Manual MG E-J 20012019 PDF
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M ICROBIOLOGÍA G ENERAL
M ANUAL
DE
L ABORATORIO
Alumno (a): _______________________Hora: ______
COLABORADORES
Mtro. Enrique Trejo Santana
MASC. María Guadalupe Yasmín Díaz Ruiz
Aprobado por el Honorable Consejo Técnico Consultivo LABORATORIO DE
Enero-Junio 2019 MICROBIOLOGÌA
1
Manual de Microbiología General
2
Manual de Microbiología General
OBJETIVOS
Ø Conocerá las medidas de Bioseguridad para el desarrollo de las prácticas, así como
el manejo adecuado de los Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos (RPBI) en el
Laboratorio de Microbiología, destacando la Normatividad vigente.
Ø Durante el curso, el alumno (a) desarrollará las habilidades necesarias para el
estudio de las características principales de bacterias, protozoos, hongos y virus.
Ø Comprenderá la importancia de la Microbiología en los diferentes campos laborales a
través de visitas.
INTENCIONES EDUCATIVAS
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
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San Luis Potosí, S.L.P., México.
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Av. Dr. Manuel Nava No. 6, Edificio M-101.Tel: (444) 8-26-23-00 ext. 6591
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4° Semestre: Días 2, 3 y 4
PROGRAMA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
Enero - Junio de 2019
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SISTEMA DE EVALUACIÓN
Las prácticas 1- 6 y 9-10 se calificarán de acuerdo al reporte que incluirá los siguientes puntos:
ü Fecha del día de trabajo
ü Nombre de la práctica
§ Evaluación diagnóstica en plataforma educativa Tzaloa 2
§ Diagrama de trabajo 1
§ Resultados 2
§ Discusión de resultados, basada en referencias bibliográficas 3
§ Conclusiones sobre el aprendizaje obtenido 2
10
ü El examen de la plataforma Tzaloa es requisito indispensable para realizar su práctica.
ü Firma del alumno
El tema que se presentará en inglés (práctica 11) será seleccionado por cada grupo y deberá
de cumplir con los requerimientos establecidos en la Plataforma Tzaloa.
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Manual de Microbiología General
ENERO-JUNIO 2019
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PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
BIOSEGURIDAD
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
OBJETIVO GENERAL
• El alumno a través de una visita guiada conocerá la organización y funcionamiento de
laboratorio de Microbiología y elaborará un análisis de riesgo potencial basado en las
actividades del curso.
OBJETIVOS PARTICULARES
• El alumno identificará las barreras primarias y barreras secundarias que aplican en el
laboratorio de Microbiología.
• Conocer y aplicar la correcta clasificación de los residuos generados en el
Laboratorio, según la normativa vigente.
• Practicará el lavado de manos, cultivando con hisopo el antes, el después y el usando
antibacterial para hacer un análisis sobre la carga microbiana.
• Desarrollará habilidades para la esterilización por calor húmedo, así como conocerá el
fundamento de los procedimientos alternativos para la esterilización que cuenta el
Laboratorio.
INTRODUCCIÓN
Concepto de Bioseguridad. Según la OMS (2005) es un conjunto de normas y medidas
para proteger la salud del personal, frente a riesgos biológicos, químicos y físicos a los
que está expuesto en el desempeño de sus funciones, considerando a los pacientes y al
medio ambiente.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD.
Existen cuatro niveles (BSLs), el responsable de laboratorio es la persona específica de
evaluar los riesgos y de aplicar adecuadamente los niveles de bioseguridad
recomendados con base al tipo de microorganismo. En general, el trabajo con agentes
conocidos debe realizarse al nivel de bioseguridad recomendado considerando los
patrones de resistencia a antibióticos, la disponibilidad de vacunas o tratamientos. Ver
videos en Plataforma Tzaloa.
Nivel de Bioseguridad 1. Representa un nivel básico de contención que se basa en
prácticas microbiológicas estándar sin ninguna barrera primaria o secundaria
especialmente recomendada, salvo una pileta para lavado de manos. Reciben este nivel
los laboratorios en los cuales se trabaja con cepas definidas y caracterizadas de
microorganismos viables que no se conocen como generadores sistemáticos de
enfermedades en humanos adultos sanos. El Bacillus subtilis, Naegleria gruberi, el virus
de la hepatitis canina infecciosa.
Día 2
EJERCICIO.
Cultivo: Lavado de manos p-84 con base a las sugerencias de la OMS.
Ver anexo p-85 y para el desarrollo correcto.
Día 3
EJERCICIO. Interpretación de resultados del cultivo de lavado de manos considerando el
antes, el después y después de aplicar sanitizante p-86.
11
Manual de Microbiología General
INTRODUCCIÓN
Para poder estudiar el comportamiento de los microorganismos en el laboratorio, es
necesario contar, entre otras cosas, con material y medios de cultivo estériles.
La esterilización es el proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida de
un objeto, medio o superficie. Para lograr este fin, se cuenta con una variedad de métodos
y su elección dependerá de la naturaleza del material que se va esterilizar.
Los métodos de esterilización son: calor ya sea seco o húmedo, filtración, radiaciones y
agentes químicos.
Esterilización por calor.- Las temperaturas elevadas pueden causar diversos daños a la
célula, que van desde la inactivación de algunas enzimas hasta la desnaturalización de
proteínas y por tanto la muerte de los microorganismos. El efecto dependerá de la
temperatura y del tiempo de exposición. La esterilización por calor puede ser en calor
húmedo o en seco.
12
Manual de Microbiología General
4do DÍA
EJERCICIO.-
ESTERILIZACIÓN POR CALOR
MATERIAL
• Material de vidrio: Cajas Petri, matraces, pipetas serológicas, tubos de ensaye, etc.
• Papel de envoltura, papel aluminio, algodón, cinta testigo p/calor húmedo, masking-tape.
• Equipo de esterilización: Autoclave y horno.
MÉTODO
1. Lavar toda la cristalería con jabón (de preferencia extrán), para eliminar materia
orgánica y enjuagar con abundante agua de la llave y al final con agua destilada, para
eliminar residuos.
2. Secar el material que se va a esterilizar a temperatura ambiente o en un horno.
3. Envolver el número de cajas que le indique el profesor. Las cajas se acomodan de tal
manera que la tapa quede para abajo y el doblez del papel quede del lado de la base
de la caja para que al abrir tengamos cuidado y no vayamos a contaminar la caja, en el
papel se anota el número de cajas, la fecha de preparación y el nombre del operario.
4. A las pipetas se les revisa que no contengan ningún residuo de agua, de tal manera
que el aire pase libremente a través de ellas, se pueden envolver de manera individual o
en la cantidad necesaria, en la envoltura se marca el volumen de cada pipeta, así como
la cantidad de ellas.
5. Los tubos de ensaye deberán llevar el tapón correspondiente ligeramente flojo para
permitir el flujo del aire.
6. Ya que está envuelto se le marcará con cinta testigo para corroborar que el proceso de
esterilización se llevó a cabo por calor húmedo.
5to DÍA
1. De los cultivos asignados por el profesor se realizará el proceso de esterilización
por calor húmedo usando tanto los indicadores del cumplimiento de las
condiciones, se usará el indicador químico (cinta testigo) y el indicador biológico
(ámpula).
6to DÍA
Interpretación de resultados de esterilización. Se entrega el material solicitado, se enfatiza
en los lineamientos de evaluación del reporte y se contribuye al orden y limpieza del
material de laboratorio.
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Manual de Microbiología General
BIBLIOGRAFÍA
• Koneman EW, Allen SD, Dowell VR, Janda WM, Sommers HM & Winn W.
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas. 6ª Edición. USA. Ed. Médica
Panamericana. 2017. p48-56
• Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011 (PDOF el 21 de abril de 2011). Para
la Organización y Funcionamiento de los Laboratorios Clínicos.
• Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 (PDOF el 17 de febrero
de 2003). Protección ambiental–Salud ambiental– Residuos Peligrosos Biológico-
Infecciosos – Clasificación y especificaciones de manejo.
• Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA, 2014.
http://www.cdc.gov/od/ohs
• Occupational Safety & Health Administration, Washington D.C., U.S.A., 2014.
http://www.osha.gov/
• Secretaria de Salud, México. 2014. http://www.ssa,gob.mx
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
OBJETIVO GENERAL
• Conocer y describir las tinciones más comunes en el laboratorio de Microbiología
para identificación presuntiva de microorganismos.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Identificar las características morfológicas de cápsulas y esporas.
• Diferenciar a través de las tinciones de Gram y Ziehl Neelsen la composición de
la pared de algunos microorganismos.
INTRODUCCIÓN
Una de las características de los microorganismos es su minúsculo tamaño que los hace
imperceptibles a simple vista y aunado a su transparencia, obliga a utilizar además del
microscopio, técnicas especiales para observar y estudiar su morfología.
La forma de realizar preparaciones de microorganismos para su estudio microscópico,
depende del tipo de microscopio, el propósito específico del estudio y el tipo de germen.
Esta práctica hace referencia a las preparaciones y tinciones más utilizadas para la
observación al microscópico de diversos tipos de gérmenes, con el microscopio óptico, en
el cual los microorganismos de diferentes especímenes pueden observarse en
preparaciones en fresco ó preparaciones fijas y teñidas.
1er DÍA
A) TINCIONES SELECTIVAS
MATERIAL
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Manual de Microbiología General
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Manual de Microbiología General
2do DÍA
MÉTODO: TINCIÓN SELECTIVA DE ESPORAS
Técnica de Schaefer y Fulton
Esporas (Bacillus subtilis)
TINCIÓN DE ESPORAS
3er DÍA
Revisión de laminillas y discusión de Tinciones Selectivas
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Manual de Microbiología General
4to DÍA
B) TINCIONES DIFERENCIALES
MATERIAL
• Microscopio
• Portaobjetos y cubreobjetos.
• Asas de siembra
• Reactivos para la tinción de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol, acetona y safranina
• Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus sp, Candida albicans.
MÉTODO
Realizar una suspensión de cada uno de los microorganismos, se fija al calor pasando una
o dos veces sobre la flama del mechero y se realizan los siguientes pasos: Fig. 1.
19
Manual de Microbiología General
5to DÍA
MATERIAL
• Microscopio
• Portaobjetos y cubreobjetos.
• Asas de siembra
• Reactivos para la tinción de Kinyou: Carbolfucsina, alcohol-ácido, azul de metileno
• Cultivo de Mycobacterium gordonae
Los Bacilos Alcohol Ácido Resistentes (BAAR) tienen esta característica debido a que su
pared celular tiene un alto contenido de lípidos (arriba del 60%) incluyendo ceras A, B, C y
D, unidos a polisacáridos. En los microorganismos acidorresistentes, una vez que el
colorante se ha combinado con las sustancias céreas, estos resisten la decoloración con
alcohol ácido, pues ni el fenol ni las ceras son solubles en éste y para observarlos se
aplica como colorante de contraste el azul de metileno.
1.- Utilizando carbolfucsina, que es una mezcla de fucsina con fenol, en el cual existen dos
variantes de ésta, ya sea utilizando calor que suaviza las ceras y facilita la solubilidad del
colorante en ellas, conocida con el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen. Fig. 2.3. O el
método en frío que recibe el nombre de tinción de Kinyou.
BIBLIOGRAFÍA
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Manual de Microbiología General
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
MEDIOS DE CULTIVO
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
OBJETIVO GENERAL
• Conocer la composición, uso, almacenamiento y aplicaciones de algunos medios
de cultivo.
• Describir la morfología macroscópica y microscópica de algunos
microorganismos.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Elegir y evaluar el procedimiento de preparación del medio de cultivo con base a
las especificaciones del fabricante.
• Diferenciar las técnicas de siembra más comunes en medio sólido, semisólido y
líquido, así como la morfología macroscópica y microscópica de algunos
microorganismos.
INTRODUCCIÓN
Todas las formas de vida, desde los microorganismos hasta los seres humanos, toman del
ambiente sustancias, denominadas nutrientes, que requieren para sintetizar su material
celular, generar energía y efectuar un funcionamiento adecuado. Los microorganismos son
extraordinariamente diversos en cuanto ha sus requerimientos y propiedades fisiológicas
específicas.
Por su diminuto tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino
que es necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir
favorecer su multiplicación in vitro, en ambientes especiales que proporcionen las
condiciones semejantes a las de su hábitat natural. Aparte de los nutrientes para el
microorganismo, se debe de controlar: El pH, la necesidad de gases, pues afectan el
desarrollo microbiano como el O2 y CO2, suministro de luz, control de la temperatura que
puede determinar la velocidad de crecimiento.
Los medios de cultivo pueden variar en su composición, no sólo en función del grupo
microbiano para el cual se utilizan, sino también por su complejidad química, su estado
físico y su aplicación.
Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:
1er DÍA
A) PREPARACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO (APEGADA A
ESPECIFICACIONES DEL FABRICANTE)
EJERCICIO
MATERIAL
• Material de cristalería estéril
• Medios deshidratados de diversos tipos
MÉTODO
8. Para el vaciamiento de los medios de cultivo en las cajas estas deben de estar
previamente identificadas y en condiciones de esterilidad.
9. Para comprobar la esterilidad de los medios, meter una muestra de tubos y cajas en la
estufa e incubar durante 24 hrs. a 37°C.
10.Los medios cuya esterilidad ha sido comprobada, serán utilizados en la siguiente
práctica.
DIAGRAMA DE TRABAJO
24
Manual de Microbiología General
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que
permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible controlar las
condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismos. Una de las
técnicas más usadas consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, al efectuar este procedimiento es necesario considerar
que en el aire que nos circunda y en la superficie del área de trabajo, existen otros muchos
microorganismos, debido a esto es necesario tomar precauciones para impedir que estos
penetren y contaminen los cultivos en estudio. Para favorecer el desarrollo de un
microorganismo en particular, es necesario considerar no sólo el aspecto nutricional, sino
también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de
cultivo se debe de ajustar el pH, concentración de sales y durante la incubación,
condiciones tales como: la temperatura, la aireación, y la luminosidad. La aplicación de
estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así
como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de éste modo, el estudio,
caracterización, aplicación, y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos,
depende del tipo de microorganismos y el propósito específico del estudio. Fig. 1, 2 y 3.
Un medio líquido puede ser inoculado mediante un asa microbiológica, un hisopo, una
pipeta serológica o una pipeta Pasteur, depositando dentro del caldo y homogenizando.
Los medios semisólidos se inoculan con asa recta, en un ángulo de 90° con respecto a
la superficie del medio, son usados para estudiar la movilidad de los microorganismos.
MATERIAL
25
Manual de Microbiología General
2do DÍA
PROCEDIMIENTO
1. Siguiendo las indicaciones anteriores y con el asa recta, se pica por el centro de los
tubos y posteriormente se siembra por estría en la superficie de pico de flauta.
26
Manual de Microbiología General
Fig. 3.3 Aislamiento por agotamiento por estrías. (Díaz y col., 2005).
27
Manual de Microbiología General
3er DÍA
INTRODUCCIÓN
Cocos
Bacilos
Espirales
Fig. 3.4 Ejemplos de morfología microscópica. (Escobar Gutiérrez A., Atlas de Bacteriología. 2ª. Barcelona, Editorial Scheramex, 1999)
28
Manual de Microbiología General
a) b) c) d)
Fig.Ejemplos
Fig. 3.6 2. Ejemplos de morfología
de morfología macroscópica.
macroscópica (De Prescott,
en medio Harley, Klein.
sólido. (Prescott y col.,2000.
2008).
Microbiología. Mc. Graw-Hill).
Existen algunos microorganismos que en agar sangre dan una hemólisis típica, que puede
orientar para la identificación de los microorganismos, esta hemólisis puede ser:
Alfa (α): Coloración verde del agar sangre alrededor de las colonias con ligera aclaración.
Beta (β): Zona de aclaración completa del agar sangre alrededor de las colonias.
Gama (γ): hay cambio en el medio que rodea a las colonias, no hay lisis de los glóbulos
rojos.
29
Manual de Microbiología General
MATERIAL
MÉTODO
1. Realizar las observaciones pertinentes tales como: Forma, elevación y bordes con
ayuda del estereoscopio de 3 diferentes colonias en medios sólidos.
2. Describir las características culturales de los microorganismos cultivados en tubo.
3. Familiarizarse con la correcta descripción de las características hemolíticas.
BIBLIOGRAFÍA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
1. Curva de crecimiento.
2. Medición del crecimiento
3. Manejo y tratamiento de sustancias químicas peligrosas
OBJETIVO GENERAL
• Conocer los métodos utilizados para cuantificación de microorganismos, así como
analizar sus aplicaciones y limitaciones.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Realizar algunas de las principales técnicas utilizadas para la cuantificación de
microorganismos.
• Analizar los resultados de cada una de las técnicas, así como su aplicación en el
campo profesional de la Microbiología.
INTRODUCCIÓN
son el método de asa calibrada, el método de dilución y vaciado en placa, recuento por
filtración en membrana, número más probable, etc.
Método de asa calibrada, el cual consiste en inocular con un volumen definido (0.001
mL), sobre la superficie del agar mediante la técnica de siembra masiva. Las colonias
serán contadas y se multiplicará por el factor de dilución (1000) para reportar las UFC/mL.
Métodos de dilución y vaciado en placa involucran la dispersión de la muestra que se
estudia, en un medio de agar. Se basa en el supuesto de que cada célula bacteriana,
fúngica o espora incluida en el medio con agar o en su superficie, al multiplicarse dará
origen a un cúmulo de células que producen una colonia.
1er DÍA
A) ESCALA DE MCFARLAND
MATERIAL
• 5 tubos con capacidad de 10 mL con tapón
• 1 pipeta de 1.0 mL y una de 10 mL
• pipetas estériles de 5 y 10 mL
• cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo
• espectrofotómetro
• filtro de λ = 625 nm
• solución de cloruro de bario al 1%, ácido sulfúrico al 1%
PROCEDIMIENTO
1. Marcar los tubos correspondientes a la tabla de la escala.
2. Adicionar las cantidades establecidas en la tabla 1 de las sustancias indicadas.
3. Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada y determinar la absorbancia de las
diferentes mezclas.
4. Graficar en el eje de las ordenadas los valores de la DO y en las abscisas el
número de bacterias
32
Manual de Microbiología General
PROCEDIMIENTO
2do DÍA
MATERIAL
MÉTODO
MÉTODO
1. Se debe de tener la cantidad de cajas de Petri necesarias para el vertido en placa
2. Se debe de considerar que el volumen adecuado para cada caja es de aprox. 20 mL
33
Manual de Microbiología General
3. Una vez esterilizado el medio, se deja enfriar a una temperatura entre 40 y 50°C.
4. Cada una de las cajas deben de estar identificadas con el nombre o siglas del medio.
5. Se vierte 1 mL de la suspensión problema a la base de la caja de Petri.
6. El medio se deposita en la base de la caja de Petri, evitando la formación de burbujas.
7. Se homogeniza la mezcla y se deja reposar hasta su solidificación.
8. Se incuba a 37°C, invirtiendo la caja, por 24h.
Fig 4.1 Cuantificación de microorganismos viable. A Método de asa calibrada. B Método de vaciado en placa
3er DÍA
1. Revisión del gráfico de valores de la DO vs el número de bacterias.
BIBLIOGRAFÍA
• Díaz R., Gamaso, C. López-Goñi, I. Manual Práctico de Microbiología. 3ª Edición.
MASSON. Barcelona.2005.
• Tortora, Funke, Case. Microbiología. 9ª Edición. San Francisco. Ed. PEARSON. 2007.
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PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
OBJETIVO GENERAL
• Conocer, comprender y analizar las pruebas bioquímicas necesarias para la
identificación correcta de diferentes microorganismos
OBJETIVOS PARTICULARES
• El alumno pondrá en práctica las técnicas de siembra aprendidas en la siembra
de pruebas bioquímicas para identificación de microorganismos
• El alumno analizará los resultados obtenidos debido a la actividad metabólica de
los microorganismos en estudio y concluirá para emitir un resultado
INTRODUCCIÓN
Todos los seres vivos tienen la capacidad de efectuar una serie de reacciones que les
permiten incorporar y transformar a diversos compuestos. El término metabolismo se
refiere al conjunto de reacciones que se dan en la célula y que conducen a la
transformación de diversos compuestos, en estas transformaciones participan diferentes
enzimas que catalizan reacciones (tablas 1-5). La mayor parte de las pruebas que se
utilizan para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de bacterias, por medio de lo
cual puede hacerse una identificación final de especie, se lleva a cabo mediante el
subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales, cuyos resultados
de incorporar o transformar los nutrientes de cada medio se interpretan para lograr la
identificación del microorganismo problema al cabo de 24 hrs. de incubación a 37oC. (Fig.
1, 2 y 3).
35
Manual de Microbiología General
1er DÍA
A) INOCULACIÓN Y SIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
MATERIAL
1. Lápiz graso o marcador
2. Mechero de Bunsen
3. Asas y portaojetos
4. Gradillas
5. Pruebas bioquímicas: A. Citrato de Simmons, A. Hierro de Kligler, A. FEA, A. LIA,
Medio SIM, Gelatina, Medio MIO, C. Urea, C. Malonato y Medio VP-RM.
6. Reactivos reveladores de pruebas bioquímicas: oxidasa (clorhidrato de tetrametil-p-
fenilendiamina), solución de rojo de metilo, α-naftol, hidróxido de potasio, peróxido de
hidrógeno, reactivo de Kovacs o reactivo de Ehrlich.
7. Cultivo de 18-24 horas de: E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca, Enterobacter sp., P.
mirabilis y P. vulgaris, Serratia marcescens, S. aureus, P. aeruginosa y ECN y otros.
MÉTODO
1. Se manejarán dos cultivos por persona (control y problema) los cuales para poder
verificar que están puros se observarán sus características macroscópicas culturales y
se les hará tinción de Gram, para efectuar las diferentes pruebas bioquímicas, a los
microorganismos en estudio. (Figura 6.1)
2. Si después de la identificación se tienen un microorganismo presente sugestivo de
enterobacteria, se procede a la siembra en las pruebas bioquímicas, primero debemos
sembrar en citrato de Simmons, para después sembrar en medios líquidos, después
sembramos en medios semisólidos por picadura y por último en medios sólidos en pico
de flauta.
3. Incubar los tubos de las pruebas bioquímicas (37ºC) con excepción de la prueba de
gelatina (se debe dejar a temperatura ambiente), los cuales se observarán a las 24
horas (siguiente sesión).
4. Se les coloca los reactivos reveladores de la reacción bioquímica que se llevó a cabo,
se realiza la interpretación de los resultados comparando con los cambios con pruebas
bioquímicas control o bien con las de sus compañeros.
MÉTODO
1. Marcar los tubos y gradillas con el nombre y equipo.
2. Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema.
3. En condiciones de asepsia, tomar una asada (asa en punta) del cultivo, inocular el tubo
con el microorganismo correspondiente.
4. Incubar a 37°C durante 24h.
5. Después de la incubación, observar si hubo desarrollo.
6. El medio se alcaliniza y se torna azul, indicando una prueba positiva
36
Manual de Microbiología General
MÉTODO
1. Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema.
2. En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo, inocular el tubo con el
microorganismo correspondiente.
3. Incubar a 37°C durante 24h.
4. Agregar a cada uno de los tubos 5 gotas del indicador rojo de metilo.
5. La presencia de un pH menor a 4.4 da una coloración roja indicando una prueba
positiva.
MÉTODO
1. Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema.
2. En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo, inocular el tubo con el
microorganismo correspondiente.
3. Incubar a 37°C durante 24h.
4. Al finalizar el período de incubación, añadir 0.6 mL de alfa-naftol y 0.2 mL de hidróxido
de potasio (es esencial que se agreguen los reactivos en este orden).
5. Agitar cuidadosamente los tubos para exponer el medio al oxígeno y dejarlos reposar
durante 10 a 15 minutos.
6. Después del tiempo de reposo el desarrollo de un color rojo indica una prueba positiva.
MÉTODO
1. Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema.
2. En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo, inocular el tubo con el
microorganismo correspondiente.
3. Incubar a 37°C durante 24h.
4. Observar los cambios, el desarrollo de un color rosa intenso indica una prueba positiva.
E.-INDOL
MÉTODO
1. Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema, la prueba
se puede valorar en los medios semisólidos SIM (Sulfhídrico-Indol-Movilidad) ó en el
medio MIO (Movilidad- Indol-Ornitina).
2. En condiciones de asepsia, tomar una asada (asa en punta) del cultivo, inocular el tubo
con el microorganismo correspondiente.
3. Incubar a 37°C durante 24h.
4. Al finalizar el período, añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs, si se emplea el reactivo
de Erlich, este paso debe ser precedido por la adición de 1 mL de cloroformo.
5. El desarrollo de un anillo color fucsia en la parte superior del medio segundos después
de añadir el reactivo indica una prueba positiva.
37
Manual de Microbiología General
Fig. 5.1 Cultivo, tinción de Gram, siembra e identificación bacteriana. (Díaz y col., 2005). A) Bioquímicas sin inocular.
38
Manual de Microbiología General
2do DÍA
B) REVELADO DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
39
Manual de Microbiología General
Los resultados de las pruebas bioquímicas se leen de acuerdo a las tablas siguientes,
para identificar el microorganismo presente sugestivo de enterobacteria.
TABLA 2
PRUEBA INTERPRETACIÓN
Fermentación de glucosa en medio de kligler (+) es enterobacteria
Oxidasa (-) es enterobacteria
Reducción de nitratos a nitritos (+) es enterobacteria
TABLA 3
TABLA 4
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Manual de Microbiología General
TABLA 5.
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Manual de Microbiología General
Fig. 5.2 También se utilizan para bacilos Gram negativos oxidasa positivo ej. V. cholerae O1
Fig. 5.3 Tira con 20 sustratos que además de identificar enterobacterias permite la identificación de otros
Bacilos Gram negativos oxidasa positivos como V. cholerae y Pseudomonas sp. etc.
3er DÍA
C) INTERPRETACIÓN Y DISCUSIÓN
Discusión de la relevancia del microorganismo encontrado e interpretación de la prueba
API
BIBLIOGRAFÍA
• Koneman/Allen/Dowell/Janda/Sommers/Win. Diagnóstico Microbiológico. Texto y
Atlas. USA: 6ª. edición. Ed. Médica Panamericana. USA 2008.
• Mac. Faddin Jean F. Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3ª. edición. Ed. Médica Panamericana. Argentina. 2003.
• Prescott, Harley, Klein. Microbiología. 7ª edición. Ed. Mc Graw-Hill. España. 2008.
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Manual de Microbiología General
PRÁCTICA
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Av. Dr. Manuel Nava Núm. 6 Edificio M-101. Tel: 8-26-23-00 ext. 6591
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San Luis Potosí, S.L.P., México.
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
1. Generalidades sobre los antibióticos y su clasificación
2. Mecanismos de acción de los antibióticos
3. Métodos estandarizados para realizar pruebas de susceptibilidad
OBJETIVO GENERAL
• El alumno conocerá los diferentes métodos para realizar pruebas de
susceptibilidad basados en lineamientos internacionales.
OBJETIVOS PARTICULARES
• El alumno desarrollara habilidades para la realización de las pruebas de
susceptibilidad por el método de difusión en placa (Kirby-Bauer) apegados a la
CLSI
• Realizará e interpretará la técnica por dilución en tubo para Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB), apegados a la CLSI
INTRODUCCIÓN
La medicina moderna depende de los quimioterapéuticos, productos químicos que se
emplean para tratar las enfermedades. La mayoría de estos agentes son antibióticos,
productos microbianos o sus derivados que pueden matar a los microorganismos. El
descubrimiento de los antibióticos y el desarrollo de nuevos fármacos más potentes han
transformado la medicina moderna y ha aliviado el sufrimiento humano, además de que se
han revelado excepcionalmente útiles en la industria, la investigación, etc.
43
Manual de Microbiología General
1er DÍA
MATERIAL
• Lápiz graso o marcador
• Gradillas
• 15 tubos de ensaye de 13 x 100
• Pipetas serológicas de 10, 5 y 1mL estériles
• Cultivo de 24 h. de Escherichia coli y Serratia marcescens
• Estándar de Mc Farland del tubo 0.5 como referncia para determinar la concentración
de microorganismos a usar. Antibiótico: Amikacina
• 15 mL de caldo Mueller Hinton
MÉTODO
1. Marcar los tubos del número 1 al 15.
2. Preparar la solución de antibiótico a una concentración de 512 µg / mL.
3. Preparar la suspensión bacteriana con el de Mc Farland de 0.5.
4. Agregar a los tubos 1 y 2, 1 mL del antibiótico (Amikacina 512 µg / mL).
5. Adicionar del tubo número 2 al 15, 1 mL de caldo Mueller Hintón
6. Realizar diluciones seriadas transfiriendo 1 mL del tubo 2 al tubo 3 hasta el tubo13, el
mL sobrante del tubo 13 se desecha.
7. Agregar 1 mL de la suspensión de microorganismo del tubo 1 al tubo 14. El tubo 15 es
el control negativo.
8. Incubar de 35 a 37°C, por 18 a 24h.
9. Interpretar la turbidez y comparar el punto de corte para la CMI. (Figura 1).
10. Para la CMB sembrar los tubos sin turbidez incluyendo los controles + (C/D) y – (S/D).
44
Manual de Microbiología General
2do. DÍA
Revisar los resultados de la sesión anterior, determinando cuál es el tubo donde se
observa el punto de corte (CMI) y sembrar para obtener la CMB.
MATERIAL
MÉTODO
1. Marcar la caja con el nombre del microorganismo, fecha, hora y nombre del alumno
que realiza la prueba.
2. Preparar la suspensión del microorganismo, en un tubo con 3 mL de solución salina
estéril, comparando la turbidez con el estándar de Mc Farland de 0.5.
45
Manual de Microbiología General
3er DÍA.
Revisión de los resultados del método de difusión de Kirby-Bauer.
BIBLIOGRAFIA
• Díaz R., Gamaso, C. López-Goñi, I. Manual Práctico de Microbiología. 3ª Edición.
MASSON. Barcelona. 2005
• Koneman/Allen/Dowell/Janda/Sommers/Win. Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas.
USA: 6ª. edición. Ed. Médica Panamericana. USA 2008.
• Prescott, Harley, Klein. Microbiología. 7ª edición. Ed. Mc Graw-Hill. España. 2008.
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Manual de Microbiología General
PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
PARASITOLOGÍA
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno deberá:
1. Conocer los pasos para realizar una adecuada iluminación de Köhler.
2. Conocer y comprender la definición de: parásito, hospedero y vector.
3. Conocer las principales forma parasitarias y sus características morfologicas.
4. Observar y comprender los videos que se encuentran en la plataforma digital Tzaloa.
OBJETIVO GENERAL
Conocer e identificar las principales características morfológicas de algunos parásitos
OBJETIVOS PARTICULARES
A) INTRODUCCIÓN A LA PARASITOLOGÍA
Seguramente las asociaciones biológicas entre los seres vivos se iniciaron con la aparición de la
vida misma sobre el planeta Tierra al competir éstos por el espacio y ponerse en contacto íntimo.
Algunos autores señalan asociaciones parasitarias encontradas en restos fósiles de protozoarios
con concha calcárea llamados foraminíferos, y algas marinas con más de 530 millones de
años de antigüedad, así que la asociación parasitaria es muchísimo más antigua que la
propia existencia del hombre en el planeta (el cual apareció hace 3 millones de años) (Tay,
Lara, & O., 2010).
Dentro de las diferentes asociaciones biológicas que existen, el parasitismo ocurre cuando
un ser vivo (parásito) se aloja en otro de diferente especie (huésped u hospedero) del cual
deriva alimento y le produce algún daño en magnitud variable (Botero, 2012) (Tay & Lopez
R., 2012).
La parasitología se inicia con el hallazgo de los parásitos por las antiguas culturas china,
griega, egipcia y persa; las cuales, de acuerdo a los datos históricos, se logró distinguir los
cuadros de paludismo, el conocimiento de Taenia sp, Ascaris lumbricoides y Dracunculus
sp, como un agentes causales de enfermedades, relacionar síntomas con enfermedades
que hoy en día conocemos, como la esquistosomiasis, y otras relacionadas con los
alimentos de consumo habitual como la triquinelosis (Botero, 2012) (Tay & Lopez R.,
2012) (Tay, Lara, & O., 2010).
48
Manual de Microbiología General
B) FACTORES DE RIESGO
49
Manual de Microbiología General
Es importante comprender que los parásitos presentan diferentes fases evolutivas, que
entre algunos géneros de parásitos podrán presentar similitudes, sin embargo, cada
agente presentará características específicas que ayudarán a su correcta identificación.
Las fases evolutivas se pueden clasificar en: quiste, trofozoíto, huevo, larva, larva
filariforme, larva rhabditiforme, parásito adulto, esquizonte, tripomastigote, amastigote,
gametocito, entre otras; en esta sesión de laboratorio, se revisarán los aspectos generales
de algunos protozoarios (tabla 7.1) y algunos helmintos (tabla 7.2).
50
Manual de Microbiología General
DÍA 1
Observar y discutir acerca de las características morfológicas, mecanismos de locomoción
y diferentes fases evolutivas de los agentes parasitarios (protozoarios intestinales) que le
proporcionará y/o le mostrará el profesor.
DÍA 2
Observar y discutir acerca de las características morfológicas, mecanismos de locomoción
y diferentes fases evolutivas de los agentes parasitarios (nemátodos y Plasmodium sp.)
que le proporcionará y/o le mostrará el profesor.
EQUIPO
Microscopio
OTROS
Laminillas fijas (controles positivos)
Filamentos intermedios
Microtúbulos
Se denominan movimientos natatorios aquellos que ocurren gracias a los cilios o flagelos,
y movimientos de reptación o ameboideos aquellos que se dan por la formación de los
seudópodos.
51
Manual de Microbiología General
Los cilios y flagelos son estructuras celulares locomotoras, conformados por agregados
internos de microtúbulos. Estas estructuras de movimiento se diferencian entre sí por
medio de su longitud; los cilios suelen medir como máximo 10 µm y los flagelos miden al
menos 10 µm; esta diferencia de longitud determinara el movimiento resultante en estas
estructuras (aunque el mecanismo molecular es prácticamente idéntico); cabe señalar que
ambas estructuras se encuentran fijas a los corpúsculos basales y que están recubiertos
por la membrana celular.
Los cilios y los flagelos están constituidos por un conjunto de microtúbulos, dispuestos de
acuerdo a la fórmula (9x2)+2 (Figura 7.3).
El movimiento que realizan los cilios asemeja al de una fusta cuando ésta es doblada;
doblándose el cilio a lo largo de toda su longitud (Figura 7.5). En cambio, el movimiento
del flagelo suele ser serpenteante, el mecanismo molecular es idéntico al realizado por los
cilios, solo que por la longitud del flagelo, el movimiento asemeja al movimiento de una
célula (Figura 7.4).
Figura 7.4. Dinámica microscópica del movimiento de los cilios y los flagelos.
D.2. MOVIMIENTOS DE REPTACIÓN.
52
Manual de Microbiología General
DÍA 3
Taller de identificación parasitológica.
Objetivo: que el alumno sea capaz de identificar agentes parasitarios a partir de las
características morfológicas que cada uno presenta.
PROCEDIMIENTO
Mecanismo de
Nombre del parásito Fase evolutiva
transmisión
Microscopio 1
Microscopio 2
Microscopio 3
Microscopio 4
53
Manual de Microbiología General
DÍA 4
Observación microscópica de la locomoción de los protozoarios.
Se recolectará una muestra de agua estancada por equipo, procurando que sean de
diferentes sitios entre sí, en un frasco de boca ancha y con tapa de rosca procurando
además recolectar sedimentos, vegetación sumergida, materia orgánica, etc. El volumen a
recolectar por equipo será de aproximadamente 80 mL.
Cada muestra deberá de etiquetarse con los siguientes datos: lugar de recolección, fecha
de recolección, profundidad del muestreo (en cm), sitio de recolección (charco, estanque,
etc).
MATERIAL
REACTIVOS
Caja de Petri
Pipeta pasteur desechable Lugol
Portaobjetos Azul de tripano
Cubreobjetos Solución salina isotónica
Aplicadores Hipoclorito de sodio al 6%
Vaso de Petri
ESPECIMEN
EQUIPO
Muestra de agua estancada recolectada
Microscopio Muestra positiva para Trichomonas sp
PROCEDIMIENTO
Fundamento.
54
Manual de Microbiología General
Técnica
Figura
7.8. Estructura general de una amiba.
Figura 7.9. Estructura general de un
flagelado.
DÍA 5
Observación microscópica a partir de una muestra biológica.
MATERIAL
55
Manual de Microbiología General
ESPECIMEN
Recolección
1) Lavarse las manos antes y después de la recolección.
2) Defecar en un recipiente seco (plástico ó desechable)
3) Con la ayuda de un abatelenguas colocar una porción (Del tamaño de una nuez) de
la muestra en un recipiente de boca ancha
4) Transportar la muestra al laboratorio dentro de las primeras dos horas
EQUIPO
Centrífuga
Microscopio
REACTIVOS
Lugol
Solución de sulfato de zinc densidad 1.18
Agua destilada
TECNICA
1) Homogeneizar la muestra de materia fecal preparando una suspensión en 10 partes
con agua destilada
2) Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro partes, utilizando el
embudo sobre un tubo de ensaye.
3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min.
4) Decantar el líquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida
anterior.
5) Re suspender y repetir dos veces más el procedimiento.
6) Decantar nuevamente el líquido sobrenadante remplazándolo por igual cantidad de
solución de sulfato de zinc con una densidad 1.18, re suspender muy bien con el
sedimento.
7) Centrifugar a 1500 rpm durante 1 min.
56
Manual de Microbiología General
Diversos autores y organismos como la CDC (Centers for Disease Control and
Prevention), explican diversos mecanismos de transmisión parasitaria. Se denomina
mecanismo de transmisión, al conjunto de estrategias que utiliza un agente para estar o
iniciar un contacto con el huésped, los mecanismos de transmisión pueden ser únicos o
variados y a su vez pueden ser sucesivos (Centers for Disease Control and Prevention,
2018). En la tabla 7.4 se explican algunos tipos de transmisión de los agentes parasitarios.
DÍA 6
Presentación en Power point del tema asignado por parte del profesor sobre agentes
parasitarios.
BIBLIOGRAFÍA
Centers for Disease Control and Prevention, C. (04 de Junio de 2015). Centers for Disease Control and Prevention.
Recuperado el 28 de Junio de 2018, de Centers for Disease Control and Prevention:
https://www.cdc.gov/std/tg2015/default.htm
Centers for Disease Control and Prevention, C. (21 de Febrero de 2018). Centers for Disease Control and Prevention.
Recuperado el 01 de Julio de 2018, de Centers for Disease Control and Prevention:
https://www.cdc.gov/parasites/transmission/index.html
Botero, D. (2012). Parasitosis humanas. Medellin, Colombia: CIB Fondo Editorial.
Díaz Ruíz, M. G., Gamez López , L. R., & Trejo Santana, E. (2017). Manual de prácticas de laboratorio de
parasitología. San Luis Potosí, México: UASLP-FCQ.
Ministerio de sanidad, consumo y bienestar social. (01 de Marzo de 2017). Ministerio de sanidad, consumo y bienestar
social. Recuperado el 29 de Junio de 2018, de http://www.msssi.gob.es/:
http://www.msssi.gob.es/ciudadanos/enfLesiones/enfTransmisibles/sida/publicaciones/profSanitarios/docConse
nsoDiagnosticoTtoITSAdultos.pdf
OMS, O. (03 de Diciembre de 2015). Organización Mundial de la Salud. Recuperado el 01 de Julio de 2018, de
Organización Mundial de la Salud: http://www.who.int/es/news-room/detail/03-12-2015-who-s-first-ever-
global-estimates-of-foodborne-diseases-find-children-under-5-account-for-almost-one-third-of-deaths
Organización Mundial de la Salud, O. (16 de Mayo de 1995). Medios auxiliares para el diagnóstico de los parásitos
intestinales. Medios auxiliares para el diagnóstico de los parásitos intestinales. Ginebra, Ginebra, Suiza: OMS.
Obtenido de file:///C:/Users/Parasitologia/Desktop/9243544764_spa.pdf
Plattner, H., & Hentschel, J. (2001). Manual de biología celular. Barcelona, España: Ediciones Omega.
Tay, J. G., Lara, R., & O., V. (2010). Parasitología Médica de Tay (8a. ed.). México: Mendez Editores.
Tay, J. G., & Lopez R., M. J. (2012). Microbiología y parasitología médicas de Tay. (4a. ed.). México: Medndez
Editores.
Vázquez Drake, C., & del Risco Barrios , U. (Junio de 2005). Incidencia de errores en la identificación microscópica de
parásitos intestinales en unidades de salud de Camagüey. Archivo Médico de Camagüey, 73-81. Obtenido de
http://scielo.sld.cu/pdf/amc/v9n3/amc080305.pdf
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Manual de Microbiología General
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Manual de Microbiología General
PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
MICOLOGÍA
MORFOLOGÍA GENERAL DE LOS HONGOS
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe conocer:
1. Generalidades y clasificación de hongos comunes en el ambiente.
2. Medios de cultivo y Técnicas de siembra para cultivo e identificación de hongos.
3. Características macroscópicas y microscópicas de algunos de los hongos contaminantes
más comunes.
OBJETIVO GENERAL
• El alumno conocerá algunos hongos comunes en el ambiente y aprenderá a
cultivarlos e identificar estructuras de morfología macroscópica y microscópica.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Capacitar al alumno para seleccionar los medios de cultivo, las condiciones de
crecimiento y las técnicas apropiadas para el aislamiento de hongos a partir de
diferentes sustratos.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de los hongos viven de manera natural en el suelo, en él juegan un papel
importante para la degradación de la materia orgánica; aunque algunos de ellos invaden las
plantas, causándoles enfermedades. Otros hongos, al encontrarse en el aire, pueden
generar problemas de contaminación en diferentes tipos de industrias. Hay otros hongos
que al penetrar al organismo por diferentes vías (cutánea, traumática, respiratoria,
digestiva, etc.), pueden implantarse en los tejidos causando enfermedades.
Existen varias técnicas para aislar diferentes tipos de hongos, de diversos sustratos. Por
ejemplo: La técnica de dilución y vaciado en placa, que se utiliza para sustratos muy
contaminados (con una gran diversidad de hongos), en los que es difícil separar las
especies de hongos, por la gran cantidad de ellas.
Otra técnica es la de inoculación por punto, que se utiliza para aislar hongos a partir de
muestras clínicas y para sustratos poco contaminados (con poca diversidad de hongos).
62
Manual de Microbiología General
MATERIAL
Cajas con Agar Sabouraud Dextrosa adicionado de Rosa de Bengala.
Tubos con 4.5 ml. de agua peptonada al 1% estéril.
Tubos con Agar Sabouraud Dextrosa en pico de flauta.
Caja de Petri con Agar Sabouraud Dextrosa
Pipetas estériles.
Asa con punta doblada en ángulo recto.
Sustratos para aislamiento:
i. Tierra de jardín ó de maceta.
ii. Alimento contaminado por hongos.
1er. DÍA
A) TÉCNICA DE DILUCIÓN Y VACIADO EN PLACA
PROCEDIMIENTO
1) Pesar 0.5 gr. de tierra de jardín ó maceta y colocarla en un tubo con 4.5 mL de agua
peptonada estéril al 1%; para obtener de esta manera una dilución 1:10. Este tubo se
rotulará con el número 1.
2) Homogeneizar el contenido del tubo No. 1. Con pipeta estéril, tomar 0.5 ml. de este tubo y
colocarlo en otro tubo, rotulado con el número 2.
3) Homogeneizar el contenido del tubo No. 2. Con pipeta estéril, tomar 0.5 mL de este tubo y
colocarlo en el tubo rotulado con el número 3, con 4.5 ml. de agua peptonada estéril al
1%.
4) Continuar así sucesivamente, hasta llegar al tubo rotulado con el número 5.
5) Tomar, con pipeta estéril, 1 mL de la suspensión del tubo No. 4 y colocarla en una caja de
Petri conteniendo Agar Papa Dextrosa con Rosa de Bengala. Realizar lo mismo con la
suspensión del tubo No. 5, colocándola en otra caja de Petri, con el mismo medio de
cultivo. Por medio de rotación de las cajas de Petri, distribuir lo más uniformemente
posible la suspensión.
6) Incubar a 28°C durante 7 días.
7) Contar por separado las colonias de hongos miceliales, de levaduras y de bacterias;
calculando el número de propágulos por gramo de muestra.
2do. DÍA
B) TÉCNICA DE INOCULACIÓN POR PUNTO
1) Raspar con una asa doblada en ángulo recto y estéril un fragmento del material (alimento)
contaminado.
63
Manual de Microbiología General
2) Inocularlo, por picadura, en un tubo con Agar Sabouraud Dextrosa en pico de flauta.
3) Incubar a 28°C durante 7 días.
1) Colocar una caja de Petri con medio Agar Sabouraud Dextrosa en el sitio donde se quiera
hacer el aislamiento.
2) Destaparla y exponerla al medio ambiente de 5 a 10 minutos. Después taparla.
3) Registrar fecha y hora del muestreo.
4) Incubar a 28°C durante 7 días.
INTRODUCCIÓN
Los hongos presentan una gran variedad de formas, tamaños y colores. Pueden vivir en
sustratos y condiciones muy diversas y se pueden desarrollar en medios naturales ó
sintéticos.
Existen condiciones óptimas para el desarrollo de los hongos, así como características
fundamentales que permiten su identificación; principalmente su macromorfología
(morfología colonial) y su micromorfología (estructuras representativas al microscopio).
Para el desarrollo óptimo de los hongos, deben encontrarse en el medio de cultivo todas las
sustancias y condiciones necesarias, entre las que destacan: Una base nitrogenada
(peptona, nitratos, etc.); carbohidratos (glucosa, maltosa, etc.); pH ligeramente ácido;
humedad relativa entre 60 y 90%; temperatura de incubación de 20-30°C (hongos
saprobios) y 35-37oC (hongos patógenos); además de que algunos de ellos requieren de
alguna vitamina ó minerales.
Los criterios más importantes a tomar en cuenta en la morfología colonial fúngica son:
a) Tiempo de crecimiento.
b) Aspecto: Puede ser aterciopelado, pulverulento, granuloso, algodonoso, rugoso,
plegado para la mayoría de los hongos filamentosos y aspecto cremosos para las
colonias de levaduras.
c) Relieve: Pueden ser planas ó elevadas sobre el medio de cultivo. Si son elevadas,
pueden ser acuminadas, crateriformes ó cerebriformes.
64
Manual de Microbiología General
3er. DÍA
MATERIAL
Tubos de ensaye y cajas de Petri con colonias de hongos filamentosos.
PROCEDIMIENTO
Observar las colonias de hongos filamentosos y describir algunas de ellas, de acuerdo a los
criterios señalados.
MATERIAL
Tubos de ensaye y cajas de Petri con colonias de hongos levaduriformes.
PROCEDIMIENTO
Observar las colonias de hongos levaduriformes y describir algunas de ellas, de acuerdo a
los criterios señalados.
INTRODUCCIÓN
Los hongos tienen como unidad anatómica fundamental, estructuras filamentosas llamadas
HIFAS. Al conjunto de hifas se le conoce como MICELIO. Este micelio se clasifica de
acuerdo a diversos criterios:
Por otra parte, los hongos pueden presentar reproducción asexual y reproducción sexual.
Sin embargo, a muchos de ellos solamente se les conoce su reproducción asexual.
65
Manual de Microbiología General
1.- ESPORAS:
Son las estructuras de reproducción sexual de los hongos. Este tipo de reproducción se
lleva a cabo por medio de la meiosis. Los productos de la reproducción sexual de los
hongos se pueden llamar zigosporas, ascosporas ó basidiosporas, dependiendo del
tipo de hongo del que se trate.
2.- CONIDIOS:
Estructuras de reproducción asexual de los hongos. Se pueden producir por
transformación (macroconidios, microconidios) ó por fragmentación de una hifa
(holoartroconidios, enteroartroconidios).
Otro tipo de conidios se producen a partir de una estructura preexistente llamada célula
conidiogénica, de las cuales se conocen varias. Este tipo de conidios se nombran
dependiendo de la célula conidiogénica que les dio origen: Fialoconidios, poroconidios,
etc.
4º. DÍA
MATERIAL
Preparaciones fijas de hongos.
PROCEDIMIENTO
Observar al microscopio las preparaciones fijas de hongos, para diferenciar el micelio y las
estructuras de reproducción.
a) b) c)
Figura 1.- Estructuras microscópicas de: a) Rhizopus, b) Aspergillus, c) Penicillium. Tomada de Bonifaz A. Micología Médica. 5ª ed.
66
Manual de Microbiología General
5º. DÍA
MATERIAL
Cultivos fúngicos obtenidos la semana anterior por los alumnos.
PROCEDIMIENTO
Observar los resultados obtenidos de los cultivos realizados en la sesión No. 1 de la
práctica.
De la técnica de dilución y vaciado en placa: contar el número de colonias de hongos
filamentosos y levaduriformes en cada una de las cajas de Petri y calcular el número de
propágulos por gramo; para cada uno de los 2 tipos de colonias.
De la técnica de inoculación por punto, describir la colonia obtenida, de acuerdo a los
criterios antes mencionados.
De la técnica de exposición de placas, determinar si se considera que hay un desarrollo
escaso, moderado ó abundante de colonias fúngicas; reportando también el lugar y hora de
muestreo.
6º. DÍA
Presentación oral del microorganismo asignado
BIBLIOGRAFÍA
• Bonifaz A. Micología Médica. 5ª ed. México: McGraw-Hill;México; 2015.
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PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
VIROLOGÍA
REQUISITOS TEÓRICOS
OBJETIVO GENERAL
El alumno será capaz de conocer las principales técnicas usadas para el
diagnóstico y detección de los virus, así como el entendimiento de las
características de los procesos de replicación de los mismos.
OBJETIVOS PARTICULARES
Después de realizar la práctica, el alumno será capaz de:
1. Aislar un bacteriófago de un ambiente natural.
2. Determinar el título de un bacteriófago simple usando los métodos de
dilución y plaqueo.
3. Describir el cultivo de los bacteriófagos.
INTRODUCCIÓN
Los bacteriófagos son definidos como virus que atacan a una bacteria de manera
específica. Algunos bacteriófagos, o fagos, como los bacteriófagos T-even, tienen
una estructura compleja. La proteína de cubierta consiste de una cabeza poliédrica
y una cola helicoidal, al que están unidas otras estructuras. La cabeza contiene los
ácidos nucleicos. Para iniciar una infección, el bacteriófago se adsorbe sobre la
superficie de la célula bacteriana por medio de sus fibras de la cola y el plato base.
El bacteriófago inyecta sus ácidos nucleicos dentro de la bacteria durante la
penetración. La cola de la cubierta se contrae, dirigiéndola hacia la pared celular e
inyectando el ácido nucleico dentro de la bacteria.
libera varios cientos de nuevos virus. Los nuevos virus infectan otras bacterias y
más virus son producidos. Todas las bacterias en el área alrededor del virus original
son destruidas, dejando un área clara, una placa o calva, contrastando con el
crecimiento continuo de la bacteria. El crecimiento continuo de las bacterias se
produce por la presencia de células bacterianas no infectadas.
En esta práctica, nosotros aislaremos un bacteriófago de células anfitrionas en un
ambiente natural (moscas de casa). Desde que el número de fagos en un recurso
natural está bajo, la deseada bacteria anfitriona y los nutrientes adicionales son
agregados como un proceso de enriquecimiento. Después de la incubación, el
bacteriófago puede ser aislado por centrifugación del medio enriquecido y filtración
con membrana. En la actualidad existen ejemplos de virus que son transmitidos por
artrópodos que están causando serios problemas de salud pública, tales como:
Zika, Dengue y el virus de Chikungunya, los cuales generan procesos infecciosos
característicos que pueden llegar a la muerte.
1º DÍA
MATERIALES
Aislamiento de bacteriófagos
• 20-25 moscas caseras
• 20mL Caldo desoja tríptica
• Mortero y pistilo
• Matraz Erlenmeyer 125mL
• Pipeta estéril de 5mL
• Tubos de centrifuga
• Tubo de tapón de rosca
• Filtro de membrana estéril (0.45 µm)
• Lentes de seguridad y guantes
Valoración de bacteriófagos
• 6 tubos con 9mL de caldo de soya tripticasa
• 6 tubos con 3mL de caldo de soya tripticasa (0.7% agar semisólido)
• 6 cajas de Petri con agar nutritivo
• 7 pipetas estériles de 1mL
• Cultivo de E. coli
PROCEDIMIENTO
Aislamiento de bacteriófagos
1. Colocar en el mortero las moscas y la mitad del caldo de soya tríptica y moler
hasta obtener una pulpa fina.
2. Transferir la mezcla al matraz estéril y añadir la otra mitad del caldo.
3. Adicionar 2mL de E. coli a una concentración de 0.5 de la escala de
McFarland
4. Incubar el enriquecimiento por 24horas a 35°C.
5. Decantar 10mL del enriquecimiento dentro del tubo de centrifuga y
centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos para remover bacterias y materiales
sólidos.
6. Filtrar el sobrenadante mediante el filtro de membrana.
7. Decantar el líquido claro dentro de un tubo de tapón de rosca. Almacenar a
5°C
70
Manual de Microbiología General
Valoración de bacteriófagos
BIBLIOGRAFÍA
Johnson TR & Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. 10th Edition. USA:
Pearson; 2013.
2º DÍA
MATERIAL
• Cronómetro.
• Dispositivos de recogida de muestras sanguíneas, para pruebas de
venopunción, sangre entera, suero o plasma.
• Contenedor para residuos con riesgo biológico.
• Guantes desechables y/o ropa de protección.
• Lanceta: Se requiere una lanceta de flujo de sangre alto con una profundidad
de entre 1,5 y 2,0 mm para producir 60 µl de gotas de sangre
• Paños y gasas estériles.
• Vendas adhesivas.
• Kit Uni-Gold™ HIV
5. Llene la pipeta desechable que viene con el kit con la muestra. Asegúrese de
que no haya burbujas de aire. Use solo la pipeta que se incluye en el kit y no
la reutilice.
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Manual de Microbiología General
INTERPRETACION DE RESULTADOS
Líneas rotas
Línea de prueba: Cuando una muestra produce una línea de prueba rota con Uni-
Gold™, se considera reactiva inicialmente (dependiendo de la presencia de una
línea de control), pero la muestra se debe volver a probar en duplicado. Cuando los
resultados duplicados son un línea completa o rota en uno o ambos duplicados, la
muestra se interpretará como positivo preliminar. Si ninguno de los duplicados
muestra una línea en la zona “T” (test), el resultado se considerará negativo.
Línea de control: Una línea de control rota no afecta la validez de la prueba.
BIBLIOGRAFIA
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PRÁCTICA
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LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA
REQUISITOS TEÓRICOS
El alumno debe revisar:
1. Métodos para cuantificación de microorganismos (NMP y filtración por
membrana)
2. NOM-210-SSA1-2014. (consultar Apéndice H. normativo).
OBJETIVO:
El alumno conocerá las técnicas más utilizadas para la determinación de coliformes
totales y fecales como indicadores microbianos en agua potable, para evaluar su
calidad microbiológica. (Basados en NOM-210-SSA1-2014 y NOM-201-SSA1-
2015).
INTRODUCCIÓN
Desde el punto de vista bacteriológico la importancia sanitaria se refiere a la
presencia de microorganismos patógenos que pueden usar el agua como vehículo
de diseminación; principalmente bacterias intestinales, procedentes de excrementos
humanos o animales, aunque puede haber otras fuentes y vías de exposición
significativas.
1er. DIA
A) RECUENTO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Coliformes totales y fecales
FUNDAMENTO
El método del NMP es un método de estimación probabilística de la densidad
bacteriana presente en una muestra, basada en la dilución de la misma, sembrada
e incubada en réplicas de tubos.
MATERIAL
• 5 tubos de 18x150 con tapón de rosca, con 10 mL de caldo lactosado a triple
concentración y el tubo de fermentación (campana de Durham).
• Muestra de agua (Colectar el volumen requerido, transportarla en el recipiente
correspondiente, según la normativa vigente).
MÉTODO
1. Inocular 5 tubos con 10 mL de caldo lactosado con 20 mL de la muestra
problema previamente bien homogenizada (agitar 25 veces)
2. incubar a 35 ± 2°C de 24 a 48 h.
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Manual de Microbiología General
2° DIA
Prueba confirmativa
(NOM-210-SSA1-2014) (Standard Methods. For the Examination of Water and Wastewater. 22nd Edition, 2012)
NMP/100 mL de muestra de agua o hielo e intervalos de confianza del 95% utilizando 5 tubos con 20 mL de
muestra.
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Manual de Microbiología General
MATERIAL
• Matraz de vacío
• Bomba de vacío
• Filtros de membrana
• Medios de cultivo: ENDO y medio M-FC
• 300 mL de muestra problema.
MÉTODO
1. Montar el aparato de filtración de membrana (bomba de vacío, boquillas o
conexiones).
2. Colocar el embudo y la membrana en condiciones de esterilidad.
3. Medir en el embudo 100 mL de muestra. Encender la bomba de vacío y
filtrar.
4. Retirar el embudo y tomar con pinzas estériles la membrana y colocarla en
una caja de Petri especial, conteniendo un cojinete con el medio de cultivo
adecuado (medio M-ENDO para Coliformes Totales, medio M-FC para
Coliformes Fecales).
5. Cerrar y golpear suavemente en la mesa, para adherir la membrana al medio
de cultivo.
6. Incubar en las condiciones adecuadas según el medio y el microorganismo a
detectar.
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Manual de Microbiología General
• Los coliformes totales aparecen como colonias rojas con brillo verde
metálico en el medio M-ENDO.
• Los coliformes fecales aparecen como colonias azules en el medio M-
FC.
BIBLIOGRAFIA
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BIBLIOGRAFÍA
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MICROBIOLOGÍA
BIBLIOGRAFIA VANCOUVER
• Botero David, Restrepo Marcos. Parasitosis Humanas. 4ª Edición. Colombia.
Corporación para Inv. Biol. 2009.
• Bonifaz A. Micología Médica. 4ª Edición., México. Mc Grawl-Hill.2012.
• Brock. Madigan, Michael. Biology of Microorganism. 12 ª Edición. EU. Pearson
Prentice Hall. 2009.
• Díaz R. Gamaso, C. López-Goñi, I. Manual Práctico de Microbiología. 3ª
Edición. Barcelona. MASSON. 2005.
• Escobar Gutiérrez A. Atlas de Bacteriología. 2ª Edición. Barcelona. Editorial
Scheramex. 1999.
• Koneman E.W., Allen S.D., Dowell V.R., Janda W.M., Sommers H.M., Winn.W.
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas. 6ª Edición. USA. Ed. Médica
Panamericana. 2008.
• MacFaddin. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de
Importancia Clínica. 3ª Edición. Argentina. Editorial Panamericana. 2003.
• Prescott, Harley, Klein. Microbiología. 7ª Edición. España. Mc Graw-Hill. 2008.
• Romero Cabello Raúl. Microbiología y Parasitología Humana. 3ª Edición.
México. Medica Panamericana. 2007.
• Tortora, Funke, Case. Microbiología. 9ª Edición. San Francisco. Ed. PEARSON.
2007.
ARTÍCULOS CIENTÍFICOS
1. L. Traviezo, J. Dávila, R. Rodríguez, et al. Contaminación enteroparasitaria de
lechugas expendidas en mercados del estado Lara. Venezuela Parasitol.
Latinoam. Jul. 2004; 59(3):167-170.
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Manual de Microbiología General
REVISTAS
REFERENCIAS ELECTRÓNICAS
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Terminología
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TERMINOLOGÍA
Residuos peligrosos
Todos aquellos residuos, en cualquier estado físico, que por sus características
corrosivas, reactivas explosivas, tóxicas, flamables y biológicamente infecciosas
representan un peligro para el equilibrio ecológico.
Contaminación
Toda materia en cualquiera de sus estados físicos y formas, que al incorporarse o
actuar en la atmósfera, agua, suelo, flora, fauna o cualquier elemento natural, altere
o modifique su comportamiento y condición natural.
Descontaminación
Destrucción o remoción de microorganismos a un nivel más bajo, pero no
necesariamente la destrucción total. El objetivo de la descontaminación es hacer un
material contaminado seguro para posterior manipulación, ya sea un instrumento
que va a lavarse y esterilizarse para usarse nuevamente o material que va a tirarse.
Esterilidad
Implica la muerte de todo agente vivo.
Desinfección
Implica el uso de un agente antimicrobiano sobre objetos inanimados (superficies
de trabajo, equipo, objetos, etc.). La desinfección puede llevarse a cabo para
propósitos de seguridad y propósitos de calidad.
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Procedimientos
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PROCEDIMIENTOS ESTANDARIZADOS
Lavado de manos
Este procedimiento es muy importante, sencillo y eficaz para prevenir y controlar la
diseminación de los microorganismos o agentes infecciosos. El protocolo es el
siguiente: a) abrir el grifo y mojarse las manos con agua, b) colocar el jabón sobre
las manos, c) extender el jabón alrededor de las manos y entre los dedos, d) lavar
las manos por 20 segundos con frotamiento vigoroso empezando por unos
centímetros antes de las muñecas y extendiendo hacia abajo entre los dedos y
alrededor y bajo las muñecas, e) enjuagar con agua corriente, empezando con la
sección arriba de la muñeca y hacia los dedos, f) secar las manos con papel y
cerrar el grifo usando el papel con el que se secó.
Derramamientos
La persona que va actuar en el derramamiento deberá portar bata, cubre bocas,
guantes, lentes, etc. y usar un germicida que debe de colocarse de la siguiente
manera: cubrir con sanitas o papel de reúso sobre la sustancia derramada para
evitar la formación de aerosoles y posteriormente aplicar el germicida sobre el área.
El germicida debe permanecer al menos 20 minutos para asegurarse de su acción
sobre los microorganismos. Al término del procedimiento se juntan los materiales
derramados y se colocan en botes de plástico para posteriormente esterilizarlos en
la autoclave.
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Alternative Proxies: