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Capitulo II. Marco Teórico

2.1 Lípidos
Los lípidos son moléculas heterogéneas, que se diluyen en solventes apolares.
En su mayoría son insolubles en agua dependiendo de su número de carbonos.
Es por esto que se las han clasificado en función de su solubilidad en lípidos
apolares y polares (Kresge, N., Simoni, R. D., & Hill, R. L. 2010).

Los lípidos más pequeños son los triacilgliceroles o triglicéridos, éstos están
compuestos de tres ácidos grasos que se unen por un enlace éster con un
glicerol (Nelson D, Cox M., 2009). Los extremos polares del glicerol y del
carboxilo hacen que la molécula de lípidos sean apolares e insolubles en agua
(Kresge, et al. 2010).

Las células de depósito de lípidos en los vertebrados son los adipocitos, donde
se almacenan triglicéridos. En las plantas los triglicéridos se almacenan en las
semillas, en estas dos células existen lipasas que hidrolizan estos lípidos para
liberar ácidos grasos que son consumidos por el organismo como combustible
(Nelson D. et al, 2009).

Entre las funciones biológicas de las lipasas está la catálisis de hidrólisis de

ésteres, enlaces que se encuentran en los triglicéridos con cadena larga de
carbono para obtener monocilglicéridos, diacilglicéridos, ácidos grasos libres y
glicerol (García, M. 2005).

2.2 Lipasas: generalidades

Las enzimas son catalizadores de las reacciones que ocurren en los organismos
biológicos. Poseen una alta especificidad y una alta velocidad de reacción, es
por este motivo que se usan de forma muy extensa en la industria (Rivera-Pérez,
C., García-Carreño, F. 2007).

Las lipasas (triacilglicerol éster hidrolasas EC 3.1.1.3) son un grupo de enzimas

hidrolíticas que tienen como función principal catalizar la hidrólisis de los
triglicéridos obteniéndose como productos glicerol y ácidos grasos libres y en un
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proceso intermedio mono y diglicéridos con el mismo sustrato (Aravindan, R.

2007). Las lipasas se encuentran distribuidas ampliamente en la naturaleza
encontrándolas en animales, plantas y microorganismos. El interés en las lipasas
ha crecido en la industria por la selectividad, estabilidad en solventes orgánicos
y la ventaja de síntesis en reacciones con baja actividad de agua (González-
Bacerio, J., Hernández, J. R., & Martínez, M. 2010)

Las lipasas tienen un mecanismo de acción llamado activación interfacial. Al

encontrarse en un medio polar la estructura denominada “lid” está cerrada
protegiendo a la enzima y dejándola actuar en la interfase agua – aceite que se
produce en la emulsión (Houde, A., Kademi, A., & Leblanc, D. 2004)

Los sustratos de las lipasas son ésteres insolubles actuando en la fase orgánico
– acusosa. A esta actividad se la determina lipolítica. La cinética enzimática no
se describe como un modelo de Michaelis – Menten, si no que en este tipo de
actividad el fenómeno de adsorción inicial y formación del complejo enzima –
sustrato ocurre en la fase orgánica, posterior a esto. Los productos son
localizados en la fase acuosa. La actividad esterásica de las lipasas ocurre de
diferente forma ya que las esterasas catalizan hidrólisis de esteres solubles no
siendo indispensable la interfase y modelando una cinética de Michaelis –
Menten. Se puede señalar que las lipasas tienen también función esterasa, no
así las esterasas, ya que estas no catalizan reacciones con sustratos insolubles
por la no existencia de la interfase para su función (Sánchez p. 3-7, 1998).

2.3 Importancia y uso de las lipasas

Se ha documentado el uso de las lipasas desde los años 1900 (Houde, A.,
Kademi, A., y Leblanc D., 2004). Las enzimas que hidrolizan los triglicéridos se
ha estudiado por un periodo mayor a trescientos años, pero no son más de
setenta años que se ha empezado a observar y estudiar la reacción de síntesis
de ésteres (Houde et al., 2004) Claude Bernarnd en el año 1856 pudo descubrir
el efecto de una lipasa en jugo pancreático cuando ésta hidrolizó gotas de aceite
conviritendolo en productos solubles en el medio. Las lipasas varían según su
origen, pudiendo ser este fúngico, bacteriano, de mamíferos y de plantas;
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hidrolizando trigliceridos para obtener ácidos grasos y glicerol o sintetizando

ésteres carboxílicos, demostrando una alta selectividad en su sustrato (Houde,
A., Kademi, A., & Leblanc, D., 2004).
Las enzimas lipolíticas tienen un potencial de aplicación en la Biotecnología que
se han podido evidenciar en la industria aceitera, agroquímicos y de compuestos
aromáticos. Entre estos productos se puede citar la producción de jabón y ácidos
poliinsaturados a partir de aceites y grasas (Kresge et al., 2010).

En la industria se aprovecha la esterificación de triglicéridos en aceites animales

o vegetales y así obtener biodiesel (Sirisha, E., Rajasekar, N., & Narasu, M. L.,
2010). Las lipasas en la industria alimentaria se han usado para mejorar
procesos tradicionales en alimentos preparados, tales como el queso y el vino
(Soria, V., 2003).

Algunas grasas que no tienen mucho valor nutritivo ni comercial, se pueden

convertir a grasas mejor aprovechables mediante procesos de catálisis dirigida
o específica como se puede observar en la producción de mantequilla de cocoa,
así también en la industria y manofactura de margarinas y mantequillas (Ramos-
Izquierdo, B., Bucio-Galindo, a, Bautista-Muñoz, C., Aranda-Ibañez, E., &
Izquierdo-Reyes, F., 2009). La interesterificación e hidrogenación son las
técnicas más usadas para aprovechar la selectividad de las lipasas (Ramos-
Izquierdo et al, 2009).

Asi como la catalisis es una de las funciones principales de la lipasa en

condiciones extraordinarias se puede esterificar acidos grasos libres en ausencia
de solventes organicos por ejemplo transesterificar metil ester en hexano con
isopropildieno glicerol (Aravindan, R. 2007).
En la actualidad, las lipasas se proyectan a aplicaciones biotecnológicas de
interés farmaceútico y en la obtención de compuestos quirales, ayudando a la
resolución de mezclas racémicas (Sánchez, 1998).
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2.4 Microorganismos productores de lipasa

Una de las primeras fuentes de lipasa fue el páncreas de mamíferos y las
semillas de ciertas plantas crucíferas. Actualmente todas se obtienen por
fermentación de microorganismos en biorreactores: hongos, bacterias y
levaduras (Arrib, M. C., Priolo, N. S., 1990).

Los microorganismos poseen potencial para producir lipasas. Estos

generalmente son encontrados en diferentes hábitats, como son desechos,
residuos de aceites vegetales, industrias lácteas, aguas y suelos contaminados,
alimentos en descomposición (Abrunhosa, L., Oliveira, F., Dantas, D.,
Gonçalves, C., & Belo, I. 2013).

La naturaleza es una amplia fuente para aislar nuevos productores de lipasas.

Mediante mecanismo de bioprospección se han aislado bacterias, hongos,
levaduras, destacándose los géneros Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus,
Staphylococcus, Rhizopus, Mucor, Candida, Aspergillus y Geotrichum sp por su
capacidad para producir lipasas extracelulares, (Ertu, S., & Takac, S. 2007).

Las lipasas son la clase de enzimas de mayor uso en procesos biotecnológicos,

procesos químicos (Zouaoui, B., & Bouziane, A. 2011).

Es por esto que los investigadores se han enfocado en buscar nuevos

microorganismos que produzcan lipasas como un desafío para la industria
biotecnológica (Joseph, B., Ramteke, P. W., Thomas, G., & Shrivastava, N.
2007).

La producción de lipasas a partir de microorganismos depende de claros factores

como la temperatura, pH, composición del medio de cultivo y sus fuentes de
carbono, nitrógeno, oxígeno (Houde, A., Kademi, A., & Leblanc, D. 2004).

2.5 Lipasas bacterianas

Las lipasas son producidas por algunos microorganismos, las lipasas aisladas
de bacterias se han estudiado en particular de Pseudomonas y Bacillus sp.
Pseudomona aeruginosa, Pseudomona fluorescens (Houde, A. et al. 2004).
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Estos microorganismos se encuentran en diversos hábitats como desechos

industriales, aceite vegetal procesado, suelo contaminado de aceite,
plantaciones de plantas aceiteras, entre otras.

Las lipasas que son producidas por organismos son extensas en sus usos, hay
lipasas extracelulares, intracelulares, inmovilizadas y lipasas de regiones
específicas. Las lipasas extracelulares son las que se aprovechan para la
producción de enzimas comerciales y para este proceso de extracción y
purificación de lipasa se han desarrollado muchas técnicas (Andualema, B., &
Gessesse, A. 2012).

Las lipasas bacterianas en su mayoría son extracelulares, su producción es

rápida, eficiente y de costo económico bajo, pero el proceso de purificación
conlleva técnicas muy costosas (Selvakumar, R. S. and G., & G. 2008) como un
método alternativo de las lipasas extracelulares se está usando células
completas y aprovechando las lipasas intracelulares de forma inmovilizadas para
disminuir costos de purificación (Andualema B, et al. 2012).

Las lipasas de origen bacteriano son las más usadas en el mercado debido a
que tienen una mejor actividad comparada con las lipasas obtenidas en
levaduras. Su actividad tiene un rango de pH que va desde el neutro al alcalino
además presentan un alto grado de termoestabilidad (Rivera-Pérez et al, 2007).

Las lipasas de origen bacteriano por su estabilidad y producción a nivel

comercial, se han establecido como alternativa en diferentes industrias como en
la ambiental, farmacéutica, alimenticia y en la producción de productos
cosméticos y de uso diario como detergentes (Nwuche, C. O., & Ogbonna, J. C.
2011).

Las lipasas de origen bacteriano tienen interés por su potencial en las

aplicaciones biotecnológicas, motivo por el cual se han desarrollado estudios de
la clonación y caracterización de muchas enzimas bacterianas, mecanismos de
expresión, plegamiento y secreción, con el fin de optimizar su producción y
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purificación (Rosenau y Jaeger, 2004; Milena, A. P., Salud, C. De, Valle, E.,
2013).

2.6 Medios y condiciones de cultivo

Las condiciones que se utilizan para fermentaciones en este tipo de
microorganismos rodean temperaturas de 30 ºC, un pH próximo a 7 y que existan
condiciones aeróbicas. Se recomienda el uso como fuente de carbono mixta
entre un glúcido y un lípido siendo un inductor para la producción de la lipasa.
Como fuente de nitrógeno generalmente se deberá usar sales de amonio o urea
(Alarcón Vivero, M. R. 2008). La producción de las lipasas es inducida por adición
de aceites o grasas en el medio de cultivo. Tanto el glicerol como la glucosa que
es fuente de carbono produce biomasa mas no lipasa. (Coca, J. et al, 2001)

Las lipasas microbianas por lo general están unidas a la membrana de la bacteria

existiendo inhibición para la producción de lipasa. En presencia de cationes de
magnesio se incrementa la cantidad de enzima producida (Alarcón Vivero, et al
2008).

2.7 Actividad lipolítica y rodamina 𝛃

Varias moléculas al momento de ser iluminadas con luz ultravioleta emiten luz
en el espectro visible. A este fenómeno se lo denomina luminiscencia pudiendo
ser de dos tipos: fluorescencia y fosforescencia (Martí F. B., 2002). El fenómeno
de fluorescencia está presente en compuestos inorgánicos y orgánicos, en estos
últimos en su mayoría son derivados de benceno, naftaleno y antracenos con
dos o más anillos aromáticos unidos, que contiene oxígeno o nitrógeno como por
ejemplo la rodamina β (Marti FB et al, 2002).

2.8 Rodamina 𝛃
La rodamina β es un colorante que se observa en el espectro visible de la luz,
emite una longitud de onda entre rojo y violeta, su peso molecular es de 479.02
g/mol y su fórmula es C28H31ClN2O3. Generalmente se usa como un trazador
para observar el flujo del aire en ensayos (Al-Kadhemy, M. F., Alsharuee, I. F., &
Al-Zuky, A. A. D. 2011). Las rodaminas se usan extensamente en técnicas
biotecnológicas como, por ejemplo: microscopia de fluorescencia, citometría de
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flujo, ELISA. La rodamina β emite fluorescencia con longitudes de onda de 350

a 650 nm (Al-Kadhemy M.F. et al 2011).

2.8.1 Ensayo en placa de rodamina 𝛃

En 1987 Kouker y Jeager presentaron un ensayo en placas Petri con rodamina
β que se uso para la detección de actividad lipolítica, usando los sobrenadantes
de los cultivos de crecimiento que contenía aceite de oliva y el colorante
rodamina β. En este ensayo las colonias productoras de lipasa emitían halos de
luz anaranjada al observarse las placas bajo luz UV 350 nm. Esta fluorescencia
era emitida por el complejo que se formaba un complejo entre la rodamina β y
los ácidos grasos libres del aceite vegetal que producían las lipasas (Kouker, G.,
& Jaeger, K. E. 1987; Brockerhoff, H., 2012).

2.9 Identificación bacteriana

En la actualidad la identificación de bacterias se la realiza por medios
convencionales como son las pruebas fenotípicas por su costo y asequibilidad
en el medio (Fernández Olmos, A., García de la Fuente, C., Saéz Nieto, J. A., &
Valdezate Ramos S., 2010). Las pruebas fenotípicas se basan en las
características que se pueden observar como su morfología, crecimiento,
propiedades bioquímicas y metabólicas (Isenberg HD, 2004).
El fundamento de la identificación fenotípica es la comparación de bacterias
desconocidas con patrones de cultivos patrón ya conocidas. La fiabilidad de este
método depende del número de características similares que se encuentren
(Fernández Olmos et al, 2010).
La falta de similitud entre las características que se puede observar en las
pruebas fenotípicas y las pruebas de las cepas patrón hacen de los métodos
fenotípicos sean una identificación no definitiva si no la más probable (Germán
Bou, et al 2011).
Otro método de identificación más específico al tipo fenotípico es el que se ha
realizado mediante métodos genotípicos que se pueden usar como
procedimientos de complemento o alternativos (Clarridge III JE. 2004).