin alcanzar
tejido subcutáneo. Habituales las infecciones provocadas por
cándidas, sobre todo en inmunodeprimidos o tras tratamiento
prolongado con antibióticos.

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 Subcutáneas: generalmente debidas a un traumatismo mediante el

cual se produce la inoculación del hongo.
 Profundas o sistémicas: afectan a algún órgano profundo. Pueden
ser primarias u oportunistas.
o Primarias profundas: endémicas de ciertas zonas.
o Oportunistas: causadas por hongos no patógenos pero que, en
determinadas ocasiones, como en inmunodeprimidos, son
capaces de colonizar tejidos.

Las micosis más frecuentes son levaduras del género Candida (candidiasis) y
Cryptococcus neoformans y hongos filamentosos del género Aspergillus, que
actúan como patógenos oportunistas. Patología que ocasionan:
 La infección de Candida spp. comienza con la colonización de la mucosa
( por ejemplo, mucosa oral, vaginal, etc), pudiendo presentar una infección
localizada o diseminarse al torrente sanguíneo.
 Cryptococcus neoformans es una levadura con cápsula polisacárida que
puede provocar meningitis y neumonía, entre otras.
 Aspergillus spp. Puede producir infecciones en las vías respiratorias, piel,
tubo digestivo, etc.

3. TRATAMIENTO DE LAS MICOSIS

 Antifúngicos para las dermatomicosis: ketoconazol, itraconazol,
fluconazol.
 Candidiasis: nistatina, anfotericina B, itraconazol y fluconazol.

4. DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES FÚNGICAS POR EL

LABORATORIO
La identificación para el diagnóstico de las enfermedades fúngicas se hace
mediante:
 Examen macroscópico
 Microscopía
 Cultivo
 Técnicas inmunológicas
 Técnicas moleculares
 Técnicas bioquímicas

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4.1. Examen macroscópico

Tras el cultivo del hongo los aspectos a tener en cuenta son:
 Textura o aspecto de la superficie de la colonia (lampiña, con
aspecto a gamuza, pulverulenta, granulada, esponjosa,
aterciopelada, algodonosa, cérea, mucosa, etc.)
 Forma y grosor de la colonia (plana, acuminada, convexa,
apilada, abovedada, con estriación radial, etc.).
 Pigmentación de la colonia: pardo, verde, negro, blanco, crema,
amarillo, marrón, rojo, rosa, etc.
 Bordes de la colonia: lisos, rugosos, irregulares, etc.
 Tamaño de la colonia y tasa de crecimiento: menor de 5 cm en
14 días o mayor a 15 cm en 15 días.
4.2. Microscopía
Es una de las herramientas más rápidas para el diagnóstico de la micosis, ya que
en ocasiones permite su detección e incluso su identificación directamente de la
muestra o del tejido. Además, la observación microscópica puede ayudar a la
elección del medio y de las condiciones de cultivo adecuadas. Los aspectos a
tener en cuenta:
 Tipo de hongo: filamentoso o unicelular
 Identificación de estructuras, hifas, pseudomicelios, blastosporas,
levaduras intracelulares, gemación etc.
Tinciones más utilizadas:
 Solución de KOH al 20-30%. Microscopía de campo brillante: Esta
solución contiene además de agua, glicerol, que protege los elementos
fúngicos de la degradación. El KOH degrada las estructuras celulares
eucariotas más rápidamente que las fúngicas, debido a que éstas poseen
pared celular.
 Blanco de calcofluor. Microscopía de fluorescencia: El blanco de
calcoflúor tiene afinidad tiene afinidad por estructuras fúngicas como la
quitina o la celulosa (ausentes en mamíferos). Absorbe luz UV emitiendo
en visible.
 Tinta china: Este método de tinción negativa se utiliza para la detección
de la cápsula de Cryptococcus neoformans en líquido cefalorraquídeo.

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 Azul algodón de Lactofenol (fenol, ácido láctico, glicerina y agua

destilada) El fenol destruye la flora acompañante, el ácido láctico protege
las estructuras fúngicas y el azul de algodón se une a las estructuras
fúngicas permitiendo su visualización.
4.3. Cultivo
En general un medio de cultivo para hongos debe llevar fuente de peptona o
nitrógeno, de hidrato de carbono como glucosa y maltosa, un soporte sólido como
el agar y un pH ligeramente ácido para favorecer el desarrollo.
Los más utilizados son:
 Agar Sabouraud con o sin antibióticos: permite el crecimiento de
gran parte de los hongos relacionados con la patología humana. La
adición de antibióticos evita el crecimiento de microorganismos de la
flora bacteriana.
 Medios cromogénicos para levaduras: permiten la identificación
directa de Candida.
 Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos,
especialmente Aspergillus spp. y Penicillium spp. Es el medio de
referencia para la identificación de Aspergillus spp.
 Agar patata glucosado: permite desarrollo de hongos y levaduras
estimulando la formación de conidios y la producción de pigmentos, lo
que facilita su identificación.
4.3.1. Temperaturas de incubación
La temperatura óptima de crecimiento para hongos productores de micosis
superficiales es 20-30º C y para los productores de micosis profundas es 37º C.
Los hongos dimórficos crecen en forma de levadura cuando se incuban a 37º C
(o in vivo) y formando colonias filamentosas a temperaturas de entre 25ºC y
30ºC. No incubar con la placa invertida para que no caigan los esporangios sobre
la tapa.

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4.3.2. Tiempo de incubación

La incubación es:
 levaduras: 1-3 días (entre 24 y 72 horas)
 hongos filamentosos: 2-20 días antes de informar un resultado negativo.
Es importante mantener una atmósfera húmeda, por lo que se introduce un
recipiente de agua en la estufa de incubación.

4.4. Técnicas inmunológicas para la detección de Antígenos y Anticuerpos:

 Identificación de levaduras: mediante kits de anticuerpos monoclonales
específicos, como “Pastorex candida ®” o “Platelia candida ®”.
 Detección de anticuerpos y antígenos específicos: cuando el estado del
paciente no permita esperar el tiempo para realizar el cultivo para identificar
la levadura, utilizaremos técnicas inmunológicas como inmunofluorescencia,
aglutinación con partículas de látex o ELISA. La muestra será la sangre,
líquido cefalorraquídeo o muestras respiratorias. Entre los más utilizados:
o Anticuerpos anti-manano, anticuerpos anti-micelio y
antígeno manano de Candida spp.
o Antígeno capsular de Cryptococcus neoformans
o Antígeno de galactomanano de Aspergillus

4.5. Técnicas moleculares:

Entre las técnicas más utilizadas tenemos:
 PCR convencional
 PCR en tiempo real
 Secuenciación de ADN
 Técnicas proteómicas como el uso del MALDI-TOF

El análisis de las secuencias de ADN es una de las técnicas más eficientes, ya que
permite distinguir entre diferentes especies de hongos. Entre los fragmentos del
genoma empleados para la identificación se encuentran regiones del ADN
ribosomal, las subunidades de la ARN polimerasa, genes que codifican distintas
proteínas, etc.

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La proteómica es todo el conjunto de proteínas expresadas de un genoma

(proteoma). El proteoma es el conjunto de proteínas de un organismo.
La espectrometría de masas y la electroforesis son las técnicas que utiliza la
proteómica.
La técnica proteómica MALDI-TOF analiza el tiempo de vuelo (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization – Time Of Flight).
Una pequeña porción de una colonia fúngica se deposita directamente sobre una
placa metálica conductora. Ésta se introduce en el espectrómetro de masas y se
bombardea con pulsos de láser UV breves. La interacción de los fotones del láser
con la muestra produce la sublimación e ionización de las proteínas. Éstas son
aceleradas en presencia de un campo eléctrico y magnético a través de un tubo
sometido a vacío hasta que alcanzan un detector. Los iones más pequeños viajan
más rápido que los iones más grandes, por lo tanto, las proteínas son separadas
para crear un espectro de masas que está compuesto por picos masa a carga
(m/z) con intensidades variables. Un espectro es una firma del microorganismo
que se compara automáticamente con una base de datos para la identificación a
nivel de género y especie.
Las colonias obtenidas en agar sabouraud suplementado con gentamicina y
cloranfenicol, muestra mejor calidad de los espectros.

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4.6. Análisis bioquímico

Es complementario al análisis morfológico. Se utilizan para la identificación de
levaduras patógenas. Las principales pruebas de identificación bioquímica son:
 AUXONOGRAMA
 ZIMOGRAMA
4.6.1. Auxonograma
Esta técnica se basa en la capacidad variable de las diferentes especies de
levaduras para la utilización de ciertos azúcares como única fuente de
carbono cuando crecen en aerobiosis. Se emplea un medio de cultivo que
posea todos los requerimientos nutritivos, excepto el que queramos testar. Sobre
este medio colocaremos discos con hidratos de carbono a testar, de manera
similar a la realización de un antibiograma. Las levaduras que crezcan en las
inmediaciones del disco serán aquellas capaces de utilizar el azúcar como única
fuente de carbono. Para identificación de levaduras de relevancia clínica,
generalmente es suficiente con la utilización de los siguientes azúcares: glucosa,
galactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, lactosa y rafinosa.
Para el estudio de la utilización de fuentes de nitrógeno se emplean disco
impregnados de sulfato amónico o nitrato potásico.
La técnica es la siguiente:
-Se prepara una suspensión de levaduras en solución salina ajustada
al patrón Nº 1 de la escala de Mc Farland.

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-Se prepara solución de azúcar al 20% en agua destilada como

glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa etc…Con ésta solución se
impregnan los discos con 2 gotas y se desecan en estufa o vienen
preparados comercialmente.
-Se inocula el medio de cultivo por la técnica de Barry tomando 0´1
ml de inóculo y 25 ml de medio de cultivo fundido a 45-55º C y
poniéndolo en una placa de Petri.
-Se colocan los discos en la placa, se ponen 6 discos en una placa
de 9cm de diámetro y 12 discos en una placa de 15 cm de diámetro.
-Incubar a 37º C durante 24-48 horas.
-Cuando la sustancia contenida en el disco es utilizada se forma una
zona de crecimiento alrededor de la misma.

4.6.2. Zimograma
Cuando los resultados anteriores no sean satisfactorios se pueden realizar
pruebas complementarias basadas en la capacidad de las levaduras para
fermentar los diferentes azúcares. Al igual que en caso del auxonograma, se
utiliza un medio de cultivo que posea un azúcar como única fuente de carbono,
pero en este caso el medio será líquido. En los tubos con medio de cultivo se
coloca una campana de Durham, que permite visualizar fácilmente el CO2
producido durante la fermentación. En aquellos tubos en los que exista presencia
de gas en la campana, se habrá producido fermentación del azúcar en cuestión.
Se utiliza un caldo indicador para la fermentación de levaduras (agua de
peptona, púrpura de bromocresol y solución de carbohidrato al 10%), soluciones
de distintos azúcares al 20% con agua destilada y suspensión de levaduras en
solución salina ajustada al patrón nº 1 de la escala de Mc Farland.
La técnica es la siguiente:
-Preparación de una batería de 6 tubos que contiene cada uno 9 ml
de caldo indicador, añadir 0´5 ml de solución de hidrato de carbono y
colocar una campana de Durham. Esterilizar.
-Inocular añadiendo a cada tubo una gota de la suspensión de
levaduras y homogeneizar por rotación suave.
-Incubar a 30-37º C durante 24-48 horas.

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-La presencia de burbujas en la campana será indicativo de

fermentación.

5. DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS EN

HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS

La determinación de la sensibilidad a antifúngicos sirve para predecir los resultados

del tratamiento mediante la realización de pruebas de sensibilidad in vitro. Tanto
CLSI estadounidense (Clinical and Laboratory Standards Institute), y
EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing) perteneciente
a la Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades
Infecciosas, son comités de referencia que establecen métodos a seguir para
realizar estas pruebas de forma estandarizada y reproducible, asegurando la
calidad de los resultados. Estos métodos son dependientes de especie.
Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos están basadas en las técnicas de
microdilución en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad
in vitro de los antibacterianos. Estas técnicas determinan la CMI (concentración
mínima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibición
respecto a un control de crecimiento. Los estándares incluyen recomendaciones
para la conservación, la preparación y la interpretación de las pruebas, así
como un sistema para controlar la calidad de los resultados.

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