Clase - 2 - Cinetica Enzimatica PDF

15/10/2013
Biotecnología Industrial
BLOQUE II: Cinética enzimática y crecimiento microbiano
Tema2: Cinética enzimática
Tema3: Cinética microbiana
Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática
1. Aspectos generales de las enzimas

1. Propiedades
2. Modo de acción
3. Regulación de la actividad enzimática
4. Clasificación y nomenclatura
2. Conceptos básicos de cinética química
3. Cinética enzimática
4. Modelo cinético de Michaelis-Menten
5. Cálculo e interpretación de Km y Vmax
6. Actividad enzimática
7. Tipos de inhibición
8. Otras enzimas
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• Las reacciones químicas que ocurren en los organismos vivos presentan casi siempre
una energía de activación tan elevada, que en condiciones compatibles con la vida
ocurrirían a velocidades casi nulas.
• Como consecuencia, una de las principales adquisiciones evolutivas de los seres vivos
fue la aparición de proteínas con actividad catalítica (enzimas), que al disminuir la
energía de activación de las reacciones hacen posible no sólo que éstas se produzcan a
gran velocidad, sino que se lleven a cabo en condiciones moderadas de presión,
temperatura, pH, etc., compatibles con la vida.
• Las enzimas son generalmente proteinas globulares con actividad catalítica, pero
también hay moléculas de RNA (ribozimas).
Las enzimas se diferencian de los catalizadores químicos ordinarios en varios aspectos

importantes:
• Velocidades de reacción más elevadas
• Condiciones de reacción más suaves: temperaturas por debajo de 50°C, a la presión

atmosférica y a valores de pH casi neutros.
• Mayor especificidad de reacción: especificidad muy grande, tanto respecto a las

identidades de sus sustratos (reactantes) como de sus productos
• Capacidad para la regulación: propiedad fundamental para la relación entre la actividad

enzimática y la homeostasis de los organismo vivos
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1.1 Propiedades generales de las enzimas
Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como
catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las
demás conformaciones posibles.
Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la

actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad
de un enzima son:
 pH
 Temperatura
 Cofactor
 pH
 Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH,
etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos.
 Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra.
 Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un
pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el
llamado pH óptimo.
 La mayoría de los enzimas son bastante sensibles a cambios del pH.
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 pH
 Temperatura
 En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas.
 Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas,
a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor.
 La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima.
 Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la
temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.
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 Cofactor
• Es un componente no proteico, necesario para la acción de una enzima. El cofactor se
une a una estructura proteica, denominada apoenzima, y el complejo apoenzima‐
cofactor recibe el nombre de holoenzima (forma activa del enzima).
• Aquellos cofactores que están covalentemente unidos a la apoenzima son
denominados grupos prostéticos, ya sean orgánicos (coenzimas) o inorgánicos. Los
cofactores son básicamente de dos tipos, iones metálicos y moléculas orgánicas,
denominadas coenzimas.
• Son compuestos que se modifican en la reacción actuando como aceptor‐donador de
electrones y/o grupos funcionales. FAD (flavín-adenín dinucleótido): transferencia de electrones y protones.
FMN (flavín mononucleótido): transferencia de electrones y protones.
NAD+(nicotín-adenín dinucleótido): transferencia de electrones y
protones.
NADP+ (nicotín-adenín dinucleótido fosfato):
Coenzima A: transferencia de grupos acetilo (por ejemplo, en
la descarboxilación del ácido pirúvico) y de grupos aciloen general.
Coenzima Q: transferencia de electrones en la cadena respiratoria.
Coenzima B12: transferencia de grupos metilo o hidrógenos entre
moléculas.
TPP (pirofosfato de tiamina): transferencia de grupos aldehído; forma
parte, entre otros, del complejo piruvato deshidrogenasa.
Vitamina C
1.2 Modo de acción
 En las reacciones espontáneas, los productos finales tienen menos energía libre de
Gibbs (G) que los reactantes.Por tanto, en las reacciones espontáneas se libera
energía de Gibbs (G<0).
 Sin embargo, el comienzo de la reacción requiere un aporte inicial de energía. Esta
energía inicial que hay que suministrar a los reactantes para que la reacción
transcurra se llama energía de activación (Ea). Cuanto menor es la Ea más
fácilmente transcurre la reacción.
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1.2 Modo de acción

• La acción de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir la Ea.
• Los enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún
más que los catalizadores inorgánicos. Por ejemplo, la descomposición del agua
oxigenada (H2O2) puede ocurrir sin catalizador, con un catalizador inorgánico
(platino), o con un enzima (catalasa).
• Las respectivas Ea para cada proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. Así, se puede calcular
que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera
370.000 veces.
1.2 Modo de acción
o Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar
con una energía y una orientación adecuadas.
o La actuación del enzima permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro
activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca, debilitando los
enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos.
o Centro activo: se define como el lugar de unión del sustrato al enzima. La configuración
del sitio activo confiere a los enzimas sus características de especificidad catalítica
respecto del sustrato.
Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima:
 el modelo llave-cerradura
 el modelo del ajuste inducido
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1.2 Modo de acción
o Modelo llave-cerradura.
 El modelo llave-cerradura supone que la estructura del sustrato y la del centro activo
son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura.
1.2 Modo de acción
o Modelo ajuste inducido.
 En algunos casos, el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del
sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio
conformacional que da lugar a la formación del producto.
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1.3 Regulación de la actividad enzimática

Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad. Su
actividad puede estar modulada por:
 cambios en el pH
 cambios en la temperatura
 presencia de cofactores
 las concentraciones del sustrato y de los productos finales
 presencia de inhibidores
 modulación alostérica
 modificación covalente
 activación por proteolisis
 isoenzimas
 Las concentraciones del sustrato y de los productos finales
 La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato.
 Además, la presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea más
lenta, o incluso invertir su sentido.
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 Presencia de inhibidores
 Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. Estos
inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el
sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima,
impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no competitivo)
1.4 Clasificación y nomenclatura.
•Nombres particulares
•Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su
descubridor. Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria una
nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y
los sustratos sobre los que actuaba.
•Nombre sistemático: consta de 3 partes:
• El sustrato preferente
• El tipo de reacción realizado
• Terminación "asa"
Un ejemplo sería la glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerización de la glucosa-6-fosfato en

fructosa-6-fosfato.
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• Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular

Biology (NC-IUBMB): http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
• El nombre de cada enzima puede ser identificado por un código numérico,

encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro
números separados por puntos. El primer número indica a cual de las seis clases
pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada
grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que
intervienen en la reacción.
• Ejemplo: ATP_glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) se define como EC

2.7.1.2. El número 2 indica que es una transferasa, el 7 que es una
fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y el último 2 indica
que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.
•Código de la comisión enzimática (enzyme comission)
 Oxidoreductasas: reacciones de oxidación-reducción

 Transferasas: transferencia de grupos funcionales
 Hidrolasas: reacciones de hidrólisis
 Liasas: adición a dobles enlaces
 Isomerasas: reacciones de isomerización
 Ligasas: son enzimas de síntesis
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El estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas

comienza a finales del siglo XIX.
La mayor parte de los primeros estudios, sobre cinética enzimática, se

realizaron con la enzima invertasa, que cataliza la reacción:
Sacarosa + Agua Glucosa + Fructosa
O´Sullivan y Tompson (1890) estudiaron esta reacción e hicieron

una serie de importantes observaciones:
La reacción era dependiente de la acidez del medio de reacción.
Supuesto que la “acidez” era la apropiada, la velocidad de la reacción era

proporcional a la cantidad de enzima.
La velocidad disminuía a medida que el sustrato se consumía, y parecía ser

proporcional a la concentración de sacarosa, aunque había ciertas
desviaciones respecto de la curva esperada.
A bajas temperaturas la velocidad de reacción se duplicaba por cada

incremento de 10ºC. Sin embargo, a diferencia de los catalizadores químicos,
la invertasa presentaba una temperatura óptima, por encima de la cual la
velocidad caía rápidamente a cero.
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Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son

aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas.
No obstante, muestran un rasgo característico saturación por el sustrato,

entendida en términos de ocupación de los centros
activos de todas las moléculas de enzima.
De forma práctica para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la

concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción,
manteniendo la cantidad de enzima constante.
Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura.
Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es

directamente proporcional a la concentración de
sustrato, y por tanto, la reacción es de primer
orden.
A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por

el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0.
En este punto, la reacción es de orden cero y la
velocidad es máxima (Vmax).
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 En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron

una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.
 Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración

inicial de sustrato ([S]0) Michaelis -Menten propusieron que las reacciones catalizadas
enzimáticamente ocurren en dos etapas:
 En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el

complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima
libre:
Realizaron sus estudios utilizando el concepto de velocidades iniciales de

reacción y diferentes concentraciones de sustrato. Con lo que eliminaban
factores:
- reversibilidad,
- inhibición por producto y
- desactivación de la enzima.
Este modelo es el que, básicamente, se ha utilizado para el desarrollo de

la Enzimología clásica.
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Las reacciones enzimáticas más sencillas son las denominadas “reacciones

monosustrato”, es decir aquellas que implican la acción de la enzima (E) sobre un
unico sustrato (S).
La ecuación matemática que describe el comportamiento cinético de una reacción

de este tipo puede deducirse, mediante dos aproximaciones:
Aproximación del equilibrio rápido (Michaelis-Menten)

Aproximación del estado estacionario (Briggs-Haldane).

Aproximación del equilibrio rápido
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Condiciones de la Ecuación de Michaelis-Menten
• Formación de un rápido equilibrio entre la enzima libre y el sustrato inicial

• La concentración de substrato inicial es muy superior a la enzima:
• Complejo [ES] es despreciable como sumando frente a la [So]
• La [S] que aparece en todas las ecuaciones es la inicial [So].
• Las velocidades son siempre iniciales
• Velocidad inicial es proporcional a la constante de catálisis y a la [ES]
• Paso limitante de la reacción total es el paso de ES P
• Valor de la constante de catálisis kcat <<<k-1
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Aproximación del estado estacionario
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5. Cálculo e interpretación de parámetros cinéticos
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La curva (v  [S]), definida por la ecuación M-M:
La ecuación de M-M define una serie de parámetros útiles del comportamiento de una enzima.
Vmax indica aquella velocidad máxima alcanzable por una cantidad determinada de enzima a
concentraciones saturantes de substrato.
La Vmax es igual al producto de la constante de catálisis Kcat por la concentración total de

enzima presente [Eo], permite obtener el valor de Kcat conociendo la enzima presente.
La constante de Michaelis, Km representa aquella concentración de substrato para la cual la

velocidad inicial es igual a la mitad de la velocidad máxima. Es una medida de la afinidad de la
enzima por el substrato.
El cociente Kcat/Km, constante de especificidad de una enzima, define la eficacia catalítica

y el grado de evolución de una enzima.
Este valor no puede superar el límite de difusión de dos substancias que van a reaccionar que
es de 108-109 M-1s-1.
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5. Cálculo e interpretación de parámetros cinéticos kcat
Sólo puede conocerse cuando se tiene a la enzima pura y por tanto se

conoce su concentración: kcat = Vmax / [E]total
En una reacción en equilibrio rápido es la constante de velocidad de
primer orden de conversión de ES a EP: (k2).
En una reacción en estado estacionario es una función de todas las

constantes de velocidad de primer orden (de pasos que ocurren tras la
unión de los sustratos).
Si uno de los pasos es limitante de la velocidad, kcat es la constante de

velocidad de este paso.
A kcat también se le conoce como número de recambio, porque indica el

número máximo de ciclos catalíticos por sitio activo y por unidad de tiempo.
v  V max
S 
V max Km  S 
kcat 
Eo v  kcatEo
S 
Km  S 
Kcat o número de cambio de una enzima:

Corresponde al número de moles de substrato transformado por mol de enzima en la
unidad de tiempo (Unidades de t-1)
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Vmax
Cuando estamos estudiando una enzima, por lo menos al principio, es prácticamente

imposible conocer la concentración inicial real de enzima, [Eo], lo que complica el
uso de la ec. de Michaelis-Menten en la forma:
v  kcatEo
S 
Km  S 
Esta dificultad, generalmente, se supera combinando kcat y [Eo] en una sola cte:
kcat[Eo] = Vmax
Vmax, o velocidad límite, debido a su dependencia de la concentración de

enzima no es una propiedad fundamental de la enzima.
[S]
v = kcat[Eo] ----------------
Km + [S]
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Km
 En condiciones de equilibrio rápido es la constante de
disociación del complejo ES.
Km = k-1 / k1
 En condiciones de estado estacionario es una constante de

disociación aparente que puede ser considerada como la
constante de disociación global de todos los complejos de la
enzima.
Km = (k-1 + kcat) / k1
 Por tanto representa la afinidad del enzima por el substrato, para

valores de Km bajos la afinidad por el sustrato será elevada.
 En todos los casos es la concentración de sustrato a la que

v = Vmax / 2
Km 
k 1  kcat Km
k1
Valores de Km oscilan entre 10-3-10-6 M
Representa la concentración de sustrato que hacen la velocidad inicial sea Vmax/2
v Vmax
Km  So
v  V max
So
So  So
1
v  V max
2
m [S]
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5. Cálculo e interpretación de parámetros cinéticos Constante de

especicidad
v  V max
S  S<<<<Km Eficacia catalítica
Km  S 
kcat
v
kcat
EoS  Kesp 
Km Km
El valor máximo que la constante de especificidad puede alcanzar, viene

determinado por la velocidad de difusión de los dos reactantes, Eo y So, que han
de chocar eficientemente para producir la reacción (bimolecular).
Por muy eficaz que fuese una enzima nunca podría superar ese límite,
determinado por la difusión de los reactantes.
Ni Vmax ni Km separadamente nos dan una idea de la eficacia

catalítica de una enzima
Constante de
especicidad
Constante de especificidad
(Vmax/Km o kcat/Km)
Indica cuál es el mejor sustrato de una enzima (aquél que tenga la mayor
constante de especificidad).
Indica la eficiencia catalítica de la enzima a concentraciones de sustrato por

debajo de la saturación.
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Especificidad versus afinidad
Especificidad: es la capacidad que tiene una enzima de discriminar entre

posibles sustratos. Nos indica la velocidad relativa a la que se llevará a cabo
la reacción catalizada con estos diferentes sustratos.
– Los mejores sustratos, es decir aquellos que producen una reacción

más rápida, son los que tienen una mayor constante de especificidad.
Afinidad: es la estabilidad del complejo ES. Nos indica la capacidad que

tiene la enzima de formar un complejo con un determinado sustrato.
Tiempo de
5. Cálculo e interpretación de parámetros cinéticos especificidad
El inverso de Vmax/Km, es decir, Km/Vmax tiene dimensiones de tiempo:
Km mmol 1
  min
V max mmol 1 min 1
Se suele denominar “tiempo de especificidad” y representa el tiempo que se
necesitaría para consumir todo el sustrato si la enzima actuara bajo condiciones
de primer orden, manteniendo su velocidad inicial indefinidamente.
NOTA: Aunque esta es más bien una definición abstracta para las condiciones de ensayo
habituales, en el caso de la célula si que tiene sentido, ya que en las células, la mayor
parte de las enzimas actúan bajo condiciones de reacción de primer orden y mantienen la
velocidad durante periodos más o menos largos (debido a la reposición de sustrato): en
estas circunstancias el “tiempo de especificidad”, es el tiempo requerido para recambiar
(turnover) el sustrato completamente.
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Linealización de la ecuación de Michaelis-Menten
Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos.

Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos
hacer es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.
Representación directa v frente a [S]
v Vmax
v  V max
S 
Km  S 
[S]
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La representación de v frente a [S] es poco útil debido a:
 La dificultad para dibujar con precisión una hipérbola rectangular
 La dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de manera correcta, y por

tanto el cálculo de Km
Estas dificultades, fueron tenidas en

cuenta por Michaelis y Menten, y
representaban v frente a log[S].
Esta representación, aparte de su

valor histórico, ha tenido poco éxito.
Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con mayor fiabilidad,
se han propuesto varios procedimientos. La mayoría de ellos basados en la
linealización de la ecuación de Michaelis-Menten
Quizás las tres representaciones más usadas sean:

- Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos: (1/v  1/[S])
- Representación de Hanes ([S]/v  [S])
- Representación de Eadie-Hofstee (v  v/[S])
Además de estas tres representaciones, basadas en la linealización de la ec. de

M&M, existe una cuarta basada en la representación directa v  [S], o
representación de Einsenthal y Cornish-Bowden.
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Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk
Si escribimos la ecuación de Michaelis-Menten en su forma inversa, obtenemos:
1 S  Km 

v V max S
1 S Km
 
v V max S V max S
1 1 Km 1
---- = ------------- + ------------- ---------
v Vmax Vmax [S]
y = b + m x
1/v
m =Km/Vmax

-Pendiente Km/Vmax
-1/Km -Corte en el eje-x  1/v =0 -1/Km
-Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax
1/Vmax
1/[S]
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Representación de Hanes-Woolf
Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
1 Km 1 
  S 
1
  
 v V max V max S  
S   Km

S 
v V max V max
La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:
S      1 
S 
Km
 
v  V max   V max 
y = b + m x
[S]/v
m = tg = 1/Vmax

Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,
- Km corta en el eje [S] en un punto = - Km
Km/Vma
x
[S]
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Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P

catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación de Hanes yLinenweaver-Burk.
.
Representación de Eadie-Hofstee.
1 1 Km 1 
     vV max
 v V max V max S  
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v y Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
v
y reordenando v  V max  Km
S 
y = b - m x
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v Vmax
m = tg = -Km

Vmax/Km
v/[S]
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax
- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P

catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes
resultados:
[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)
0,30 0,57
0,50 0,85
0,75 1,18
1,50 1,82
3,00 2,50
7,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la
representación de Eadie-Hofstee.
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Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden
Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los

anteriores, para la obtención de Vmax y Km, conocido como
representación lineal directa.
La ecuación de M y M podemos transformarla en la ecuación canónica de

una recta en la que tratamos a Vmax y Km como variables, y a [S] y v
como constantes,
Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuación la podemos escribir
V max S 
v 
Km  S 
Reordenando v Km  S   V max S 
Km V max
1
Dividiendo por v y (S) S  v
V max Km
Reordenando,  1
v S
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Si el primer par de valores observados de v y [S] son v1 y [S1]

y representamos la recta que definen:
Vmax
v1
-S1 Km
Si tomamos ahora un segundo par de valores observados: v2 y (S2), ....
Vmax
v2
v1
-S2 -S1 Km
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Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....

Vmax
(Km, Vmax)
v3
v2
v1
-S3 -S2 -S1 Km

Como podemos observar, las distintas rectas se cortan, intersecan, en un punto,
común a todas ellas, de coordenadas (Km, Vmax).
NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos un punto, si no un entorno de

puntos, y la media de las coordenadas de estos puntos nos dará el valor medio de Km y Vmax con
sus correspondientes desviaciones estándar.
Vmax
(Km, Vmax)
v3
v2
v1
-S3 -S2 -S1 Km

El número máximo de puntos de corte vendrá dado por: [n(n-1)]/2, donde
n es el número de rectas.
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Suponer que estamos estudiando una enzima E que cataliza la reacción S 

P, y que obtenemos los siguientes datos experimentales:
Concentración inicial Concentración de producto (mol L-1)

de sustrato (mmol L-1) a distintos tiempos (t = min)
t=0 t=1 t=2 t=3 t=4
5,0 0 150 300 450 600
6,5 0 180 360 540 720
10,0 0 235 470 705 940
20,0 0 325 650 975 1300
40,0 0 410 820 1230 1640
Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos
estudiados.
Resumen
Estudiada la ecuación de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reacción podemos encontrar las
siguientes circunstancias-
a) A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reacción
La comparación de actividades enzimáticas en ordén cero de reacción puede servir para comparar
cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metabólicas.
b) A concentraciones de substrato menores que un décimo de la constante de Michaelis, nos encontramos en
orden uno de reacción.
c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una ecuación a
partir de la ecuación integrada de Michaelis-Menten permite determinar gráficamente los parámetros
cinéticos Vmax y Km estudiando la curva del avance de una reacción con respecto al tiempo
La ecuación de Michaelis-Menten es una cónica, hipérbola que pasa por el centro de coordenadas v:S, cuya
asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad máxima.
Diferentes transformaciones algebráicas permiten la linealización de la ecuación de M-M para una

determinación más fácil de los parámetros Vmax y Km.
Entre estas se encuentran:
Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk.
Representación de Hanes
Representación de Eadie-Hofstee
Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden
34
15/10/2013
6. Actividad enzimática
Actividad enzimática: son los moles de sustrato transformado por min y por
mL de extracto enzimático, definiéndose la unidad enzimática (UI) como la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de un umol de sustrato en
1min a 20ºC.
1 katal (Kat): cantidad de enzima para transformar un mol de sustrato por

seg, equivale a 6 107 UI.
Actividad específica: son los moles de sustrato transformados por min y

por mg de enzima.
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
1. Introducción
2. Inhibición reversible
2.1 Inhibición competitiva (inhibición
específica)
2.2 Inhibición no-competitiva
2.3 Inhibición incompetitiva o acompetitiva
2.4 Inhibición por sustrato
35
15/10/2013
1. Introducción
Las sustancias que disminuyen la velocidad de reacción,

química o enzimática, se denominan inhibidores.
Los inhibidores se pueden dividir en tres grandes grupos:
- Inhibidores reversibles,
- Inhibidores pseudorreversibles
- Inhibidores irreversibles
INHIBIDORES REVERSIBLES  la unión del inhibidor a la enzima es

débil.
INHIBIDORES PSEUDOIRREVERSIBLES  la unión del inhibidor a la

enzima es fuerte.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES  la unión del inhibidor a la enzima es

prácticamente irreversible, generalmente covalente (inhibidores
suicidas).
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15/10/2013
2. INHIBICIÓN REVERSIBLE
Los inhibidores reversibles son sustancias que forman

complejos reversibles con la enzima ( interacciones
de tipo débil).
Cumplen las condiciones impuestas al Substrato para la

deducción de la ecuación cinética de M&M:
La concentración inicial de inhibidor [Io] >> [Eo]
Para resolver la ecuación de velocidad en presencia de inhibidor,

[EI] o [ESI] es despreciable frente a la de [Io].
Por lo tanto, en todo momento , [I] = [Io]
Por otra parte, la formación de los complejos EI o ESI es muy rápida, de

forma que se alcanza rápidamente el siguiente equilibrio:
E + I <=====> EI
y podemos definir la constante de disociación del complejo EI:
[E] [I]
Ki = ------------
[EI]
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15/10/2013
Donde. [E] concentración

de enzima libre [I] concentración de inhibidor libre
[EI] concentración del complejo EI
-Así mismo, debemos tener en cuenta:
i) que la actividad de la enzima se afecta por la presencia del inhibidor
ii) que las velocidades medidas son velocidades iniciales
iii) que estamos en una situación de estado estacionario
Consecuentemente, la concentración de las diferentes especies químicas en que

puede encontrarse la enzima: [E], [ES], [EI] y en su caso [ESI] son constantes
respecto del tiempo,  d[EX]/dt = 0.
Si la enzima, a concentraciones saturante de inhibidor, no presenta actividad catalítica

alguna (v = 0) se dice que la inhibición es completa o total.
Sin embargo, frecuentemente nos referimos a este tipo de

inhibición como inhibición lineal, ya que la representación de
Kmap/Vmaxap o de 1/Vmaxap frente a [I] nos da una linea recta.
Con menor frecuencia está el caso en que el complejo EI sí

presenta cierta actividad catalítica residual (v  0) a
concentraciones saturantes de inhibidor.
Este tipo de inhibición se conoce como inhibición parcial, o

inhibición hiperbólica, ya que la curva resultante al representar
Kmap/Vmaxap o 1/Vmaxap frente a la [I], nos da una curva
hiperbólica.
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Ambos tipos de inhibición, lineal e hiperbólica, pueden a su

vez subclasificarse de acuerdo con los parámetros cinéticos
aparentes de Michaelis-Menten que se vean afectados, si
bien, nosotros nos centraremos en la inhibición lineal.
La inhibición por inhibidores reversibles lineales,

tradicionalmente, y de acuerdo con el mecanismo de reacción,
se suele clasificar en tres grupos:
- Inhibición competitiva --> Inhibidores competitivos

- Inhibición no-competitiva --> Inhibidores no-competitivos
- Inhibición acompetitiva --> Inhibidores acompetitivos
2.1. Inhibición competitiva
En la inhibición competitiva o inhibición específica, el inhibidor compite con

el sustrato por el mismo centro activo de la enzima.
La molécula del inhibidor es, generalmente, en todo o en parte,

un isóstero del sustrato, excluyendose mutuamente del centro
activo de la enzima.
Isóstero --> Moléculas que tienen formas y tamaños similares
39
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Km kcat
E + S <====> ES ----------> E + P
<=====>
I Kic
EI -------->
La enzima, Eo, puede estar como enzima libre, E, unida al
sustrato formando el complejo-ES, ES o como enzima unida al
inhibidor formando el complejo-EI, (EI).
Pero solamente el complejo ES puede dar producto.
Y de acuerdo con la ecuación de conservación de la materia
podemos escribir:
[Eo] = [E] + [ES] + [EI]

Vic = kcat [ES]
Velocidad inicial en presencia de inhibidor competitivo
El valor de la [ES] lo podemos obtener a partir de la cte de

Michaelis:
[E] [S] [E] [S]
Km = ------------ [ES] = -----------
[ES] Km
Y análogamente, el valor de la [EI] lo podemos obtener a partir de

la definición de la constante de disociación del complejo EI:
Kic
40
15/10/2013
[E] [I] [E] [I]

Kic = ------------ [EI] = ------------
[EI] Kic
Sustituyendo estos valores en la ec. de balance de materia:
Eo = E + ES + EI
[E] [S] [E] [I]

[Eo] = [E] + ------------ + ------------
Km Kic
1
Valor de la Enzima libre E  Eo
I S
1 
[E] [S] Ki Km
[ES] = -----------
S
1
Km ES  Eo
I S Km
1 
Vic=Kcat [ES] Ki Km
1 S S
vic  kcatEo  V max
I S Km IKm
1  Km  S
Ki Km Ki
S
vic  V max
 I 
Km1    S
 Ki 
Ecuación representa el comportamiento cinético de un inhibidor
competitivo puro
41
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La velocidad de reacción inicial, en presencia de inhibidor

competitivo vendrá dada por la ecuación:
[S]
vic = Vmax -----------------
[S] + Kmap
Ecuación semejante a la ec. de M&M, pero donde el valor de
Kmap depende de la concentración del inhibidor (I) y de la cte de
inhibición Kic.
 I 
Kmap  Km1  
 Kic 
En este tipo de inhibición reversible, los valores de las ctes de
inhibición, Kic, suelen ser del mismo orden que las Km.
Oscilando entre 10-3 y 10-6 M.
- Algunos inhibidores de este tipo suelen tener aplicaciones

medico-farmacéuticas.
¿Cuáles serán los mejores?
 aquellos que tengan un valor de Ki pequeño
El análisis de la ec. anterior nos indica que el grado de inhibición, depende:
i) de la concentración de inhibidor, [I];

ii) del valor de la Kic;
iii) de la concentración de sustrato, [S]
iv) de la constante de Michaelis, Km
- A concentraciones altas de sustrato, [S], el valor de inhibición

puede ser no significativo.
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Determinación gráfica de los parámetros cinéticos

en una inhibición competitiva
Podemos utilizar las mismas linealizaciones que para la ecuación
de Michaelis-Menten; por ejemplo:
* 1/vic vs 1/[S] --> Representación de Linenweaver-Burk
* vic vs vic/[S] --> Representación de Eadie-Hoftee
* [S]/vic vs [S] --> Representación de Hanes
* vic vs [S] --> Representación directa o de Eisenthal-

Cornish
1/v
[I] > 0
[I] = 0
Representación de
Linenweaver-Burk
- 1/Km
1/Vmax
-1/Kmap 1/[S]
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44
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2.2. Inhibición no-competitiva
En una inhibición no-competitiva el inhibidor se une a la enzima

en un centro de unión diferente al centro activo de la enzima.
Las especies químicas en las que puede encontrarse la enzima serán:

- la enzima libre, E,
- la enzima unida al sustrato, ES (complejo-ES)
- la enzima unida al inhibidor, EI (complejo-EI)
- la enzima unida al sustrato y al inhibidor, ESI o EIS
(complejo- ESI o EIS)
En el caso de la inhibición no-competitiva pura suponemos que

tanto la enzima libre, E, como el complejo-ES pueden unirse al
inhibidor, y que la constante de disociación, Ki, es igual en ambos
casos.
E y EI unen al sustrato sin que afecten a las constantes
de disociación (Km)
En este caso, también, sólo el complejo-ES evoluciona dando producto
45
15/10/2013
Los inhibidores no-competitivos,

generalmente no presentan
relación estructural con el sustrato,
y se unen a la enzima en un sitio
distinto del centro activo.
Cuando [S]   no desaparece la inhibición.
46
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Km kcat
E + S <====> ES ----------> E + P
<=====>
<=====>
I Ki I Ki
Km
EI <=====> ESI ---------->
* La deducción de la velocidad de reacción, en este caso, es
análoga a la realizada en el caso de la inhibición competitiva:
vinc = kcat (ES)

[Eo] = [E] + [ES] + [EI]+ [ESI]
[S]
vinc = Vmaxap --------------------
[S] + Km
En una inhibición no-competitiva pura, la Km de la enzima por el

sustrato no se modifica, sin embargo, la Vmax sí se modifica,
transformándose en una Vmaxap.
V max
V max ap 
 I 
1  
 Ki 
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Representación de Linenweaver-Burk
1/vinc (I) > 0
(I) = 0
1/Vmaxap
1/Vmax
- (1/Km) 1/S
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2.3. Inhibición acompetitiva
El tercer tipo de inhibición reversible es la inhibición acompetitiva,

en la que el inhibidor sólo puede unirse al complejo-ES, formando
un complejo-ESI, que no da producto.
* En este caso como en los dos anteriores, únicamente el complejo-ES da producto de
reacción.
- De acuerdo con el siguiente esquema:
Km kcat
E + S <====> ES ----------> E + P
<=====>
I Ki
ESI ---------->
* Al igual que los otros dos casos, en este la velocidad de
reacción viene dada por:
viac = kcat (ES)
[Eo] = [E] + [ES] + [ESI]
Y por tanto su deducción se realizará de manera análoga.
49
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Así pues, en una inhibición acompetitiva se modifica tanto Vmax como Km, y ambas se
ven afectadas por el mismo factor multiplicativo
Vmax S
viac 
 I  Km
S
1  
 K 
iac  1 
I 
 K 
 iac 
[S]
viac = Vmaxap ----------------
Kmap + [S]
Vmax Km
Vmap  K map 
 I   I 
1   1  
 K iac   K iac 
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15/10/2013
Del análisis de la anterior figura así como de la ecuación que nos da viac
podemos observar que tanto la Vmax como la Km están disminuidas por un
mismo factor:
 I 
1  
 Ki 
¿No les parece paradójico que un inhibidor disminuya la Km de
una enzima por el sustrato?
Es decir, ¡que aumente la afinidad de la enzima por el sustrato!
La respuesta la podríamos tener en el mecanismo de inhibición
Al unirse el inhibidor al complejo-ES desplaza el equilibrio y,

aparentemente, por lo tanto, la constante de disociación Kmap
disminuye.
Determinación gráfica de los parámetros cinéticos en una inhibición

acompetitiva
Representacion de Linenweaver-Burk
1/viac (I) > 0 (I) = 0
1/Vmaxap
1/Vmax
- (1/Kmap) - (1/Km) 1/S
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2.4. Inhibición por exceso de sustrato
* Este es otro tipo de inhibición reversible en el que un exceso de sustrato provoca una
pérdida de actividad de la enzima.
* En este caso, el modelo cinético presupone que una segunda molécula de substrato
puede unirse al complejo-ES dando lugar a la formación del complejo-ES2 que no da
producto:
Km kcat
E + S <====> ES ----------> E + P
<=====>
Suponemos que la constante de

S Ks´ disociación del segundo complejo
[ES2] es diferente a la Km
Se denomina Ks´
ES2 ---------->
- La ecuación de velocidad, como siempre, la podemos deducir a
partir de:
v = kcat (ES)
52
15/10/2013
Ecuación de conservación de la enzima

Km 
E S 
ES 
Eo = E + ES + ES2 Ks`
E S 
ES 2 
S ES 2
Eo  E  E  E  Eo
S
1
S2
1 
Km KmKs` Km KmKs´
[E] [S]
v = kcat [ES] [ES] = -----------
Km
1 S
v  kcatEo 2
S S Km
1 
Km KmKs´
1 S
v  V max 2
S S Km
1 
Km KmKs´
La representación de v frente a (S) muestra una curva que

presenta un máximo:
La concentración de sustrato Igualando a cero la
v primera derivada
a la cual se obtiene el con respecto a la [S]
máximo de velocidad
Vmax
S op  KmKs´
(S)op (S)
53
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RESUMEN
Inhibidores: aquellos compuestos disminuyen la actividad de una enzima. Se agrupan en

tres clases: Reversibles, Pseudoirreversibles y suicidas.
Inhibidores reversibles: cumplen las condiciones de Michaelis, la [Io] es muy superior a

la [Eo] siendo el complejo enzima-inhibidor [EI] despreciable frente a [I]
Tres tipos de inhibición reversible:

a) Inhibición competitiva el inhibidor compite por el mismo lugar que el substrato. La
velocidad máxima queda inafectada por el inhibidor y aumenta la Kmap.
b) Inhibición no competitva el inhibidor se une a la enzima en un lugar diferente al

de la unión al substrato. La inhibición afecta a la velocidad máxima disminuyendo
su. El grado de inhibición depende solamente de la [I] y de la constante Ki.
c) Inhibición acompetitiva el inhibidor se une solamente al complejo Enzima-

Substrato, disminuye la velocidad máxima por el factor (1+ I/Ki) y, paradójicamente,
disminuye la Km por el mismo valor obteniéndose una Kmap menor.
Inhibición por exceso de substrato puede ocurrir. La curva de velocidad en función de

diferentes concentraciones de substrato presenta un máximo. En general se da este tipo
de inhibición cuando el substrato a grandes concentraciones puede reaccionar con la
proteína enzimática en lugar diferente al de la unión enzima substrato
54

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15/10/2013

BLOQUE II: Cinética enzimática y crecimiento microbiano

Tema2: Cinética enzimática

Tema3: Cinética microbiana

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1. Aspectos generales de las enzimas

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1. Aspectos generales de las enzimas

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1. Aspectos generales de las enzimas

Las enzimas se diferencian de los catalizadores químicos ordinarios en varios aspectos

• Velocidades de reacción más elevadas

• Condiciones de reacción más suaves: temperaturas por debajo de 50°C, a la presión

• Mayor especificidad de reacción: especificidad muy grande, tanto respecto a las

• Capacidad para la regulación: propiedad fundamental para la relación entre la actividad

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.1 Propiedades generales de las enzimas

Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.1 Propiedades generales de las enzimas

 La mayoría de los enzimas son bastante sensibles a cambios del pH.

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.1 Propiedades generales de las enzimas

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.1 Propiedades generales de las enzimas

 En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas.

a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor.

 La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima.

 Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la

temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la

desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.1 Propiedades generales de las enzimas

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.2 Modo de acción

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.2 Modo de acción

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.2 Modo de acción

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.2 Modo de acción

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.2 Modo de acción

o Modelo ajuste inducido.

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.3 Regulación de la actividad enzimática

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.3 Regulación de la actividad enzimática

 Las concentraciones del sustrato y de los productos finales

 La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de sustrato.

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.3 Regulación de la actividad enzimática

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.4 Clasificación y nomenclatura.

Un ejemplo sería la glucosa fosfato isomerasa que cataliza la isomerización de la glucosa-6-fosfato en

Biotecnología Industrial Tema2: Cinética enzimática

1.4 Clasificación y nomenclatura.

• Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular

• El nombre de cada enzima puede ser identificado por un código numérico,