Introduccin 3

1. INTRODUCCIN AL MUNDO DE LAS PROTEASAS

1.1. Concepto de Enzima

Qumicamente las enzimas son protenas que actan como potentes y
eficaces catalizadores. Un catalizador es una sustancia que acelera una reaccin
qumica, hasta hacerla instantnea o casi instantnea al disminuir la energa de
activacin. Actan en pequea cantidad y se recuperan indefinidamente. No
llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables, ni tampoco
modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su
consecucin.

1.2. Caractersticas de la accin enzimtica

La caracterstica ms sobresaliente de las enzimas es su elevada
especificidad, que no permite que se formen subproductos y que se manifiesta
como especificidad de sustrato y especificidad de accin.

Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molcula sobre la que

la enzima ejerce su accin cataltica.

Especificidad de accin. Cada reaccin est catalizada por una

enzima especfica.

La accin enzimtica se caracteriza por la formacin de un complejo que

representa el estado de transicin:

E+S ES E+P
donde E representa la enzima, S el sustrato, ES el complejo transitorio enzima-

sustrato y P los productos de la reaccin.

El sustrato se une a la enzima a travs de numerosas interacciones dbiles

tales como puentes de hidrgeno, uniones electrostticas, hidrofbicas, o de van
der Waals, en un lugar especfico, el centro activo. Este centro es una pequea
 Introduccin 4

porcin de la enzima, constituido por una serie de aminocidos que

interaccionan con el sustrato.

1.3. Clasificacin de las enzimas

En funcin de su accin cataltica especfica las enzimas se clasifican en
grupos o clases. A cada enzima se le asigna un nmero compuesto por cuatro
dgitos, as como un nombre sistemtico, que identifica la reaccin que cataliza.
Este sistema de nomenclatura y clasificacin de las enzimas fue creado en el ao
1961 por la Comisin de Enzimas (Enzyme Comission, EC) de la International
Union of Biochemistlry (IUB). Actualmente el Comit de Nomenclatura de la
IUBMB es el sucesor de la Comisin de Enzimas. El sistema E.C. agrupa a las
enzimas en seis clases:

Clase 1: Oxidorreductasas
Clase 2: Transferasas
Clase 3: Hidrolasas
Clase 4: Liasas
Clase 5: Isomerasas
Clase 6: Ligasas

Clase 1. Las Oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreduccin, es decir,

transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la
reaccin general:

AH2 + B A + BH2

Ared + Box Aox + Bred

 Introduccin 5

Compuesto Reducido A Compuesto Oxidado B

(Agente Reductor) (Agente Oxidante)

A se oxida. Pierde B se reduce. Gana

electrones electrones

Compuesto A Compuesto B
Oxidado Reducido

Sus funciones estn bsicamente relacionadas con las reacciones de

xido reduccin de los organismos. Se encuentran muy comnmente en
reacciones metablicas. Dentro de ellas existen dos subgrupos
principales: Las Deshidrogenasas y las Oxidasas. Ejemplos de estas
enzimas son la succinato deshidrogenasa y la citocromo oxidasa.

Clase 2. A esta clase de enzimas pertenecen las transferasas, que catalizan la

transferencia de un grupo qumico (distinto del hidrgeno) desde un sustrato a
otro, segn la reaccin:

A-B + C A + C-B

Un ejemplo es la glucoquinasa, que cataliza la siguiente reaccin :

glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato

 Introduccin 6

Clase 3. Las hidrolasas catalizan reacciones de hidrlisis. Este grupo de enzimas

permite romper molculas de alto peso molecular, hacindolas reaccionar con
molculas de agua. Con este mtodo pueden romper enlaces peptdicos, steres
o glicosdicos. La mayora de las enzimas gstricas son de este tipo.

A-B + H2O AH + B-OH

Otro ejemplo es la lactasa, que cataliza la reaccin:

lactosa + H2O glucosa + galactosa

Clase 4. A esta clase de enzimas pertenecen las liasas, que catalizan reacciones
de ruptura o soldadura de sustratos. Estas molculas rompen enlaces carbono-
carbono, carbono-oxgeno, carbono-nitrgeno y carbono-azufre.

A-B A+B
Un ejemplo es la acetacetato descarboxilasa, que cataliza la reaccin:

cido acetactico CO2 + acetona

Clase 5. Las isomerasas catalizan la interconversin de ismeros. Realizan

modificaciones en una molcula, cambiando su conformacin molecular, ya sea
como ismero ptico, funcional o de otro tipo.

A B
Son ejemplos de esta clase de enzimas la fosfotriosa isomerasa y la
fosfoglucosa isomerasa, que catalizan las reacciones abajo representadas:

fosfotriosaisomerasa

Dihidroxiacetona-3-P Gliceraldehdo-3-P
 Introduccin 7

Fosfoglucosa isomerasa

Glucosa-6-P Fructosa-6-P

Clase 6. Las ligasas son enzimas que catalizan la unin de dos sustratos con
hidrlisis simultnea de un nucletido trifosfato (ATP, GTP, etc.):

A + B + XTP A-B + XDP + Pi

Un ejemplo de esta clase de enzimas es la piruvato carboxilasa, que cataliza
la reaccin:

piruvato + CO2 + ATP oxaloacetato + ADP + Pi

1.4. Hidrolasas vegetales

En los vegetales las hidrolasas estn involucradas en procesos metablicos
vitales para el crecimiento, desarrollo y mantenimiento de los mismos. Muchas
de estas enzimas, entre ellas proteasas, pectinasas, xilanasas, esterasas,
poligalacturonidasas, celulasas, son de gran inters industrial por la variedad
de procesos en que pueden ser aplicadas.
La mayora de estas enzimas se encuentran presentes en el ltex de muchas
especies. El ltex es una de las caractersticas ms salientes de las familias
Asclepiadaceae, Apocynaceae, Euphorbiaceae y Moraceae (Rajesh et al., 2005).
El ltex es el fluido lechoso contenido en la o las clulas de los tubos
laticferos. Est compuesto por una suspensin/solucin de una mezcla
compleja de diferentes sustancias: enzimas, terpenos, alcaloides, vitaminas,
 Introduccin 8

glcidos, lpidos y aminocidos libres y se han detectado componentes

subcelulares, tales como ncleo, mitocondrias, ribosomas y vacuolas.
La presencia de ltex ha sido reportada en al menos 12000 especies de
plantas pertenecientes a 900 gneros diferentes. Las enzimas detectadas en
ltex, tales como proteasas y quitinasas, sugieren un rol en el mecanismo de
defensa de las plantas contra patgenos, parsitos y herbvoros (Freitas et al.,
2007).
Las pectinasas son enzimas que digieren la pectina, sustancia presente en las
paredes de las clulas vegetales y en la lmina media (pctica) y se emplean en
el procesamiento de alimentos vegetales. La pectina es un polisacrido
constituido principalmente por la unin de muchas molculas de cido
galacturnico parcialmente metoxilado. En los extractos comerciales de
pectinasas usados para la fabricacin de jugos de fruta coexisten tres enzimas:
pectinliasa, poligalacturonasa y pectinmetilesterasa.
Las pectinasas son fundamentalmente utilizadas en la clarificacin de jugos
de frutos y para evitar el sabor amargo de los mismos. Algunos jugos de frutas,
como los de manzana y pera, deben tener aspecto cristalino, lo cual hace
necesario aclararlos, ya que el producto obtenido por prensado es viscoso y
persistentemente turbio. Los jugos de naranja o pomelo, contrariamente a los
anteriores, deben llegar turbios al consumidor por lo que se usan las mismas
enzimas para causar un efecto contrario al aclaramiento (con el tiempo, las
pectinas de alto peso molecular tienden a precipitar, a causa del calcio presente
en el jugo; si se tratan de manera controlada con pectinasas, se reduce su peso
molecular, no precipitan y la turbidez del jugo se estabiliza). Por otra parte, las
pectinasas se aplican en los procesos de fermentacin de t y caf y en la
extraccin de aceites (Kashyap et al., 2001). Asimismo, las pectinesterasas se
usan como espesantes en la industria de las mermeladas (Camperi et al., 1996).
Las quitinasas catalizan la hidrlisis de quitina, un biopolmero de N-acetil-
D-glucosamina. Los patrones de expresin de quitinasas en estudios in vitro
(Meins & Ahl, 1989), de inhibicin del crecimiento fngico por quitinasas
(Schlumbaum et al., 1986) y la mayor resistencia de plantas transgnicas a
 Introduccin 9

hongos patgenos (Broglie et al., 1991) son consistentes con la hiptesis de que
las quitinasas constituyen un importante componente de los sistemas de
defensa de las plantas. Consecuentemente, las quitinasas vegetales son objeto
de intensas investigaciones que podran finalmente conducir a cultivos
resistentes a enfermedades y disminuir el uso de pesticidas ecolgicamente
nocivos.
Probablemente las hidrolasas de mayor inters estn representadas por las
enzimas proteolticas, que representan casi las dos terceras partes de las
enzimas que se comercializan en el mercado mundial (Barrett et al., 2004). Se
estima que en el mundo las industrias que aplican enzimas para sus productos
invierten anualmente cerca de un billn de dlares en su comercializacin, de
las cuales el 75% son enzimas hidrolticas; de este porcentaje, las proteasas
representan el 60% de total de las ventas mundiales (Rao et al., 1998).
La mayora de estas enzimas proviene de fuentes microbianas, pero varias
proteinasas vegetales tales como papana, bromelana y ficina siguen siendo
preferidas en un gran nmero de procesos (Mantell et al., 1986). Sin embargo el
nmero de proteasas vegetales que han sido aisladas y caracterizadas es an
muy bajo (Trejo, 2005).
Tanto proteasas como pectinasas y quitinasas se encuentran formando parte
del ltex de muchas especies de la familia Asclepiadaceae (Freitas et al., 2007).

1.4.1. Enzimas proteolticas

Dentro de la clase 3 correspondiente a las hidrolasas, las enzimas
proteolticas tambin denominadas proteasas, proteinasas o peptidasas integran
la subclase 3.4 y representan alrededor del 2% de todos los productos gnicos
(Barrett et al., 2004). Estas enzimas se caracterizan porque catalizan
especficamente la hidrlisis del enlace peptdico. Se han utilizado desde
tiempos muy antigos en un gran nmero de procesos biotecnolgicos. Entre
los ms conocidos pueden citarse: la tiernizacin de carnes, la elaboracin de
cerveza, la panificacin, la elaboracin de quesos y la obtencin de protenas
modificadas en la industria alimentaria. Tambin se utilizan como aditivos en
 Introduccin 10

polvos detergentes, en el tratamiento de efluentes industriales, en el proceso de

manufactura de cueros, en la industria textil y ms recientemente en la sntesis
de pptidos en medios no convencionales (Uhlig, 1998, Guzmn et al., 2007). Es
as que debido a sus variadas aplicaciones, el inters de los investigadores por
las enzimas proteolticas de diverso origen se ha mantenido a lo largo de los
aos.
Se ha demostrado tambin que las peptidasas participan en procesos que
conducen al desarrollo de enfermedades de fuerte impacto social. Por tal
motivo tambin se ha despertado el inters por obtener o disear inhibidores
que puedan actuar como agentes teraputicos teniendo como "blanco" a las
proteasas. Entre las principales enfermedades en las que aparecen
involucradas las enzimas proteolticas pueden mencionarse el cncer
(Coussens et al., 2002), el SIDA (Baltimore et al., 1998; Bartlett & Moore, 1998),
el asma (Katz et al., 1998; Rice et al., 1998, Agusti et al., 1998; Mulligan et al.,
2000), la malaria (Rosenthal et al., 1998; Dahlgren et al., 2003) y el mal de
Alzheimer (Maccioni et al., 2001; Roberts, 2002).
Las proteasas cistenicas tipo papana han sido identificadas como claves
en patologas relacionadas con desrdenes degenerativos, invasivos y del
sistema inmune (Lecaille et al., 2002; Brmme & Kaleta, 2002). La catepsina K
tiene como principal accin la degradacin del hueso en los osteoclastos y su
inhibicin selectiva puede ser beneficiosa en el tratamiento de la osteoporosis
y en ciertas formas de artritis (Gowen et al., 2000; Yamashita & Dodds, 2000;
Hou et al., 2002). Se ha demostrado que la catepsina S desempea un rol
fundamental en la presentacin de antgenos clase II del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC); la inhibicin de la catepsina S disminuye
significativamente la respuesta a antgenos, hecho que convierte a esta enzima
en un nuevo blanco para drogas contra el asma y ciertas enfermedades
autoinmunes (Cimerman et al., 2001; Riese et al., 1998). Las catepsinas han sido
tambin implicadas en la invasin tumoral y en las metstasis (Levicar et al.,
2002). Recientemente se ha desarrollado un creciente inters en el rol que
juegan las proteasas cistenicas en un amplio rango de enfermedades
 Introduccin 11

parasitarias como la malaria, la enfermedad de Chagas y la esquistosomiasis

(Lecaille et al., 2002; McKerrow, 1999). Las proteasas cistenicas tipo papana
cumplen en los organismos parsitos roles indispensables en el crecimiento,
diferenciacin celular, sealizacin e invasin al husped y actan
frecuentemente como factor de virulencia, atacando al sistema inmune del
husped (Sajid & McKerrow, 2002).
Si bien las proteasas que participan en cada una de las enfermedades
mencionadas son especficas, el hecho de que muchas de ellas compartan un
mismo mecanismo cataltico facilita el diseo de molculas que puedan
interferir en su actividad y convertirse, en consecuencia, en potenciales
frmacos para el tratamiento teraputico de aqullas. Ello no significa
necesariamente que el mismo frmaco resulte de aplicacin en enfermedades de
distinta etiologa, pero es obvio que en la medida en que se incremente el
conocimiento de la estructura y de las caractersticas catalticas de nuevas
proteasas se dispondr de nueva informacin bsica que redundar en la
conformacin de una base de datos multipropsito en constante crecimiento.
Seguramente es aqu donde debe buscarse la razn del renovado inters que se
advierte en muchos grupos de investigacin por el estudio de proteasas y de
inhibidores de distinto origen.

1.4.1.1. Clasificacin y Nomenclatura de las enzimas proteolticas

El primer trmino con el que se denomin a las enzimas proteolticas fue el
de proteasas y surgi a finales del siglo XIX como un trmino general que
abarcaba a todas las hidrolasas que actan sobre los enlaces peptdicos. Ms
adelante un grupo de investigadores alemn sugiri el trmino proteinasas para
denominar a aquellas proteasas que tienen como sustrato a las protenas y
peptidasas a aquellas enzimas que tienen como sustrato a los pptidos de menor
peso molecular. Sin embargo, tambin fue utilizado el trmino peptidasa en un
sentido ms amplio, abarcando a todas las hidrolasas del enlace peptdico
(Barrett, 2004). Dado que el uso del trmino peptidasa ha generado confusin, el
Comit de Nomenclatura de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica
 Introduccin 12

y Biologa Molecular (NC-IUBMB) en el ao 1984 ha recomendado el uso de

este trmino en un sentido general para todas las hidrolasas que actan sobre
los enlaces peptdicos. Segn esta nomenclatura, las peptidasas pertenecen a la
clase de las hidrolasas (EC 3) y, dentro de esta clase, a la subclase EC 3.4, que
contiene las enzimas que catalizan la hidrlisis de la unin peptdica.

Segn la ubicacin de los enlaces hidrolizados, las peptidasas a su vez se

dividen en dos grandes grupos: las endopeptidasas que rompen uniones
peptdicas en distintos puntos del interior de la protena y las exopeptidasas
que remueven uno o ms aminocidos desde los extremos carboxilo o amino.

Las endopeptidasas difieren de casi todas las dems enzimas en que su

especificidad de sustrato resulta extremadamente difcil de definir, hecho que
llev a Hartley (1960) a proponer una clasificacin de las mismas basada en las
caractersticas de sus respectivos mecanismos catalticos, constituyendo en la
actualidad siete-subgrupos en la clasificacin internacional: endopeptidasas
sernicas, endopeptidasas cistenicas, endopeptidasas asprticas, metalo-
endopeptidasas, endopeptidasas treonnicas, endopeptidasas glutmicas y
endopeptidasas de mecanismo cataltico desconocido. Cada una de las sub-
subclases de endopeptidasas mencionadas posee un mecanismo cataltico
distintivo, pero an as pueden agruparse en dos grandes categoras: las que
forman complejos covalentes entre la enzima y el sustrato (sernicas, cistenicas
y treonnicas) y las que no forman complejos enzima-sustrato covalentes
(asprticas, glutmicas y metalopeptidasas).

Schechter & Berger (1967) han propuesto un modelo conceptual para

referirse a la especificidad de una peptidasa. En este modelo se consideran los
residuos de aminocido del sustrato (P) que se unen a subsitios del sitio activo
de la enzima (S). Estos residuos se numeran a partir del enlace a ser clivado
hacia el N-terminal como P1, P2, P3, etc., en tanto que los que se encuentran
hacia el C-terminal se denominan P1', P2', P3', etc. Los subsitios de la proteasa
que acomodan los residuos del sustrato se numeran como S1, S2, S3 y S1', S2',
 Introduccin 13

S3', respectivamente, (Figura 1). El esquema presentado est obtenido de Turk &
Guncar, 2003.
Unin peptdica
susceptible al corte

S3 S2 S1 S1 S2 S3

P3 P2 P1 P1 P2 P3

Figura 1. Interaccin enzima-sustrato. Esquema representativo del

sistema de nomenclatura de Schechter y Berger para los
subsitios del sitio activo de una peptidasa.

A la informacin sobre el Comit de Nomenclatura de la Unin

Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular (NC-IUBMB) se puede
acceder en el sitio http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.
A medida que un rea de investigacin crece se hace necesario un sistema
de nomenclatura y clasificacin para facilitar el manejo de toda la informacin y
que adems permita la comunicacin entre las personas y el almacenamiento y
bsqueda de dicha informacin sin ambigedades. En este sentido los sistemas
EC y MEROPS, con diferentes criterios, ordenan, clasifican y renen la
informacin acerca de las peptidasas.
El sistema EC tiene la desventaja de no tener en cuenta la existencia de
grupos estructurales que reflejen las relaciones evolutivas de las peptidasas
miembro de cada clase; por esta causa en 1993 Rawlings & Barrett comenzaron
el diseo de un sistema de clasificin de peptidasas que salva esa deficiencia y
agrupa a las peptidasas teniendo en cuenta esta caracterstica fundamental. El
sistema se sigue perfeccionando durante algunos aos hasta que en 1996
comienza a publicarse en en la web como base de datos de proteasas MEROPS
(Rawlings et al., 2006, http://merops.sanger.ac.uk/index.htm) donde se encuentran
ms de dos mil peptidasas con nmero de identificacin y cerca de 2500
 Introduccin 14

secuencias. Este sistema de clasificacin tiene en cuenta los conceptos de tipo

cataltico, clan, familia y peptidasa (Tabla 1).

Nivel Descripcin

Conjunto de familias en las que todas las peptidasas

han evolucionado a partir de un nico ancestro. Las
Clan familias en el mismo clan tienen en comn que las
peptidasas que las integran exhiben tipos de
plegamiento similares

Una familia incluye peptidasas que presentan

Familia homologa en la secuencia aminoacdica de la regin
encargada de la actividad enzimtica

Una peptidasa es un grupo de protenas que

Peptidasa muestran una actividad proteoltica particular y que
estn muy estrechamente relacionadas en secuencia

Tabla 1. Sistema MEROPS de clasificacin de peptidasas.

El concepto de tipo cataltico de una peptidasa depende de la naturaleza

qumica de los grupos responsables de la catlisis (Barrett et al., 2004).

En los clanes y familias se agrupan peptidasas homlogas. Un clan contiene

una o ms familias de peptidasas que muestran tener un origen comn, es decir
que estn relacionadas evolutivamente. La evidencia ms clara de homologa en
el nivel de clan est dada por la similitud en la estructura terciaria. En las
familias, las peptidasas estn agrupadas en base a la homologa de su secuencia
aminoacdica, particularmente en la zona de la molcula responsable de la
actividad enzimtica (Barrett et al., 2004).

La mayora de los clanes estn formados por peptidasas de un solo tipo

cataltico, tal el caso del clan CA, formado por varias familias de peptidasas
cistenicas. La primer peptidasa reconocida como de tipo cistenico fue papana,
 Introduccin 15

prototipo de la familia C1 y del clan CA. Casi todas las peptidasas cistenicas de
origen vegetal pertenecen a la familia C1.

1.4.1.2. Mecanismos catalticos de las endopeptidasas

1.4.1.2.1. Peptidasas sernicas y treonnicas
Esta clase de peptidasas comprende dos familias distintas: la familia de la
quimotripsina que incluye enzimas de mamferos (quimotripsina, tripsina,
elastasa), plantas y microorganismos y la familia de la subtilisina, que si bien en
un principio se crey constituida solamente por enzimas bacterianas (ejemplo:
subtilisina), actualmente se han encontrado representantes en otros
microorganismos, en plantas y en animales superiores. Si bien la estructura
general tridimensional es diferente en las dos familias, ambas tienen la misma
geometra de sitio activo y en consecuencia catalizan las reacciones con el
mismo mecanismo. Las proteinasas sernicas exhiben diferentes especificidades
de sustrato, relacionadas con las sustituciones de aminocidos en varios
subsitios enzimticos que interactan con los residuos de los sustratos. Algunas
enzimas tienen un amplio sitio de interaccin con el sustrato, mientras que otras
tienen una especificidad restringida al residuo P1 del sustrato.
La actividad de las mismas suele ser mxima a valores de pH alcalinos y no
requieren activadores, aunque los iones calcio intervienen en la activacin de
algunas proenzimas y estabilizaran a algunas enzimas.

Si bien estas enzimas son las ms estudiadas en el campo de las proteasas,

son relativamente pocas las que se conocen dentro de los vegetales. Entre ellas
pueden citarse cucumisina, aislada de Cucumis melo L. var. Prince (Kaneda &
Tominaga, 1975; Kaneda et al., 1995; Uchikoba et. al., 1995); macluralisina
obtenida de Maclura pomifera (Raf.) Schneid. (Rudenskaya et al., 1995);
taraxalisina extrada de Taraxacum officinale Webb s.l. (Rudenskaya et al., 1998),
cryptolepana purificada y caracterizada a partir de Cryptolepis Buchanan (Pande et
al., 2006), carnena de Ipomoea carnea (Patel et al., 2007) y wrightiana, una proteasa
estable aislada del ltex de Wrightia tinctoria (Tomar et al, 2008). Tambin fueron
estudiadas las enzimas obtenidas a partir de Benincasa cerifera (Kaneda &
 Introduccin 16

Tominaga, 1977), de Trichosantes cucumeroides Maxim. (Kaneda et al., 1986),

Trichosantes bracteata (Lam.) Voigt (Kaneda & Uchikoba, 1994), de Cucurbita
ficifolia (Curotto et al., 1989), de Synadenium grantii Hook, f. (Menon et al, 2002),
de Euphorbia supina (Arima et al, 2000) y Euphorbia milii (Yadav et al., 2006), de
Melothria japonica (thumb) Maxim (Uchikoba et al, 2001) y de Cucumis trigonus
Roxburghi (Asif-Ullah, et al. 2006), entre otras.

1.4.1.2.2. Peptidasas cistenicas

Esta clase incluye las proteasas vegetales ms extensamente estudiadas ,tales
como papana, ficina, actinidina o bromelana, varias catepsinas de mamferos,
calpanas citoslicas y algunas proteasas de parsitos como las de Trypanosoma.
La mayora de las peptidasas de esta clase estn incluidas dentro de la familia
de la papana, que es la enzima cistenica ms ampliamente estudiada,
responsable de los principales avances no solamente en el campo de las
proteinasas cistenicas sino en la enzimologa en general. Ha sido la primera
proteinasa cistenica a la que se le determin la estructura tridimensional
(Drenth et al., 1968), por lo que es considerada como el arquetipo de esta clase
de peptidasas.
Actualmente se sabe que estas peptidasas se sintetizan en los polisomas del
citoplasma como un precursor o propptido N-terminal de corta longitud y otro
C-terminal ms largo. Esta proenzima inactiva se dirige al lumen del retculo
endoplasmtico y luego es transportada a las vacuolas o a la pared celular que
constituyen su destino final. La mayora de las protenas solubles de las plantas
poseen una secuencia seal a nivel del C-terminal reconocida por un receptor
del aparato de Golgi (Okamoto et al, 2003) y luego transportada por la red trans
Golgi. Sin embargo, ciertas peptidasas de la familia de la papana tienen una
secuencia seal de retencin al retculo endoplasmtico y as, son transportadas
en grandes vesculas que emergen del retculo y se fusionan directamente con
las vacuolas almacenadoras de protenas, sin pasar por el Aparato de Golgi,
(Okamoto et al, 2003). Finalmente, cuando se remueven las secuencias C y N-
terminales del propptido en estas vacuolas adoptan la conformacin nativa
 Introduccin 17

que es la estructura qumica con capacidad de cumplir su funcin biolgica

(Grudkowska & Zagdaska, 2004).

Al igual que en las proteasas sernicas, la catlisis ocurre a travs de la

formacin de un intermediario covalente e involucra un residuo cistena y un
residuo histidina. La Cistena 25 y la Histidina 159 (de acuerdo a la numeracin
de papana) juegan el mismo rol de la Serina 195 y de la Histidina 57,
respectivamente. El nuclefilo en este caso no es un grupo OH, sino un ion
tiolato que es estabilizado a travs de la formacin de un par inico con el
grupo vecino imidazol de la Histidina 159. Siendo el nuclefilo atacante el par
inico tiolato-imidazol en ambas etapas, no se requiere una molcula de agua.
La cistena cataltica est involucrada en un equilibrio tautomrico entre las
formas neutras y dipolar (zwitterion). Se cree que el sulfuro aninico est
involucrado directamente en un ataque nucleoflico en el carboxilo del sustrato.
La ruptura del mismo implica el ataque del agua catalizado por la enzima.

Dado que estas enzimas son inactivadas por reactivos bloqueantes de los
grupos sulfhidrilo por conversin en puentes disulfuro y tienen la capacidad de
reactivarse en presencia de agentes reductores, se las denomin
tiolproteinasas (Hartley, 1960). Considerando que el nico aminocido que
posee un grupo sulfhidrilo (tiol) en la cadena lateral es la cistena, se sugiri
sustituir el trmino tiolproteinasas por el de proteinasas cistenicas (NC-
IUBMB, 1984) (Figura 2, esquema tomado de http://delphi.phys.univ-
tours.fr/Prolysis/index.html).

Como ejemplos de peptidasas cistenicas vegetales se pueden citar a las

aisladas de Carica papaya (Azarkan et al., 2003, Azarkan et al., 2006), de Araujia
hortorum (Priolo et al., 2000; Obregn et al., 2001), de Araujia angustifolia
(Obregn et al., 2006), de Melia azedarach (Uchickoba et al., 1999), de Calotropis
gigantea (Rajesh et al, 2005), de Bromelia hieronymi Mez (Bruno et al, 2003, Bruno
et al., 2006, Bruno, 2007), de Bromelia balansae Mez (Pardo et al., 2001), de
Bromelia pinguin (Abreu Payrol et al., 2005, Abreu Payrol et al., 2007), de Bromelia
fastuosa (Cabral, 2006), de Funastrum clausum (Morcelle del Valle et al., 2004a;
 Introduccin 18

Morcelle del Valle, 2004 b), de Asclepias curassavica (Liggieri, et al. 2004, Liggieri,
2005), de Phillibertia gilliesi (Sequeiros et al., 2005; Sequeiros, 2006), de Carica
candamarcensis (Pereira, et al., 2001), de Calotropis procera (Freitas et al., 2007) y
Vasconcellea spp. (Kyndt et al., 2007) entre otras.

Acilacin Deacilacin
Sustrato

N-ter pptido
liberado

Imidazol

Imidazol

Estado de transicin

C-ter pptido
liberado

Imidazol

Figura 2. Mecanismo cataltico de las proteinasas cistenicas.

 Introduccin 19

1.4.1.2.3. Peptidasas asprticas

La mayora de las proteinasas asprticas estudiadas pertenecen a la familia
de la pepsina. Esta familia incluye enzimas digestivas tales como pepsina y
quimopepsina, catepsina D y algunas proteasas fngicas. Una segunda familia
incluye protenas virales tales como la proteasa del virus del SIDA, llamada
retropepsina.
Estudios cristalogrficos permitieron mostrar que estas enzimas son
molculas constituidas por dos lbulos homlogos, con el sitio activo localizado
entre ambos. Cada lbulo contribuye con un residuo asprtico de la dada
activa de aspartatos. Estos dos residuos asprticos estn geomtricamente muy
prximos en la molcula activa y uno slo de ambos aspartatos es ionizado en
el rango de pH ptimo (2-3). Por actuar en forma ptima a bajos valores de pH
estas proteinasas tambin fueron denominadas proteinasas cidas por
Hartley (1960).
Las proteasas asprticas vegetales conocidas han sido aisladas y
caracterizadas a partir de hojas, flores y semillas de diferentes especies. Entre
ellas podemos mencionar phytepsina aislada a partir de especies de Arabidopsis,
Brassica, Centaurea, Cynara, Hordeum, Lycopersicum, Orysa y Vigna, (Kervinen,
1998, A. Kulkarni & M. Rao, 2007) adems de cyprosina obtenida a partir de
Centaurea calcitrapa y de Cynara cardunculus (Cordeiro et al., 1998) y cardosina A
(Pires, 1998a) y cardosina B (Pires, 1998b) aisladas de Cynara cardunculus.
Recientemente se aisl otra proteasa asprtica de la especie Silybum marianum
(L.) Gaertn. (Vairo Cavalli, 2005). Por otra parte, recientemente se ha
caracterizado una proteasa asprtica de Arabidopsis implicada en procesos de
defensa (Simes et al., 2007).
Estas enzimas pueden ser monomricas o heterodimricas, conteniendo dos
pptidos procesados a partir del mismo precursor proteico. Las proteinasas
asprticas de los vegetales son generalmente secretadas o bien destinadas al
compartimento vacuolar. La secuencia primaria de algunas de estas enzimas ha
sido determinada y presentan un alto grado de identidad con las de origen
animal y microbiano; sin embargo, las proteinasas asprticas vegetales tienen
 Introduccin 20

una regin muy especfica que no se encuentra en animales, microorganismos o

proteinasas virales. Si bien la funcin de esta regin no ha sido an elucidada se
ha propuesto una funcin en el procesamiento o degradacin de protenas,
aunque se requeriran ms estudios para confirmar su funcin in vivo.
Resultados ms recientes sugieren posibles roles en la muerte celular
programada de los tejidos y en la resistencia a los patgenos (Mutlu & Gal,
1999).

1.4.1.2.4. Metalopeptidasas
Las metaloproteinasas se encuentran entre las hidrolasas en las cuales el
ataque nucleoflico sobre el enlace peptdico es mediado por una molcula de
agua. Esta es una caracterstica compartida con las proteasas asprticas, pero en
las metaloproteasas un catin metlico divalente, usualmente cinc, aunque
algunas veces cobalto, nquel o manganeso, activan la molcula de agua. El in
metlico es generalmente sostenido por tres aminocidos ligandos.
Estas proteinasas se dividen en dos grandes grupos dependiendo del
nmero de iones metlicos requeridos para la catlisis. En varias
metaloproteasas se requiere solamente un in cinc, pero en algunas son dos los
iones metlicos que actan cocatalticamente. Todas aquellas en las que son
esenciales cobalto o manganeso, se requieren dos iones metlicos, aunque hay
familias dependientes de cinc en las que tambin dos iones son cocatalticos. En
las proteinasas con iones metlicos cocatalticos, solamente cinco residuos
aminoacdicos actan como ligandos, siendo uno de ellos el que liga a ambos
iones. Todas las metaloproteinasas con iones metlicos cocatalticos son
exopeptidasas, mientras que las metaloproteinasas con un ion metlico
cataltico pueden ser exo- o endopeptidasas. Los ligandos conocidos son
Histidina, Glutamina, Asprtico o Lisina.
Estas enzimas difieren ampliamente en sus secuencias y en sus estructuras
pero la gran mayora contiene un tomo de cinc catalticamente activo. En
algunos casos, el cinc puede ser reemplazado por otro metal como cobalto o
nquel sin prdida de la actividad. La termolisina bacteriana ha sido bien
 Introduccin 21

caracterizada y su estructura cristalogrfica indica que el zinc est unido por

dos histidinas y un cido glutmico.
Varias enzimas contienen la secuencia HEXXH, la cual provee dos ligandos
histidinas para el cinc mientras el tercer ligando es tanto cido glutmico
(termolisina, neprilisina, alanilaminopeptidasas) o una histidina (astacina).
Otras familias exhiben un modo diferente de unin al tomo de cinc. Las
metalopeptidasas constituyen el grupo de enzimas proteolticas menos
estudiado en los vegetales. Existen solamente unas pocas referencias sobre la
presencia de esta clase enzimas en semillas de Cucurbita pepo (Hara &
Matsubara, 1980), de soja: Glicine max (Bond & Bowles, 1983), de Canavalia
ensiformis (Dalkin et al., 1983) y de Fagopyrum esculentum (Belozersky et al. 1990).
Recientemente se han aislado de Arabidopsis thaliana (Chabregas, 2003).

1.4.1.2.5. Peptidasas glutmicas

Las proteasas glutmicas en un principio fueron denominadas
carboxilpeptidasas insensibles a la pepstatina". Son similares a las asprticas,
de origen fngico y pertenecen a la denominada familia G1. La importancia de
los residuos glutmico 136 ("E") y glutamina 53 ("Q") en el sitio activo de estas
proteasas llev a proponer el trmino "familia EQolisina para referirse a las
mismas. El mecanismo sugerido es un ataque nucleoflico por una molcula de
agua activada por la cadena lateral del glutmico 136 formando el intermediario
tetradrico con el tomo de C del enlace peptco que se escinde. La asistencia
electroflica y la estabilizacin del oxianin son provistas por la amida de la
Glutamina 153. (Fujinaga et al., 2004).

1.4.1.2.6. Peptidasas de mecanismo cataltico desconocido

Existe un nmero de peptidasas para las cuales el mecanismo cataltico no se
ha elucidado. Aquellas sobre las cuales se conoce la secuencia de aminocidos
se han denominado con la letra U (unclassified) sin considerar el
mecanismo cataltico y se les asigna adems un nmero arbitrario, por ejemplo
 Introduccin 22

Familia U28 que contiene dipeptidasa E de Escherichia coli. Las bases de datos
muestran 20 familias de peptidasas no clasificadas (Barrett, et al., 2004).

1.5. Proteasas de ltex

En el curso de su desarrollo todas las clulas recambian protenas y por lo
tanto contienen enzimas proteolticas para cumplir dicha funcin.
Generalmente estas proteasas se encuentran en cantidades relativamente bajas y
son frecuentemente difciles de detectar si no se emplean sustratos muy
sensibles. Sin embargo, algunas especies de plantas poseen gran concentracin
de proteasas en ciertos tejidos. Un ejemplo de ello es el ltex obtenido a partir
de plantas de diversas familias en el que las enzimas proteolticas superan el
50% de las protenas totales. En estos casos la actividad proteoltica es por lo
menos superior en dos rdenes de magnitud a la encontrada en otros tejidos. La
abundancia de estas proteasas por sobre los requerimientos para el crecimiento
y el desarrollo celular indican que podran actuar como "aleloqumicos"
(Dalling, 1986; Kono et al., 2004).
Proteasas cistenicas de ltex de frutos tales como papana y ficina son
conocidas por digerir la cutcula de los nematodos y presentar baja toxicidad,
por lo que se utilizan desde hace tiempo en el tratamiento gastrointestinal de
infecciones por nematodos tanto en animales como en el hombre (Stepenk et al.,
2004).

1.5.1. Proteasas de ltex de Asclepiadaceae

En el ao 1811 Robert Brown separ la familia Asclepiadaceae de Apocynaceae
(Jussieu, 1789). Sin embargo, a raz de recientes trabajos sobre teoras
filogenticas basadas en el anlisis de ADN, se han fusionado nuevamente
como Apocynaceae (Endress & Bruyns, 2000) siendo Asclepiadaceae considerada
en la actualidad por muchos autores como la subfamilia Asclepiadoideae. Si bien
esto ha sido aceptado por muchos investigadores, no hay an unanimidad de
creiterios en tal sentido, por lo que en el presente trabajo se considerar como
familia Asclepiadaceae.
 Introduccin 23

Los primeros trabajos en cuanto a la deteccin de proteasas en el ltex de

esta familia datan del ao 1940 en que Winnick y colaboradores aislaron del
ltex de Asclepias speciosa una proteinasa cistenica a la que denominaron
asclepana s. En el mismo ao Greenberg & Winnick (1940) obtuvieron una
enzima de iguales caractersticas a partir del ltex de Asclepias mexicana
(asclepana m), ambas con mxima actividad a pH 7,5 frente a hemoglobina
desnaturalizada y ovalbmina como sustratos.
Poco tiempo despus Carpenter & Lovelace (1943) determinaron que el pI
de una proteasa aislada de Asclepias syriaca es de 3,1. El ltex de esta especie fue
sometido a posteriores estudios (Brockbank & Lynn, 1979; Lynn et al., 1980), que
revelaron la existencia de al menos dos tipos de proteasas, cada una de ellas con
mltiples formas que difieren ligeramente en su composicin de aminocidos,
su pH ptimo (7 y 8,5) y su peso molecular (21 y 23 kD), an cuando su
comportamiento frente a la cadena de insulina muestra una especificidad
similar. Barragn et al. (1985); y Tablero et al. (1991) estudiaron las distintas
formas moleculares de proteasas presentes en el ltex de Asclepias glaucescens,
que no difieren significativamente de las encontradas en las anteriores especies:
si bien el pI vara entre 3,6 y 9,2, las proteasas ms abundantes (de pI superior a
9) tienen un peso molecular de 23 kD y su estructura secundaria es muy similar
a la de papana.
Del ltex de Calotropis gigantea se aislaron inicialmente dos cisteinilproteasas
(Abraham & Joshi, 1979a, 1979b), denominadas calotropina FI y calotropina FII;
se trata de glicoprotenas de parecido peso molecular (23-27 kD) que muestran
dos valores ptimos de pH sobre hemoglobina (4,3 y 8,1) y similar composicin
aminoacdica. Un estudio posterior (Pal & Sinha, 1980) revel la existencia de
dos proteinasas adicionales (calotropinas DI y DII) que pudieron cristalizarse y
que poseen un nico mximo de actividad frente a azoalbmina (pH 7,5-8,0); su
peso molecular est dentro del mismo rango (24 kD) pero su composicin
aminoacdica difiere de las anteriores. A partir de Calotropis procera se ha aislado
procerana (Kumar Dubey & Jagannadham, 2003), una proteasa cistenica de
28,8 kDa y pI 9,32 que es capaz de hidrolizar N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-
 Introduccin 24

nitroanilida pero no N-succinil-L-Ala-Ala-p-nitroanilida, N-succinil-L-Ala-p-

nitroanilida ni N-d-Benzoil DL-Arg-p-nitroanilida; la enzima no est glicosilada,
tiene el N-terminal bloqueado y contiene 8 residuos de triptofano, 20 de tirosina
y 7 de cistena. En estudios ms recientemente se analiz el perfil enzimtico del
ltex de Calotropis procera (Freitas et al., 2007) detectndose que la mayor
actividad proteoltica es debida a la presencia de al menos cuatro proteinasas
cistenicas a las que le asignan el rol de defensa que posee el ltex en las plantas.
Posteriormente se purificaron y caracterizaron varias peptidasas a partir del
ltex de otras especies de Asclepiadaceae. A partir del ltex de Araujia hortorum
Fourn. mediante cromatografa de intercambio catinico (CM-Sepharosa CL 6B)
se han purificado tres endopeptidasas cistenicas: araujain h I, h II y h III, cuyos
pesos moleculares son 24,0 kD, 23,7 kD y 23,5 kD, respectivamente; las tres
mostraron preferencia por el derivado de Gln para sustratos del tipo N-CBZ-
aa-p-nitrofenilster y un perfil de pH sobre casena con mximo de actividad
entre pH 8,0 y 9,0. Araujana h I y h III tienen pI > 9,3, mientras que araujana h
II tiene un pI algo ms bajo (8,9). La secuencia N-terminal de araujana h II
revel un 68% de identidad con quimopapana y un 59% con araujana h III, en
tanto que araujana h I tiene el N-terminal bloqueado (Priolo et al., 2000;
Obregn et al., 2001). Funastrana c II fue aislada a partir del ltex de Funastrum
clausum (Jacq.) Schlechter por cromatografa de intercambio inico, utilizando
SP-Sepharosa FF, su peso molecular es de 23,6 kD y su pI > 9,3. Se determin el
pH ptimo sobre casena (pH 9,0-10,0) y empleando PFLNA (Filippova et
al.,1984) (pH 6,8); con este sustrato el valor de Km fue 0,1011 mM y kcat 0,9 s 1.
La secuencia N-terminal tiene 75% de identidad con asclepana a y 71% con
asclepana b (ambas enzimas de Asclepias syriaca) y 70% con araujana h III
(Morcelle et al., 2004b). Del ltex de Asclepias curassavica L. tambin se ha aislado
por cromatografa de intercambio inico utilizando SP-Sepharosa FF una
endopeptidasa cistenica denominada asclepana c I, que posee un pI > 9,3, un
peso molecular de 23,2 kD, manifiesta preferencia por el derivado de Gln para
sustratos del tipo N-CBZ-aa-p-nitrofenilster y un valor de Km 0,818 mM
frente a PFLNA (Liggieri et al., 2004).
 Introduccin 25

Tambin se han estudiado dos especies pertenecientes al gnero Morrenia:

M. brachystephana Griseb. (Vairo Cavalli et al., 2003) y M. odorata (Hook et Arn.)
Lindley; del ltex de M. brachystephana se aislaron morrenana b I y b II, que
difieren en cuanto a su preferencia sobre sustratos del tipo N-CBZ-aa-p-
nitrofenil ster (morrenana b I mostr mayor afinidad para el derivado de Asp,
mientras que morrenana b II hizo lo propio con el derivado de Gly); la
secuencia N-terminal de morrenana b I muestra un 73% de identidad con
araujana h II y slo un 47% de identidad con morrenana b II. Morrenana o II
fue obtenida a partir del ltex de M. odorata; su N-terminal tiene un 95% de
identidad con el de morrenana b II, ambas tienen un pI > 9,3 pero difieren en
los valores de Km y kcat frente a los derivados N-CBZ-aa-p-nitrofenilster de
Ala, Asp y Gly (Vairo Cavalli et al., 2001). Recientemente se ha demostrado la
presencia de varias proteasas en el ltex de Philibertia gilliessi Hook. et Arn.
(Sequeiros et al. 2005) y se ha purificado una de ellas denominada philibertana
g I, que es una endopeptidasa cistenica bsica (pI > 10,25), con un peso
molecular de 23,5 kD que hidroliza al PFLNA (Km 0,15 mM) y cuya secuencia
N-terminal tiene un 73% de identidad con la de caricana (proteasa de Carica
papaya).
A partir del ltex de Ervatamia coronaria se han purificado y caracterizado
tres proteasas cistenicas, llamadas ervatamana A, B y C. Ervatamana B y C
fueron cristalizadas en el ao 1999 y se les determin la estructura
cristalogrfica preliminar con una resolucin de 2,5 y 2,6 , respectivamente
(Chakrabarti et al. 1999).
Ervatamana A (Nallamsetty et al., 2003) exhibe alta actividad proteoltica
frente a sustratos naturales y amidoltica frente a sustratos sintticos, posee una
masa molecular de 27,6 kD y su pI es 8,37. En su molcula hay 11 residuos de
tirosina, 8 de triptofano y 7 de cistena. La secuencia N-terminal muestra los
aminocidos tpicamente conservados en las proteasas cistenicas.
Ervatamana B ha sido purificada por cromatografa de intercambio inico y
cristalizacin (Kundu et al., 2000), su pI es 9,35 y la masa molecular fue
estimada en 26 kD por SDS-PAGE y gel filtracin. Posee 7 residuos de
 Introduccin 26

triptofano y 10 de tirosina por molcula y slo 2 puentes disulfuro, en lugar de

los tres tpicos de las proteasas cistenicas. La enzima hidroliza sustratos
naturales desnaturalizados como casena, azoalbmina y azocasena con alta
actividad especfica, adems de mostrar actividad amidoltica frente a N-
succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida con un valor de Km 6,6 mM. Se estudiaron
los cambios conformacionales inducidos en dicha enzima por el agregado de
diferentes alcoholes e incrementos de temperatura (Kundu et al., 2002). En un
trabajo posterior (Biswas et al., 2003) se determin la estructura cristalogrfica
de ervatamana B con una resolucin de 1,63 , se pudo inferir su estructura
primaria y se detectaron varias sustituciones con respecto a papana que
justifican la alta estabilidad de esta enzima, as como su especificidad de
sustrato.
Ervatamana C (Thakurta et al., 2004) es una enzima muy estable que ha sido
cristalizada y de la cual se ha determinado su secuencia. Si bien la estructura
tridimensional en general es similar a la de los otros miembros de la familia de
la papana, presenta la sustitucin de algunos residuos de aminocidos que
normalmente estn conservados tanto en los dominios L y R como en la regin
de la hendidura del interdominio. Estas sustituciones provocaran un
incremento en el nmero de interacciones (puente de H) intra e interdominios,
fortaleciendo la estructura de ervatamana C. Por otra parte se ha identificado
en el dominio R una nica unin disulfuro, en contraposicin a las tres
conservadas en la familia de la papana. Todos estos factores contribuyen a un
aumento en la estabilidad de ervatamana C. En esta enzima, la naturaleza del
subsitio S2, que es el primer determinante de especificidad de estas proteasas,
es similar a papana, pero en el subsitio S3 Ala reemplaza a un residuo
aromtico y tiene el efecto de eliminar las interacciones hidrofbicas requeridas
para la estabilizacin de S3-P3. Esto explicara la menor actividad de
ervatamana C para substratos o inhibidores pequeos. Esta sustitucin, sin
embargo, no afecta significativamente la unin de sustratos proteicos naturales
desnaturalizados a la enzima, porque existen varias interacciones adicionales
enzima-sustrato fuera de la hendidura del sitio activo.
 Introduccin 27

A partir del ltex de Ervatamia heyneana ha sido purificada una nueva

peptidasa cistenica muy estable y con alto contenido de cistenas (Patel &
Jagannadham, 2003); la enzima tiene una masa molecular de 23 kD, su pI es 10,8
y posee 11 residuos de cistena.
Ms recientemente, en el ltex de Vasconcellea spp. se detect elevada
actividad proteoltica debida a la presencia de una alta concentracin de
proteasas cistenicas que al ser secuenciadas a partir de sus cADN mostraron
elevada homologa con otras proteasas cistenicas provenientes de diferentes
especies de Caricaceae (Kindt et al., 2007).

2. INTRODUCCIN AL MUNDO DE LAS MICAS

El avance de la gentica molecular y celular y el poder de las tecnologas de

la informacin ha permitido que la genmica, junto con la bioinformtica, estn
generando catlogos completos de todos los genes, adems de su localizacin y
funcin. Este avance de la ciencia ha sido exponencial en los ltimos 30 aos.
Las aproximaciones tradicionales para aislar genes de plantas implicaban la
utilizacin de tcnicas moleculares y genticas, incluyendo la prospeccin de
genotecas, clonacin basada en la homologa y el mapeo, as como la seleccin
de mutantes fisiolgicos y de desarrollo. La mayora de estas estrategias
experimentales van encaminadas a la caracterizacin de un solo gen y su
aislamiento es un prerrequisito para llevar a cabo cualquier estudio posterior.
Sin embargo, actualmente es cada vez ms frecuente arrancar un proyecto de
investigacin con una secuencia de ADN encontrada en una base de datos y se
pueden identificar nuevos genes por bsqueda directa en las bases de datos en
virtud de su similitud con genes conocidos, una aproximacin bioinformtica
anloga a la prospeccin de una genoteca usando hibridacin con sondas de
cidos nucleicos. Las iniciativas genmicas y los recursos de la internet que
contienen informacin de secuencias han cambiado en forma drstica la
biologa experimental en plantas, proporcionando a los investigadores nuevos
caminos para el descubrimiento de genes. El gran tamao de muchos de los
 Introduccin 28

genomas de plantas hace que esta aproximacin se haya limitado, sin embargo,
a unas pocas especies.
Con el aumento de secuencias de genes en las bases de datos se ha
producido una explosin en la aplicacin de herramientas a gran escala para
analizar perfiles de expresin en los sistemas biolgicos. La capacidad de
analizar cualitativa y cuantitativamente poblaciones de ARNm
(transcriptmica) y protenas (protemica) suscita la tentadora posibilidad de
descifrar las rutas reguladoras y funcionales que representan el puente entre el
genotipo y el fenotipo.
El trmino protemica se est convirtiendo en algo ambiguo que engloba
casi cualquier aspecto de la expresin de protenas, el estudio de su estructura o
su funcin. Sin embargo, en trminos generales, deberamos definirlo como el
estudio del perfil del conjunto de protenas complementarias del genoma que
sera anlogo al perfil de transcritos en una situacin dada. A diferencia de los
estudios de transcriptmica en los que el ARN se extrae y manipula con
facilidad, los estudios con protenas presentan mltiples desafos: su
heterogeneidad fisicoqumica y complejidad estructural, lo que complica su
extraccin, solubilizacin, manejo, separacin e identificacin. Adems, no
existe ningn tipo de tecnologa similar a la PCR que permita amplificar
aquellas protenas que son poco abundantes. Algunos de estos problemas son
particularmente crticos cuando se trabaja con tejidos vegetales. Existen bases
de datos disponibles que contienen datos sobre perfiles de protenas. La
segunda categora en el anlisis de protemica es la llamada protemica
comparativa, donde el objetivo no es ya identificar todas las protenas presentes
en una situacin concreta, sino caracterizar las diferencias entre distintas
poblaciones de protenas en dos situaciones biolgicas diferentes.
Aunque gran parte del esfuerzo en protemica se ha realizado en la puesta a
punto de mtodos de alta resolucin para separar e identificar protenas, uno de
los pasos crticos es la extraccin y preparacin de muestras. Los tejidos
vegetales son usualmente ms complicados a la hora de preparar extractos de
protenas que otras fuentes biolgicas. Tienen menor contenido de protenas,
 Introduccin 29

usualmente contienen ms proteasas y otros compuestos que interfieren en la

estabilidad de las protenas polisacridos, lpidos y compuestos fenlicos,
adems de toda una coleccin de metabolitos secundarios que pueden interferir
no slo en el proceso de extraccin, sino tambin en el fraccionamiento y
posterior anlisis.
Finalmente, la metabolmica aparece como una nueva herramienta
funcional de la genmica que contribuye a la comprensin de las complejas
interacciones moleculares en los sistemas vivos. Al ser una de las ltimas
micas aparecidas, presenta todava muchos campos metodolgicos que se
pueden y se deben mejorar antes de que aparezcan bases de datos que nos
permitan integrar las concentraciones de metabolitos con el resto de recursos de
la genmica. El puente necesario que debe existir entre la metabolmica y las
otras aproximaciones de la gentica funcional: transcriptmica y protemica,
permitir el desarrollo de bases de datos que almacenen, integren, relacionen y
permitan establecer relaciones causales entre genes, transcritos, protenas y
metabolitos.
Los metabolitos de las plantas estn implicados en muchas de las respuestas
de resistencia al ataque de patgenos, en condiciones de estrs y contribuyen al
color, sabor y olor de flores y frutos. El fenotipo bioqumico de una planta es el
resultado de la interaccin entre el genotipo y el entorno. Por tanto, se necesita
identificar y cuantificar los metabolitos para estudiar la dinmica del
metaboloma y analizar los flujos metablicos. El reto de la metabolmica reside
en encontrar cambios en las cantidades de metabolitos que se puedan
correlacionar con el estado fisiolgico y de desarrollo de una clula, de un tejido
o de un organismo.
Para obtener un conocimiento global de cmo funciona un sistema biolgico
es esencial saber cmo responde utilizando los tres niveles de expresin, lo que
permitir deducir asociaciones relevantes entre macromolculas, identificar
correlaciones funcionales con fenotipos y construir modelos que describan de
forma cuantitativa la dinmica de un sistema biolgico. Estos anlisis
fenotpicos a gran escala permitirn en un futuro predecir como ser el
 Introduccin 30

comportamiento de una planta dada en un determinado contexto

medioambiental (http://www.encuentros.uma.es/encuentros100/omicas.htm).

2.1. Biologa molecular

La biologa molecular es una disciplina de la bioqumica que estudia, entre
otras, las molculas de cidos nucleicos, el cido desoxirribonucleico (ADN) y el
cido ribonucleico (ARN). El origen de la biologa molecular se puede rastrear
hasta fines del siglo XIX; sin embargo, el descubrimiento de la estructura del
ADN se considera como el inicio de esta disciplina (Watson & Crick, 1953). Los
avances producidos por la biologa molecular en la dcada del 60 nos permiten
contar hoy con herramientas para el estudio de microorganismos a nivel
molecular. En particular, el aislamiento de la ADN polimerasa y las
propiedades de hibridacin del ADN son algunos de los conocimientos que son
aplicados hoy da en la reaccin en cadena de la polimerasa, as como muchas
otras reacciones que se han transformado en herramientas tiles para el estudio
de material biolgico a nivel molecular.

2.1.1. Hitos en el desarrollo de la biologa molecular

El aislamiento de la molcula de ADN se realiz por primera vez en 1869, a
partir de ncleos aislados de linfocitos humanos y se denomin "nuclena.
Posteriormente se demostr que la nuclena estaba compuesta por 4 bases
orgnicas, adenina, guanina, timina y citosina. El desarrollo de un marcador
qumico a principios del siglo XX demostr por microscopa ptica que el ADN
se encuentra en el ncleo de todas las clulas de distintas especies. En 1944
Avery et al. demostraron que en el ADN estaba la informacin responsable de la
herencia. Sin embargo, este descubrimiento no tuvo mayor impacto en su poca
ya que en ese momento se crea que el contenido de las cuatro bases era similar
en todas las molculas de ADN y por lo tanto no explicaba la diversidad
gentica (Freifelder, 1978). En 1950 Chargaff demostr que la composicin
qumica del ADN variaba enormemente entre un organismo y otro, y que a
pesar de ello, siempre exista una concentracin molar equivalente entre
 Introduccin 31

adenina-timina y citosina-guanina.
En 1953, basndose en este descubrimiento y utilizando datos de difraccin
de rayos X, Watson y Crick propusieron el modelo de doble hebra para la
estructura del ADN (Watson & Crick, 1953; Fierro, 2001).
En este modelo las bases nitrogenadas de cada hebra forman una cadena
unida por grupos fosfatos externos e internamente las bases interactan con las
respectivas bases complementarias (adeninatimina y citosinaguanina) de la
otra hebra a travs de enlaces de hidrgeno. El descubrimiento de Watson y
Crick permiti conocer la estructura del ADN y comprender el mecanismo de la
herencia, en el que cada hebra sirve de molde para su propia replicacin
(replicacin semiconservativa) y es considerado como el inicio de la biologa
molecular (Fierro, 2001).
En 1960, Kronberg aisl y purific la enzima responsable de la replicacin
del ADN, la ADN polimerasa (Alberts et al., 1994). El descubrimiento de esta
enzima permiti definir elementos crticos para la sntesis de la molcula de
ADN, en particular el sitio de inicio de la sntesis formado por ADN de doble
hebra. Este descubrimiento es la base para todos los mtodos de sntesis de
ADN in vitro como la reaccin en cadena de la polimerasa .
Ese mismo ao, Doty et al. descubrieron las propiedades de hibridacin del
ADN. Contrariamente a lo pensado en esa poca, que la separacin por calor
del ADN doble hebra (denaturacin) era un fenmeno irreversible, estos
investigadores observaron que si el ADN desnaturalizado era llevado a 65 C,
se volva a formar ADN doble hebra. Estos autores denominaron a este
fenmeno renaturacin o hibridacin del ADN (Doty et al., 1960) e incluso
demostraron que poda ocurrir entre molculas de ADN y ARN con una
sensibilidad de 1:100.000. El descubrimiento de Doty et al. sent las bases para
todos los mtodos de hibridacin utilizados actualmente con la nica diferencia
de que en los mtodos actuales se introduce un fragmento de hebra simple,
denominado "sonda", el que al estar en una concentracin mayor al ADN doble
hebra y producirse la renaturalizacin, forma un hbrido "sonda: ADN" (Alberts
et al., 1994).
 Introduccin 32

En 1962, Arber aisl y purific enzimas que cortaban el ADN en secuencias

especficas (Watson & Tooze, 1981). Estas enzimas tenan la particularidad de
reconocer secuencias palindrmicas en el genoma y cortar ambas hebras. La
funcin de estas enzimas es proteger a las bacterias de infecciones virales
degradando el ADN viral (Nathans & Smith, 1975).
La utilizacin de estas enzimas en el anlisis de ADN permiti cortar esta
gran molcula en fragmentos ms pequeos y especficos y as estudiarla en
regiones discretas. Posteriormente, el descubrimiento de enzimas con capacidad
de unir fragmentos de ADN (ADN ligasa) dio origen a molculas de ADN
recombinante. Al combinar el corte con enzimas de restriccin en dos molculas
diferentes y reunir los fragmentos generados utilizando la ADN ligasa, se
crearon las primeras molculas de ADN recombinante, dando origen a la
ingeniera gentica (Gilbert &Villa-Komaroff, 1980).
En 1975, Southern desarroll un mtodo para fijar ADN digerido por
enzimas de restriccin a un soporte slido y realizar en l la hibridacin con
sondas especficas. Esta tcnica se basa en la separacin del ADN por migracin
electrofortica a travs de un polmero, usualmente agarosa, y posteriormente
transferirlo y fijarlo a una membrana de nitrocelulosa. La tcnica desarrollada
se llam Southern-blot y la extensin de esta metodologa a ARN se denomin
Northern-blot y a protenas, Western-blot (Alberts et al., 1994).
Otras variaciones de este mtodo, que no utilizan la separacin
electrofortica, se denominan dot-blot o slot-blot (Alberts et al., 1994).
Entre 1975 y 1977 dos grupos, Sanger et al. y Maxam y Gilbert (Alberts et al.,
1994) desarrollaron mtodos de secuenciacin del ADN. Ambos mtodos
difieren en que uno permite leer el cdigo gentico rompiendo la molcula de
ADN en nucletidos especficos y el otro incorporando nucletidos que
bloquean la extensin de la sntesis de ADN. Este ltimo mtodo es el ms
utilizado actualmente, en particular, en los mtodos de secuenciacin
automtica.
En 1985, Mullis reuni algunas de las metodologas mencionadas para
realizar sntesis de ADN in vitro en forma exponencial, denominando este
 Introduccin 33

mtodo reaccin en cadena de la polimerasa, ms comnmente conocida por

sus siglas en ingls: PCR, Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1990). Esta
metodologa es considerada como una revolucin dentro la biologa molecular,
ya que con la amplificacin exponencial es posible el anlisis de molculas de
ADN o ARN partiendo de mnimas cantidades de muestras.
A partir de esta metodologa, se han desarrollado las tcnicas mas modernas
utilizadas hoy en da en el campo de la genmica y genmica funcional.

2.1.2. Reaccin en cadena de la polimerasa

El mtodo de PCR se basa en ciclos de amplificacin exponencial de un
fragmento especfico de ADN. Este fragmento est determinado por secuencias
introducidas en la reaccin, denominadas cebadores ("primers), a partir de los
cuales la enzima ADN polimerasa realiza la sntesis exponencial.
Cada ciclo de amplificacin consta de tres etapas: desnaturalizacin,
alineamiento y extensin. La desnaturalizacin se realiza a 95 C y la separacin
conseguida permite que cada hebra sirva como molde o templado para la
sntesis de una nueva molcula de ADN. El tiempo de desnaturalizacin
depende del largo del templado, y generalmente dura entre 30 segundos y 1
minuto. Debido a que al comienzo de la amplificacin es necesario separar todo
el ADN de la muestra analizada, inicialmente se realiza una incubacin de 5
minutos a 95 C por nica vez.
Despus de la desnaturalizacin sigue la etapa de alineamiento entre el
ADN templado y los cebadores; esta etapa se basa en el principio de la
renaturalizacin de Doty et al. y ocurre al llevar la reaccin a 45 C 60 C.
Sin embargo, dado que los cebadores estn en mayor concentracin que el
templado, se favorecer el alineamiento entre templadocebador por sobre
templadotemplado. El ADN doble hebra formado (templadocebador)
definir el sitio de accin de la ADN polimerasa o extensin, etapa en la cual
esta enzima unir nucletidos libres en forma complementaria a la secuencia
del templado. La extensin ocurre a 72 C, que es la temperatura de mxima
eficiencia de la enzima y el tiempo de la extensin depender de la distancia de
 Introduccin 34

los cebadores entre s.

En general se ha calculado que la ADN polimerasa es capaz de incorporar 60
nucletidos por segundo a 70 C (Innis et al., 1988), por lo que un minuto es
tiempo suficiente para incorporar alrededor de 1.000 pares de bases. Dado que
se utilizan dos cebadores en la reaccin, uno para cada hebra, y que stos
quedan a una distancia de entrecruzamiento durante la sntesis de ADN, el
segmento definido ser amplificado en forma exponencial. As por ejemplo, si
al momento de iniciarse la amplificacin slo hay una molcula de ADN doble
hebra (2 templados), despus de 30 ciclos de amplificacin se habrn generado
1.097.736.000 copias del segmento flanqueado por los cebadores.
El elemento mas crtico de la amplificacin por PCR es el alineamiento.
Dado que este fenmeno se basa en la complementariedad entre las bases
nitrogenadas del templado y del cebador, sta es una unin alterada por varios
factores, entre otros la temperatura.
La importancia de la amplificacin por PCR se basa en que con esta
magnitud de amplificacin es posible el anlisis de molculas de ADN o ARN a
partir de mnimas cantidades de muestra. As por ejemplo, si consideramos
1 fg (10-9 g) de ADN, la amplificacin por PCR permitir generar alrededor de
0,1 g (10-6 g) de una regin especfica de ADN. En la prctica, este mtodo
permite identificar secuencias presentes entre 10 y 50 copias en una muestra.
La visualizacin del producto amplificado requiere de otras metodologas
posteriores a la amplificacin. El mtodo ms utilizado es la electroforesis de
agarosa; sin embargo, este es un mtodo indirecto, porque slo indica el tamao
del amplificado. La visualizacin directa requiere de mtodos que "lean" la
secuencia del amplificado. Entre estos mtodos figuran cortes con enzimas de
restriccin, hibridacin con sondas especficas (Southern-blot) o secuenciacin
del producto de PCR.

2.1.3. Clonacin de proteasas cistenicas vegetales

A la fecha son varias las proteasas cistenicas de origen vegetal que han sido
clonadas. Los ltimos trabajos reportados dan cuenta de: una proteasa clonada
 Introduccin 35

y expresada de Oriza sativa en E. coli (Su et al., 2006), de la clonacin del cDNA
de una proteasa cistenica .termoestable de Ervatamia (Ghosh et al., 2007), de una
proteasa presente en hojas senescentes de Ipomoea batatas (Chen et al 2002, 2006),
de proteasas de Trifolium repens (Asp et al. 2004) y de Zea mays L. (Pechan et al
2004). Tambin se clonaron 2 proteasas de porotos de soja (Ling 2003) y otra de
Hordeum vulgare, tipo catepsina B, (Martnez et al. 2003). A partir de frutos de
Bromelia fastuosa se logr clonar fastuosaina (Cabral et al., 2006) y en alfalfa se
aisl y caracteriz el cDNA que codifica una proteasa cistenica del tipo de la
papana (Yan et al., 2007). En tanto que la nica proteasa cistenica de ltex
clonada, expresada y caracterizada es Asclepaina f, aislada en nuestro
laboratorio a partir de Asclepias fruticosa (Trejo 2005).

2.2. Protemica
El anuncio de la finalizacin de la secuenciacin del genoma humano ha
sido un hecho histrico que ha trascendido las fronteras del entorno cientfico.
Se ha abierto una etapa que, aunque bautizada como era postgenmica, debe
considerarse ms como una continuacin que como el final de la revolucin
genmica.
Gracias a la informacin aportada por los proyectos de secuenciacin es hoy
posible abordar de forma efectiva el estudio de la funcionalidad del genoma, y
en especial el anlisis de los productos codificados por los genes: las protenas.
La protemica, ciencia que estudia las protenas y sus interacciones en los
distintos modelos vivos, es un rea de investigacin y desarrollo que ha
evolucionado vertiginosamente en los ltimos aos. El inters suscitado por
estos nuevos conocimientos reside en el potencial de la protemica como
generadora de una nueva revolucin biotecnolgica en sectores como el
desarrollo de frmacos, o en la caracterizacin de marcadores de enfermedades,
de uso en el diagnstico mdico. Adems de estas importantes aplicaciones
existen otras que quizs son menos conocidas, pero que tiene ms impacto
directo en nuestra vida cotidiana: en agricultura y control de alimentos, en
 Introduccin 36

clasificacin de pescados para el consumo o en el diagnstico de las

enfermedades reumticas (www.proteored.org).
El trmino proteoma fue usado por vez primera en 1995 para describir el
conjunto de PROTEnas de un genOMA, una clula o un tejido. De forma
imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la
protemica.
Esencialmente la protemica es el estudio a gran escala de las productos
gnicos de un genoma mediante mtodos bioqumicos, con el fin de obtener
una visin global e integrada de los procesos celulares. El trmino protemica
se ha asociado tradicionalmente con la separacin de un gran nmero de
protenas de una clula u organismo mediante 2D-PAGE. Segn esto, la
protemica comenz en los aos setenta cuando se empezaron a construir bases
de datos de protenas utilizando la electroforesis bidimensional. Sin embargo, la
identificacin de las protenas era difcil debido a la falta de mtodos analticos
rpidos y sensibles para la caracterizacin de las mismas. En los aos noventa,
la espectrometra de masas surge como un mtodo analtico muy poderoso, ya
que elimina la mayora de las limitaciones del anlisis de protenas. Este
desarrollo, junto con la disponibilidad de los genomas secuenciados marca el
comienzo de una nueva era. Actualmente muchas reas de estudio han sido
agrupadas dentro de la protemica. Se pueden incluir, entre otros, los estudios
de interacciones de protenas, de modificaciones pos-traduccionales, el anlisis
funcional de protenas y estudios de localizacin. Se puede hablar de dos tipos
de protemica: protemica de expresin y protemica del mapa celular.

2.2.1. Metodologa protemica

La protemica es, junto a la genmica, una de las nuevas tecnologas que
ms inters estn despertando ltimamente. Bsicamente la protemica utiliza
estrategias para identificar protenas basadas en la digestin enzimtica o
qumica de las protenas y en el anlisis de los pptidos mediante
espectrometra de masas.
El auge actual de la protemica se debe a dos razones fundamentales: por
 Introduccin 37

un lado, a los grandes proyectos de secuenciacin de genomas que han

generado una enorme cantidad de informacin y por otra parte, el avance en las
tcnicas de anlisis qumico de protenas ocurridas en los ltimos aos.
El reciente desarrollo de las denominadas tcnicas de ionizacin suave
(MALDI y electrospray) abri el camino al estudio de macromolculas
mediante espectrometra de masas. Estos mtodos de ionizacin, en
combinacin con diversas tcnicas de anlisis, permiten hoy en da la
identificacin y secuenciacin de protenas con unos niveles de rapidez,
sensibilidad y versatilidad sin precedentes. La aparicin de herramientas que
por primera vez en la historia de las biociencias permiten el anlisis sistemtico
de los agentes fundamentales de la vida, las protenas, hecho que ha dado lugar
al desarrollo de la moderna protemica.
La espectrometra de masas esencialmente es una alternativa muy
importante de la tcnica clsica de secuenciacin de la porcin N-terminal de la
protena, por medio del mtodo de la degradacin de Edman, sustituyndola
incluso en la qumica tradicional de protenas, ya que es mucho ms sensible,
puede ocuparse de mezclas de protenas y tiene un rendimiento de
procesamiento muy alto.
El mtodo de anlisis de pptidos conocido como mapeo de la masa del
pptido" (huella peptdica) fue desarrollado inicialmente por Henzel y sus
colaboradores en 1993 (Perkins et al., 1999). Dicho mtodo permite obtener el
espectro total de la mezcla de pptidos provenientes de la digestin especfica
de la secuencia de la protena; lo que da lugar a una huella digital de las masas
de los pptidos de la protena que est siendo estudiada. Este espectro total es
obtenido por un mtodo de espectrometra de masas relativamente simple,
utilizando una fuente de ionizacin y la desorcin de muestras asistida por un
lser (MALDI-TOF), lo que resulta en una medicin del "tiempo de vuelo" de
los pptidos que constituyen la mezcla.
Recientes avances en la automatizacin del procedimiento de identificacin
de protenas mediante MALDI han permitido que cientos de protenas puedan
ser obtenidas desde los geles de electroforesis, digeridas enzimticamente y su
 Introduccin 38

espectro de masas analizado automticamente e identificado en las bases de

datos de protenas (Jensen et al.,1997; Berndt et al.1999). En un procedimiento de
dos etapas para la identificacin rpida e inequvoca de una protena, la huella
digital de la protena obtenida mediante MALDI sera un primer paso
(Shevchenko et al., 1996; Shevchenko et al., 2000). El segundo paso ser la
secuencia de pptidos individuales. En este mtodo, los pptidos son ionizados
directamente por ionizacin en electroaspersin a partir de la fase lquida. Los
iones de los pptidos ingresan con un roco en un espectrmetro de masas en
serie que tenga la capacidad de separar los pptidos de una mezcla, adems de
aislar una especie al mismo tiempo y de disociarla en los fragmentos amino o
carboxilo-terminal. Los datos de la secuencia no slo se pueden utilizar para
identificar protenas en bases de datos de secuencias de aminocidos sino
tambin en bases de datos de secuencias de nucletidos y bases de datos de
genomas.
En definitiva, la protemica proporciona un conjunto de herramientas muy
poderosas para el estudio a gran escala de la funcin de los genes a nivel de
protena. Los estudios mediante espectrometra de masas de las protenas
separadas en geles est conduciendo al renacimiento de las aproximaciones
bioqumicas para el estudio de la funcin de las protenas. Actualmente existen
dos estrategias bien definidas para el estudio del proteoma: una de ellas se basa
en la utilizacin de la electroforesis bidimensional y la otra utiliza otros
mtodos de separacin de protenas, principalmente mtodos cromatogrficos.
En ambos casos la identificacin y caracterizacin de protenas se realiza
mediante espectrometra de masas.

3. INTRODUCCIN A LA BIOCATLISIS EN MEDIOS NO

CONVENCIONALES

En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances,

que fueron rpidamente transmitidos a aplicaciones industriales en la obtencin
de productos qumicos, esencialmente en las industrias alimentaria y
 Introduccin 39

farmacutica.
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms
numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biolgicos:
a) poseen una gran actividad cataltica
b) muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad
y regioespecificidad)
c) son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado
en los procesos qumicos industriales debido a que la mayora de las enzimas
no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en
agua, su separacin de los sustratos y productos es difcil, y por tanto, no se
pueden reutilizar. Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar
estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea
econmicamente rentable.
En general, la mayora de los procesos de catlisis enzimtica son llevados a
cabo en soluciones acuosas. No obstante, muchos de los productos de reaccin
no pueden obtenerse en medio acuoso por razones tales como:
a) insolubilidad de sustratos
b) equilibrio termodinmico desfavorable
c) inhibicin de la actividad enzimtica debida a reactivos y/o productos
d) dificultad para obtener los productos.
La biocatlisis en fase orgnica no slo permite la expresin de la
funcionalidad de las enzimas, sino que exhibe ventajas relevantes respecto de la
biocatlisis en fase acuosa (Cesti, et al., 1986), tales como:
a) cambios en el equilibrio de la reaccin, como consecuencia de la alteracin
del coeficiente de particin de sustratos y productos entre las fases de
inters, pudiendo favorecer la reaccin de sntesis y evitar la hidrlisis de
pptidos, steres, amidas, etc.
b) facilidad de recuperacin de los productos y del biocatalizador
 Introduccin 40

c) aumento de la termoestabilidad del biocatalizador

d) aumento de la estereoespecificidad en la resolucin de mezclas racmicas
El inters por desarrollar procesos enzimticos en fase orgnica ha crecido
notablemente en las ltimas dcadas por cuanto representan una interesante
alternativa a procesos de sntesis qumica convencionales (Klibanov, 1986).
Adems existe la posibilidad de influenciar las propiedades enzimticas por
medio de la naturaleza del solvente usado en la mezcla de reaccin (Wescott &
Klibanov 1994).
Bsicamente existen dos tipos de sistemas de biocatlisis en solventes
orgnicos: homogneos y heterogneos. Los sistemas homogneos son mezclas
de agua con solventes orgnicos miscibles. Los sistemas heterogneos pueden
dividirse en sistemas macroheterogneos, entre los que se pueden distinguir
sistemas de dos lquidos inmiscibles, y sistemas slido-lquido, en donde la
enzima est inmovilizada en una matriz slida o bien en forma de protena
insoluble suspendida en el solvente orgnico, y sistemas microheterogneos
representados por micelas reversas. Estos sistemas difieren drsticamente de
aquellos que han sido usados tradicionalmente, y tambin son diferentes entre
s (Illanes & Barberis, 1994).
Una de las estrategias para evaluar y seleccionar el sistema de reaccin
contempla la posibilidad de utilizar al catalizador en fase slida, lo que
permitira mayor estabilidad del mismo en los distintos medios a ensayar
(acuosos y no acuosos) y su posible reutilizacin, siendo esta ltima una de las
aplicaciones ms interesantes y prometedoras.

3.1. Inmovilizacin enzimtica en distintos soportes.

La catlisis enzimtica en fase heterognea (enzimas inmovilizadas) permite
un uso ms eficaz del catalizador al estabilizar la estructura proteica de la
enzima y asimismo permite el desarrollo de procesos continuos con todas las
ventajas operacionales asociadas (Travascio et al., 2002).
La inmovilizacin es el proceso de capturar la enzima en un espacio
determinado en contacto con la solucin que contiene sustratos y productos. La
 Introduccin 41

inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la

enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles
que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas
repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso
por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de
movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte
(Gerhartz 1990).
La inmovilizacin de la enzima permite utilizarla en reiteradas ocasiones,
disminuyendo as el costo de operacin y evitando una etapa de separacin del
producto de la enzima, lo que encarece el proceso. En la Tabla 2 se presentan las
principales ventajas y desventajas del empleo de enzimas inmovilizadas y
adems se compara con las ventajas y desventajas del uso de enzimas libres.
(Giorno & Drioli, 2000; Ferreira et al., 2002)

Tabla 2.- Ventajas y desventajas de la Inmovilizacin.

Enzima Soluble Enzima Inmovilizada

Ventajas Desventajas Ventajas Desventajas
Menor costo Gran cantidad de La enzima es Baja actividad
Utilizable en caso enzima remanente reutilizable especfica (Prdida
de sustrato con alto en producto luego La reaccin de actividad en
peso molecular de participar en la puede terminarse inmovilizacin)
No existen reaccin por la separacin Restricciones
perdidas de No es posible el del sustrato de la difusionales o
actividad (mayor rehuso de la enzima estricas
actividad enzima El control es m{as Inactivacin con
especifica) La reaccin esta preciso una operacin
limitada por Hay una menor continua
Inhibicin por inhibicin por Mayor costo,
producto producto debido al soporte y
Dificultad de un Mayor el proceso de
preciso control estabilidad a inmovilizacin
Si es necesario, condiciones de T y Necesita
detener la reaccin pH sanitizacin o
con calor, lo que Puede usarse en regeneracin del
puede afectar el forma batch o reactor.
alimento continua
Existe una gran
flexibilidad en el
diseo de reactores
 Introduccin 42

Los ensayos de biocatlisis en medio orgnico requieren de enzimas que

deben encontrarse ya sea en estado slido (liofilizadas o bien como polvos o
precipitados acetnicos) o en forma inmovilizada. Los mtodos que pueden ser
empleados son el entrampamiento en geles de poliacrilamida, la inmovilizacin
por adsorcin de proteasas sobre soportes slidos (poliamida, celite) y la
inmovilizacin por unin covalente sobre agarosa activada, entre otros.
La inmovilizacin por adsorcin de proteasas sobre soportes slidos
(poliamida, celite) es un mtodo sencillo y econmico y se ha aplicado para la
sntesis enzimtica de pptidos saborizantes (Morcelle et al., 2006) y
tensioactivos con propiedades antimicrobianas (Claps & Infante, 2002).
La inmovilizacin de enzimas a soportes que contienen grupos aldehdos
alifticos, como por ejemplo glioxil-agarosa, presenta una serie de interesantes
caractersticas desde el punto de vista prctico. Se puede aumentar la rigidez de
la molcula enzimtica y por lo tanto hacerlas ms resistentes a cambios
conformacionales inducidos por calor, solventes orgnicos y otros, comparada a
las molculas solubles. Adems, el grueso de la estructura proteica no se ver
afectada an cuando se hayan establecido un gran nmero de enlaces (Guisn,
2006). La agarosa corresponde a un tipo de soporte utilizado para inmovilizar
enzimas debido a sus buenas propiedades fsico-qumicas: a mayor grado de
entrecruzamiento, se tiene mayor superficie, dado que las fibras que componen
la agarosa son ms gruesas y el tamao del poro se hace ms pequeo, por lo
tanto se puede cargar este soporte con ms grupos reactivos. Este tipo de
soporte, debido a sus caractersticas fsico-qumicas, ha sido utilizado para
inmovilizar mediante la tcnica de unin multipuntual covalente algunas
enzimas como penicilina G acilasa de Escherichia coli (Guisn et al. 1990), tripsina
(Guisn et al. 1997) y -quimotripsina de pncreas de bovino (Guisn et al.
1991). El mtodo de inmovilizacin multipuntual covalente, es aquel en el que
los residuos aminoacdicos de la molcula enzimtica reaccionan con los
residuos de un soporte activado, quedando ubicada la enzima en su superficie
mediante el establecimiento de varios puntos de unin.
 Introduccin 43

El entrampamiento consiste en la retencin fsica de la enzima en las

cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por
prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno,
alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se
lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del
monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de
temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El entrampamiento
puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el
primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en
el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de
una fibra sinttica. El entrampamiento, de gran sencillez desde el punto de vista
experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.
Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura.
De todas formas, el entrampamiento requiere un control riguroso de las
condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza
qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena (Arroyo, 1998;
Guisn, 2006).

3.2. Aplicacin de proteasas a la biosntesis en medios no convencionales.

La catlisis enzimtica en fase orgnica es una alternativa interesante para
llevar a cabo procesos biocatalticos que no puedan realizarse o lo hagan con
dificultad en agua (Morcelle et al., 2006; Quiroga et al., 2006, Quiroga et al. 2007,
Guzmn et al., 2007). Dichos mtodos enzimticos presentan ventajas tales como
condiciones suaves de reaccin, proceder sin racemizacin y con elevada
estereoespecificidad (Bjrup et al. 1998), lo cual hace que dichos
biocatalizadores sean especialmente atractivos para el rea farmacutica y de la
agroqumica. Adems, se ha demostrado que las enzimas pueden ser ms
estables, aunque menos activas, en solventes orgnicos, en donde es ms
favorable la formacin de los enlaces peptdicos que la hidrlisis de pptidos
(Liu et al. 2002).
 Introduccin 44

Desde un punto de vista industrial las proteasas son enzimas con

caractersticas muy importantes utilizadas en la industria del cuero, de los
detergentes, en la produccin de hidrolizados proteicos y en la industria de los
alimentos (Ghorbel et al. 2003). Actualmente, la aplicacin de proteasas en la
produccin de pequeos oligopptidos ha recibido mucha atencin ya que
constituye una alternativa viable a la sntesis qumica (Fan et al. 2001). La
sntesis de dipptidos y tripptidos es importante para la industria farmacutica
y de los alimentos (Claps et al. 1995; Calvet et al. 1996; Bjrup et al. 1999;
Trusek-Holownia 2003).
En la bibliografa se ha informado el uso de fitoproteasas cistenicas tales
como papana (Mitin et al. 1984), ficina (Monter et al. 1991) y, ms
recientemente, Morrenia brachystephana (Barberis et al. 2002), Funastrum clausum
(Morcelle et al., 2006) y Araujia hortorum (Quiroga et al 2007) para la sntesis de
pptidos en medios no convencionales.
La sntesis de pptidos mediante endopeptidasas es una de las aplicaciones
de mayor potencial de la catlisis enzimtica en fase orgnica, logrndose
desplazar el equilibrio de la reaccin desde la hidrlisis hacia la sntesis.
Uno de los ejemplos ms conocidos de la sntesis enzimtica de pptidos es
la sntesis del dipptido aspartamo catalizada por termolisina inmovilizada,
que en la actualidad se transform en el lder de los edulcorantes no calricos a
nivel mundial (Oyama, 1987)
La formacin de uniones peptdicas obedece a la siguiente reaccin:
R-A-OR + H-A-OR R-A-A-OR + ROH
donde R, Ry R son los grupos protectores N-terminal y C-terminal de los
sustratos, en tanto que A y A son residuos de aminocidos.
Los mtodos de formacin de uniones peptdicas catalizadas por proteasas
pueden ser clasificados dentro de dos estrategias bsicas, en funcin del tipo de
componente carboxlico (donante de acilo) utilizado. Una es la inversa de la
hidrlisis de pptidos (aproximacin termodinmica o sntesis controlada en el
equilibrio) en donde el grupo R es un H, es decir, el componente carboxlico es
un grupo carboxilo terminal libre. La otra, corresponde a la aminlisis de
 Introduccin 45

aminocidos N-protegidos o derivados peptdicos (aproximacin cintica o

sntesis bajo control cintico) en donde el grupo R es un ster o una amida, es
decir un donante de acilo activado (Jakubke et al. 1985; Murakami et al. 2000).
En la sntesis bajo control cintico, el intermediario acil-enzima se forma
rpidamente y particiona competitivamente al reaccionar con el componente
nucleoflico (aminlisis) por un lado, y el agua (hidrlisis) por otro. Slo la
aminlisis rinde el pptido deseado, mientras que la hidrlisis da origen al
donante de acilo con el grupo carboxilo libre. Debido a que las proteasas no son
aciltransferasas perfectas, pueden ocurrir reacciones laterales no deseadas tales
como la hidrlisis del intermediario acil-enzima o la hidrlisis secundaria del
dipptido formado. Estos inconvenientes pueden ser superados por medio de
ingeniera de medios (medios orgnicos) o de enzimas (Jakubke, 1987).

Control Cintico

E
R-COOAc + R-NH2 R-CONH-R + AcOH

H2O H2O
E E

R-COOH + AcOH R-COOH + R-NH2

Por su parte, en una reaccin de sntesis bajo control termodinmico el

equilibrio qumico puede ser desplazado hacia la formacin de uniones
peptdicas por la adicin de un medio orgnico, por extraccin continua del
producto de sntesis o por la formacin de productos insolubles (Murakami et
al. 2000, Bordusa, 2002).
 Introduccin 46

Control Termodinmico

E
R-COOH + R-NH2 R-CO NH-R + H2O

R-COO- + H+ R-NH3+
 Introduccin 47

REFERENCIAS

Abraham, K.I. & P.N. Joshi (1979a) Studies on proteinases from Calotropis
gigantea latex. I. Purification and some properties of two proteinases
containing carbohydrate, Biochim. Biophys. Acta, 568: 111-9.
Abreu Payrol, J., W.D. Obregn, C.L. Natalucci & N.O. Caffini (2005)
Reinvestigation of the proteolytically active components of Bromelia
pinguin fruit . Fitoterapia, 76: 540-548.
Abreu Payrol, J., W.D. Obregn, S.A. Trejo & N.O. Caffini. (2007) Purification
and Characterization of Four New Cysteine Endopeptidases from fruits of
Bromelia pinguin L. grown in Cuba. The Protein Journal, PMID: 17932734 .En
prensa.
Abraham, K.I. & P.N. Joshi (1979b) Studies on proteinases from Calotropis
gigantea latex. II. Physico-chemical properties of calotropain-FI and F-II,
Biochim. Biophys. Acta, 568: 120-6.
Agusti, C., K. Takeyama, L.O. Cardel, I. Ueki, J. Lausier, Y.P. Lou & J.A. Nadel
(1998) Goblet cell degranulation after antigen challenge in sensitized guinea
pigs. Role of Neutrophils, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 15:1253-8.
Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & J.D. Watson (1994)
Recombinant DNA technology en: Molecular Biology of the Cell 3th
Edition Gardland pp: 291-334.
Arima, K., Uchikoba, H., Yonezawa, H., M. Shimada, & M. Kaneda (2000).
Cucumisin-like protease from the latex of Euphorbia supina. Phytochemistry,
53: 639-644.
Arroyo, M. (1998) Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y
aplicaciones Ars Pharmaceutica, 39: 23-39.
Asif-Ullah M., Kim K.S. & Y.G.Yu (2006) Purification and characterization of a
serine protease from Cucumis trigonus Roxburghi. Phytochemistry, 67: 870-5.
Asp, T., S. Bowra, Borg & P.B. Holm (2004) Molecular cloning, functional
expression in Escherichia coli and enzymatic characterisation of a cysteine
protease from white clover (Trifolium repens). Biochim. Biophys. Acta, 1699 (1-
2):111-22.
Azarkan, M., A. El Moussaoui, D. van Wuytswinkel, G. Dehon & Y. Looze
(2003) Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex
ofCarica papaya. Journal of Chromatography B, 790: 229238.
Azarkan, M., R. Dibiani, C. Baulard & D. Baeyens-Volant (2006) Effects of
mechanical wounding on Carica papaya cysteine endopeptidases
accumulation and activity International Journal of Biological Macromolecule,
38: 216-224.
Avery O., C. MacLeod & M. McCarty Studies on the chemical nature of the
substance inducing transformation of pneumococcal types. (1944). J Exp
Med., 79: 137-57.
Baltimore, D. y C. Heilman (1998) HIV vaccines: prospects and challenges, Sci.
Am., 279: 78-83
 Introduccin 48

Barberis, S.E. & A. Illanes (1994) Enzyme Biotechnology, 1st ed., 35 th Monograph,
Biology Series, The Secretrariat of the Organization of American States,
Washington, D.C., USA. Annex p.p. 250-253.
Barberis, S.E., E. Quiroga, M.C. Arribre, & N. Priolo (2002) Peptide synthesis
in aqueous-organic biphasic systems catalyzed by a protease isolated from
Morrenia brachystephana (Asclepiadaceae). Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 17(1):39-47.
Barragn, B.E., M.T. Cruz, L.M. del Castillo & M. Castaeda-Agull (1985).
Proteinases of mexican plants. XI. Asclepain g from the ltex of Asclepias
glaucescens. Rev. Latinoameri. Qum., 16:117-119.
Barrett, A.J., N.D. Rawlings & J.F. Woessner. (1998) Handbook of Proteolytic
Enzymes. Academic Press, London.
Barrett, A., N. Rawlings & J. Woessner (2004) Introduction. En: Handbook of
Proteolytic Enzymes (A. Barrett, N. Rawlings & J. Woessner, eds.). London:
Academic Press.
Bartlett, J.G. & R.D. Moore (1998) Improving HIV therapy, Sci. Am., 279: 64-73.
Belozersky, A., Y.E Dunaevsky & N. Voskoboynikova (1990). Isolation and
properties of a metalloproteinase from buckwheat Fagopyrum esculentum
seeds. Biochem. J., 272:677-682.
Berndt, P., U. Hobohm & H. Langen (1999). Reliable automatic protein
identification from matrix-assisted laser desorption/ionization mass
spectrometric peptide fingerprints Electrophoresis, 20: 3521-3526.
Biswas, S., C. Chakrabarti, S. Kundu, M.V. Jagannadham & J.K. Dattagupta
(2003) Proposed amino acid sequence and the 1.63 A X-ray crystal structure
of a plant cysteine protease, ervatamin B: some insights into the structural
basis of its stability and substrate specificity, Proteins, 51: 489-97.
Bond, H.M. & D.J. Bowles (1983). Characterization of soybean endopeptidase
activity using exogenous and endogenous substrates. Plant Physiol., 72:345-
370.
Bjrup, P., E. Wehtje & P. Adlercreutz (1996) Effects of acetonitrile-water
mixtures on -chymotrypsin catalysed dipeptide synthesis. Biocatalysis and
Biotransformation, 13 (3):189-200.
Bjrup, P., P. Adlercreutz & P. Claps (1999) Useful methods in enzymatic
synthesis of peptides: a comparative study focusing on kinetically controlled
synthesis of Ac-Phe-Leu-NH2 catalyzed by - chymotrypsin. Biocatalysis
and Biotransformation, 17(5): 319-345.
Bordusa, F. (2002) Proteases in organic synthesis. Chemical Reviews, December,
102 (12):4817-4868.
Brockbank, W.J. & K.R. Lynn (1979) Purification and preliminary
characterization of two asclepains from the latex of Asclepias syriaca L.
(milkweed). Biochim. Biophys. Acta., 578:113-122.
Broglie, K., I. Chet, M. Holliday, R. Cressman, P. Biddle, S. Knowlton, C.
Mauvais & R. Broglie (1991). Transgenic plants with enhanced resistance to
the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science, 254:1194-1197.
Brmme, D. & J. Kaleta (2002) Thiol-dependent cathepsins: pathophysiological
implications and recent advances in inhibitor design. Curr. Pharm. Des., 8:
1639-58
 Introduccin 49

Brown, R. (1811) On the Asclepiadeae, a natural order of plants separated from

the Apocyneae of Jussieu. Mem Wernerian Nat. Hist. Soc. 1: 12-78. Reproducido
en 1876 en Miscellaneous Bot. Works of R. Brown II: 193-247, en Darviniana 23
(2-3): 368.
Bruno, M.A., M.A. Pardo, N.O. Caffini & L.M.I. Lpez. (2003). "Hieronymain I,
a new cysteine peptidase isolated from unripe fruits of Bromelia hieronymi
Mez (Bromeliaceae)". Journal of Protein Chemistry, 22: 127-134.
Bruno, M.A., S.A. Trejo, X.F. Avils, N.O. Caffini & L.M.I. Lpez (2006).
Isolation and characterization of Hieronymain II, another peptidase
isolated from fruits of Bromelia hieronymi Mez. The Protein Journal, 25: 224-
231.
Bruno, M. (2007) Aislamiento, purificacin y caracterizacin de las proteasas
de frutos Bromelia hieronymi Mez. (Bromeliaceae) Tesis para optar al
Doctorado de la Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La
Plata.
Cabral H., A.M., E.H. Tajara, L.J. Greene, V.M. Faa, R.P. Mateus, C.R. Ceron, A.
de Souza Judice, L. Julianod, G.O. Bonilla-Rodriguez (2006). Preliminary
functional characterization, cloning and primary sequence of Fastuosain, a
cysteine peptidase isolated from fruits of Bromelia fastuosa. Protein Pept.
Lett., 13:83-9.
Calvet, S., J.T. Torres & P. Claps (1996) Enzymatic peptide synthesis in
organic media. Synthesis of CCK-8 dipeptide fragments Biocatal. Biotrans.,
13: 201-216.
Camperi, S., R. Hours, R. Audaz, M. Miranda & O. Cascone "Jugos de fruta sin
metanol" (1996) Ciencia Hoy vol. 6 N33.
Carpenter, D.C. & F.E. Lovelace (1943). The isoelectric point of Asclepain. J.
Amer. Chem. Soc, 65:2364-2365.
Cesti, P., F. Francalanci, & M. Foa (1986). La Chimica e la industria. 68: 11-15
Chabregas, S. (2003). Caracterizao da localizao subcelular da protena
THI1 de Arabidopsis thaliana. Tesis doctoral. Escola Superior de Agricultura
Luiz de Queiroz. Brasil.
Chakrabatti, C., S. Biswas, S. Kundu, M. Sund, M.V. Jagannadham & J. K.
Dattagupta (1999). Crystallitation and premilinary X-Ray analysis of
ervatamin B and C, two thiol proteases from Ervatamia coronaria. Acta
Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 55:1074-1075.
Chargaff E. (1950) Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their
enzymatic degradation. Experentia, 6: 201-9.
Chen, G.H., L.T. Huang, M.N. Yap, R.H. Lee, Y.J. Huang, M.C. Cheng & S.C.
Chen (2002) Molecular characterization of a senescence-associated gene
encoding cysteine proteinase and its gene expression during leaf senescence
in sweet potato. Plant Cell Physiol., 43(9):984-91.
Chen H.J., D.J. Huang , W.C. Hou , J.S. Liu & Y.H. Lin (2006) Molecular
cloning and characterization of a granulin-containing cysteine protease
SPCP3 from sweet potato (Ipomoea batatas) senescent leaves. J. Plant
Physiol., 163(8):863-76.
 Introduccin 50

Cimerman, N., P.M. Brguljan, M. Krasovec, S. Suskovic & J. Kos (2001)

Circadian and concentration profile of cathepsin S in sera from healthy
subjects and asthmatic patients. Pflugers Arch., 442: 204-6.
Claps, P., J. L. Torres & P. Aldercreutz (1995) Enzymatic Peptide Synthesis in
Low Water Content Systems: preparative Enzymatic Synthesis of [Leu]- and
[Met]- Enkephalin Derivatives, Bioorganic and Medicinal Chemistry 3:245-255.
Claps, P. & M.R. Infante (2002) Amino acid-based surfactants: enzymatic
synthesis, properties and potential applications. Biocatal. Biotrans., 20: 215-
233.
Cordeiro, M., P.E. Brodelius & S.M. Pais (1998). Cyprosin. Handbook of
Proteolytic Enzymes. (Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J.F. eds.),
Academic Press, London, pp.: 839-842.
Coussens, L.M., B. Fingleton & L.M. Matrisian (2002) Matrix metalloproteinase
inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science, 295: 2387-92.
Curotto, E., G. S. Gonzlez, O. Reilly & G. Tapia (1989). Isolation and partial
characterization of a protease from Cucurbita ficifolia. FEBS Lett., 243:363-
365.
Dahlgren, A., I. Kvarnstrom, L. Vrang, E. Hamelink, A. Hallberg, A. Rosenquist
& B. Samuelsson (2003) New inhibitors of the malaria aspartyl proteases
plasmepsin I and II. Bioorg. Med. Chem., 11: 3423-37.
Dalkin, K., S. Marcus & D.J. Bowles (1983). Endopeptidase activity in jackbeans
and its effect on concanavalin A. Planta, 157:531-535.
Doty P., J. Marmur, J. Eigner & C. Schildkraut (1960). Strand separtation and
specific recombination in deoxyribonucleic acids: physical chemical
studies. Proc Natl Acad Sci USA., 46: 461-76.
Dalling, M.J. (1986) Plant proteolytic enzymes, Vol I. CRC Press, Inc., Florida.
Drenth, J., J.N. Jansonius, R. Koekoek, H.M. Swen & B.G Wolthers (1968).
Structure of papain. Nature, 218:929-932.
Endress, M. E. & P. Bruyns (2000) A revised classification of Apocynaceae sl.
Bot. Rev., 66: 1-56.
Fan, K., P. Ouyang, X., Wu & Z. Lu (2001) A model of interfacial inactivation
for papain in aqueous organic biphasic systems. Enzyme Microb. Tech., 28: 3-
7.
Ferreira, L., M.A. Ramos, M.H. Gil & J.S. Dordick (2002). Exquisite
regioselectivity and increased transesterification activity of an immobilized
Bacillus subtilis protease Biotechnol. Prog., 18: 986-993.
Fierro A. (2001). Breve historia del descubrimiento de la estructura del ADN.
Rev Md Clnica Las Condes., 20: 71-75.
Filippova I.Y., E.N. Lysogorskaya, E.S. Oksenoit, G.N. Rudenskaya & V.M.
Stepanov (1984) L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide -
A chromogenic substrate for thiol proteinase assay. Anal. Biochem., 143: 293-
297.
Freifelder D M. The DNA molecule Structure and Properties. (1978) WH
Freeman, pp: 1-7.
 Introduccin 51

Freitas, C.D.T., J.S. Oliveira, M.R.A. Miranda, N.M.R. Macedo, M.P. Sales, L.A.
Villas-Boas, & M.V. Ramos (2007) Enzymatic activities and protein profile
of latex from Calotropis procera Plant Physiology and Biochemistry, 45: 781-789.
Fujinaga, M., M.M, Cherney, H, Oyama,. K, Oda. & M.N. James (2004) The
molecular structure and catalytic mechanism of a novel carboxyl peptidase
from Scytalidium lignicolum. Proc Natl Acad Sci U S A, 101: 3364-3369.
Gerhartz, W. (1990) Enzymes in industry. Production and applications Ed.
Sntesis, Madrid.
Ghorbel, B., A. Sellami-Kamoun & M. Nasri (2003) Stability studies of protease
from Bacillus cereus BG1. Enzyme and Microbial Technology, 32(5): 513-518.
Ghosh R, Dattagupta JK, & S.Biswas (2007) A thermostable cysteine protease
precursor from a tropical plant contains an unusual C-terminal propeptide:
cDNA cloning, sequence comparison and molecular modeling studies.
Biochem Biophys Res Commun., 362:965-970.
Gilbert W. & L. Villa-Komaroff (1980). Useful proteins from recombinant
bacteria. Sci Am., 242: 74-94.
Giorno, L. & E. Drioli, (2000). Biocatalytic membrane reactors: applications and
perspectives. Trends Biotech., 18: 339-349.
Gowen, M., J.G. Mery & S. Kumar (2000) Emerg Drugs, 5:1-43.
Greenberg, D.M. & T. Winnick (1940). Plant proteases II. pH-activity curves. J.
Biol. Chem., 135:775-780.
Grudkowska, M. & B. Zagdaska (2004). Multifunctional role of plant cysteine
proteinases. Acta Bichimica Polonica, 51 (3): 609624.
Guisn, J., A. Bastidas, C. Cuesta, R. Fernandez & M. Rosel (1990)
Inmobilization-stabilization of penicillin G acylase from E. coli Appl.
Biochem Biotechnol., 26: 181-195.
Guisn J., A. Bastidas, C. Cuesta, R. Fernndez-Lafuente & C.M. Rosell, (1991)
Immobilization-stabilization of -chymotrypsin by covalent attachment to
aldehyde-agarose gels Biotechnol. &Bioeng., 38:1144-1152.
Guisn J., G. Penzol, P. Armasen, A. Bastidas, R. Blanco, Fernandez-Lafuente, &
Garca-Junceda. (1997) Inmobilization of Enzymes on glyoxyl agarose
Inmobilization of Enzymes and Cells. Bickerstaff, G.F., ed., Humana Press
Inc. Totowa, pp 277-287.
Guisn , J.M. (2006) Immobilization of enzymes and cells Humana Press Inc.
Totowa, pp 185-204.
Guzmn F., S. Barberis & A. Illanes (2007) Peptide synthesis: chemical or
enzymatic Electronic Journal of Biotechnology, 10: 279-314.
Hara, I. & H. Matsubara (1980). Pumpkin (Cucurbita sp.) seed globulin. V.
Proteolytic activities involved in globulin degradation in ungerminated
seeds. Plant Cell Physiol., 21:219-232.
Hartley, B.S. (1960). Proteolytic enzymes. Ann. Rev. Biochem., 29:45-72.
Henzel, W. J., T. M., Billeci, J. T. Stultsand & S. C. Wong (1993). Identifying
proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide
fragments in protein sequence databases. Proc. Natl Acad. Sci. USA,
90: 5011-5015.
 Introduccin 52

Hou, W.S., W. Li, G. Keyszer., E. Weber., R. Levy, M.J. Klein, E.M. Gravallese,
S.R. Goldring & D. Bromme (2002) Comparison of cathepsins K and S
expression within the rheumatoid and osteoarthritic synovium. Arthritis
Rheum., 46: 663-74.
Illanes, A. & S. Barberis (1994) Catlisis enzimtica en fase orgnica en
Biotecnologa de Enzimas .Monografa 35. Serie Biologa. Secretara General
de la Organizacin de los Estados Americanos, Washington, DC,USA.
Ediciones Universitarias de Valparaso, Valparaso, p. 225-254.
Innis M.A, K.B Myambo, D.H. Gelfand & M.A. Brow. (1988) DNA sequencing
with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of
polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 85:
9436-40.
Jakubke, H. D., P. Kuhl, & A. Konnecke (1985). Basic principles of protease-
catalized peptide bond formation. Angewandte Chemie International Edition
in English, 24(2): 85-93.
Jakubke, H.D. (1987) Enzymatic Peptide Synthesis. In: UDENFRIEND, S. &
MEIENHOFER, J. eds. The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Academic
Press Inc., New York, , vol. 9, p. 103-165.
Jensen, O.N., P., Mortensen, O. Vorm & M. Mann (1997). Automation of matrix
assisted laser desorption/ionization mass spectrometry using fuzzy logic
feedback control. Anal. Chem.,69:1706-1714.
Jussieu, A.L. (1789) Gen. Plant.: 143-151. En Darwiniana 23: 368.
Kaneda, M. & N. Tominaga (1975). Isolation and characterization of a
proteinase from sarcocarp of melon fruit, J. Biochem. (Tokyo) 78: 1287-1296.
Kaneda, M., H. Yonesawa & T. Uchikoba (1995). Improved isolation, stability
and substrate specificity of cucumisin, a plant serine endopeptidase.
Biotechnol. Appl. Biochem., 22: 215-222.
Kaneda, M., A. Sobue, S. Eida & N. Tominaga (1986). Isolation and
characterization of proteinases from the sarcocarp of snake-gourd fruit. J.
Biochem., 99:569-577.
Kaneda, M. & N. Tominaga, (1977). Isolation and characterization of a
proteinase from white gourd. Phytochemistry, 16:345-346.
Kaneda, M., Uchikoba, T. (1994). Protease from the sarcocarp of Trichosantes
bracteata. Phytochemistry, 35:583-586.
Kashyap, D R, P.K. Vohra, S. Chopra & R. Tewari (2001) Applications of
pectinases in the commercial sector: a review Bioresour Technol., 77 (3): 215-
27.
Katz, B.A., J.M. Clark, J.S. Finer-Moore, T.E. Jenkins, C.R. Johnson, M.J. Ross, C.
Luong, W.R. Moore & R.M. Stroud (1998) Design of potent selective zinc-
mediated serine protease inhibitors. Nature, 391: 608-12.
Kervinen, J. (1998). Aspartic Peptidases. En: Handbook of Proteolytic Enzymes
(Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J. ed.), Academic Press, London.
pp.: 836-839.
Kindt, T., E.J.M. Van Damme, J. Van Beeumen & G. Gheysen (2007)
Purification and characterization of the cysteine proteinases in the latex of
Vasconcellea spp. The FEBS Journal, 274: 451-462.
 Introduccin 53

Klibanov, A.M. (1986) Enzymes that work in organic solvents Chem. Tech., 6:
354-359.
Konno, K., C. Hirayama, M. Nakamura, K. Tateishi, Y. Tamura, M. Hattori & K.
Kdino (2004). Papain protects papaya trees from herbovorus insects: role of
cysteine porteases in latex. The Plant Journal, 37: 370-378.
Kulkarni, A. & M. Rao (2007) Biochemical characterization of an aspartic
protease from Vigna radiata: Kinetic interactions with the classical inhibitor
pepstatin implicating a tight binding mechanism BBA - Proteins and
Proteomic,. 4 (5): 619-27.
Kumar Dubey, V. & M.V. Jagannadham (2003) Procerain, a stable cysteine
protease from the latex of Calotropis procera. Phytochemistry, 62: 1057-71.
Kundu, S., M. Sund & M.V. Jagannadham (2000). Purification y
Characterization of a stable cysteine protease ervatamin B, whit two
disulfide bridges, from the latex of Ervatamia coronaria. J. Agric. Food Chem.,
48:171-179.
Kundu, S., M. Sundd & M.V. Jagannadham (2002) Alcohol and temperature
induced conformational transitions in ervatamin B: sequential unfolding of
domains. J. Biochem. Mol. Biol., 35: 155-64.
Lecaille, F., J. Kaleta, & D. Brmme (2002) Human and parasitic papain-like
cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent
developments in inhibitor design. Chem. Rev., 102: 445988.
Levicar, N., T. Strojnik, J. Kos, R.A. Dewey, G.J. Pilkington & T.T. Lah (2002)
Lysosomal enzymes, cathepsins in brain tumour invasion. J. Neurooncol.,
58: 21-32.
Liggieri, C, M.C. Arribre, S.A.; Trejo, F. Canals, F. Avils & N. Priolo (2004).
Purification and biochemical characterization of asclepain c I from the latex
Asclepias curassavica L. The Journal Protein, 23:403-411.
Liggieri, C. (2005) Proteasas extradas del ltex de Asclepias curassavica L. Su
caracterizacin y aplicacin en la sntesis de pptidos Tesis para optar al
Doctorado de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de
La Plata.
Ling J.Q., T. Kojima , M. Shiraiwa & H. Takahara (2003) Cloning of two
cysteine proteinase genes, CysP1 and CysP2, from soybean cotyledons by
cDNA representational difference analysis. Biochim Biophys Acta, 1627(2-
3):129-39.
Liu, P., G. Tian, K. Lee, M., Wong & Y. Ye (2002) Full enzymatic synthesis of a
precursor of bioactive pentapeptide OGP (10-14) in organic solvents
Tetrahedron Letters, 43(13): 2423-2425.
Lpez, L.M.I. (1995). "Aislamiento, purificacin y caracterizacin de las
proteasas presentes en el ltex de frutos de Maclura pomifera (Raf.) Schneid.
(Moraceae)". Tesis de doctorado. Facultad de Ciencias Exactas, Universidad
Nacional de La Plata, Argentina.
Lynn, K.R., W.J. Brockbank & N.A. Clevette, (1980). Multiple forms of the
asclepains, cysteinyl proteases from milkweed. Biochim. Biophys. Acta,
612:119-125.
 Introduccin 54

Maccioni, R.B., C. Ott, I.I. Concha & J.P. Muoz (2001) The protein kinase
Cdk5. Structural aspects, roles in neurogenesis and involvement in
Alzheimer's pathology. Eur. J. Biochem., 268: 1518-27.
Mantell, S.H., J.A. Matthews & R.A. McKee (1986) Principles of plant
biotechnology. Blackwell Sci. Pub., Oxford, pp. 207-212.
Martnez M., I. Rubio-Somoza, P. Carbonero & I. Daz (2003) A cathepsin B-
like cysteine protease gene from Hordeum vulgare (gene CatB) induced by
GA in aleurone cells is under circadian control in leaves. J Exp Bot.,
54(384):951-9.
McKerrow, J.H (1999) Development of cysteine protease inhibitors as
chemotherapy for parasitic diseases: insights on safety, target validation,
and mechanism of action. Int. .J. Parasitol., 29: 833-7
Meins, F. & P. Ahl. (1989). Induction of chitinase and b-1, 3-glucanase in
tobacco plants infected with Pseudomonas tabaci and Phytophthora parasitica
var. Nicotianae. Plant Sci., 61:155-161.
Mitin, Y.V., N.P. Zapevalova, & E.Y. Gorbunova (1984) Peptide synthesis
catalyzed by papain at alkaline pH values. International Journal of Peptide
and Protein Research, 23 (5): 528-534.
Monter, B., B. Herzog, P. Stehle & P. Frst (1991) Kinetically controlled
synthesis of dipeptides using ficin as biocatalyst. Biotechnology and Applied
Biochemistry, 14,(2):183-191.
Morcelle del Valle, S. R. (2004a). Proteasas del ltex de Funastrum clausum
(Jacq.) Schlechter (Asclepiadaceae): Caracterizacin, purificacin y aplicacin
en la sntesis de pptidos en medios orgnicos. Tesis Doctoral. Facultad de
Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. Bs. As. Argentina.
Morcelle del Valle, S., N. Caffini & N. Priolo, (2004b). Proteolytic properties of
Funastrum clausum latex. Fitoterapia, 75: 480-490.
Morcelle, S., S. Barberis, N. Priolo, N. Caffini & P. Claps (2006) Comparative
behaviour of proteinases from the latex of Carica papaya and Funastrum
clausum as catalysts for the synthesis of Z-Ala-Phe-OMe. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic, 41: 117-12.
Mrinalini M., P.J. Vithayathil, S.M. Raju & C.S. Ramadoss (2002) Isolation
and characterization of proteolytic enzymes from the latex of Synadenium
grantii Hook, f . Plant Science, 163:131-139.
Mulligan, M.S., A.B. Lentsch, M. Huber-Lang, R.-F. Guo, V. Sarma, C.D. Wright,
T.R. Ulich & P.A. Ward (2000) Anti-inflammatory effects of mutant forms
of secretory leukocyte protease inhibitor. Am. J. Pathol., 15:1033-9.
Mullis K B. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci
Am., 262: 56-61, 64-5.
Murakami, Y., T. Yoshida, S. Hayashi & A. Hirata (2000) Continuous
enzymatic production of peptide precursor in aqueous/organic biphasic
medium Biotechnology and Bioengineering, July, 69(1):57-65.
Mutlu, A. & S. Gal, (1999). Plant aspartic proteinases: Enzymes on the way to a
function. Phsyiol. Plant., 105:569-576.
 Introduccin 55

Nallamsetty, S., S. Kundu & M.V. Jagannadham (2003) Purification and

biochemical characterization of a highly active cysteine protease ervatamin
A from the latex of Ervatamia coronaria. J. Protein Chem., 22: 1-13.
Nathans D. & H.J.O. Smith. (1975). Restricction endo-nucleases in the analysis
and restructuring of DNA molecules. Ann Rev Biochem., 44: 449-67.
NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) (1984) Enzyme Nomenclature 1984,
Academic Press, NY.
Obregn, W.D., M.C., Arribre, S. Morcelle del Valle, C., Liggieri, N.O. Caffini,
& N.S. Priolo (2001). Two new cysteine endopeptidases obtained from the
latex of Araujia hortorum fruits. J. Protein Chem., 20:17-25.
Obregn, W.D., R. Curciarello, N.O. Caffini & N.S. Priolo (2006) Hidrolytic
Profile and isolation of the Proteolytic Components of Latex from Araujia
angustifolia FruitsActa Farm. Bonaerense, 25: 206-12.
Okamoto, T., T. Shimada, I. Hara-Nishimura, M. Nishimura, & T. Minamikawa
(2003). C-terminal KDEL sequence of a KDEL-tailed cysteine proteinase
(sulfhydryl-endopeptidase) is involved in formation of KDEL vesicle in
efficient vacuolar transport of sulfhydryl-endopeptidase. Plant Physiol.,
132:1892900.
Oyama, K., S. Irino & N. Hagi (1987) Production of aspartame by immobilized
thermoase Methods in Enzymology, 136:503-516.
Pal, G. & N.K. Sinha, (1980). Isolation, crystallization and properties of
Calotropis DI and DII of Calotropis gigantea. Arch Biochem. Biophys., 202:321-
329.
Pande M., V.K. Dubey, S.C Yadav & M.V. Jagannadham (2006) A novel serine
protease cryptolepain from Cryptolepis buchanani: purification and
biochemical characterization J Agric Food Chem., 54(26):10141-50.
Pardo, M.F., L.M.I. Lpez, N.O. Caffini & C.L. Natalucci, (2001). Properties of
a milk clotting protease isolated from Fruits of Bromelia balansae Mez.
Biological Chemistry Hoppe-Seyler., 382: 871-874.
Patel B.K. & M.V. Jagannadham (2003) A high cysteine containing thiol
proteinase from the latex of Ervatamia heyneana: purification and comparison
with ervatamin B and C from Ervatamia coronaria. J. Agric. Food Chem., 51:
6326-34.
Patel A.K., V.K. Singh & M.V. Jagannadham (2007) Carnein, a serine protease
from noxious plant weed Ipomoea carnea (morning glory).J Agric Food Chem.,
55:5809-18.
Pechan T., P.W. Ma & D.S. Luthe. (2004) Heterologous expression of maize
(Zea mays L.) Mir1 cysteine proteinase in eukaryotic and prokaryotic
expression systems. Protein Expr Purif., 34(1):134-41.
Pereira, M.T., Lopes, M.T. P., Meira, W.l O. & C. E. Salas (2001) Purification of
a Cysteine Proteinase from Carica candamarcensis L. and Cloning of a
Genomic Putative Fragment Coding for This Enzyme Protein Expression and
Purification, 22: 249257.
 Introduccin 56

Perkins, D. N., D. J Pappin, D. M. Creasy & J. S. Cottrell (1999). Probability-

based protein identification by searching sequence databases using mass
spectrometry data. Electrophoresis, 20:3551-3567.
Pires, E. (1998a). Cardosin A. En: Handbook of Proteolytic Enzymes, Barrett, A.J.,
Rawlings, N.D., Woessner, J. ed.), Academic Press, London. p.: 843-844.
Pires, E. (1998b). Cardosin B. En: Handbook of Proteolytic Enzymes, (Barrett,
A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J. ed.), Academic Press, London, pp.: 844-
846.
Priolo, N., S. Morcelle del Valle, M.C. Arribre, L.M.I. Lpez, & N. Caffini,
(2000). Isolation and characterization of a cysteine portease from the latex
of Araujia hortorum fruits. J. Protein Chem., 19:39-49.
Quiroga, E., N. Priolo, J. Marchese & S. Barberis (2006) Behaviour of araujiain, a
new cysteine phytoprotease, in organic media with low water content.
Electronic Journal of Biotechnology, 9 (1): 18-25.
Quiroga, E., D. Obregn, N. Priolo, J. Marchese & S. Barberis (2007) Peptide
synthesis in aqueous-organic media catalyzed by proteases from latex of
Araujia hortorum (Asclepiadaceae) fruits. Biochemical Engineering Journal.
Article in Press (doi:10.1016/j.bej.2007.08.020)
Rajesh, R., C.D. Raghavendra Gowda, A. Natarajo, B.L. Dhananjava, K.
Kemparaju, & B.S. Vishwanath, (2005). Procoagulant activity of Calotropis
gigantea latex associated with fibrin(ogen)olytic activity. Toxicon, 46: 84-92.
Rao, M., A. Tanksale, M.Ghatge, & V. Deshpande, (1998). Molecular and
Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 62( 3):597635.
Rawlings, N.D. & A.J. Barrett (1993) Evolutionary families of peptidases.
Biochem. J., 290: 205-18.
Rawlings, N. & A. Barrett (1995). Families of aspartic peptidases, and those of
unknown catalytic mechanism. Methods in Enzymology, 248:105120
Rawlings, N. & A. Barrett (2004a) Introduction the clans and families of
cysteine endopeptidases. En: Handbook of proteolytic enzymes, 2da edn. (A.
Barret, N. Rawlings & J. Woessner, eds.) Amsterdan: Elsevier Academic
Press, pp.: 1051-1071.
Rawlings, N. & A. Barrett (2004b) Introduction: serine peptidases and their
clans and families. En: Handbook of proteolytic enzymes, 2da edn. (A. Barret,
N. Rawlings & J. Woessner, eds.) Amsterdan: Elsevier Academic Press. pp.:
1417-1438.
Rawlings, N.D., F.R. Morton & A.J. Barrett, (2006) MEROPS: the peptidase
database. Nucleic Acids Res., 34, D270-D272.
Rice, K.D., R.D. Tanaka, B.A. Katz, R.P. Numerof & W.R. Moore (1998)
Inhibitors of tryptase for the treatment of mast cell-mediated diseases.
Curr Pharm. Design, 4: 381-96.
Riese, R.J., R.N. Mitchell, J.A. Villadangos, G.P. Shi, J.T. Palmer, E.R. Karp, G.T.
De Sanctis, H.L. Ploegh & H.A. Chapman (1998) Cathepsin S activity
regulates antigen presentation and immunity J. Clin. Invest., 101: 2351-63.
Roberts, S.B. (2002) Gamma-secretase inhibitors and Alzheimer's disease.
Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 1579-88.
 Introduccin 57

Rosenthal, P.J. (1998) Proteases of Malaria Parasites: New Targets for

Chemotherapy. Emerg. Infect. Diseases, 4: 4956.
Rudenskaya, G., E. Bogdanova, L. Revina, B. Golovkin, V., Stepanov & V.M.
(1995). "Macluralisin-a serine proteinase from fruits of Maclura pomifera
(Raf.) Schneid". Planta, 196:174-79.
Rudenskaya, G.N., A.M. Bogacheva, A. Preusser, A.V. Kuznetsova, Y.E.
Dunaevsky, B.N. Golovkin & V.M. Stepanov (1998). Taraxalisin- a serine
proteinase from dandelion Taraxacum officinale Webb. s.l. FEBS Let.,
437:237-240.
Sajid, M. & J.H. McKerrow (2002) Cysteine proteases of parasitic organisms.
Mol. Biochem. Parasitol., 120: 121.
Sanger F., S. Nicklen & A.R. Coulson (1977). DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74: 5463-7.
Southern E M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis. J Mol Biol., 98: 503-17.
Schecter, I. & A. Berger, (1967). "On the size of the active site in proteases. I.
Papain", Biochim. Biophys. Res. Commun., 27:157-62.
Shevchenko, A., O.N. Jensen, A.V. Podtelejnikov, F. Sagliocco, M. Wilm, O.
Vorm, P. Mortensen, A. Shevchenko, H. Boucherie & M. Mann (1996).
Linking genome and proteome by mass spectrometry: large scale
identification of yeast proteins from two dimensional gels. Proc. Natl Acad.
Sci. USA , 93:14440-14445.
Shevchenko, A., A. Loboda, A. Shevchenko, W. Ens & K. G. Standing (2000).
MALDI quadruple time-of-flight mass spectrometry: powerful tool for
proteomic research. Anal. Chem., 72:2132-2141.
Schlumbaum, A., F. Mauch, U. Vogeli & T. Boller. 1986. Plant chitinases are
potent inhibitors of fungal growth. Nature, 324:365-367.
Sequeiros, C., M.J. Torres, S.A. Trejo, C. L. Natalucci & L. M. I. Lpez (2005).
"Philibertain g I the most basic cysteine endopeptidase purified from the
latex of Philibertia gilliesii Hook. et Arn. (Apocynaceae)". The Protein Journal,
24:445-53.
Sequeiros, C., (2006) Bsqueda de proteasas en plantas de la Patagonia.
Purificacin y caracterizacin de endopeptidasas cistenicas del ltex de
Philibertia gilliesii Hook et Arn. (Apocynaceae)Tesis para optar al Doctorado
de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata.
Simes, I., R. Faro , D. Bur , & C. Faro (2007) Characterization of recombinant
CDR1, an Arabidopsis aspartic proteinase involved in disease resistance J
Biol Chem., 282: 31358-31365.
Stepek, G., J.M. Behnke, D.J. Buttle & I.R. Duce (2004) Natural plant cysteine
proteinases asanthelmintics Trends Parasit., 20 (7): 322-327.
Su W, Lin C, Wu J, Li K, He G, Qian X, Wei C, & J. Yang. (2006) Molecular
cloning and expression of a cDNA encoding Lon protease from rice (Oryza
sativa) Biotechnol Lett., 28:923-927.
Tablero, M., R. Arregun, B. Arregun, M. Soriano, R.I. Snchez, A. Rodrguez
Romero & A. Hernndez-Arana (1991). Purification and caracterization of
 Introduccin 58

multiple forms of asclepain g from Asclepias glaucescens. H.B.K Plant Sci.,

74:7-15.
Thakurta, P.G., S. Biswas, C. Chakrabarti, M. Sundd, M.V. Jagannadham & J.K.
Dattagupta (2004) Structural basis of the unusual stability and substrate
specificity of ervatamin C, a plant cysteine protease from Ervatamia
coronaria. Biochemistry, 43:1532-40.
Travascio, P., Zito, E. Portaccio, M., Diano, N., Grano, V., Di Martino, S.,
Bertolini, T., Rossi, S. & D.G. Mita, (2002). Enzyme reaction engineering:
effect of metanol on the synthesis of antibiotics catalyzed by immobilized
Penicillin G acylase under isothermal and non-isothermal conditions.
Biotechnol. Prog., 18: 975-985.
Trejo, S.A. (2005) Purificacin, caracterizacin bioqumica y estructural y
expresin de una endopeptidasa cistenica de ltex de Asclepios fruticosa L.
(Apocynaceae), Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad
Nacional de La Plata.
Trusek-Holownia, A. (2003) Synthesis of ZAlaPheOMe, the precursor of bitter
dipeptide in the two-phase ethyl acetate-water system catalysed by
thermolysin Journal of Biotechnology, 102 (2):153-163.
Turk, D. & G. Guncar (2003) Lysosomal cysteine proteases (cathepsins):
promising drug targets. Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr., 59, 203-13.
Uchikoba, T., H. Yonezawa & M. Kaneda (1995). "Cleavage specificity of
cucumisin, a plant serine protease". J. Biochem., 117: 1126-1130.
Uchikoba, T., H. Yonezawa, M. Shimada & M. Kaneda (1999) Melain G, a
cysteine protease from green fruits of the bead tree, Melia azedarach: a
protease aected by specic amino acids at P3 position. BBA., 1430: 84-94.
Uchikoba, T., S. Hosoyamada, M. Onjyo, K. Arma, H. Yonezawa & M. Kaneda,
(2001). A serine endopeptidase from the fruits of Melothria japonica (thumb)
Maxim. Phytochemistry, 57:1-5.
Uhlig, H. (1998). Industrial enzymes and their applications. Nueva York: Willey &
Sons, pp.: 1-11, 146-179.
Vairo Cavalli, S., M.C. Arribre, A. Cortadi, N.O. Caffini & N.S. Priolo (2003).
Morrenain b I, a papain-like endo-peptidase from the latex of Morrenia
brachystephana Griseb. (Asclepiadaceae). J. Protein. Chem., 22:15-22.
Vairo Cavalli, S.E. (2005). Aspartilendopeptidasas de Sylybum marianum (L.).
Gaertn. con potencial aplicacin en la industria lctea. Tesis Doctoral.
Facultad de Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata.
Vairo Cavalli, S.E., A. Cortadi, M.C. Arribre, P. Conforti, N.O. Caffini & N.S.
Priolo, (2001). Comparison of two cysteine endopeptidases from latices of
Morrenia brachystephana Griseb. and Morrenia odorata (Hook et Arn.) Lindley
(Asclepiadaceae). Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 382:879883.
Watson J.D. & F.H.C. Crick (1953) A structure for Deo-xiribose Nucleic Acid.
Nature, 171:737-8.
Watson J.D. & J. Tooze (1981). The DNA story: A documentary history of gene
cloning. New York: WH Freeman.
Wescott, C.R. & A.M. Klibanov (1994) The solvent dependence of enzyme
specificity Biochim. Biophys. Acta, 1206: 1-9.
 Introduccin 59

Winnick, T., A.R. Davis & D.M. Greenberg (1940). Physicochemical properties
of the proteolytic enzyme from the latex of the milkweed, Asclepias speciosa
Torr. Some comparisons with other proteases. J. Gen. Physiol., 23:275-288.
Yadav, S.C., M. Pande & M.V. Jagannadam (2006) Highly stable glycosylated
serine protease from the medicinal plant Euphorbia milii Phytochemistry,
67(14):1414-26.
Yamashita, D.S. & R.A. Dodds (2000) Cathepsin K and the design of inhibitors
of cathepsin K. Curr Pharm Des., 6: 1-24.
Yan, L., J.Han, Q.Yang, Y.Sun, J.Kang, Z. Liu & M. Wu (2007) Isolation and
characterization of a cDNA encoding a papain-like cysteine protease from
alfalfa. DNA Seq. Sep 25;:1 [Epub ahead of print].