Las Células Madre

A2.3.
1 Las células madre
Las células madre, a diferencia del resto de las células del cuerpo (que
son expertas en llevar a cabo una función), no están especializadas,
pueden dividirse manteniendo ese estado y dar lugar a otros tipos
celulares. Por eso son las responsables del crecimiento y reparación
de los tejidos. Todos los animales y vegetales las poseen.
En función de su capacidad para producir tejidos diferentes, existen

tres tipos de células madre.
Las llamadas totipotentes son capaces de dar lugar a un organismo
completo; las pluripotentes pueden producir cualquiera de los
tejidos que conforman un individuo, como el epitelial y el muscular;
y las multipotentes solo crean los tipos celulares de un tejido
determinado.
La capacidad de las células madre disminuye con el tiempo, tomando como punto de partida el momento de la fecundación, según
avanza el desarrollo. Las células son totipotentes durante uno o dos días; luego multipotentes hasta los cuatro o cinco días, cuando
forman parte de una estructura de unas 150 células que se denomina blastocisto; y existen células multipotentes en un organismo
adulto, que serán las encargadas de renovar algunos tejidos.
Es decir, que las únicas células madre que permanecen en un cuerpo adulto son las multipotentes. Por ello se habla de células
madre “embrionarias” cuando se cita a las totipotentes y pluripotentes, y de células madre “adultas” cuando se quiere designar a
las multipotentes. La consideración de que un blastocisto sea un ser humano pone en evidencia las creencias éticas y religiosas de
la sociedad.
Las posibles aplicaciones de las células madre son numerosas, y en la actualidad se investiga con células madre pluripotentes y
multipotentes. Por ejemplo, ya se está consiguiendo regenerar un tejido dañado mediante implante de estas células; la
generalización de este tratamiento permitiría reconstruir tejidos dañados por infartos, quemaduras, fracturas graves o afectados
por muchas y variadas enfermedades; de esta manera podrían tratarse la diabetes, el Alzheimer, el Parkinson, la leucemia o la
artritis reumatoide. Por otro lado, la investigación con células madre podría permitir profundizar en el estudio de las primeras
etapas del desarrollo y ayudar a evaluar in vitro fármacos como los anticancerígenos.
Para conseguir estos objetivos se puede partir de células madre embrionarias o adultas. En el primer caso, las células se obtienen
de óvulos fecundados in vitro, que no han sido utilizados en terapias de infertilidad, o bien de embarazos interrumpidos. Una vez
aisladas, las células se ponen bajo las condiciones que llevan a producir el tejido deseado. Si partimos de células madre adultas,
se debe lograr que pierdan su limitación para producir exclusivamente células del tejido en el que estaban y que sean capaces de
dar lugar a otro determinado.
Preguntas para el debate

• ¿Qué es una célula madre? Da una definición.
• ¿Cuáles son sus características?
• ¿Cuántos tipos de células madre existen?
• ¿Qué diferencia existe entre células madre pluripotentes y multipotentes?
• ¿Qué se entiende por célula progenitora?
• ¿Cómo se obtienen las células madre?
• ¿Para qué se utiliza la clonación terapéutica?
• ¿Qué utilidad puede tener el estudio de células madre en enfermedades como el Parkinson o el Alzheimer?
• ¿Cuáles son las dos vías de investigación que el autor del artículo se plantea en relación con las células madre y el
Parkinson?
• ¿Cuál es tu opinión sobre las células madre? ¿Está bien o está mal?
Electroporación y la producción de ratones Knockout

Los ratones Knockout son los animales para los cuales genético se han modificado para no expresar uno o más genes, o “se han
golpeado fuera.” Los estudios entonces se realizan en los ratones para determinar lo que tienen los efectos de una baja del gen
en el animal, o los efectos de drogas y de otras terapias.
Haber de imagen: unoL/Shutterstock
El gen que corregía tecnología se ha mostrado para tener ventajas sobre más viejas técnicas de la ingeniería genética para producir
ratones knockout. El gen que corrige las tecnologías que se han utilizado con éxito con este fin incluye la nucleasa del dedo del
cinc (ZFN), transcripción activador-como nucleasa del determinante (TALEN), y nucleasa palindrómica corta regularmente
interspaced agrupada (CRISPR) de las repeticiones.
El sistema CRISPR-cas9 particularmente se ha convertido en una aproximación preferida para la ingeniería del genoma del ratón.
La manera usual de introducir los componentes de CRISPR en embriones del ratón para corregir o para eliminar un gen está por
el microinjection. Sin embargo, el microinjection requiere un de alto nivel de la habilidad y es necesitando mucho trabajo porque
los embriones deben ser inyectados uno a la vez.
Mice "Tales"...the Knockout Mouse Production and Phenotyping Project
Una nueva técnica
Un método de la electroporación ha sido desarrollado por los investigadores en Japón como opción para entregar el gen que
corregían elementos en un embrión llamado “técnica para el sistema Knockout animal por la electroporación (la TOMA).” Este
método introduce eficientemente los reactivos en zygotes del ratón sin la necesidad de habilidades de manejo especiales y de
ningún daño al pellucida del zona (una capa de la glicoproteína que rodea la membrana de plasma) del embrión, como ocurre
normalmente con la electroporación convencional.
Los científicos introdujeron ZFN, TALEN, y CRISPR mRNA en embriones de la rata usando el NEPA estupendo 21 de Electroporator
usando un sistema del pulso del tres-paso. En el primer paso, el pulso crea los micro-orificios en la membrana del pellucida y de
plasma del zona de los embriones. En el paso siguiente, un diverso equipo de pulsos impulsa el mRNA en el citoplasma a través
de los microporos. En el tercer paso, la polaridad se cambia para terminar la transferencia del mRNA en los embriones. También
microinjected el mRNA para la comparación.
Resultados positivos
Después de la electroporación, los embriones en el escenario de 2 células fueron transferidos en ratas femeninas sustitutas. El
diez por ciento de embriones microinjected con ZFN mRNA desarrollado en descendiente, y el 33 por ciento de ésos tenían corregir
correcto del gen del objetivo. En cambio, el 31, 24, y 6 por ciento de embriones electroporated con el ms 0,5 ms, 1,5, y 2,5 pulsos
del ms desarrollados en descendiente, con corregir correcto del gen del objetivo en el 37, 73, y 75 por ciento del descendiente.
Los resultados positivos similares fueron logrados con TALEN y CRISPR-cas9 que corregían sistemas.
Para confirmar la transmisión del germline, aparearon a algún descendiente knockout de la rata derivado de los embriones
electroporated con ZFN mRNA con una anchura de pulso de 1,5 ms con el tipo salvaje ratas, y la generación siguiente de
descendiente era analizada. Encontraron que su método produjo con éxito la transmisión del germline del golpe de gracia del gen.
Los investigadores concluyeron que su método era simple y efectivo comparado a los métodos de la electroporación del convenio
que debilitan o quitan el pellucida del zona. El uso de la electroporación también permite la generación de animales knockout en
deformaciones y la especie que no han establecido variedades de células embrionarias del vástago, que es necesario en métodos
convencionales.
Introducción.
2.1.2. Elementos transponibles de clase II. Transposones de DNA.
La mayoría de los transposones de DNA siguen un mecanismo de transposición no replicativo,

de escisión e inserción. Estos ETs codifican para una proteína con función integrasa,
denominada transposasa, encargada de su movilización a través de un producto intermediario,
que es el propio transposón de DNA. La transposasa reconoce sus repeticiones terminales
invertidas (TIRs) y corta la secuencia del elemento móvil por ambos extremos para integrarlo,
posteriormente, en otra localización del genoma. En función de la homología existente tanto
entre su secuencia interna y codificante, como la aparecida entre los TIRs o entre las TSDs
(duplicaciones del sitio de inserción), se han definido siete superfamilias de transposones de
DNA eucariotas (Robertson HM, 2002; Feschotte C et al., 2002b). Así mismo, por semejanza
estructural de los elementos, se han podido establecer relaciones entre transposones de DNA
eucariotas y procariotas. En concreto se ha visto que los elementos de la superfamilia Tc/mariner
eucariotas son los que más similitud presentan con las IS bacterianas (Chandler M and Mahillon
J, 2002).
Como en el caso de los retrotransposones, los diferentes grupos de elementos móviles de clase
II contienen miembros autónomos y miembros no autónomos, que comparten las secuencias en
cis necesarias para su movilización. La transposición de los elementos no autónomos se produce
en trans, gracias a la maquinaria aportada por los elementos autónomos.
Un tipo especial de elementos transponibles de DNA no autónomos son los MITEs (Miniature
Inverted-repeat Transposable Elements). Los MITEs son transposones de pequeño tamaño (que
varía entre 100 pb y 700 pb) con TIRs de 10 a 15 nt de longitud, que flanquean una secuencia
interna no codificante rica en AT. La presencia de los TIRs y de repeticiones subterminales
(SIRs) confieren a estos elementos la capacidad de formar estructuras secundarias (Bureau TE
and Wessler SR, 1992). Una característica especial de estos ETs es que parecen tener un
mecanismo replicativo de transposición, debido al elevado número de copias de ciertas familias,
existentes en diferentes genomas (Feschotte C et al., 2002b). Pero la identificación en el genoma
de Arabidopsis de un elemento potencialmente autónomo, de la familia Tc1/mariner, relacionado
con la familia Emigrant de MITEs, sugiere que estos elementos podrían ser movilizados por ETs
de clase II activos presentes en el mismo genoma (Feschotte C and Mouches C, 2000). Sin
embargo hasta la publicación en 2003 de tres trabajos, en un mismo número de la revista
Nature, que describían la movilización de una familia de MITEs de arroz, denominada mPing, no
13
C I E N C I A V E T E R I N A R I A 9 -2 0 0 3 -4 35
TÉCNICAS DE CLONACIÓN
DE EMBRIONES
MARÍA DEL CARMEN NAVARRO MALDONADO

ADOLFO ROSADO GARCÍA
HÉCTOR FERNANDO SERRANO.
I. Introducción .............................................................................. 36
II. Técnicas de clonación de embriones ....................................... 38
1.Partición 0 división de embriones .................................... 39

2.Separación y cultivo de blastómeros aislados .................. 42
3.Transferencia nuclear ........................................................44
III. Ventajas y desventajas de las técnicas de clonación............. 53
IV: Aplicaciones de la clonación de embriones .......................... 56
1.Clonación de embriones por generación múltiple ....................57

2.Aspectos comerciales de la clonación de embriones ................59
3.Aplicación de la clonación en la conservación de especies ....... 60
36 TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE EMBRIONES
V Consideraciones éticas de la clonación ............................ 61
VI. Conclusiones .................................................................... 64
Referencias ...................................................................... 66
I. Introducción
Durante la última década, la investigación y aplicación de

nuevas tecnologías relacionadas con la reproducció n animal ha
evolucionado de manera acelerada con el desarrollo de técnicas
que incrementan la capacidad reproductiva y permiten el
mejoramiento genético. Las técnicas de manipulación del
proceso reproductivo que mayor atención han recibido son la
superovulación, transferencia embrionaria, congelación de
embriones, cultivo in vitro de embriones, partición y clonación
de embriones, así como el sexado de embriones y de fetos. La
combinación de ellas y su utilización en el ámbito comercial,
forman parte de un s istema para la producción y
comercialización de mejores animales productores de leche,
carne y lana, entre otros campos (1).
La clonación representa una de las tecnologías de gran

interés mundial en la actualidad, debido a su aplicabilidad tanto
en los animales de importancia económica como en los seres
humanos. A pesar de que actualmente es de baja eficiencia,
muestra que constituye una alternativa en la solución de los
problemas reproductivos. En la medida en que se tenga mayor
comprensión de sus deficie ncias, en un futuro muy cercano
permitirá
C I E N C I A V E T E R I N A R I A 9 -2003-4 37
seleccionar y reproducir animales de interés económico y

ecológico a gran escala. Actualmente se requieren grandes
cantidades de material biológico de alta calidad para obtener
resultados positivos 10 que incrementa el costo de la técnica (2).
El presente trabajo contiene una selección de la información

concerniente alas diferentes técnicas desarrolladas durante los
últimos años para obtener animales genéticamente idénticos entre
sí, dando prioridad a su aplicación en animales domésticos y de
laboratorio, sus aplicaciones comerciales y potencial uso
ecológico. Se discuten algunas consideraciones éticas que deben
tomarse en cuenta para establecer un limite a los alcances de este
tipo de técnicas, entre los cuales esta su aplicación en embriones
humanos.
La clonación puede verse en un sentido vertical, en donde los

individuos clonados por transferencia de núcleos serán
semejantes al individuo del que se obtenga la célula donadora de
éste, también puede enfocarse en forma horizontal, en la que 10s
individuos clonados por técnicas diferentes ala transferencia de
núcleos serán similares entre S1. En el primer caso se requiere de
la combinación de dos células manipuladas: de una de ellas se
tomara solamente el núcleo que será introducido en el citoplasma
de otra (3). En el sentido horizontal, la manipulación se realiza
en las edades tempranas del embrión para producir gemelo s
idénticos. En este caso, no se requiere de una manipulación tan
elaborada como en la transferencia nuclear.
Para algunos autores, la clonación esta limitada

exclusivamente al conjunto de técnicas que permiten la
manipulación de una célula somática para transferir
posteriormente su núcleo a un citoplasma adecuado e iniciar el
desarrollo de un nuevo animal como un duplicado genético exacto
al de la célula original de la cual se extrajo el núc leo (3). En

consecuencia los clones representan un grupo de organismos
vivos que comparten el mismo complemento de genes nucleares
(4). Igualmente puede interpretarse como la reproducción
asexual que da lugar ala formación de individuos genéticamente
similares. En ella, la célula inicial obtiene su información
genética del núcleo de una célula somática de un solo donador,
en este contexto, el individuo clonado es casi idéntico a este
último con variaciones menores debidas a la presencia de
información genética contenida en las mitocondrias (5, 6).
Para otros autores, la clonación no está limitada a la

transferencia de núcleos sino que consideran que los gemelos
monocigóticos, formados por la separación de las células que
produce el huevo fertilizado después de varias divisiones, dado
que se originan de un mismo genoma, esencialmente contienen
la misma información genética, por lo que puede considerárseles
como clones (2). Este enfoque abre el campo para incluir a la
clonación como la forma natural de reproducción de algunas
especies animales como el armadillo (Dasypus novemcinctus) y
su primo argentino, la mulita. El armadillo produce cuádruples
monocigóticos (7) y la mulita produce nacimientos de individuos
idénticos por una segregación de blastómeros poco antes de la
implantación (8).
II. Técnicas de clonación de embriones
Con base en los conceptos de la clonación descritos

anteriormente, se observa que existen tres técnicas que han sido
utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir
embriones genéticamente idénticos. Dos de ellas cabrían en el
concepto de la clonación en un sentido horizontal: la partición o
división de embriones por microcirugía, y la separación y cultivo
CIENCIA VETERINARIA 9 -2003-4 39
de blastómeros aislados por métodos enzimáticos 0 mecánicos

(9, 10). La tercera entra en el concepto de la clonación en un
sentido vertical: la transferencia nuclear a partir de células
somáticas de adulto 0 embrionarias (3) 0 de blastómeros de
embriones (11, 12, 13) entre otras células (Cuadro 1).
CUADRO 1
PRINCIPALES TIPOS CELULARES UTILIZADOS EN
LAS TÉCNICAS DE CLONACION
Metodología Tipos Celulares
A) Partición de embriones • Mórulas 0 blastocistos tempranos 0 tardíos

(15,38).
B) Separación y cultivo • Blastómeros de embriones en diferentes

de blastómeros aislados etapas de la segmentación, desde 2 células
hasta mórulas, cultivándose in vitro dentro o
fuera de su zona pelúcida (65, 66, 67).
• Partenogenotes (ovocitos activados
químicamente para dividirse) para reagregar
blastómeros ( 52, 68).
C) Transferencia nuclear
• Como carioplastos (células • Blastómeros obtenidos de embriones en

donadoras de núcleos) diferentes etapas de la segmentación (desde 2
células hasta blastocistos) (52, 69).
• Células somáticas de embriones
(trofoectodermo y masa celular interna 0
MCI, fibroblastos fetales, células de riñón,
piel, músculo, glándula mamaria y células
cúmulo 0 espermatogonias de animales
adultos) (3, 4, 15, 19, 39, 44, 54, 70, 71, 72).
• Como citoplastos (células • Ovocitos enucleados
receptoras de núcleos) • Cigotos
• Embriones de 2 bastómeros (19, 54, 71)
1. Partición 0 división de embriones
En la década de los 70 se pensaba que los embriones en fases

te mpranas de la segmentación no sobrevivirían después de una
microcirugía. Fue en los años ochenta cuando se demostró que las

mórulas y blastocistos de los animales domésticos eran capaces de
desarrollarse después de una partición y producir nacimientos
viables (14). Actualmente la partición de embriones permite la
producción de gemelos idénticos al dividir el embrión original por
métodos microquirúrgicos. Las evidencias experimentales indican
que existe una relación inversa entre el número de secciones que
se le hagan al embrión y e l porcentaje de éxito. Las tasas de
producción de gemelos monocigóticos van desde poco mas de
30% en bovinos y ovinos (4, 15, 16) siendo hasta casi 70% en
bovinos, con porcentajes de gestación superiores a 60% (14) e
incluso, en algunos casos, equivalentes a 100% (17).
El número de células que tenga el embrión no solo limita el

número de segmentos en que pueda dividirse, sino que también
tiene incidencia sobre otros aspectos. Típicamente se utilizan
embriones en etapa de mórula 0 blastocisto (18, 19). Esta
estrategia permite utilizar una de las secciones para otros fines
experimentales como la determinación del sexo del embrión,
mientras que el resto se cultiva 0 congela para después transferirse
a hembras receptoras previamente sincronizadas para mantener la
gestación (20, 21, 22).
Los embriones en etapa de blastocisto son seccionados de

manera que se dividan en dos partes iguales tanto la masa celular
interna (MCI como el trofoectodermo. Es recomendable emplear
soluciones que deshidraten ligeramente al embrión (por ejemplo,
sacarosa 200 mM), con lo que se reduce el daño al trofoectodermo
durante su partición. Una vez cortadas, las mórulas compactas y
los blastocistos no necesariamente deben ser introducidos a zonas
pelúcidas, teniendo una sobrevivencia aceptable al ser transferidas
en hembras receptoras; aunque existen informes que indican tasas
de supervivencia de 15% en medios embriones
CIENCIA VETERINARIA 9-2003-4 41
(0 demi-embriones) sin zona pelúcida y de 35% cuando se

transfieren con zona pelúcida. En este último caso las tasas de
gestación van de 55% a 65% en bovinos (18). Willadsen y
Godke (23) obtuvieron tasas de gestación de 80% en bisecciones
de embriones de ovino indistintamente si tenían zona pelúcida 0
no. En el Cuadro 2 se muestran algunos de los factores
principales que afectan la s tasas de éxito con esta técnica.
CUADRO 2
FACTORES QUE AFECTAN LAS TASAS DE GESTACIÓN EN LA
PARTICIÓN DE EMBRIONES
Factores Consideraciones
Calidad morfológica Mejores los de grados 1 a 2 (14)
Fase de segmentación de Mejores resultados (30) y con mayor tasa de

los embriones gestación (16) en blastocistos que con mórulas
Número de secciones en las Los medios embriones (demi-embriones)

que se divide al embrión sobreviven mejor en el útero que los cuartos
embriones (14). Los cuartos embriones carecen
de MCI funcional, viabilidad reducida (30).
Presencia de zona pelúcida Resultados controversiales, necesaria en algunos

casos (66) 0 con escasa diferencia (16)
Sistema de cultivo de los Mejor en oviductos ligados que in vitro.

embriones partidos
Número de demi-embriones Relación directa entre el número de demi-

transferidos a hembras embriones transferidos y la tasa de
receptoras gestación.
Preservación Menor probabilidad de supervivencia de

demi-embriones congelados (14, 23).
Sexo Afectado por la manipulación y el cultivo de los

embriones, mayor pérdida de embriones
femeninos (20).
2. Separación y cultivo de blastómeros aislados
En algunas especies, como los equinos, se ha utilizado la

separación de blastómeros de embriones previos a su
implantación para efectuar estudios de diagnóstico de
enfermedades genéticas. En ellos se ha determinado la viabilidad
de los embriones analizados después de su transferencia en
hembras receptoras, encontrándose tasas de gestación de 21%
(24).
En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados

también han sido utilizados en estudios de biopsias de embriones
en diferentes etapas de segmentación con la finalidad de dar
alternativas a los estudios de diagnóstico prenatal, evaluando a su
vez el desarrollo embrionario in vitro con el propósito de que se
seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en
blastocistos y congelarlos mientras se evalúan sus blastómeros
aislados (25, 26, 27).
La técnica de separación de los blastómeros implica la

remoción de la zona pelúcida, ya sea por métodos químicos,
mecánicos 0 enzimáticos, para posteriormente obtener los
blastómeros mediante aspiración, extrusión 0 disminución de sus
interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (12, 28,
29,30). Los blastómeros de rata aislados en la etapa de dos
células, son capaces de formar embriones com pletos (31). En el
ratón se han obtenido gemelos idénticos removiendo la zona
pelúcida de embriones de dos células y cultivándolos
separadamente previo a su transferencia (16). En otras especies,
el éxito del experimento se ha determinado como dependiente de
diversos factores. Así, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja
eficiencia en la obtención de fetos se debe a la baja sobrevivencia
in vivo
de embriones libres de zona pelúcida en fases previas a la

compactación (16). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse
si se utilizan embriones encapsulados en gel de agarosa
(15,32). De manera que algunas estrategias para suplir a la
zona pelúcida son el empleo de capsulas artificiales de agarosa
(33) 0 de alginato de sodio (34, 35), o matrices extracelulares
como la fibronectina y laminina (28, 36).
EI número de células que forman al embrión separado

constituye otro factor importante en la probabilidad de éxito.
Willadsen (37) demostró que la tasa de gestación en ovinos y
bovinos se reducía conforme se hacían grupos de células de
números menores. La mayor tasa de gestación que obtuvo este
autor fue del 66% al utilizar embriones de dos células 0 dos
grupos de células provenientes de embriones de hasta ocho
células. Cuando utilizó embriones de cuatro células 0 pares de
células de embriones de ocho células, la tasa de gestación se
redujo a 50%. Cuando se utilizaron los blastómeros
individuales provenientes de embriones de ocho células, la tasa
de gestación fue de sólo 5%. En todos los casos en los que se
separaron las células embrionarias, el número de células
formando el blastocisto se reducía linealmente con el número
de "divisiones" a la que era sometido el embrión. Un dato
importante de este estudio es que cuando se utilizaron las
células individuales de los embriones de ocho células, el
desarrollo de la MCI se veía fuertemente comprometido al
extremo de formarse sólo vesículas sin la presencia de este
grupo de células. Aparentemente, en los blastómeros aislados
se promueve más fácilmente la apoptosis y se afecta
preferentemente alas células de la MCI. Este proceso
contribuye a la incidencia de abortos
debido a que la poca cantidad de células de la MCI reduce la

viabilidad fetal (38).
En monos esta misma técnica ha sido aplicada a partir de

embriones de ocho células, en la que se separan los
blastómeros mientras son mantenidos en medio libre de
2+ 2+
Ca y Mg ,y luego se reagrupan por pares que se
introducen en zonas pelúcidas para que puedan desarrollarse
hasta la fase de compactación y así transferirlos a hembras
receptoras. El 8% de los embriones tratados brindaron crías
vivas (38).
3. Transferencia nuclear
Una técnica que incrementa el potencial de desarrollo de

los blastómeros aislados de embriones de ocho células 0 de
etapas mas tardías de la segmentación es la transferencia
nuclear (37). Esta técnica permite la producción de
individuos genéticamente idénticos originados a partir de un
solo donador de núcleos (1). Implica la inserción por
métodos químicos, físicos, biológicos 0 mecánicos del núcleo
de una célula donadora que puede ser tomada de varios
tejidos a la cual se le llama carioplasto, con un ovocito
activado y carente de núcleo, 0 con un huevo fertilizado al
que se le hayan extraído los pronúcleos (4, 37, 39, 43).
Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de
esta metodología es más bien antiguo, si bien hasta hace poco
ha acaparado el interés no sólo de la comunidad científica,
sino del público en general. En el Cuadro 3 se muestra una
cronología de los eventos más importantes en la obtención de
organismos clonados por transferencia nuclear.
CUADRO 3
CRONOLOGIA DE LA CLONACIÓN MEDIANTE TRANSFERENCIA
NUCLEAR Y SEPARACIÓN DE BLASTÓMEROS
Año Evento
1938 Hans Spemann divide un cigoto de salamandra con un cabello; mantiene

al núcleo en una de sus mitades que continúa su segmentación. AI retirar la
barrera, uno de los nuevos núcleos llega al interior de la mitad que carecía
de él y se segmenta hasta convertirse en otro embrión (6).
1952 Robert Briggs y Thomas King demuestran que los núcleos de
blastocistos de rana (Rana pipiens) son capaces de desarrollar renacuajos al
ser transferidos a ovocitos enucleados (6, 48).
1967 DiBernardino observa que los núcleos aislados de embriones de rana en
etapa de gástrula, desarrollan renacuajos anormales (6).
Década Se efectúan algunos experimentos parcialmente exitosos de clonación con
de los núcleos de células intestinales de sapos. Estos clones se desarrollan hasta
70 alcanzar el estado de renacuajos, sin llegar a adultos (5).
1981 Primer reporte del nacimiento de ratones provenientes de la transferencia de
núcleos de células somáticas en ovocitos enucleados, al intentar repetir estos
experimentos otros investigadores no pudieron lograrlo (53).
1984 Clonación de ovinos utilizando núcleos de blastómeros de embriones por
fusión con virus Sendai 0 campo eléctrico con ovocitos enucleados. Ovejas
a término de su desarrollo (23).
1987 Nacimiento de dos terneros a partir de cigotos reconstituidos con núcleos de
blastómeros de embriones electrofusionados con ovocitos enucleados.
Cultivo in vivo en oviductos de oveja hasta blastocisto y transferencia a una
vaca receptor a hasta que llegaron al término de su desarrollo (11).
1992 Uso del color ante Hoechst para monitorear el proceso de enucleación de
ovocitos de bovino. Nacimiento de 32 terneros (54).
1993 Electrofusión de núcleos de ratón a partir de blastómeros de embriones en
estado de 2, 4 y 8 células con ovocitos, con nacimiento de crías vivas (29).
1996 Nacimiento de ovejas vivas partiendo de ovocitos enucleados por
transferencia núcleos de células epiteliales de embriones de 9 días de
gestación mantenidas en etapa Go (3).
1997 Nacimiento de "Dolly" utilizando el núcleo de células derivadas de glándula
mamaria de oveja adulta arrestada en la fase G por reducción de suero en el
medio. Los núcleos fueron electrofusionados a ovocitos enucleados. La tasa
de éxito es inferior al 1% (5).
1997 Nacimiento de "Neti" y "Ditto", dos monos Rhesus obtenidos por
electrofusión de núcleos derivados de fertilización in vitro y ovocitos
madurados in vitro, enucleados y activados con cicloheximida. Tasa de
éxito de 3.77% (39).
2000 Obtención de cerdos clonados mediante electrofusión y microinyección de
núcleos. Tasas de éxito inferiores al8% (61,65).
Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibirá

al núcleo transferido como el propio núcleo deben tener
características fisiológicas específicas para que se realice con
éxito tanto la transferencia nuclear como el desarrollo posterior
de la célula reconstituida y, eventualmente, el desarrollo del
nuevo organismo. La célula que contiene al núcleo que será
transferido (carioplasto) debe tener características particulares
que permitan cierto porcentaje de éxito antes de ser colocado en
el espacio perivitelino adyacente a la membrana del ovocito
(citoplasto) y se fusione. Experimentalmente el uso de
citocalacina B para bloquear la polimerización de
microfilamentos, y de colchicina para la de los microtúbulos,
permiten controlar los movimientos del citoesqueleto en el
carioplasto, provocar una elasticidad de la membrana
plasmática y favorecer así la enucleación mediante el uso de
micropipetas, sin romper la membrana plasmática (4,
11,29,40 ,41,42).
Si se utiliza un embrión en segmentación como carioplasto,
también requerirá de la micromanipulación para obtener sus
blastómeros. Uno de estos últimos se transfiere dentro del
ovocito en metafase II desprovisto previamente de su núcleo, y
se fus iona con él. Mediante este proceso, el ovocito se activa y
da inicio a su desarrollo como un nuevo embrión. En algunas
especies la sola transferencia del carioplasto inicia la activación
del ovocito (4, 41, 43, 44).
La primera etapa de esta metodología es la obtención del

citoplasma adecuado para que sirva de aceptor del núcleo. A los
ovocitos en metafase II se les retira el núcleo 0, en el caso de
huevos fertilizados, se les extraen los pronúcleos en
microscopía de contraste de fases. Para confirmar q ue el
material cromosómico haya sido totalmente extraído, se aplican
tinciones de ADN en el citoplasma del ovocito. El colorante
más utilizado
para esta etapa es el Hoechst 33258 para visualizar la ausencia

de contenido nuclear en los ovocitos enucleados, bajo luz
ultravioleta durante períodos de menos de diez segundos, sin
efectos negativos en el desarrollo de los embriones
reconstituidos (42, 45,46).
Respecto alas características del carioplasto, entre mas

diferenciada esté la célula somática, menor será la probabilidad
de éxito en la transferencia nuclear. Para que una célula sea
totipotencial requiere que su núcleo sea capaz de desarrollarse
en un nuevo embrión (47). Para ello los genes que dan lugar al
desarrollo de un organismo completo deben estar presentes aún
cuando no todos sean expresados (48). Algunos de los genes que
deben expresar las células totipotentes son el gen Tnap, los
factores de transcripción, los genes Oct 3/4, el proto-oncoge n c-
kit, y la ADN metiltransferasa 0 Mt (49).
La experiencia con múltiples tipos celulares tanto

embrionarios como de tejidos diferenciados ha demostrado que
el uso de núcleos de blastómeros obtenidos de embriones de dos
células es mas eficiente que los de ocho células; asimismo, los
núcleos de blastómeros 0 de las células de la MCI son mas
eficientes que los de las células de la granulosa, por ende, las
células embrionarias son mas efectivas que las células de
individuos adultos (4). A su vez, los núcleos de las células de la
MCI son más efectivos que los de las células del trofoectodermo
(44). Cheong et al (29) encontraron que al utilizar núcleos de
blastómeros de embriones de dos, cuatro y ocho células que se
hallaran en la fase temprana del ciclo celular (fase G 1 de la
segunda división), como donadores de núcleos para ser
transferidos, los de dos células daban 78% de blastocistos y
29% de ratones nacidos vivos a partir de los embriones
reconstituidos, mientras que los de cuatro células daban 71% de
blastocistos y
22% de ratones nacidos vivos, y los de ocho células daban 46% y

17% respectivamente. En resumen, los núcleos obtenidos de
embriones en las fases tempranas de la segmentació n tienen la
ventaja sobre los provenientes de células diferenciadas en que los
primeros revierten con facilidad los cambios que sufren previo a
su diferenciación; mientras que los últimos deben revertir los
cambios que ya han sufrido durante más de 30 ciclos de
divisiones celulares.
Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un

desarrollo a término del huevo manipulado, dependerá de la
reprogramación adecuada del núcleo donador. Las
macromoléculas del tipo del ARN mensajero y las proteínas
a lmacenadas en el ovocito sólo soportan el desarrollo
embrionario durante un tiempo relativamente corto. Entre más
corto sea este período, se requerirá menor tiempo para la
reprogramación. Conforme el embrión sufre cambios mayores y
crece, sus células requerirán mayor tiempo y será probable que
esta reprogramación no se lleve a cabo adecuadamente. En
algunas especies, la activación de la transcripción del genoma
reintroducido ocurre hasta el estado previo al blastocisto, por 10
que depende de la transcripción del ARN materno. En embriones
productos de una fertilización normal, este proceso se lleva a
cabo a diferentes tiempos en diferentes especies: a partir del
estado de dos células en ratones y caprinos; de cuatro células en
porcinos; y en el paso de ocho a dieciséis células en embriones de
ovinos y bovinos (11). En la transferencia nuclear, la
compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el núcleo donador,
es poco entendida aún y toma parte en la reprogramación del
núcleo donado (47).
Dentro de los cambios que deben revertir los núcleos de las

células de adulto durante la transferencia nuclear está la
metilación del ADN que es esencial para el desarrollo

embrionario. El genoma del ovocito está poc o metilado,
mientras que en el embrión comienza a incrementarse esta
metilación. Esto ultimo afecta la expresión de los genes, la
inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular, y el
imprinting (50). Otros cambios asociados son la activación de
las histonas y modificaciones en otras proteínas nucleares. Si
estos cambios no se revierten, durante el crecimiento
ocurrirían modificaciones genéticas de los núcleos adultos,
tales como la mutagénesis somática, los errores mitóticos, las
deleciones y triso mías (4).
Con el propósito de revertir los cambios en las células

diferenciadas y así incrementar las tasas de éxito en la fusión y
en el desarrollo de embriones reconstituidos por medio de la
transferencia nuclear, es importante la sincronización de los.
ciclos celulares de las células donadoras de núcleos y de los
ovocitos receptores (39, 47, 51). Merchant (6) le llama a este
proceso sincronización nucleocitoplásmica.
Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y

hasta la pubertad, el ovocit o de los mamíferos se encuentra
detenido en la etapa de diploteno de la profase de la meiosis I
y sus cromosomas se condensan poco antes de que ocurra la
ovulación por acción de las gonadotropinas. Este estímulo
promueve que el ovocito reasuma su programa de división
formándose el ovocito secundario con su primer cuerpo polar,
eliminando así la mitad de su material genético. En los
mamíferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y
termina en la ovulación, cuando es depositado en el oviducto
en donde madura e inicia su segunda división meiótica
(meiosis II), en la cual se vuelve a detener, solo que esta vez 10
hace en la metafase II. El ovocito arrestado en metafase II
continuará su división únicamente si es activado por el

espermatozoide durante la fertilización, en cuyo caso culminará
su segunda división meiótica y formará el segundo cuerpo polar
(6, 52, 53).
Durante la maduración y la activación, el citoplasma del

ovocito modifica sus propiedades en la medida en que la célula
es liberada del arresto en la metafase II y es activada con la
fertilización mediante una serie de descargas de calcio que
promueven la reacción cortical. Una vez ocurrida la fertilización,
la transcripción del ARN materno comienza a controlar el
desarrollo en las primeras divisiones mitóticas hasta la activación
del genoma embrionario. Cuando se efectúa una transferencia
nuclear, la transcripción del genoma materno del ovocito dirige
al núcleo donado mientras que éste es capaz de asumir el control
de las fases embrionarias tempranas por sí mismo (4).
AI igual que en las células que se dividen, el ciclo celular del

ovocito se encuentra controlado mediante dos factores
proteínicos: el factor promotor de la mitosis 0 de la maduración
(MPF) formado por una ciclina y la cinasa dependiente de
ciclina, y el factor citostático (CSF) que es esencialmente el
mismo MPF pero asociado a una proteína que inhibe la acción de
la cinasa. Cuando la proteína inhibidora de la ciclina se degrada,
la célula es capaz de sintetizar ADN, si el inhibidor no se
degrada, la célula primeramente es incapaz de entrar ala fase S
del ciclo y, en consecuencia, puede condensar de manera
prematura su material genético. Cuando las concentraciones del
MPF se elevan, se inducen algunas alteraciones, tales como la
desintegración 0 rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), la
condensación prematura de los cromosomas (CPC) y la
reorganización del citoesqueleto (3, 39).
Para que los eventos ocurran apropiadamente después de la

transferencia nuclear, los niveles de MPF deben descender o
ser bajos. De otro modo la incidencia de daño cromosómico y
aneuploidías puede ser alta (39, 42). Si la transferencia nuclear
se hace cuando el ovocito tiene bajos niveles de MPF (siete a
diez horas después de su activación), no sólo se presentarán
menos problemas de aneuploidías, sino que además se
mantendrá intacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se
condensarán prematuramente, por lo que continuarán su ciclo
de replicación-condensación de manera normal, favoreciendo
la sincronización nucleocitoplásmica y con ello el desarrollo
del cigoto así reconstituido (6).
Si se fusionan células en G con cé lulas en G, el material

2 1
genético de estas últimas sufre una condensación
prematura como si estuviera lista a iniciar los movimientos
clásicos de la división celular (mitosis). Si la fusión es entre
células en etapa S y G, la2 síntesis del material genético se
completa y el contenido de cromosomas en el producto es
Aberrante , pues no sólo hay más sino que incluso las células
hijas sufren la falta de uno 0 varios de ellos, mientras que la
otra presenta má s de un par de copias de un cromosoma
(trisomías) (51). Los núcleos donadores que se encuentren en
la fase del ciclo G 0 G 1resultan
0
en un mejor desarrollo
J
que los que están en fases S 0 G , ya que es más sencillo
2
reprogramar un genoma que está abierto para sufrir una
replicación, además de que los factores citoplásmicos tienen
mayor acceso al genoma cuando las células donadoras están en
dichas fases (54). Los núcleos se inducen a entrar en un estado
de quiescencia (G) cultivando las células donadoras
o
en medios con cantidades reducidas de suero. De esta
manera se coordinan los ciclos celulares del carioplasto y
citoplasto.
Ahora bien, para la fusió n de carioplastos y citoplastos se

han utilizado estímulos eléctricos, virales y químicos. La
fusión eléctrica y la fusión viral se han utilizado en roedores,
lepóridos y ovinos. La fusión eléctrica se ha usado además en
bovinos y en monos rhesus (39, 41). La fusión inducida por el
virus Sendai tiene el inconveniente de que los núcleos
transferidos no sobreviven 0 los embriones reconstituidos no
logran segmentarse. Las tasas de éxito en la fusión por virus
son de 30% en ovinos, siendo de tan solo 8% en bovi nos (41,
43), por 10 que este tipo de estímulo ya no se utiliza. Una vez
efectuada la fusión, los factores presentes en el citoplasma del
ovocito enucleado y activado serán los que reprogramen al
núcleo, confiriéndole la habilidad para regular el desarroll o
embrionario hasta que llegue a término (4, 44). Este desarrollo
embrionario puede llevarse a cabo in vitro, 0 in vivo en
oviductos de ovino (37, 41).
Todavía existe gran variabilidad de resultados con estas

técnicas, con tasas de éxito en la electrofusión de blastómeros
obtenidos a partir de embriones de ocho células del 90% en
ovinos, 74% en bovinos, 84% en lepóridos y 87% en porcinos
(41), y tasas de gestación de 0% a 54% (1) 0 hasta de 78% en
bovinos. En esta última especie, las tasas de segmentación de
los embriones reconstituidos varían según el sexo de los
mismos: 73% para embriones hembras, 63% para embriones
machos (46).
Existe un informe interesante en bovinos que describe la

transferencia nuclear utilizando ovocitos de vacas Holstein
(Bos taurus) con núcleos de células aisladas de embriones
Brangus (5/8 Angus, Bos taurus y 3/8 Brahman, Bos indicus).
En otra etapa del estudio, utilizaron blastómeros de embriones
de ocho a dieciséis células de ovino que se
C I E N C I A V E T E R I N A RIA 9 -2003-4 53
fusionaron con ovocitos enucleados de caprino, desarrollándose

hasta el estado de ocho células al ser cultivados in vivo en
oviducto de ovino. Lo anterior demuestra que es factible obtener
un clon a partir de dos células provenientes de diferentes especies
animales y cultivarlo in vivo en el aparato reproductor de una
especie no homó1oga (37).
III. Ventajas y desventajas de las técnicas de

clonación
La clonación a partir de células de animales adultos tiene algunas

ventajas y desventajas dependiendo de la técnica que se trate
(Cuadros 4 y 5), aunque en general todas tendrían la ventaja de
que al conocerse las características del donador permitirían
seleccionar a los individuos con alto valor biológico 0 productivo
si las características seleccionadas dependen solo de factores
genéticos, lo que no es tan probable por el efecto de las
condiciones ambientales, de manera que se desconoce hasta qué
grado es un clon realmente idéntico a su donador (5).
CUADRO 4
PRINCIPALES DESVENTAJAS DE LA PARTICIÓN 0 DIVISIÓN DE
EMBRI0NES
• Solo se obtienen de uno a cuatro embriones monocigóticos, y solo la mitad de ellos

llegan al término en su desarrollo (21, 73).
• Los demi-embriones obtenidos con esta técnica no resisten la criopreservación.
• Reducción de las tasas de gestación posteriores a la transferencia en hembras

receptoras (21).
• Dificultad de separar con exactitud dos mitades que sean exactamente iguales entre sí,
por lo que los individuos monocigóticos no son 100% idénticos (30).
CUADRO 5
COMPARACIÓN ENTRE LA CLONACIÓN POR SEPARACIÓN DE
BLASTÓMEROS Y LA TRANSFERENCIA NUCLEAR
Separación de blastómeros Transferencia nuclear

Ventajas
• Obtención de individuos 100% • Obtención de copias genómicas de

idénticos genéticamente entre si. individuos superiores
• Facilidad de obtención de
blastómeros aislados
• No requiere métodos especializados

para obtener los carioplastos,
citoplastos 0 la fusión entre ellos .
• En la separación y reagregación de
blastómeros los blastocistos
obtenidos de quíntuples y séptuples
pueden utilizarse para establecer
células totiponteciales.
Desventajas
• Necesita determinarse el medio • Los clones no son 100% idénticos

óptimo para el desarrollo genéticamente debido a la participación
embrionario in vitro para cada del ADN mitocondrial
especie utilizada.
• Los clones muestran diversos grados de
• Puede requerir de la utilización de alteración.
zonas pelúcidas 0 de sustitutos de
ellas. • Requiere de metodologías y equipos
sofisticados para la obtención de
• Bajas tasas de éxito en crías carioplastos, citoplastos y su fusión.
nacidas que se reducen al utilizar
embriones en fases avanzadas de • Requiere de una adecuada
la segmentación. sincronización nucleocitoplásmica
• Tasas de aborto elevadas después de • Bajas tasas de éxito en crías nacidas

transferir embriones clonados en
hembras receptoras
Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se

planea la clonación por transferencia de núcleos tornados de
células de adultos, es que éstos reflejan la edad biológica del
donador. Esto último parece ser trivial, sin embargo tiene
importancia si se analiza lo ocurrido con las regiones terminales
de los cromosomas. En estas regiones se encuentra ADN de
secuencia altamente repetida y en forma general, por tripletes o
tétradas de nucleótidos repetidos, dichas secuencias se conocen
como microsatélites. Experimentalmente se ha determinado que
el número de repeticiones que debe tener es importante para la
función celular. Durante el envejecimiento, cada vez que la
célula se divide el número de estas repeticiones se hacen
menores y permiten que se desarrollen enfermedades propias de
la edad adulta aún en organismos "jóvenes" (55).
Sin embargo, Lanza et al. (56) observaron que en bovinos

clonados por transferencia nuclear a partir de células somáticas
envejecidas in vitro, ocurría un aumento en la duración de la
vida replicativa de la célula así como en la longitud de sus
telómeros. Asimismo, las células somáticas que han e stado
expuestas a carcinógenos químicos y radiaciones durante
períodos prolongados, en este sentido, es posible que hayan
acumulado mutaciones que pueden manifestarse durante la
gestación, como malformaciones congénitas 0 predisposiciones
a diversas enfermedades en los recién nacidos (5).
Con la clonación queda todavía un buen número de

problemas a resolver, como son la eficiencia de la té cnica de
transferencia nuclear, que actualmente es muy baja y demasiado
costosa para aplicarla comercialmente de manera rutinaria, ya
que aún en el estudio mas conocido de esta técnica se obtuvo
una eficiencia de 0.36% (54). Considerando que el patrón de
desarrollo de los cigotos es muy diverso, la adaptación de las
técnicas a otras
especies precisa aún de una extensa investigación para cada una

de ellas (6).
IV Aplicaciones de la clonación de embriones
En el ámbito científico, la clonación ha abierto un nuevo campo

de experimentación para abordar problemas fundamentales sobre
los mecanismos que controlan la diferenciación celular en el
inicio del desarrollo (6). También es útil en los estudios de
fisiología, embriología, genética y crianza animal (15, 16).
Los individuos genéticamente idénticos pueden ser de sumo

valor para los experimentos controlados en los que se evalúen los
efectos ambientales, tales como nutrición, instalaciones y
medicamentos. La transferencia de genomas idénticos en
diferentes tipos de citoplastos permitirían evaluar las
interacciones entre citoplasma y núcleo (17, 41).
Los clones transgénicos y los derivados de células

primordiales pueden ser incluidos en la investigación de terapias
celulares 0 genéticas, principalmente si se trabaja con primates
no humanos, ya que esto último salvaría la distancia existente
entre las especies de roedores comúnmente utilizadas en los
laboratorios para desarrollo y prueba de fármacos de uso en
humanos. En enero de 2001, el grupo de Gerald Schatten dio a
conocer el nacimiento de un simio que tiene insertado el gene de
la proteína verde fluorescente (GFP), de tal suerte que sus célula s
pueden ser utilizadas con relativa facilidad para estudios
encaminados a determinar los efectos nocivos de fármacos que
puedan ser semejantes a los obtenidos en humanos, por 10 que los
estudios de fases terminales pueden ser mas rápidos y con un
modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgo que
implica hacer la extrapolación del
C I E N C I A V E T E R I N A R I A 9 -2003-4 57
modelo de roedor 0 conejo, comúnmente usado en la

investigación farmacológica.
Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento

(considerando que de un mismo grupo de clones unos sean
transferidos directamente y otros sean congelados para
transferirlos con posterioridad) tienen aplicación en el análisis
fenotípico de los individuos clonados antes de que sean
propagados y en la transferencia seriada de células totipotentes
para dirigir la edad celular mas allá de las expectativas de vida
(44). Además, los clones implantados en una misma hembra
subrogada podrían probar los efectos epigenéticos que incluyan
el ambiente materno (38).
1. Clonación de embriones por generación múltiple
La última meta de los proyectos de clonación de embriones es

producir gran número 0 un número ilimitado de individuos
idénticos a partir de un individuo original. Lo anterior ha sido
llevado a cabo a través de la clonación por generación múltiple
también conocido como reclonación, que utiliza embriones
clonados por transferencia nuclear como donadores de núcleos
para producir la próxima generación de embriones idénticos. De
manera que si el primer ciclo de transferencia nuclear produce 10
embriones clonados viables, el siguiente ciclo posiblemente
resultaría en 100 embriones clonados en la segunda generación
(2, 45).
A este respecto, desde la década de los 80, se han reportado

resultados exitosos en los procedimientos de reclonación,
pudiéndose obtener seis generaciones de embriones (37) y
terneros de tercera generación a partir de embriones en diferentes
estados de segmentac ión, obtenidos por transferencia nuclear.
Asimismo,
la multiplicación en serie de embriones mediante la clonación ha

incrementado el número de progenie producida de un embrión
donador determinado. Mediante ciclos repetidos de transferencia
nuclear, se han obtenido gestaciones de clones de tercera
generación y se han producido embriones en etapa de blastocisto
de clones de quinta generación. Los límites de la clonación en serie
aún no han sido definidos. Las tasa de gestación de los embriones
en estado de mórula 0 blastocisto producidos por clonación en
serie no difieren de las tasas de gestación de los clones derivados
de embriones frescos (2, 45).
Se ha visto que los blastómeros provenientes de embriones

clonados por transferencia nuclear en etapas mas tempranas de la
segmentación, tienen mayores probabilidades de fusionarse a los
citoplastos que los provenientes de embriones clonados en etapas
mas tardías de la segmentación, y que esto va relacionado con el
tamaño del blastómero que se va a transferir. Las tasas de éxito en
la reclonación difieren con relación en el tiempo de cultivo y el
número generacional del clon; por ejemplo, cuatro días de cultivo
in vivo en oviductos de ovino da lugar a tasas de fusión de 68% en
embriones reconstituidos de bovino, respecto del 57% obtenidos
tras cinco días de cultivo in vivo. Sin embargo, los clones de cinco
días de cultivo pueden producir 4.5 generaciones de clones,
mientras que los de cuatro días solo 3.6. La tasa de éxito en la
fusión se reduce de una generación a otra, ya que de una línea
clonad se han obtenido 11 clones en la primera generación, 16 en
la segunda, 20 en la tercera y solo 7 clones en la cuarta generación
(45).
Yong y Yuqiang (42) lograron obtener crías de caprino de la

primera a la sexta generaciones, de las cuales tres pares fueron
gemelos monocigóticos, tres series fueron de triples
monocigóticos, dos series de cuádruples monocigóticos, tres
series de quíntuples y una serie de heptaples monocigóticos.
Los abortos y las tasas de gestación pueden diferir entre

reclines y la primer a generación de embriones clonados por
transferencia nuclear. Willadsen (37) in forma que la segunda o
posteriores generaciones de bovinos y ovinos, tienen tasas de
gestación mas bajas que la primera generación de embriones
clonados, y que las tasas de aborto se incrementan a partir de la
segunda generación.
Con el estudio profundo y el adecuado control de las

deficiencias actuales de la clonación, en un futuro la clonación en
serie permitirá a su vez, la clonación de animales transgénicos
que contengan genes selectos. De ahí se deduce que la clonación
ofrece una enorme oportunidad pa ra la ganancia genética, el
incremento en la eficiencia de la producción de alimentos de
origen animal y los programas de investigación (2).
2. Aspectos comerciales de la clonación de embriones
Cuando la clonación se aplica a los embriones de alto valor, la

habilidad para producir varios nacimientos por cada embrión
ofrece suficiente ventaja económica para recuperar los costos
involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos de sexado
de embriones, de manera que los nacimientos de individuos
clonados sean de sexo predeterminado. Esto pondría un limite en
el número de embriones de sexo masculino transferidos, lo cual
reduciría el número de transferencias requeridas 0 permitiría
obtener una población de pie de cría efectiva con el mismo
número total de transferencias (57). Sin embargo, la eficiencia
con la que se cuenta actualmente aún no permite una producción
de embriones en masa a un costo accesible para la producción de
animales comerciales (2). Es necesario que se
incrementen significativamente las tasas de éxito para que el

mercado de los embriones clonados pueda hacerse realidad.
Actualmente en el mundo existe un laboratorio que ofrece la
clonación de embriones por transferencia nuclear, a la cual los
ganaderos pueden enviar sus embriones para recibir clones por
100 dólares cada uno (1).
Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados al

nacimiento son anormales. Estos procedimientos da n lugar a una
mayor incidencia de distocias, aunque posterior al nacimiento las
tasas de crecimiento no se afectan por este procedimiento. No se
conoce explicación biológica sobre este aspecto (2). Es necesario
incrementar la eficiencia de este procedimiento para eliminar el
problema de gigantismo fetal que se ha encontrado en algunos
becerros producidos por transferencia nuclear (1). En ovinos no
se ha observado alteración en los pesos al nacimiento de los
individuos clonados, pero sí un alargamiento en la duración de la
gestación que es influenciado por el genotipo fetal (54).
Es clara la necesidad de investigación básica, utilizando

especies de las que se tenga un conocimiento adecuado para los
fines de la investigación. Este tipo de estrategias, por su
accesibilidad y bajo costo, podrían ser llevadas a cabo en
animales de laboratorio, explorando mas la técnica en los ámbitos
celular y molecular, de manera que la solución a los problemas de
las tasas de gestación y pesos al nacimiento podría obtenerse de
los experimentos a partir de estas especies (2).
3. Aplicación de la clonación en la conservación de especies
La reciente demostración de la capacidad para clonar

mamíferos adultos, ha propiciado una variedad de nuevas ideas
de investigación
para los interesados en las especies en peligro de extinción. La

clonación tiene el potencial de minimizar la pérdida de recursos
genéticos, al igual que rescatar la pérdida de material gené tico; por
lo que permitiría expandir el número de taxas incluidos en los
programas de supervivencia de especies, porque haría posible la
criopreservación de embriones clonados; aunque habría que pensar
con cuidado, en las especies animales que podrían ser utilizadas
como las receptoras de los embriones de especies en peligro de
extinción que vayan a ser clonados, y considerando: que los tipos
de placentación son diferentes para cada especie; que la
transferencia embrionaria interespecífica sólo funciona en las
especies en las que es posible crear híbridos; que hay especies
silvestres que no se reproducen en cautiverio, y también que el
comportamiento materno de las hembras receptoras hacia las crías
nacidas a partir de embriones clonados de especies no homólogas a
ellas, podría afectar la supervivencia de los clones, etcétera (8).
El grupo Lanza et al. (58) efectuaron la primera clonación de

una especie en peligro de extinción: un gaur asiático a quien
llamaron «Noé», obtenido por la transferencia de núcleos
utilizando células de piel (fibroblastos) de gaur macho y ovocito
enucleado de vaca doméstica, y cuyo embrión reconstituido fue
transferido en una vaca doméstica. Actualmente esperan el
nacimiento del gaur clonado y señalan que están en planes de ser
clonadas especies tales como el antílope bongo, el tigre de Sumatra
y el panda gigante. Asimismo, se cuenta con células preservadas de
una especie ya extinta, la cabra bucardo de montaña, de España, en
la que se esta pensando aplicar la clonación.
V. Consideraciones éticas de la clonación
Hasta ahora se ha hablado sobre algunas consideraciones que

deben ser cuidadosamente estudiadas con respecto ala clonación
de animales, tanto para el abas to como para la conservación de

especies en peligro de extinción; queda solamente mencionar
las probables consecuencias que esta técnica tendría si fuera
aplicada a los seres humanos.
En 1984 McLaren (44) consideraba que la transferencia

nuclear podría ser aplicada en los seres humanos; señalaba que
para las parejas que tuvieran el riesgo de transmitir defectos
genéticos a su progenie, si se recuperaran varios ovocitos de
una mujer, se enuclearan y se les transfiriera un núcleo de la
MCI de alguno de sus propios embriones; unos cuantos podrían
ser congelados mientras que los remanentes genéticamente
idénticos podrían ser evaluados para defectos genéticos por
análisis cromosómico, análisis de ADN 0 por métodos
bioquímicos. De esta forma se aseguraría a l a pareja que
cualquier embrión transferido al útero materno del stock que
fuera congelado, estaría libre de defectos genéticos.
A este respecto existen opiniones tanto en favor como en

contra. Por ejemplo, en 1997 el Consejo Bioético de Estados
Unidos de América (59), señaló la preocupación existente
acerca del posible daño físico provocado por la manipulación
del ovocito, núcleo y embriones, así como del daño psicológico
en cuanto al sentido de la individualidad y la autonomía
personal de los individuos c lonados. Mencionan la
preocupación ética sobre la degradación de la calidad de la
familia y el parentesco en el caso de que los padres quisieran
tener un control excesivo sobre las características de sus hijos.
Lisker y Tapia (5) opinan que la clonación d e embriones

humanos tendría utilidad en la investigación siempre y cuando
los embriones no fueran implantados en el útero de mujeres, y
que tuviera la finalidad de incrementar el conocimiento en
biología celular y los mecanismos de expresión genética, ya que no

deben ponerse obstáculos al avance en la investigación científica.
Aunque hacen hincapié en la importancia de discutir y resolver
todos los problemas éticos y legales que plantea la clonación de
nuestra especie.
A finales del 2000 las autoridades inglesas aceptaron la

aplicación de la clonación por transferencia nuclear en humanos,
pero con una temporalidad finita de solo 2 semanas y con una idea
de aplicación exclusiva para la obtención de tejidos que puedan ser
utilizados para transplante. Una alternativa en este sentido es la
estrategia definida por los trabajos de Onishi et al. (60), y de
Polajaeva et al. (61) en los cuales se obtuvieron cerdos clonados
por transferencia nuclear y cuya similitud en cuanto a tamaño de
órganos y capacidades de aspecto inmunológico son muy similares
a la de los humanos.
Hottois (62) considera que se le está dando mayor prioridad alas

reacciones simbólicas de la clonación que al análisis de sus
técnicas. Opina que no hay razón para enjuiciar la clonación, ya que
desde el punto de vista de una pareja con problemas de esterilidad
total, 0 que hayan perdido a un hijo, 0 de una pareja en la que
ambos cargan genes letales, la clonación no implicaría la
reproducció n en masa de clones sino de tan solo uno 0 quizás dos, y
que ello no afectaría la autonomía de los clones. Además, recuerda
que la identidad biológica entre los clones, y entre ellos y su
donador no sería total, ya que existen diferencias ligadas al ADN
mitocondrial (que permanece en los ovocitos receptores) y alas
interacciones entre los genes y el ambiente que genera mutaciones.
De hecho, menciona que los clones son más diferentes entre sí que
los gemelos monocigóticos. Sin embargo, no hay que perder de
vista que en este ultimo aspecto, los genes letales que deberían ser
removidos de la población por efecto de
la selección natural, son reintegrados al juego con lo que

eventualmente pueden obtenerse individuos en cuyos embarazos
se manifiesten nuevamente estos genes letales.
Por otro lado, Bryan (63) trata de aproximar el que sería el

sentir de los humanos como individuos clonados con el de los
gemelos monocigóticos que nacen de manera natural. Explica
que en virtud de que aún cuando estos últimos son idénticos
genéticamente, siempre hay uno que nace primero que el otro y
que, por 10 tanto los medios uterino y extrauterino influyen para
producir no solo apariencias sino también personalidades
diferentes en cada uno. En el aspecto psicológico, señala como
ventaja que los gemelos monocigóticos tienen facilidad para
relacionarse y comprenderse mutuamente dada su identidad
biológica; pero como desventajas, que tienen mayores riesgos de
nacer prematuramente 0 de tener altas tasas de muerte perinatal.
Por último, Edwards y Beard (4) señalan que la bisección 0

separación de embriones y la transferencia nuclear actualmente
aplicadas en animales, podrían considerarse para su aplicación en
humanos en la próxima década.
VI. Conclusiones
Aún cuando son muchas las definiciones que se le dan a la

clonación, es posible concretar que la clonación implica la
utilización de técnicas que permiten la manipulación de una
célula para que se desarrollen a partir de ella nuevos individuos
con un duplicado genético de la célula original.
Si bien la clonación de embriones de mamíferos superiores a

través de sus diversas técnicas tiene un potencial considerable
en el mejoramiento de la producción animal y en el rescate de

especies animales en peligro de extinción, es necesario buscar
mayores avances en dichas técnicas para obtener un sistema
eficiente de clonación de embriones, que reduzca al máximo las
anormalidades cromosómicas, tales como las aneuploidías 0 las
anormalidades en los individuos clonados, tales como el
gigantismo fetal, y que se incremente la tasa de éxito en la
obtenció n de individuos clonados. En la actualidad los
investigadores están regresando a la investigación básica, para
tratar de superar este obstáculo (64).
Por otra parte, aún cuando la partición 0 división de

embriones ya tiene aplicación comercial en el ganado, la
separación de blastómeros y la transferencia nuclear todavía
están en etapa de investigación y perfeccionamiento de las
técnicas. Habría que darle mayor atención a la separación de
blastómeros, pues sus ventajas son mayores a las que ofrece la
transferencia nuclear en el sentido de que no requiere
manipulaciones mayores que la separación y cultivo de
blastómeros aislados, sin necesidad de sincronizar ciclos
celulares ni de fusionar células con la pérdida de control que
cada una de estas etapas implica. A pesar de que las tasas de
éxito en el desarrollo a término de los individuos obtenidos de
esta forma es también reducido, hasta ahora no se han descrito
problemas de anormalidades en los individuos al nacimiento.
Debemos dejar claro que esta técnica solo producirá individuos
genéticamente similares entre sí, acorde a la definición de
clonación en el sentido horizontal, más no con respecto de los
individuos que intervengan para obtener la célula donadora de
genes, como sucede con la transferencia nuclear. Aún así,
permitiría obtener buen número de individuos clonados de genes
selectos que, inclusive, podrían ser seleccionados con base en su
sexo, a un menor riesgo.
Por ultimo, dados los alcances de la clonación, es necesario valorar

su aplicación en embriones humanos teniendo presentes las
consecuencias que podría ocasionar su mal uso. Aun está en estudio y
requiere ser perfeccionada al máximo para evitar dañar física y
psicológicamente a los individuos clonados. Asimismo, la legislación
alrededor de esta metodología la va haciendo cada vez menos mágica
y le está poniendo límites reales, por lo que es de esperarse que la
utilización que de ella se tenga, sea también adecuada. Dios le ha dado
ala humanidad la capacidad de utilizar a la ciencia para hacer el bien,
toca a la comunidad científica velar porque así sea.
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2. Separación y cultivo de blastómeros aislados
En algunas especies, como los equinos, se ha utilizado la

separación de blastómeros de embriones previos a su
implantación para efectuar estudios de diagnóstico de
enfermedades genéticas. En ellos se ha determinado la viabilidad
de los embriones analizados después de su transferencia en
hembras receptoras, encontrándose tasas de gestación de 21%
(24).
En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados

también han sido utilizados en estudios de biopsias de embriones
en diferentes etapas de segmentación con la finalidad de dar
alternativas a los estudios de diagnóstico prenatal, evaluando a su
vez el desarrollo embrionario in vitro con el propósito de que se
seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en
blastocistos y congelarlos mientras se evalúan sus blastómeros
aislados (25, 26, 27).
La técnica de separación de los blastómeros implica la

remoción de la zona pelúcida, ya sea por métodos químicos,
mecánicos 0 enzimáticos, para posteriormente obtener los
blastómeros mediante aspiración, extrusión 0 disminución de sus
interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (12, 28,
29,30). Los blastómeros de rata aislados en la etapa de dos
células, son capaces de formar embriones com pletos (31). En el
ratón se han obtenido gemelos idénticos removiendo la zona
pelúcida de embriones de dos células y cultivándolos
separadamente previo a su transferencia (16). En otras especies,
el éxito del experimento se ha determinado como dependiente de
diversos factores. Así, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja
eficiencia en la obtención de fetos se debe a la baja sobrevivencia
in vivo
L EGORRETA -H ERRERA M ET AL . : Los vectores virales y la transgénesis
© VERTIENTES Revista Especializada en Ciencias de la Salud, 15(1):5-14, 2012.
LOS VECTORES VIRALES Y LA TRANSGÉNESIS

VECTORES
Martha Legorreta-Herrera 1
Francisco Martínez-Flores 2
Fernando Hernández Sánchez 3
Alejandro Zentella-Dehesa 4
RESUMEN
Los vectores virales son el medio más eficiente para transferir genes, permiten modificar específicamente a una célula o a
un tejido, para inducir la expresión de genes terapéuticos. Actualmente, se investigan diferentes virus que proporcionen
la expresión permanente o temporal del transgene. Esos virus incluyen a los virus recombinantes, a los adenovirus, los virus
adeno-asociados, los retrovirus y los virus herpes simplex. La elección del vector depende del uso y la eficiencia de la
expresión del transgene, también se considera que su producción sea fácil, segura y estable.
En esta revisión se presenta: la biología de los virus, las bases de su manipulación genética y su potencial aplicación en
modelos de transgénesis, algunos de estos factores podrían aportar elementos de juicio para la toma de decisiones prácticas
y convenientes en procedimientos de transgénesis.
Palabras Claves: Virus, vector, transgénesis, transfección.
The viral vectors and the transgenesis
ABSTRACT
Viral vectors constitute the most efficient vehicles to transfer genes, they make possible to specifically modify cells or tissues
to induce the expression of therapeutic genes. Actually, different virus to transduce permanent or temporally transgenes are
studied. Those virus include recombinant, adenoviruses, adeno associated virus, retrovirus, lentivirus and herpes virus. The
vector selection depends on the efficiency and use of the transgen. It is also important to consider its easy, safe and stable
production.
In this work, we present the biology of virus, the basis for its genetic manipulation and the potential application in transgenesis
models. Some of these factors could be critical elements to take decisions on transgenesis procedures.
Key Words: Virus, vectors, transgenesis, transfection.
ARTÍCULO RECIBIDO EL 04 DE MAYO DEL 2012 Y ACEPTADO EL 18 DE MAYO DEL 2012.
1. I NTRODUCCIÓN
La transgénesis se define como la introducción de ADN exógeno, los métodos de transferencia de genes inició desde los años
en una célula eucarionte. A diferencia de la transferencia vertical cincuentas, cuando se describió el ciclo lisogénico de los
de genes que ocurre en la reproducción (de padres a hijos), en bacteriófagos cuyo genoma se integra establemente en la
la transgénesis la información se transmite de forma horizontal bacteria huésped y se replica junto con ella. La posterior
(directamente de un individuo a otro) por medio de procesos descripción de elementos hereditarios no asociados con el
similares a una infección, con consecuencias biológicas como: cromosoma como los plásmidos, que en algunos casos se
mosaicismo, modificaciones en la dosis génica, inestabilidad pueden insertar de forma estable en el genoma (episomal),
del genoma, transferencia de mutaciones, etc. El desarrollo de posibilitó la transformación artificial de organismos unicelulares
1
Lab. de Inmunología Molecular, FES Zaragoza, UNAM. 2 Depto. de Morfología
Celular y Molecular, Instituto Nacional de Rehabilitación, 3 Depto. de
Microbiología, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosío
Villegas, 4 Depto. de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y
Nutrición Salvador Zubirán. 1 E-mail: marthal@unam.mx.
MLH recibió financiamiento de DGAPA, PAPIME PE200910.
5
VERTIENTES
y promovió la invención de métodos artificiales de transferencia Los virus son elementos genéticos con capacidad infectiva que
de genes1. se pueden replicar independientemente de los cromosomas de
la célula que infectan. A diferencia de otros elementos genéticos
La transfección es la introducción de material genético externo como los plásmidos, el genoma viral puede ser ARN o ADN y
en células eucariotas por medio de plásmidos, virus2 u otras está rodeado por una cubierta proteica o cápside. El conjunto
herramientas moleculares como la microinyección, la biobalística, de ácido nucleico y cápside se denomina nucleocápside o core
los liposomas3, etc. (Figura 1). El problema de la transfección es del virus, el cual puede tener una envoltura. Cuando se encuentran
la pluricelularidad porque la metodología es diferente si queremos en estado extracelular, a la partícula vírica se le denomina virión
modificar a todo el individuo o únicamente una parte. También y esa es la estructura infectiva. Las proteínas asociadas al
es importante conocer si se requiere que los fenotipos adquiridos elemento genético (cápside, envoltura y proteínas reservorio
se hereden y tomar en consideración que no todas las células encapsuladas) confieren un papel mucho más activo y menos
que contienen el mismo genoma responden al mismo método de azaroso durante la infección que depende del tropismo celular
transfección. Finalmente, la compartamentalización también de cada virus, este es un fenómeno de interacción específica
afecta la expresión del gen de interés. entre las proteínas de fijación de la superficie de la partícula
vírica y los receptores de la membrana citoplasmática de la célula
Entre los factores a considerar para un procedimiento óptimo de diana. Tras la fijación a la célula, la nucleocápside penetra en el
transfección en eucariontes están: el blanco, la ventana de interior del citoplasma, donde el ácido nucleico se libera de la
tiempo, el nivel de expresión deseado, la estabilidad esperada, cápside para migrar a los lugares de la biosíntesis celular.
así como la factibilidad técnica. En este documento, se revisa la Cuando el genoma viral se introduce a una nueva célula se inicia
biología de los principales vectores víricos, las bases de su la fase intracelular donde ocurre la replicación vírica.
manipulación genética y su potencial aplicación en la
transgénesis. La topología, el tamaño y la naturaleza del genoma viral influyen
en el éxito y la especificidad de la infección y en consecuencia
2. BIOLOGÍA DE LOS VIRUS el potencial como herramienta de transferencia de genes. El
La palabra virus deriva del latín, que significa toxina o veneno. ácido nucleico de los virus puede ser: monocatenario o
Figura 1. Diferentes formas de introducir material genético extraño en una célula. Existen tres barreras que se deben salvar para
lograr la transferencia del material genético. La primera barrera es la permeabilidad de la membrana, la segunda es la internalización
selectiva y la tercera es la entrada al núcleo celular. Estos obstáculos se pueden salvar utilizando técnicas como la biobalística,
la microinyección, el dimetil sulfóxido, la electroporación, la lipofección con liposomas y la infección viral. Las flechas punteadas
indican que el proceso de internalización al núcleo no es directo y que eso disminuye la eficiencia.
6
bicatenario, entre los que se encuentran moléculas lineales de son la herramienta más eficiente en la transgénesis, permiten
ADN, moléculas de ADN circular covalentemente cerradas, sobre expresar proteínas en células humanas (Figura 2) y como
ARN segmentado o ARN monocatenario de polaridad positiva consecuencia se pueden obtener proteínas recombinantes con
o negativa, los virus se clasifican con base en estas características un procesamiento postraduccional adecuado5.
además de la presencia o ausencia de envoltura.
Entre los virus recombinantes con aplicaciones en transgénesis
La capacidad de los virus para transferir genes de manera se encuentran los adenovirus, los retrovirus, los virus adeno
natural, es la cualidad más atractiva para convertirlos en una asociados, los lentivirus, además de otros ADN o ARN virus.
herramienta eficiente en los modelos de transgénesis in vitro e
in vivo4. El conocimiento de su biología ha permitido el diseño Los adenovirus
de vectores recombinantes no replicativos o replicativos, acorde Los adenovirus tienen importancia clínica porque generan
a las necesidades de cada modelo para la transferencia de genes. infecciones respiratorias y conjuntivales. El prefijo adeno deriva
del término latino glándula, estos virus se aislaron por primera
3. V ECTORES VIRALES vez en las amígdalas y en las glándulas adenoideas de humanos6.
Virus recombinantes Pertenecen al género Mastadenovirus, se han identificado un
Las partículas virales silvestres no se pueden emplear total de 51 serotipos humanos agrupados en seis especies (A-
directamente como vectores de expresión, es necesario F) que causan infección de tracto respiratorio y gastrointestinal
convertirlos en virus deficientes en su replicación dentro de la además de ocular7. Los adenovirus se utilizan en terapia génica
célula diana. De esta forma, el vector viral sólo se podrá in vivo, ya que pueden infectar de forma eficaz células que no
multiplicar en las células de empaquetamiento, que son líneas están en fase de división y facilitan la expresión de grandes
celulares modificadas que tienen la propiedad de ensamblar a cantidades del producto proteico. Los adenovirus son altamente
los virus y producir partículas virales que poseen los genes que estables sin integrarse en el material genético de la célula diana8.
codifican para las proteínas virales y para el gen de interés. La capacidad para replicarse de los adenovirus in vivo depende
del tipo de célula diana, un inconveniente es que algunas de las
Los virus recombinantes son estructuras capaces de transferir proteínas virales pueden ser tóxicas para la célula. Otra desventaja
material genético a una célula diana. El uso de la tecnología del de estos vectores, es que la expresión de algunas de las
ADN recombinante junto con el conocimiento del genoma viral, proteínas virales puede favorecer una respuesta inmune intensa
ha permitido generar viriones con capacidad de infectar y contra las células diana7. Sin embargo, a los vectores de nueva
transferir su material genético (transfectar), pero incapaces de generación les han removido algunos genes y eso ha disminuido
replicarse bajo condiciones especificas. Los virus recombinantes ese problema9, 10.
Figura 2. Modelo clásico de la transgénesis. 1. El gen de la proteína verde fluorescente (GFP) proviene de la anemona que
constitutivamente expresa a la GFP; 2. El gen se clona en un vector viral, 3. Con esas partículas se infectan mioblastos humanos,
el genoma viral se integra en esas células y cuando el transgen se expresa le confiere una nueva característica a la célula eucarionte
que es la fluorescencia verde.
7
VERTIENTES
Los adenovirus son viriones sin envoltura y con un genoma ese ha sido el avance más importante para disminuirles la
constituido por ADN de doble cadena de aproximadamente 26- inmunogenicidad, prolongando la expresión del transgene y
45 kb que se replica en el núcleo de células que se están mejorando la expectativa de los vectores adenovirales para una
dividiendo o en células quiescentes. La mayoría de los serotipos terapia génica de largo tiempo20. Las ventajas y las desventajas
utilizan el receptor Coxsackie y el virus receptor (CAR)11, 12 para más importantes de cada uno de los vectores virales se resumen
una unión primaria y αv integrinas para la internalización13. Los en la Tabla 1.
adenovirus poseen cuatro unidades transcripcionales en su
genoma: E1, E2, E3 y E4; que tienen funciones reguladoras. El Los virus adeno asociados AAV
gen E1 es esencial para el ensamblaje de las partículas virales. Los virus adeno asociados (AAV) están constituidos por ADN
El gen E3 codifica para proteínas involucradas en la evasión del de cadena sencilla, requieren de un adenovirus o de un virus
sistema inmune del hospedero (Figura 3). herpes que coopere con sus funciones para que se puedan
replicar. Los AAV no son patogénicos y su genoma con 4.7 kb
Otros atributos que hacen de los adenovirus un vector atractivo contiene dos marcos de lectura (ORF) que están flanqueados
incluyen la relativa fácil producción de grandes cantidades de por repeticiones terminales invertidas (ITR). En la ausencia de
virus con un título alto.14 Además, poseen el potencial de un virus cooperador, la doble cadena del ADN viral se integra
insertar genes de tamaño grande en las construcciones, lo que en el genoma de la célula hospedera gracias a la recombinación
puede generar virus selectivamente oncolíticos7. A la primera dirigida por la región viral rep21. A los vectores AAV les han
generación de adenovirus que se utilizaron como vectores para removido la mayor parte de su ADN dejando únicamente los
terapia génica les eliminaron la región E1 porque así se produce ITRs lo que permite incorporar un transgene con una capacidad
un virus deficiente de replicación y así también se elimina su de aproximadamente 4.9 kb22.
potencial oncogenicidad15. Las regiones E3 no son esenciales
para la replicación viral y si se elimina esta región se aumenta la Los AAV son uno de los vectores más utilizados. Principalmente
efectividad del vector. Los virus a los que se les ha removido la porque inducen una expresión eficiente del transgene por
región E1 se producen de forma estable en líneas celulares que tiempos prolongados en diferentes tejidos como lo son: el
expresen E1a y E1B como las células humanas embrionarias de hígado, el músculo, la retina y el sistema nervioso central23. Sin
riñón 293T16. A los adenovirus de segunda y tercer generación embargo, su capacidad de empaquetamiento se restringe cuando
les han eliminado otras regiones como la E2 o la E4 lo que ha se realiza a gran escala, lo que trae como consecuencia una
reducido su toxicidad en los modelos animales17-19. Sin embargo, producción ineficiente. Además, existe una inmunidad
lo mas sorprendente ha sido el desarrollo de virus cooperadores prexistente en los humanos para los vectores AAV y la integración
(HD-ADs) a los que les han eliminado todos los genes virales, en el genoma humano (si llegara a ocurrir) es al azar, la cual
Figura 3. Los vectores adenovirales. A) Estructura del Genoma del adenovirus silvestre. B) Cuando se construye un vector adenoviral
no replicativo, el transgene (que en este ejemplo es la Proteína Amarilla Fluorescente EYFP), se introduce en el sitio donde se
removieron las regiones E1, E2, E3 y E4 del adenovirus y el gene de interés queda flanqueado por secuencias virales ITR, además
se inserta la secuencia de un promotor para aumentar la eficiencia. C) Con esas partículas virales se infecta a la línea celular CHO,
y entonces las células expresan la Proteína Amarilla Fluorescente. La fotografía se tomó en el Departamento de Morfología Celular
y Molecular. INR.
8
Vector Material Capacidad Tropismo Tipo de Ventajas Desventajas

genético de transgen vector
NOENVUELTOS
Adenovirus ADN doble 8 kb Amplio Episomal Extremadamente Generan inflamación
cadena eficiente
AAV ADN cadena < 5kb Amplio excepto Episomal Extemadamente Generan inflamación
sencilla para células eficiente en la mayoría
hematopoyéticas de tejidos
ENVUELTOS
Retrovirus ARN 8 kb Células en división Integrado Persistente y se Pueden inducir
transfiere en células ongenesis
en división
Lentivirus ARN 8 kb Amplio Integrado Persistente en la Pueden inducir
mayoría de los tejidos ongenesis
HSV-1 ADN doble 40 kb Neuronas Episomal Capacidad para Expresión transitoria en
cadena insertar genes de 40 kb células diferentes a las
neuronas
Tabla 1. Cuadro comparativo de los vectores virales mas utilizados, se destacan sus principales características, además de las
ventajas y desventajas de cada uno.
conduce a una activación inesperada o inhibición de la expresión material genético del virus se retrotranscribe de ARN a ADN de
del gen endógeno. doble hebra. Este ADN puede integrarse de forma precisa como
copia simple en el genoma de la célula huésped7.
Diferentes serotipos de AAV tienen distintos patrones de
expresión debido a diferencias en las células y en las actividades Los retrovirus que se han utilizado como vectores para la
intracelulares. Por ejemplo, el serotipo AAV1 es adecuado para transfección de genes derivan de modificaciones del virus
inducir la expresión en el músculo esquelético y la retina, mientras murino de la leucemia Moloney (Mo-MLV), del virus del sarcoma
el serotipo AAV5 transduce eficientemente a las neuronas y a las de Rous o del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).
células de pulmón24. Por el contrario, los AAV2 se caracterizan
porque se expresan por mayor tiempo, pero los niveles de expresión Las formas deficientes en replicación de estos vectores se
son pobres, por lo que los AAV7 y AAV9 de monos Rhesus obtienen remplazando las regiones codificadoras para las
podrían ser una alternativa interesante para la terapia humana25. proteínas virales estructurales gag, pol y env por el gen o genes
Otro hallazgo importante de los AAV es que sensibilizan a las de interés, lo que permite la incorporación de moléculas de ADN
células para drogas terapéuticas, de tal forma que la infección con de hasta 8 kb (Figura 4). Los virus empleados como vectores
el virus AAV2 incrementa la fragmentación de las células Hela y carecen de la secuencia empacadora psi (ψ), además las partículas
de las A549 que induce la quimioterapia con cisplatino26. virales no contienen a los transgenes. Otro punto a considerar,
es el de prevenir la recombinación, la cual se logra cuando el
Los retrovirus virus es capaz de autoreplicarse. Por lo tanto, todas las regiones
Los retrovirus son virus envueltos, en la fase de lisogenia las homólogas dentro del vector viral se remueven, y los genes no
nucleocápsides recién formadas migran a la membrana esenciales deberán expresarse a una distancia de por lo menos
citoplasmática llevándose como envoltura parte de la membrana dos unidades transcripcionales, aunque la autorreplicación
citoplasmática. retroviral ocurra con baja frecuencia27.
Los retrovirus son los vectores más útiles para la mayoría de los Se puede dirigir la expresión del transgen con un promotor o una
experimentos de terapia génica, son capaces de infectar una región potenciadora (enhancer) ubicada río abajo del 5´LTR o
amplia gama de tipos celulares. Sin embargo, los retrovirus bien, con el promotor de un virus alternativo (como el
precisan que las células estén en división para que la forma de citomegalovirus) o también por promotores celulares como
provirus (ADN) pueda integrarse en el genoma, con lo que su beta-actina. Se ha observado que la remoción de la secuencia
empleo se restringe a las células en división activa. Una de las gag y la región río arriba inmediatamente a ella no afecta el
grandes ventajas del empleo de retrovirus es la estabilidad empacamiento viral, cuando se encuentra dentro de las células
funcional y estructural de las formas integradas del vector. A empacadoras; y tampoco se modifica la expresión del transgen.
pesar de que los retrovirus pueden integrarse en cualquier parte Sin embargo, la posición exacta del sitio de inicio del transgen
del genoma, parece que existen ciertos lugares de inserción y las pequeñas alteraciones en las regiones LTR si afectan de
preferenciales. Cuando los retrovirus infectan a una célula, el manera considerable la expresión del transgen28.
9
VERTIENTES
Figura 4. Vectores retrovirales. A) Se muestra la estructura de un virus silvestre que contiene las secuencias de empaquetamiento
( ψ ) y las secuencias de proteínas virales ( gag , pol y env ). B) Para obtener un vector retroviral se sustituyen las unidades gag , pol
y env por un promotor y dos genes reporteros: el que confiere resistencia a la neomicina y el de la proteína verde fluorescente
(GFP), la construcción queda flanqueada por secuencias de repetición (LTR). C) Células eucariotas transformadas con el retrovirus
y que expresan el gene GFP.
Los lentivirus de inserción del transgén puede modificar su expresión, ya que

Los letivirus pertenecen al grupo de los retrovirus, muchos de puede interaccionar con secuencias reguladoras de la
los vectores lentivirus que se utilizan en terapia génica se basan transcripción aledañas como promotores, potenciadores
en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)29. Los vectores (enhancers) y represores (silencers)32. Además, el sitio de
HIV pueden permitir insertos de genes grandes e inducir su inserción del transgén puede interrumpir algún otro gen
expresión por mayor tiempo porque se integran en el cromosoma. importante para la sobrevivencia celular.
A diferencia de los retrovirus convencionales, los lentivirus
también pueden infectar de forma eficiente a células que no se La expresión de los transgenes integrados se puede apagar a
están dividiendo y por lo tanto se pueden utilizar para la corto plazo por remodelación de la cromatina en la zona de
expresión del transgene en las neuronas, de hecho, ya se han inserción32, 33. Estos fenómenos pueden impedirse si durante la
logrado introducir exitosamente construcciones con intrones construcción del vector se incluyen secuencias de ADN que
en lentivirus 30 aislan al transgén (insulators), como los que están presentes en
el locus de la β- globina de pollo33.
Algunos factores moleculares a considerar en la transgénesis
El cDNA introducido en células eucariotes mediante transfección La incorporación de intrones artificiales al final de la secuencia
puede expresarse aunque no se encuentre integrado al ADN de un transgén resulta en una mejor expresión de éste34. Al
cromosómico. Esta expresión se puede detectar a partir de las parecer esto se debe a que durante la maduración del ARN
12 horas de la transfección31. Sin embargo, si el transgén mensajero se reclutan sobre él proteínas que resultan cruciales
permanece episómico se pierde gradualmente de las células, para la eficiencia de los siguientes pasos necesarios para la
tanto por destrucción como por dilución en la progenie. Por lo expresión que son: la exportación al citoplasma, la unión al
tanto, la expresión del ADN no integrado típicamente es ribosoma y la traducción.
transitoria y deja de detectarse después de 72 horas de la
transfección31. Cuando se trabaja con células que pueden Los promotores útiles en la transgénesis:
mantenerse en cultivo por varias semanas, es posible generar Los promotores son secuencias de ADN que reconocen tanto
transfecciones estables seleccionando las células que han los factores de transcripción como una ARN polimerasa del tipo
integrado el transgén en su ADN cromosómico y que mantienen II y provocan el inicio de la transcripción. En la transgénesis se
permanentemente una o varias copias en su genoma y lo utilizan diferentes promotores para las células eucariotes,
transmiten a su progenie. generalmente incluyen algunas secuencias aledañas que los
activan hasta 1000 veces, es decir se usan en compañía de sus
Una vez que se ha logrado una transgénesis estable, la expresión potenciadores proximales naturales31 y su tamaño oscila entre
aún puede afectarse por múltiples factores, por ejemplo, el sitio los 500bp y los 2000bp, incluyendo las regiones reguladoras.
10
Resulta interesante, que aún antes de promover la transcripción, c) Los promotores regulables.
la presencia de un promotor cerca del transgén es útil, ya que Son secuencias que modulan la expresión dependiendo de la
facilita el transporte del ADN transgénico al núcleo mediante concentración de alguna molécula biológica, como las
mecanismos todavía desconocidos, al unir factores de hormonas, la metalotioneína, los metales pesados, los
transcripción se favorece que la maquinaria celular reconozca interferones; o a moléculas de respuesta a circunstancias como
al ADN transgénico como una molécula nuclear y se facilita su el choque térmico o la hipoxia36, 37.
traslado al interior de ese compartimiento35. Los promotores que
se utilizan en la transgénesis se clasifican en: constitutivos y Los genes reporteros:
regulables ó bien en tejido-inespecíficos y tejido-específicos. Para caracterizar a los promotores y sus secuencias reguladoras,
es necesario poder seguir la expresión de alguna proteína cuya
a) Los promotores constitutivos, tejido-inespecíficos. función se detecte fácilmente. Los genes reporteros cumplen
Producen expresiones altas y relativamente constantes de los ese propósito y sirven además para identificar a la transgénesis
transgenes en distintos tipos de células eucariotas. El mas en el tiempo y en el espacio. Un gen reportero idealmente
utilizado es el promotor del Citomegalovirus (CMV) y el del virus requiere codificar para una proteína cuya actividad endógena
simiano 40 (SMV-40)31, 34. Otros promotores de este tipo incluyen en las células blanco sea nula o muy baja; o que se distinga
los LTRs (del Inglés Long Terminal Repeats) del virus del fácilmente de la actividad endógena. Además no debe ser tóxico
sarcoma de Rous, o del virus Moloney de la leucemia murina y para las células y se prefiere que pueda medirse sin destruir al
el promotor del virus de Epstein-Bar31, 34. Estos promotores son tejido (detección no invasiva), para poder observar el curso
capaces de mantener la expresión de los transgenes en distintas temporal de la expresión, sin que esto impida utilizar las células
células de mamíferos ya que responden a múltiples factores de para otros fines posteriormente. Se prefieren proteínas
transcripción endógenos, por ejemplo, el promotor de CMV monoméricas sin cofactores, que sean codificadas por ADNc
responde a NFkB y a otros factores de transcripción dependientes relativamente cortos. Su detección debe ser simple y muy
de AMPc, entre otros36. Los niveles de expresión pueden variar sensible, por lo que generalmente se utilizan fluoróforos o
con un mismo promotor dependiendo del tipo celular que se enzimas que generen cromógenos como reporteros. Las
estudie, ya que cada tejido mantiene una combinación distinta actividades enzimáticas ofrecen la ventaja de que el sustrato se
de factores de transcripción31, 32, 37, 38. acumula, aumentando la posibilidad de detección. Los reporteros
utilizados con mayor frecuencia se describen en la Tabla 2,
La principal desventaja de estos promotores es que por su todos ellos pueden emplearse con vectores virales.
origen viral son susceptibles a inactivarse mediante mecanismos
de defensa presentes en las células eucariotas, por ejemplo el 4. A PLICACIONES
promotor de CMV se inactiva por metilación de los dinucleótidos Investigación y organismos modificados
CpG. genéticamente
En general, pueden mencionarse dos grandes áreas de aplicación:
b) Los promotores específicos de un tejido. las que sirven para investigación básica y médica, donde el
Estos promotores responden a factores de transcripción que animal de elección es el ratón, debido a sus características
únicamente se expresan en el tejido blanco, lo que genera biológicas (tamaño, manejabilidad, ciclo reproductivo corto,
niveles de expresión moderados o bajos, en comparación con manutención a bajo costo, etc), con ciertas excepciones, ya que
los promotores virales inespecíficos. en ocasiones no se ajusta estrictamente a las características del
Reportero y fuente Sistema de detección Actividad endógena Estabilidad
Proteína verde fluorescente (GFP) Fluorescencia, FACS, Microscopía Nula Alta resiste fijación
confocal. No invasivo
Galactosidasa de E. coli Colorimetrico. Invasivo Presente a pH ácido Alta, resiste fijación,
y en senecencia resiste pH 7.5 a 8.0
Luciferasa de Photinus pyralis Luminiscente. Emite un fotón al Nula Baja
hidrolizar ATP. No invasivo
Cloranfenicol Acetil Transferasa Detección de formas acetiladas de Nula Alta, resiste
(CAT) de E. coli cloranfenicol. Invasiva detergentes
Glucuronidasa de E. coli Quimiolumniscencia, Fluorescencia, Muy baja en plantas Muy estable a 37°C,
espectrofotometría e histoquímica resiste hasta 60°C.
Fosfatasas alcalina humana Espectrofotométrica. Invasiva Presente Estable
Hormona del crecimiento humana Radioinmunoanálisis o ELISA Nula Estable
Tabla 2. Cuadro comparativo de los genes reporteros que se utilizan con mayor frecuencia y la fuente, así como el sistema de
detección y su estabilidad.
11
VERTIENTES
modelo experimental, por lo que es necesario emplear otras hereditarias monogénicas, es decir, provocadas por la alteración
especies; y las que tienen un impacto directo sobre la producción de un solo gen, mediante la introducción de un gen diseñado
y sanidad animal (mejoramiento de especies). para que suministre una nueva propiedad a las células, por
ejemplo que obstaculice la replicación del virus o bloquee una
En la investigación biomédica la estrategia es la generación de proteína efectora, lo que frenaría el progreso de la enfermedad.
modelos experimentales “hechos a la medida”, ya sea por la
sustitución o la inactivación de genes. En teoría, y con el Dado que existe una respuesta biológica natural de silenciamiento
advenimiento de técnicas de transgénesis nuevas y eficientes, específico de genes estimulada por la presencia de ARN de
todos los organismos se pueden manipular genéticamente, ya interferencia, se ha desarrollado una estrategia alternativa para
se han utilizado una gran variedad de especies, entre las que se combatir enfermedades infecciosas o degenerativas la cual
incluyen plantas, y en mayor proporción, animales como el consiste en la generación de anticuerpos recombinantes
conejo, la oveja, la cabra, el cerdo, la vaca, el pollo, diversas bloqueadores que se expresen en el interior de las células, estos
especies de peces, insectos, parásitos, e inclusive el hombre. anticuerpos intracelulares o “intrabodies” se pueden generar al
Los modelos en los cuales se ha inactivado la función de un gen, introducir a las células blanco los genes de las cadenas VH y VL
también referidos como knock out, son particularmente útiles junto con secuencias específicas de localización subcelular
para estudiar la carencia de proteínas específicas y pueden para que los anticuerpos recombinantes se transporten a algún
servir como modelos de enfermedades humanas39. compartimiento como el núcleo, las mitocondrias o el retículo
dependiendo del lugar donde se encuentre la molécula a
La producción de proteínas recombinantes es uno de los bloquear43. Existen anticuerpos intracelulares desarrollados
principales éxitos de la biotecnología. Las principales compañías experimentalmente para el tratamiento de enfermedades
del mercado biotecnológico ya han puesto en marcha las neurodegenerativas tales como Parkinson44, Huntington45 y
primeras granjas biofarmacéuticas en las que, de forma Alzheimer46; enfermedades virales como el herpes virus asociado
experimental, rebaños de vacas, ovejas y cabras transgénicas a sarcoma de Kaposi (KSHV)47, virus del papiloma (HPB)48, virus
están produciendo sustancias de uso terapéutico. Purificando de la hepatitis C (HCV), rotavirus. En el área de la Oncología este
la leche se elaboran medicamentos contra el enfisema, la tipo de moléculas no sólo han servido para el área clínica, si no
hemofilia, la artritis reumatoide, el cáncer o el SIDA, entre más también para dilucidar algunos mecanismos involucrados en la
de un centenar de enfermedades. transformación49.
Los xenotransplantes (utilización de animales como donantes) R EFERENCIAS B IBLIOGRÁFICAS

representan un avance prometedor ante la actual demanda y 1. Mulligan, RC. The basic science of gene therapy. Science
escasez de órganos. El cerdo es un candidato ideal para 1993;260:926-32.
convertirse en donante universal. Por otro lado, una causa 2. Jolly, D. Viral vector systems for gene therapy. Cancer Gene Ther
importante del fracaso de los xenotransplantes es el rechazo 1994;1:51-64.
hiperagudo que se produce cuando el organismo que recibió el
xenotransplante reconoce la presencia del órgano de otra 3. Gao, X and Huang, L. Cationic liposome-mediated gene transfer.
especie40. El primer paso consiste en la obtención de cerdos Gene Ther 1995;2:710-22.
transgénicos capaces de expresar el antígeno regulador del 4. Warnock, JN, Daigre, C and Al-Rubeai, M. Introduction to viral
complemento humano, evitando así el rechazo hiperagudo, vectors. Methods Mol Biol 2011;737:1-25.
otras estrategias consisten en bloquear la expresión de la α-1,3-
5. Navarro, J, Oudrhiri, N, Fabrega, S and Lehn, P. Gene delivery
galactosiltransferasa, que es la enzima involucrada en la síntesis
systems: Bridging the gap between recombinant viruses and artificial
de los carbohidratos de superficie en las células del cerdo41. vectors. Adv Drug Deliv Rev 1998;30:5-11.
Por otra parte, en la industria agroalimentaria, se tiene la esperanza 6. Rowe, WP, Huebner, RJ, Gilmore, LK, Parrott, RH and Ward, TG.
de crear plantas que produzcan vacunas ingeribles para Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing
humanos42, o plantas con contenidos nutricionales mejorados. spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med
1953;84:570-3.
Si estas proteínas se encuentran en cantidad suficiente en el
vegetal y se pueden separar fácilmente, el cultivo en el campo 7. Young, LS, Searle, PF, Onion, D and Mautner, V. Viral gene therapy
de estas plantas transgénicas, seguido del proceso de extracción strategies: from basic science to clinical application. J Pathol
y de saneamiento, permitirá obtener una gran cantidad de 2006;208:299-318.
proteínas a un costo de producción relativamente bajo. Esta 8. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy.
opción evita también el riesgo de contaminación, contrariamente Trends Biotechnol 2003;21:117-22.
a lo que sucede con los animales, las plantas no son portadoras
de virus patógenos para el hombre. 9. Schiedner, G, Morral, N, Parks, RJ, et al. Genomic DNA transfer
with a high-capacity adenovirus vector results in improved in vivo
gene expression and decreased toxicity. Nat Genet 1998;18:180-3.
Terapia génica; Aplicaciones de la transgenesis en humanos.
la terapia se usa exclusivamente para tratar enfermedades 10. Stecher, H, Shayakhmetov, DM, Stamatoyannopoulos, G and
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14
El Transposón SB de salmónidos como vector
para transferencia de genes en vertebrados
J. M. Coll
Dpto. Biotecnología. SGIT-INIA. Ctra. La Coruña, Km 7. Madrid (España)
coll@inia.es
RESUMEN
Este trabajo es una descripción-revisión del uso de los transposones de salmonidos para transferencia genéti-
ca en vertebrados. Los transposones son secuencias DNA móviles del genoma que se encuentran entre las secuen-
cias repetidas y que están distribuidos entre animales, bacterias y plantas con secuencias diferentes. Los transposo-
nes de vertebrados de la familia Tc1/mariner tienen de unas 1.300 a 2.400 pares de bases (pb) de longitud. Como
mínimo contienen un gen único que codifica la enzima transposasa flanqueada por 2 repeticiones terminales inver-
tidas (tir) de unas 250 pb. Cada una de las tir poseen uno o varios sitios de 20-30 pb de interacción con la transpo-
sasa. La transposasa interacciona con estos sitios para cortar el transposón, luego interacciona con secuencias pre-
sentes en el genoma en otro locus y pega el transposón en el nuevo locus. En vertebrados todos los transposones
que se han detectado están inactivados por mutaciones. Sin embargo, recientemente se ha obtenido un transposon
activo de salmónidos mediante multiple mutagénesis dirigida. Dicho transposon denominado «bella durmiente» o
«sleeping beauty» (SB) se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehículo para
incorporar nuevos genes en ~ 1.000 sitios por genoma y para inactivar genes en el genoma por insercion. Además
se podría usar como marcador para el mapeo de genes. Es muy posible que se vayan descubriendo más elementos
de este tipo en vertebrados con nuevas aplicaciones prácticas para manipular sus genomas.
PALABRAS CLAVE: Transposones

Vectores
Transgénicos
Vertebrados
INTRODUCCIÓN
Este trabajo está enfocado a una descripción-revisión sobre la aplicación de los trans-
posones como vectores en la transferencia génica de vertebrados haciendo hincapié en la
reconstrucción del transposón «sleeping beauty» (SB) o bella durmiente en salmónidos y
Recibido: 16-1-01
Aceptado para su publicación: 28-5-01
Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (2), 2001

238 J.M. COLL
su uso como vector en células de vertebrados. Los transposones son secuencias móviles
del genoma capaces de transportarse ellos mismos a otras localizaciones dentro del geno-
ma. Se encuentran tanto en procariontes como en eucariontes.
Localización de los transposones en el genoma de los vertebrados
El experimento clásico de cinética de renaturalización de genomas desnaturalizados

confirma que sólo contienen aproximadamente un 10 % de secuencias únicas o genes
(Colosimo et al., 2000). El resto del genoma está formado por un 50 % de secuencias re-
petidas unas 1.000 veces (aquí se encuentran entre otros los transposones, los rRNA y los
tRNA), un 20 % de secuencias repetidas unas 100.000 veces (DNA estructural o satélite
que forma los centrómeros y los telómeros de los cromosomas) y un 20 % de secuencias
palindrómicas (Crollius et al., 2000; Izsvak et al., 2000). Los transposones o elementos
móviles forman parte de las secuencias que se encuentran repetidas unas 1.000 veces por
genoma. Existen varias familias de transposones con características moleculares diferen-
tes (Sherratt, 1995), pero en este trabajo nos centraremos únicamente en el transposon SB
de la familia Tc1/mariner.
Los transposones inactivos de vertebrados
Nunca se ha aislado un transposon de vertebrados activo debido a que aunque están

presentes, contienen muchas mutaciones que los inactivan (Ivics et al., 1996; Lam et
al., 1996; Raz et al., 1997), lo cual es lógico, ya que la presencia de transposones acti-
vos tendría consecuencias funestas para la estabilidad de los genomas. Hasta ahora se
han detectado varias familias de elementos móviles o transposones tales como el
Tc1/mariner (Avancini et al., 1996), el mermaid (Shimoda et al., 1996), los elementos
DANA (Izsvak et al., 1996), los Tol2 (Ac-like) (Kawakami y Shima, 1999; Kawakami
et al., 2000), los Tdr2 (Gottens et al., 1999), Tc3 (Raz et al., 1997), etc. Se han caracte-
rizado varios transposones semejantes al Tc1/mariner en pez cebra (Danio rerio) (Ivics
et al., 1996; Ivics et al., 1996; Izsvak et al., 1997; Lam et al., 1996), trucha y salmón
(Radice et al., 1994). Es muy posible que con el tiempo se vayan descubriendo y carac-
terizando muchos más.
Los genes de las transposasas presentes en los transposones detectados, varían de lon-
gitud, por ejemplo, Himar1 (1291 bp), Tc1 (1612 bp), Tc3 (2335 bp), SB (1639 bp), Bari
1 (1639 bp), Pogo (2417 bp), etc. Las repeticiones terminales invertidas (tir) también va-
rían en el tamaño y en los sitios de unión a la transposasa. Por ejemplo: Himar 1 (31 pb
con un sitio de ligamiento de transposasa de 28 pb), Tc1 (54 pb con un sitio de ligamiento
de transposasa de 28 pb), Tc3 (462 pb con 2 sitios de ligamiento de transposasa de 33 pb),
SB (225 pb con 2 sitios de ligamiento de transposasa de 30 pb), Bari 1 (26 pb con 1 sitio
de ligamiento de transposasa), Pogo (26 bp con 1 sitio de ligamiento de transposasa de 12
pb), etc (Plasterk et al., 1999).
Los transposones de la familia Tc1/mariner, contienen el gen de la enzima transposa-
sa de unos 1.500-2400 pb flanqueada por sequencias con repeticiones terminales inverti-
das de 200-250 pb con sitios de unión para la transposasa de 20-30 pb (Fig. 1). Estructu-
ras muy similares están presentes en transposones de la misma familia estudiados en in-
TRANSPOSONES EN VERTEBRADOS 239
Fig. 1.–Esquema de un transposon SB
Un transposon SB consta de un único gen que codifica la enzima transposasa ( ) flanqueado por dos secuen-
cias diez veces más cortas y con repeticiónes terminales invertidas (tir).
sectos, peces (Izsvak et al., 1997; Weinberg, 1998) y otros vertebrados, sin embargo no
hay conservación de sus secuencias DNA (Izsvak et al., 1995).
Uso de los transposones como vectores: «Sleeping Beauty» (SB)
Los transposones bacterianos son bien conocidos desde hace tiempo e incluso se han
comercializado kits que utilizan el trasposon EZ::Tn (Epicentre, Madison, WI, USA).
Estos kits permiten realizar in vitro inserciones del transposon en plásmidos diana. Para
ello se incuba el plásmido diana con un transposon que contiene el gen de interes en el lu-
gar de la transposasa y con la enzima transposasa. También se pueden utilizar para gene-
rar «knock-outs» por inserción en el genoma de celulas vivas transfiriendo el transposon
completo por electroporación a celulas in vitro.
Los transposones han sido también muy útiles como vectores transgénicos y como
mutágenos por inserción en la mosca Drosophila y el gusano Caenorhabditis donde se co-
nocen versiones activas de transposones endógenos.
Sin embargo para vertebrados, hasta ahora sólo se han podido utilizar los retrovirus
como vectores y/o mutágenos. En concreto se están usando retrovirus (pseudotipos) que
contienen la glicoproteína G del rabdovirus VSV para mutagénesis insercional (Gaiano y
Hopkins, 1996) como vectores (Burns et al., 1993). Ahora bien, existen algunas dificulta-
des para utilizar retrovirus como vectores. i) es necesario que estén a concentraciones
muy altas. ii) sólo puede acomodar una longitud limitada de DNA, y iii) pueden infectar
al experimentador, por lo que hay que manejarlos en condiciones de alta seguridad. Es
por todo ello que el uso de transposones como vectores en vertebrados ofrecería una alter-
nativa con algunas ventajas sobre los retrovirus.
Para ser útiles como vectores en vertebrados, los transposones deberían ser capaces
de incorporar segmentos de DNA de varias Kb para poder contener genes enteros y ade-
más retener la capacidad de poder ser movilizados por la transposasa (Izsvak et al., 1997).
Otros requerimientos que necesita un vector transposon son: facilidad de uso, amplio ran-

240 J.M. COLL
go de huéspedes, integración eficiente en los cromosomas y una vez insertado, manteni-

miento estable a través de varias generaciones (Ivics et al., 1999).
Sin embargo todos los transposones de vertebrados que se conocen hasta ahora se en-
cuentran inactivados, tal y como hemos mencionado anteriormente. La inhibición de las
transposiciones puede deberse a factores celulares externos o a factores intrínsecos al
transposon (mutaciones en la transposasa o en las tir). Para obtener un transposon activo
habría que reparar sus mutaciones. Ahora bien, si por ejemplo, se reparan las mutaciones
del transposon y este se introduce en un genoma, debido a que los transposones y sus se-
cuencias tir están presentes en miles de copias en el genoma (Izsvak et al., 1998), se cau-
saría una transposición masiva lo que conllevaría a una inestabilidad genética y por lo
tanto a una interferencia con los objetivos experimentales. Una solución a este problema
es el diseñar un sistema disociado de transposones, es decir separar el gen de la transposa-
sa de las tir (Fig. 2) y heterólogo, en el que la intervención del huésped sea mínima.
Para solucionar el problema de la inactivación de los transposones de vertebrados, se
ha procedido a repararlos. Comparando secuencias de transposones filogenéticamente se-
mejantes y utilizando mutagenesis dirigida se ha reconstruido un transposon activo a par-
tir de elementos móviles inactivos aislados del salmón (Goodier y Davidson, 1994; Ivics
et al., 1997). A este transposon reparado se le ha denominado «bella durmiente» o «slee-
ping beauty» (SB). Se ha demostrado que SB es funcional en líneas celulares tanto de pe-
ces como de ratones y humanos y que es capaz de integración estable y expresión a largo
plazo en ratones (Yant et al., 2000). Además se ha demostrado que SB es capaz de trans-
ferir genes (Raz et al., 1997). En principio, se podría también utilizar en vertebrados para
técnicas de mutagénesis por inserción, para mapeo de genes y para atrapamiento de pro-
motores.
SB es el único transposon basado en DNA de origen vertebrado que puede usarse por
ahora para la manipulación experimental. Este transposón se ha utilizado como un instru-
mento para investigar los requerimientos en cis y en trans para la movilización de estos
elementos y los mecanismos que regulan la transposición en las especies de vertebrados
(Izsvak et al., 2000). Es por ello y a modo de ejemplo que se va a describir a continuación
su proceso de transposición en detalle.
Mecanismo de la transposición en SB
La transposición del transposon SB requiere, al menos dos sitios de ligamiento dentro

de las tir tal y como demuestran la mutación o la deleción de dichas secuencias (Izsvak et
al., 2000). La transposasa reconoce y se une a las tir para cortar el elemento móvil y pe-
garlo en otro lugar del genoma (cortar y pegar). El corte ocurre en las dos cadenas de
DNA y en las 2 tir, de tal forma, que al cortar las dos cadenas dejan una huella en el ge-
noma de 2-3 bases. Por ejemplo, la mayoría de los transposones Tc1/mariner se integran
en la secuencia TA reconociendo las secuencias y quizá la estructura del DNA que flan-
quea estas secuencias. Durante la integración del transposon cortado ocurren otros dos
cortes que dejan secuencias AT y TA en cada una de las cadenas del sitio de integración.
Al incorporarse el transposon a continuación de estas secuencias se producen dos sitios
AT flanqueando el elemento móvil transpuesto (Plasterk et al., 1999). Aun así el transpo-
son se integra también al azar en el genoma. Los sitios de integración varían mucho según
el tipo y especie celular del 17,4 al 89,7 % específica.
Fig. 2.–Esquema de un procedimiento para integrar genes en células usando transposones
El sistema requiere: un plasmido con el gen de la transposasa ( ) y un plasmido con el gen/es inserto/s ( )
flanqueados por las secuencias tir. Los dos plásmidos conteniendo cada una de estas dos partes por separado se
contrasfectan en una célula. La transposasa bajo el control de un promotor universal (® , promotor de citomega-
lovirus CMV, por ejemplo) se expresa, corta enzimáticamente las tir del otro plásmido y después integra las tir
+ gen/es insertos en los nuevos sitios en el genoma. Si además del gen de interés se incluye un gen de resistencia
a antibióticos con su promotor (® ) correspondiente (el gen neo, por ejemplo), al seleccionar por resistencia al
antibiótico G418, se obtendrán células con el gen inserto integrado en su genoma. Al perderse el plásmido de la
transposasa a través de las divisiones celulares, la integración del gen entre las tir será estable. Mediante este
método se ha podido integrar el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) y detectar su expresión en las gene-
raciones parental y primera generación (F0 y F1) en el pez cebra (Raz et al., 1997)

242 J.M. COLL
Se han podido identificar tres dominios funcionales en la transposasa del SB. Existe
una región con señales de localización nuclear (nuclear localization signal, NLS) en los aa
105-120 y regiones de a hélices (leucine-zipper) en las zonas de unión al DNA en los aa
8-110 (Ivics et al., 1996). Un tercer dominio es el catalítico o motivo DDE (aa 146-290)
que se encuentra en todas las transposasas y recombinasas (Plasterk et al., 1999). En
cuanto a la regulación de su actividad, no parece que el aumento de expresión de la trans-
posasa de SB inhiba su transposición tal y como ocurre en otros transposones (Izsvak et
al., 2000).
SB puede transformar un rango amplio de células de vertebrados desde peces hasta
humanas (Weinberg, 1998). Usando distintos ensayos se han podido detectar hasta 10.000
inserciones independientes por célula en un experimento de transfección, pero la cantidad
de transposición que estimula la transposasa SB varía entre diferentes líneas celulares.
Puesto que en estos ensayos el nivel de transposición es proporcional a la cantidad de
transposasa, esta variación puede deberse a la variación de la eficiencia de transfección
tanto para los plásmidos con transposasa como para los plásmidos con los genes insertos
y con las tir (Fig. 2). Puede haber también diferencias en la transcripción-traducción del
gen de la transposasa que determinen su concentración final. Además pueden existir fac-
tores celulares que afecten la transposición.
El límite de tamaño del gen inserto entre las tir no parece ser tan crítico como en los
retrovirus. Eso sí, se ha observado que cuanto más grandes son los elementos móviles,
menor es su frecuencia de transposición, aunque esto podría ser también una ventaja para
su estabilidad una vez insertados. Con cada Kb de aumento de tamaño del gen inserto en
el transposon SB (entre 2.2 a 10.3 Kb), se obtiene una disminución exponencial del 30 %
en la eficiencia de transposición (Izsvak et al., 2000).
Futuro
Aunque todavía existen algunos problemas con el sistema SB, es indudable que ofre-
ce un método de introducción de DNA que puede dirigirse a localizaciones concretas den-
tro del genoma. La identificación del locus de integración del gen inserto después de una
transposición puede hacerse facilmente mediante PCR usando oligonucleótidos diseñados
a partir de las secuencias de las tir e hibridando después las secuencias amplificadas con
sondas del gen del inserto. Conforme se vayan descubriendo más elementos móviles po-
tencialmente escondidos en ese casi 50 % del genoma que contiene secuencias repetidas,
se tendrán más instrumentos del tipo SB o quizá otros con nuevas propiedades que los ha-
gan más útiles como herramientas de diseño. Además la identificación y estudio de los
mecanismos de movilización de estos elementos repetidos pueden hacer avanzar nuestros
conocimientos sobre la evolución y cambios en los genomas.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece a J. Coll P. su mecanografía. Este trabajo fue financiado por los proyectos europeos FAIR
CT98-4003 y CT98-4398, por los proyectos FEDER IFD97-467, CICYT ACU01003 e INIA, SC00046.
SUMMARY
The SB transposon of salmonids as a vector for gene transfer in vertebrates
Transposons are variable sequences or mobile elements of the genome that are found among the repeated
sequences in the enorme and are distributed among animals, bacteria and plants. Those transposons of the
Tc1/mariner vertebrates are about 1300 to 2400 base pairs (bp) in length. Minimally they contain a unique gene
that encodes the trasposase enzyme flanked by two sequences with terminal inverted repeats (tir) of about 250
bp. Each of the tir contains one or several sites of 20 to 30bp in length that interact with the transposase. The
transposase interacts with these sites to cut the transposon, then it interacts with sequences present at other loci
in the genome and pastes the transposon into the new locus. The transposons described in vertebrates are inacti-
vated because of mutations. However, by multiple site-directed mutagenesis of a fish inactive transposon an ac-
tive vertebrate transposon has been obtained. This transposon, named «Sleeping beauty» (SB) can be used in
vertebrates other than fish as a vehicle to introduce new genes in 1000’s of new sites in the genome or to inacti-
vate genomic genes by insertion. Furthermore, it could be used as a label to map new genes. It is possible that
new elements of this vector will be discovered that provide new methods to manipulate the genomes.
KEY WORDS: Transposons

Vectors
Transgenics
Vertebrates
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGÍA DELOS RECURSOS NATURALES
BIOTECNOLOGÍA ANIMAL
ANIMALES TRASGÉNICOS
Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar las características de los
animales domésticos intentando incrementar aquellas que mejoraban sus condiciones como
animales de compañía, de producción, de trabajo o de abasto, mediante la selección de los más
aptos y el cruzamiento de los ejemplares que presentaban mejores características: mayor
producción de leche o carne o más fuerza y resistencia. Se seleccionaban aquellos ejemplares con
características deseables, apareándolos entre sí y con su descendencia, para perpetuar los rasgos
de interés, recurriendo al mestizaje cuando se advertía la aparición de características fenotípicas
indeseadas debido a la consanguinidad (Basrur & King, 2005).
Hoy en día, gracias a la reproducción asistida y a la biotecnología, se planifican y dirigen los

procesos reproductivos, se transmiten los rasgos deseados y se acelera la mejora genética. El
intervalo intergeneracional puede reducirse sensiblemente gracias a la combinación de la
inseminación artificial, que es la más antigua y utilizada de las técnicas de reproducción asistida,
con las técnicas más recientes como son: el estro sincronizado, la superovulación, la extracción
de óvulos de hembras sexualmente inmaduras aun fuera de la época de cría, o la producción de
embriones “in vitro” y la transferencia de embriones (Park, 2007). Además, es posible seleccionar
el sexo de la progenie con semen sexado para la inseminación; se puede realizar la selección
genética de individuos mediante marcadores moleculares asociados a caracteres de interés.
También se puede modificar el genoma de los organismos: introduciendo genes de interés
(organismos transgénicos); modificando los genes (organismos transgénicos “knockins”); o
eliminando o silenciando genes concretos (organismos transgénicos “knockouts”). Y se puede
llevar a cabo la clonación de animales por transferencia nuclear de células somáticas, germinales
o embrionarias (Smith & Heald, 2014).
HISTORIA
A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que
inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició
una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente,
demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados
en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro (Gordon & Ruddle, 1981).
Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se
podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra
especie. Así, obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el
gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron también
ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen humano que codifica para
la hormona de crecimiento (Palmiter & Brinster, 1982).
El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la hormona de crecimiento de la rata, tiene
un aumento de tamaño del 80% en comparación con un ratón normal. Como era de esperar, a los
ratones transgénicos siguieron los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había
introducido por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano que
codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el tamaño de tales animales
(Gordon & Ruddle, 1981)Sin embargo, este avance científico no tuvo aplicación zootécnica
porque la presencia del transgén modifica la fisiología del animal transgénico, produciendo
efectos colaterales perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis
animal había comenzado como una realidad imparable.
Cerdo transgénico que lleva incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Su
desarrollo presentaba trastornos fisiológicos importantes (Cummings, 1995).
AÑO EVENTO
1938 Experimento de transferencia nuclear
1949 Embriones de ratón en cultivo in vitro
1961 Ratones quiméricos agregando embriones
1966 Técnica de microinyección de embriones de ratón
Primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en
1980
el pronúcleo de cigotos de ratón
Animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con
1985
el transgén de la hormona del crecimiento humano
Ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de
1989 coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en
el pronúcleo del cigoto
1993 Ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
Ovejas clónicas por transferencia nuclear de células
1997
diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1999 Cabras transgénicas por transferencia nuclear
USOS
APLICACIONES EN BIOMEDICINA
Desarrollo de modelos animales para el estudio de enfermedades humanas
La aplicación de la tecnología transgénica ha sido particularmente útil para el examen de la

importancia de la expresión de determinados genes en la etiopatogenia de gran número de
enfermedades (Melo, Cavanavessi, Franco, & Rumpf, 2007).
Utilización de animales modificados genéticamente como donantes de órganos para

humanos: xenotrasplantes.
La posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de órganos se planteó hace ya

muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995, se realizaron 32 xenotrasplantes de riñón,
corazón, hígado y médula ósea procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril, con un
resultado negativo en todos los casos (Bacci, 2007).
Utilización de animales transgénicos en terapia génica
Los experimentos de terapia génica que utilizan animales tienen tres objetivos generales:
conocer la fiabilidad y seguridad de los vectores, estudiar la eficacia de la transferencia de los
genes problema y ensayar nuevas terapias para curar la enfermedad (Niemann & Kues, 2007).
APLICACIONES EN INDUSTRIA FARMACÉUTICA

Realización de ensayos farmacológicos y toxicológicos utilizando animales modificados
genéticamente
Se han diseñado roedores transgénicos sensibles a toxinas medioambientales que son capaces de
evaluar la seguridad de medicamentos, productos o materiales mucho más rápidamente que los
ancestros de los que provienen. Este tipo de pruebas pueden realizarse con un número mucho
menor de animales porque la presencia del transgén mejora la eficacia (Wheeler, Walters, &
Clark, 2003).
APLICACIONES EN ZOOTECNIA
Cambios en la composición de la leche
Los avances en la tecnología del DNA recombinante han permitido cambiar la composición de la
leche introduciendo proteínas totalmente nuevas. Estos cambios pueden aumentar las
posibilidades de utilización de la leche e incrementar su valor (Bacci, 2007).
Modificación de los índices de crecimiento y de la composición de la canal
En cerdos se han realizado esfuerzos para mejorar su crecimiento y variar la composición de su

carne mediante la adición de transgenes: un estudio de expresión en músculo de un gen factor de
crecimiento “insulina-like” exógeno demostró una significativa reducción de la grasa y un
incremento del músculo magro; en otro estudio, un gen exógeno de la hormona del crecimiento
produjo un incremento de la ganancia de peso, mejoró la eficiencia en la alimentación y redujo el
grosor de la grasa dorsal (Wheeler, Walters, & Clark, 2003).
Animales resistentes a enfermedades
La aplicación de la transgénesis para regular aspectos definidos del sistema inmunológico puede
proporcionar oportunidades para diseñar, por ingeniería genética, ganado con mayor resistencia a
las enfermedades (Melo, Cavanavessi, Franco, & Rumpf, 2007).
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE ANIMALES TRASGÉNICOS
Para la obtención de animales transgénicos se han llevado a cabo varios métodos, entre los cuales
se pueden citar:
1. MICROINYECCIÓN DE ADN EN PRONÚCLEO O EN CITOPLASMA DE

CIGOTO (ÓVULO FECUNDADO)
En esta técnica, la introducción del transgén se realiza mediante la microinyección de esta

construcción de DNA en el pronúcleo de un ovocito fertilizado. El procedimiento sería el
siguiente (Peñaranda & Asensio, 2014):
1. Se extraen óvulos de hembras en las que se ha inducido una superovulación y han sido
fertilizadas “in vivo”, o bien se fertilizan posteriormente “in vitro”.
2. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el óvulo fecundado y se
inyecta en uno de sus pronúcleos una solución que contiene muchas copias del transgén.
3. Posteriormente, estos óvulos fecundados y microinyectados se introducen en madres
receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la
técnica de la transferencia de embriones.
4. Finalmente, los recién nacidos son examinados para ver si en ellos se ha producido la
incorporación del transgén.
La microinyección es un método para generar animales transgénicos muy ineficiente, debido a
que conlleva la integración aleatoria del gen foráneo en el genoma receptor con las siguientes
consecuencias (Peñaranda & Asensio, 2014):
• El transgén se introduce en el genoma receptor de forma aleatoria, por lo que sólo en un

pequeño porcentaje se sitúa en el lugar adecuado para conseguir una buena expresión en
el animal transgénico.
• No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma el transgén (no son
transgénicos, por tanto).
• El gen exógeno puede insertarse en un lugar erróneo, por ejemplo en medio de un gen del
genoma receptor, interrumpiéndolo y causando su mutación y, con ello, la muerte del
embrión o alteraciones en el animal transgénico nacido.
• Se produce un patrón variable de expresión del gen exógeno en la progenie transgénica,
a menudo en mosaico.
2. MICROINYECCIÓN DEL ADN EN CÉLULAS EMBRIONARIAS
Esta técnica requiere de infraestructura, equipamiento y personal debidamente entrenado para su

realización, lo cual aumenta significativamente los costos. La microinyección de embriones de
especies de mamíferos, anfibios y peces se ha constituido en una forma útil de probar
construcciones genéticas directamente en los embriones y en algunas estirpes celulares derivadas
de ellos (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
El organismo adulto será una quimera ya que no todas las células incorporan el nuevo gen.
Entonces, se utilizarán solo los animales que tengan el gen en sus gametas y por lo tanto lo
transmitan a su descendencia. Esta técnica es más fácil y eficiente que la anterior a pesar de que
se descarten animales (PQBio, 2007).
El gen que se inserta está dentro del plásmido de una bacteria E. coli, se introduce todo el plásmido
(con el gen de interés y con otras secuencias del plásmido) y una vez dentro del núcleo de la célula
el ADN se integra al material genético del animal (PQBio, 2007).
3. ELECTROPORACIÓN DE CIGOTO
La electroporación es una técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células
durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las células (en este caso los cigotos)
despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas
de ADN que se encuentran alrededor. La ventaja de esta técnica es que se aplica a varios cigotos
a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada del ADN del 100%. Es una técnica
que requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones óptimas de
duración y potencia del pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que
aseguran la entrada en la célula y las que maximizan la viabilidad celular. La eficiencia de la
transfección por electroporación esta mediada por una serie de factores como la magnitud del
campo eléctrico aplicado, la duración del pulso eléctrico, la temperatura, la concentración, el tipo
de ADN y la composición iónica del medio (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
La electroporación se ha usado para transferir ADN foráneo a espermatozoides bovinos para su

uso en transgénesis mediante inseminación artificial. A partir de 1986, la electroporación se ha
empleado como el método de elección para la transfección de células embrionarias totipotentes
(embryonic stem cells ES) tanto en experimentos de gene knock-out, como de reemplazamiento
alélico y recombinación de homólogos (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
En términos generales la mayor desventaja de la electroporación es su costo, ya que la mayoría
de los equipos comercialmente disponibles (electroporadores) y los accesorios como cubetas y
adaptadores tienen un precio elevado (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
4. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS TOTIPOTENTES
Las células Totipotentes son aquellas células no germinales pero con capacidad de desarrollarse
en determinadas condiciones, pudiendo dar lugar a la formación de quimeras, integrando órganos
y tejidos del embrión y del individuo adulto. Hasta hace poco el factor limitante de esta estrategia
era la necesidad de contar con una línea celular para cada especie cuyo genoma se quisiera
manipular.
La gran ventaja de las células totipotentes, es que, como en cualquier línea celular, la introducción
de un gen es más sencilla, así como el saber si el gen se expresa y en qué proporción.
El transgen puede ser incorporado a la célula por microinyección, por electroporación o por
transfección, estos dos últimos sistemas son algo menos costosas. En todos los casos es posible
aislar a aquellas células transformadas utilizando marcadores de resistencia a algún agente
exógeno llegando a obtener una línea celular transformada y capaz de expresar la nueva
información genética.
La inclusión de células de esta línea en el blastosisto se hace por microinyección en el blastocele

de las células aisladas del cultivo, dirigiendo la aguja hacia la masa celular interna del embrión.
Es preciso remarcar que el individuo nacido de un blastocisto microinyectado con células
totipotentes no es transgénico, es una quimera, su descendencia sólo será transgénica si alguna de
las células microinyectadas, al colonizar la masa celular interna del embrión fue capaz de formar
la línea germinal (Muñoz, 2009).
5. TRANSFERENCIA DE DNA EXÓGENO MEDIADA POR ESPERMA

DURANTE LA FERTILIZACIÓN (SMGT, “SPERMMEDIATED GENE
TRANSFER”).
Desde hace casi dos décadas, el uso de los espermatozoides como vectores de ADN exógeno
(transgénesis mediada por espermatozoides: SMGT) ha centrado la atención de numerosos
investigadores en un continuo debate sobre la transgénesis animal.
En 1989 se demostró la capacidad que tenían los espermatozoides de ratón, de transportar ADN
exógeno y transferir estas moléculas al interior del ovocito en el proceso de la fecundación, dando
lugar a animales modificados genéticamente. De tal manera, la transgénesis mediada por
espermatozoides, debido a su relativa sencillez y bajo costo, podría ser ampliamente utilizada para
la producción de animales de granja modificados genéticamente, representando una potente
herramienta para la biomedicina. Dicha metodología mejora notablemente la eficiencia que se
alcanza al emplear la microinyección pronuclear (0,5-4% de eficiencia), ya que se han obtenido
resultados muy esperanzadores próximos a un 80% de animales transgénicos obtenidos.
Sin embargo, las dificultades en la repetitividad y la baja eficiencia en la integración de los

transgenes en el genoma del animal obtenida con esta tecnología, resultó en una considerable
controversia sobre dicho trabajo durante numerosos años. No obstante, son varios los estudios
que han sido publicados recientemente en los que se confirma que, los espermatozoides de
múltiples especies pueden ser usados como vectores para introducir transgenes dentro del genoma
del animal.
En la especie porcina (Sus scrofa) doméstica, se ha utilizado con éxito esta técnica para producir
cerdos transgénicos mediante el uso de la inseminación artificial (IA), o mediante el uso de
transferencia de embriones producidos mediante la inyección intracitoplásmica de
espermatozoides (ICSI). La aplicación de IA intrauterina permite el uso de un número reducido
de espermatozoides al depositar los espermatozoides próximos al lugar de fecundación y evitar el
proceso de transporte espermático que se produce a través del tracto reproductor femenino cuando
se realiza una IA convencional. La calidad seminal de la muestra determina la capacidad de
fecundar los ovocitos y producir embriones viables, por tanto es necesario asegurar, como paso
previo, que la incubación de los espermatozoides en presencia de ADN no afecte sustancialmente
la calidad seminal.
Pasos para obtener el transgénico:
• Seleccionar al donador de semen de fertilidad probada

• Mantenerlo en habitáculos con temperatura controlada (25°) y bajo condiciones naturales
de luz y humedad
• Diluir y lavar los espermatozoides con SFM (Swine Fertilization Medium) y posterior
evaluación de la calidad seminal
• Selección y construcción del gen de interés a ser transferido
• Transferencia del gen al los espermatozoides
• Inseminación intrauterina a la hembra
6. VECTORES VIRALES
Un método alternativo es la transgénesis viral: el uso de virus recombinantes para introducir genes
en el embrión. Los vectores retrovirales han sido estudiados extensamente para terapia génica
humana. Estos vectores han demostrado transferir eficientemente genes en embriones murinos,
bovinos y porcinos. Sin embargo, los retrovirus están sometidos a modificación epigenética y la
expresión retroviral se corta durante la embriogénesis o es breve después del nacimiento.
En animales de granja, la eficiencia de la transgénesis con vectores lentivirales es 50 veces

superior a la que se consigue con la microinyección pronuclear de DNA. Su mayor limitación es
que no pueden transportar transgenes con más de 8-9 kb de DNA y, además, los sitios en los que
se produce su integración de forma preferente son regiones codificantes de los genes de las células
que infectan.
El procedimiento podría ser así: embriones pre-implantación son expuestos “in vitro” a soluciones
concentradas de virus recombinantes (virus a los que previamente se les ha introducido el gen de
interés), o son incubados sobre una monocapa de células infectadas con estos virus. A
continuación de la exposición a los virus, los embriones infectados “in vitro” son transferidos a
hembras receptoras para completar la gestación (Narbón, 2008).
Las partículas virales silvestres no se pueden emplear directamente como vectores de expresión,
es necesario convertirlos en virus deficientes en su replicación dentro de la célula diana. De esta
forma, el vector viral sólo se podrá multiplicar en las células de empaquetamiento, que son líneas
celulares modificadas que tienen la propiedad de ensamblar a los virus y producir partículas
virales que poseen los genes que codifican para las proteínas virales y para el gen de interés. Los
virus recombinantes son estructuras capaces de transferir material genético a una célula diana.
El uso de la tecnología del ADN recombinante junto con el conocimiento del genoma viral, ha
permitido generar viriones con capacidad de infectar y transferir su material genético (transfectar),
pero incapaces de replicarse bajo condiciones especificas. Los virus recombinantes son la
herramienta más eficiente en la transgénesis, permiten sobre expresar proteínas en células
humanas y como consecuencia se pueden obtener proteínas recombinantes con un procesamiento
postraduccional adecuado. Entre los virus recombinantes con aplicaciones en transgénesis se
encuentran los adenovirus, los retrovirus, los virus adeno asociados, los lentivirus, además de
otros ADN o ARN virus (Narbón, 2008)
Proceso de transgénesis por vectores virales
• Seleccionar el virus recombinante

• Sustituir los genes que producen la muerte
• Genes importantes en el ciclo viral
• Extraer los embriones de la hembra de unos 2 días post-coito
• Cultivarlos en placas
• Incluir en las placas los virus recombinantes
• Transferir el embrión infectado a la hembra.
• La transmisión del transgén sólo es posible si el retrovirus se integra en algunas de las
células germinales
7. TRANSFERENCIA NUCLEAR
En la transferencia nuclear (NT) se utiliza el núcleo de una célula procedente del animal que
queremos clonar para introducirlo en un ovocito receptor previamente enucleado. Este ovocito se
activa eléctricamente, o por otros métodos, para que reprograme al núcleo y éste comience la
generación de un embrión que tendrá un 98-99% de la información genética procedente del núcleo
del animal a clonar y un 1-2% procedente del DNA contenido en las mitocondrias y otras
organelas presentes en el citoplasma del óvulo receptor. Consecuentemente, el organismo
resultante no será un clon exacto del animal donante del núcleo. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Durante el desarrollo, el contenido genético de cada célula se mantiene, con unas pocas
excepciones, idéntico al que tenía el cigoto. Por lo tanto, las células diferenciadas (adultas) poseen
en su núcleo toda la información necesaria para generar un organismo completo. Esto es lo que
se conoce como totipotencia nuclear. En sus inicios, la transferencia nuclear (NT) se desarrolló
como un medio de comprobar, de forma experimental, este concepto de totipotencia, mediante la
clonación de animales a partir de células adultas. Los núcleos de estas células adultas se
reprograman con la información que hay en el citoplasma del ovocito, de manera que se silencian
algunos genes y comienzan a funcionar otros, produciéndose la parada de la fase adulta para
encenderse la embrionaria. Esta reprogramación permite que las células donantes de los núcleos
para la NT puedan ser fetales, embrionarias o somáticas. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Como es posible obtener un número ilimitado de células somáticas a partir de un animal, la
clonación constituye una tecnología que puede ser utilizada para la producción de un gran número
de animales genéticamente idénticos entre sí (clonación reproductiva), aunque difieran en algo de
su progenitor donante del núcleo. Muchos animales de granja, tales como vacas, cerdos y ovejas,
han sido clonados de forma satisfactoria utilizando esta técnica. La oveja Dolly, en 1996, fue el
primer animal clonado a partir de una célula somática adulta (célula de la glándula mamaria de
una oveja de 6 años. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Las líneas celulares obtenidas a partir de células somáticas permiten la manipulación de los
genomas de los animales de granja “in vitro”, lo cual permite crear células transgénicas de ovejas,
cerdos y vacas cuyos núcleos, posteriormente, pueden ser transferidos a un ovocito enucleado
para generar un animal transgénico mediante transferencia nuclear: clonación a partir de una
célula transgénica. Polly es la primera oveja transgénica producida por transferencia nuclear. Fue
generada a partir de fibroblastos fetales que fueron previamente modificados genéticamente
mediante la adición del gen humano que codifica el factor IX de coagulación, introducido en un
vector que portaba un promotor que dirigía la expresión a la glándula mamaria. Polly excretaba
el factor IX de coagulación humano en su leche.
Por otra parte, si un embrión obtenido por NT de células somáticas se detiene en fase de
blastocisto y de él se obtienen células ES, éstas pueden cultivarse “in vitro” para diferentes usos
potenciales (clonación terapéutica): terapias de reemplazo y regeneración celular; investigación
médica; e, incluso, se puede realizar la modificación genética de estas células ES para corregir un
defecto genético del individuo donante. (Peñaranda & Asensio, 2014)
8. TRANSFECCION DE GAMETOS
Se comentan algunos aspectos sobre la transfección de gametos y su empleo para la producción

de animales transgénicos (AT). Para la transfección de gametos han sido empleados ADN
desnudo, vectores virales, complejos ADN-Liposomas, electroporación, o microproyectiles de
alta velocidad. En general, se han obtenido altos porcentajes de transfección (hasta del 80% en
espermatozoides) y se ha observado que los transgenes se localizan en el interior del núcleo. Se
ha constatado que los gametos están naturalmente protegidos frente a la entrada de genes extraños:
en espermatozoides esta función la cumplen diversas proteínas presentes en los fluidos seminales
o en su membrana plasmática; mientras que en los gametos femeninos son las envolturas del
huevo (zona pelúcida en mamíferos o membrana perivitelina en moluscos) las que desarrollan
esta labor. En muchos casos, los gametos transfectados se han utilizado en fecundaciones in vitro
o en inseminaciones a fin de crear AT. En algunos casos, los porcentajes de estos AT han sido
altos, como en el salmón (85%). Pero los AT, así creados, han sido en su mayoría quimeras y no
han sido capaces de producir líneas transgénicas. Se sugiere que los AT producidos por gametos
transfectados, son diferentes a los producidos por el método convencional de microinyección. Es
probable que los gametos posean mecanismos, aún no descritos, capaces de modificar la
integración/expresión de los transgenes, o que impedirían la integración de los transgenes en la
línea germinal. (Esponda, 2005)
El procedimiento habitual para transfectar un espermatozoide ha sido el método in vitro. Los

gametos se incuban durante períodos de tiempo cortos en una solución que contiene las
construcciones de genes y luego se comprueban para la transfección, esta técnica ha sido usada
para las inseminaciones o para procedimientos de fertilización in vitro. En varios casos el ADN
desnudo fue empleado con éxito, pero complejos ADN-liposoma o electroporación
procedimientos han sido también usados. El método in vivo emplea una inyección del transgen
en el conducto deferente del ratón y después de 6-12 horas los gametos son recogidos y
analizados. En el caso de las transfecciones in vitro de gametos femeninos se han usado liposomas
o retrovirus los cuales han sido aplicados con éxito. (Esponda, 2005)
La localización del gen foráneo en el espermatozoide se lo realiza mediante hibridación in situ

fluorescente, autorradiografía o inmunocitoquímica. Después de usar el procedimiento de
transfección in vitro o in vivo un alto porcentaje (80%) de espermatozoides aparecieron
transfectados. Generalmente, estos resultados mostraron que el gen extraño apareció en el núcleo
de los espermatozoides y procedimientos moleculares (secuencias de Slot-Blot, PCR, Southern
Blot) han demostrado la presencia del transgen en el ADN de los gametos. (Esponda, 2005)
9. TRANSFERENCIA GÉNICA CON TRANSPOSONES
Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales a
parte de los necesarios para la transposición y están dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta
categoría se encuentran los trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de
Drosophila, secuencias Alu de mamíferos, retrotrasposones. (Narbón, 2008)
Los trasposones son secuencias de material genómico que tienen la capacidad del saltar fuera y
dentro del genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios
dentro del genoma (trasponerse o “saltar”). Pueden entrar en plásmidos y ser propagados por ellos.
Estas propiedades les confieren la capacidad de ser transferidos exitosamente en células y
genomas extraños. La ingeniería genética puede manipular estos trasposones para llevar a cabo
transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes es la transferencia de
material genético entre células y genomas que pertenecen a especies no relacionadas, por procesos
distintos a la reproducción. Un ejemplo de ello es el uso de los trasposones de salmónidos para la
transferencia génica en vertebrados. Los trasposones de vertebrados de la familia Tc1/mariner
contienen como mínimo un gen único que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos
repeticiones terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de 20-30 p.b.
de interacción con la trasposasa. (Narbón, 2008)
La trasposasa interacciona con estos sitios para cortar el trasposón, luego interacciona con
secuencias presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposón en el nuevo locus. En
vertebrados todos los trasposones que se han detectado están inactivados por mutaciones. Sin
embargo recientemente se ha obtenido un trasposón activo de salmónidos mediante múltiple
mutagénesis dirigida. Dicho transposón denominado “Bella durmiente” o “Sleeping beauty” (SB)
se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehículo de
incorporación de nuevos genes y para inactivar genes en el genoma por inserción. (Narbón, 2008)
Microbiología Industrial y Alimentaria
1 Capítulo 1: Biotecnología Industrial. Pag 7. Ya
En la práctica, las empresas multidisciplinarias están casi invariablemente orientadas a la misión. Sin embargo,
cuando se produzca una verdadera síntesis interdisciplinaria, la nueva área abrirá un nuevo espectro de
investigaciones. Muchos aspectos de la biotecnología han surgido a través de la interacción entre varias partes de la
biología y la ingeniería. Un biotecnólogo puede utilizar técnicas derivadas de la química, microbiología, bioquímica,
ingeniería química e informática (Fig. 1.1). Los principales objetivos serán la innovación, el desarrollo y el óptimo
funcionamiento de procesos en los que la catálisis bioquímica tiene un papel fundamental e insustituible. Los
biotecnólogos también deben aspirar a lograr una estrecha cooperación de trabajo con expertos de otros campos
relacionados, como la medicina, la nutrición, las industrias farmacéutica y química, la protección del medio ambiente
y la tecnología de procesos de residuos. La biotecnología tiene dos características claras: sus conexiones con
aplicaciones prácticas y la cooperación interdisciplinar. La aplicación industrial de la biotecnología dependerá cada
vez más de cada una de las disciplinas que contribuyan a comprender el lenguaje técnico de las demás y, sobre todo,
a comprender el potencial y las limitaciones de las otras áreas. Por ejemplo, para las bioindustrias de fermentación,
la educación tradicional para ingenieros químicos y diseñadores de plantas industriales normalmente no ha incluido
procesos biológicos. La naturaleza de los materiales requeridos, los recipientes del reactor (biorreactores) y las
condiciones de funcionamiento son tan diferentes que se requiere un reentrenamiento completo (Fig. 1.2).
1
2 Capítulo 1: Microbiología Industrial. Capítulo 1. Pp 11. ya
¿Qué es la microbiología industrial?

La microbiología industrial es la microbiología que estudia la aplicación de la biotecnología de los
microorganismos en la industria. Esto implica la utilización de sistemas biológicos en diferentes procesos
industriales. En general puede abarcar diferentes ámbitos:
- Fabricación de diferentes compuestos orgánicos.
- Transformación de productos, hecho que cada día tiene más importancia, puesto que las
reacciones mediadas por los seres vivos ocurren en condiciones de presión, temperatura,...
normales. Por lo tanto puede ser más barato el uso de seres vivos, ya que no se requieren
condiciones especiales. Además, en muchos casos serán reacciones más eficaces que las
químicas. Se ha de tener en cuenta siempre que la industria buscará la mayor eficiencia posible
y la reducción de costes, ya que lo que interesa es tener beneficios.
- Reacciones con compuestos inorgánicos, como puede ser el caso de la lixiviación de metales.
- Producción de biomasa, con diferentes finalidades. A menudo el producto final de las
reacciones son los propios microorganismos, por su valor en alimentación humana, como
Saccharomyces,... o animal, como las SCP.
- Degradación de sustancias, como puede ser la depuración de aguas, el tratamiento de
residuos,...
- Biosensores, determinación de la presencia de sustancias, mediante sistemas biológicos.
También puede servir en los controles de calidad. Está adquiriendo una gran importancia en
los últimos años, ya que es una muy importante herramienta de análisis.
Microbiología Industrial Microbiología Alimentaria
Considera la parte positiva de los Considera la parte negativa de los microorganismos.

microorganismos, sus posibles aplicaciones. La La microbiología alimentaria aborda principalmente 2
microbiología industrial va encaminada a 3 grandes problemas.
áreas:
- Los alimentos no pueden causar enfermedades
- Servicios, como eliminación de residuos al ser ingeridos. Es básica en un alimento su
inocuidad, que no provoquen perjuicios al ser
- Producción de sustancias de interés
humano, por la presencia de organismos
económico
patógenos en ellos.
- Análisis, en el desarrollo de biosensores
- Los alimentos han de poder conservarse
La microbiología industrial se centra en los durante un cierto tiempo, no se pueden
posibles beneficios que se pueden obtener del uso estropear por la acción de organismos en ellos,
de microorganismos en procesos industriales. o como mínimo retrasar la degradación.
La microbiología alimentaria se preocupa por la
alteración de los alimentos por la acción de los
microorganismos desde el punto de vista sanitario y
organoléptico.
Biotecnología
Ambos tipos de microbiología abarcan diferentes aplicaciones de la biotecnología. La idea de la
biotecnología surge en los años 20, ligada a la producción de alimentos. Tuvo su auge en los años 50,
centrada en la producción de plásticos e hidrocarburos. La biotecnología será por lo tanto el uso integrado
de la bioquímica, la biología y la ingeniería química para conseguir aplicaciones tecnológicas de los
sistemas biológicos y los cultivos celulares. Una nueva definición de biotecnología actualmente dice que la
biotecnología es el conjunto de procesos industriales donde se utilizan organismos obtenidos mediante
DNA recombinante y otras técnicas genéticas.
2
Existen diferentes definiciones de biotecnología:
Biotecnología
Manipulación de organismos vivos, sobre todo a escala genética, para obtener productos útiles. Según esta
definición, parece que la microbiología industrial no sería biotecnología.
Combinación de procesos industriales donde se usan sistemas biológicos obtenidos mediante DNA
recombinante u otras técnicas de manipulación genética. Se aproxima más a la microbiología industrial, pero no es
adecuada aun.
Uso integrado de la bioquímica, microbiología y de la ingeniería química con el fin de obtener productos
útiles y aplicaciones tecnológicas de los microorganismos, cultivos celulares y otros sistemas biológicos.
Esta es la definición más adecuada a los contenidos de la microbiología industrial y alimentaria.
De hecho distinguimos 2 clases de biotecnología.
Biotecnología tradicional o clásica (Industrial)
Es la rama de la biotecnología que obtiene producción a gran escala, con costes reducidos. Sus principales
productos son alimentos o ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibióticos y ácido cítrico. Se
trata de producción en toneladas y se valora en aproximadamente 3·10 10 $ anuales
Nueva biotecnología o biotecnología fina
Se concentra en la fabricación de productos al detalle. Producción de tan solo kilogramos al año, pero son
productos de un gran valor añadido, como pueden ser insulina, interferón, enzimas,... Se requiere el uso
de técnicas más nuevas de ingeniería genética y de la fusión de células para obtener organismos capaces
de generar los productos deseados. Hacia 1989 la biotecnología fina generaba aproximadamente 10 9 $ al
año, pero cada vez representa una mayor fracción de la industria total.
Esta división no quiere decir que la biotecnología clásica no utilice las más modernas técnicas de ingeniería
genética, ya que si son necesarias, se usan. Ni tampoco quiere decir que en la biotecnología fina no se usen
los conocimientos adquiridos tras tantos años de trabajo en la biotecnología tradicional.
En realidad, el ser humano aprovecha las reacciones mediadas por los microorganismos desde hace siglos:
Año Producto, proceso o descubrimiento

20000 aC Bebidas alcohólicas por fermentación de diferentes zumos de frutas en pueblos primitivos
6000 aC Cerveza y pan en Mesopotamia, Egipto y China

Cultivo de viña en el sur del Cáucaso
3000 aC Leches fermentadas y quesos en oriente medio
Tecnologías de vinos y cervezas en Egipto y Sumeria
Vinagre a partir de zumos fermentados
2600 aC Tecnología del vino fermentado en Egipto
1800 aC Vino: Noé, babilonio Upnapishtim
1100 aC Cerveza en el Segrià
79 dC Quesos azules
1070 Queso Roquefort
1133 Cerveza con lúpulo: Santa Hildegarda
1150 Espíritu del vino
Arnau de Vilanova: alcohol
1300 Vinagre industrial en Orleáns
1650 Cultivo de champiñones en Francia
3
1680 Leeuwenhoek: visión de células de levaduras

1700 Primeras cervecerías industriales
S. XIX Nacimiento de la microbiología con Pasteur
S. XX
1920 1ª Guerra Mundial. Los alemanes ponen a punto la tecnología necesaria para las
fermentaciones a escala industrial, para la producción de disolventes orgánicos.
1940 2ª Guerra Mundial. Fleming descubre la penicilina. Se hacen importantes descubrimientos
en ingeniería, como técnicas de esterilización y se perfeccionan las técnicas de mejora de
cepas.
1940 – 1960 El producto estrella de la biotecnología son los antibióticos. También se desarrolla la
transformación de los esteroides y se perfeccionan los cultivos de células animales para el
desarrollo de vacunas víricas.
1960 – 1970 En Japón se desarrolla la tecnología para la producción de aminoácidos y 5’ nucleósidos,
estimulantes del sabor. Se perfecciona la producción de enzimas, así como las técnicas de
inmovilización de células y enzimas. Se mejoran las fermentaciones en continuo, para la
producción de SCP.
1975 Aparición de la tecnología del DNA recombinante. Producción de insulina humana en
E. coli.
Aplicaciones de los microorganismos en la industria

Producción de metabolitos primarios y de productos relacionados
Bebidas alcohólicas Vinos Saccharomyces
Cervezas
Etanol Etanol industrial
Ácido láctico Lactobacillus
Productos lácticos Leches fermentadas Bacterias lácticas
Quesos
Embutidos
Vegetales fermentados: col ácida,...
Ácido acético Vinagre Acetobacter
Ácido cítrico Aspergillus
Ácido propiónico Quesos Emmental Propionibacterium
Alimentos orientales fermentados Salsa de soja, miso, kimchi, sutu, Floriduras y bacterias
tempeh,... lácticas
Aminoácidos L – Glutámico Corynebacterium
L – Lisina
Producción de metabolitos secundarios
Antibióticos  – lactámicos Penicilium
Tetraciclinas Streptomyces
Peptídicos Bacillus
Aminoglicósidos Streptomyces
Alcaloides Ergotamina Claviceps
Pigmentos Astaxantina Phaffia
Producción de otros componentes biológicos
Polisacáridos Dextrano Leuconostoc
Xantano Xanthomonas
Bioplásticos Polihidroxialcanatos Alcaligenes
Vitaminas B12 Pseudomonas
Riboflavina Ashbya
Transformación de esteroides Floriduras
Streptomyces
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Aplicaciones ambientales
Depuración de aguas residuales Fangos activos Bacterias aerobias
Protozoos
Depuración de materia orgánica Biodigestión anaerobia Bacterias anaeróbicas
semisólida Arqueas
Metanógenes
Biodegradación de xenobióticos Biodegradación de hidrocarburos Pseudomonas
Aplicaciones analíticas
Biosensores Análisis de glucosa Aspergillus
Bioensayos Tests de Toxicidad ambiental Photobacterium
Tests mutagénicos Test de Ames Salmonela
Producción de biomasa microbiana
Microorganismos unicelulares Levadura de panificación Saccharomyces
Proteína unicelular bacteriana Methylophilus
Proteína unicelular de levaduras Candida
Microalgas Chlorella
Scenedesmus
Spirulina
Esporas bacteriana Bioinsecticidas Bacillus
Biomasa fúngica Proteína unicelular fúngica Paecilomyces
Cultivo de setas Morchella
Producción de enzimas y otras proteínas
Enzimas Amilasas Aspergillus
Proteasas Bacillus
Hormonas Insulina humana Escherichia
Otras proteínas Interferón humano Escherichia
Sistemas biológicos usados en la microbiología industrial

Un biocatalizador es un agente biológico que se utiliza en la obtención de un producto o servicio de interés
biotecnológico. En la microbiología industrial se usan diferentes tipos de agentes biológicos.
Microorganismos: Son los sistemas biológicos más usados en la microbiológica industrial. Se trata de
bacterias, hongos, protozoos y virus.
Esporas: En ocasiones el sistema biológico de interés para producir el producto o el servicio son las esporas,
como en el caso de los bioinsecticidas. Obtendremos las esporas a partir de cultivos celulares.
Enzimas y otras proteínas.
Cultivos celulares. Podemos usar cultivos celulares vegetales o animales para la fabricación de productos
o la obtención de servicios, como por ejemplo el uso de hibridomas para la obtención de anticuerpos
monoclonales. En ocasiones se pueden usar solo algunos orgánulos.
Los microorganismos presentan una serie de ventajas sobre los otros posibles sistemas biológicos.
- Tienen una elevada diversidad metabólica y una gran plasticidad. Siempre existirá algún
microorganismo que pueda hacer la reacción que se desea en un determinado momento. El
único problema es que se ha de encontrar el microorganismo más adecuado. Se cree que se
conocen tan solo 1/3 de los microorganismos existentes en el mundo.
- Son extremadamente fáciles y baratos de cultivar.
o Crecen sobre sustratos baratos. En ocasiones pueden crecer sobre residuos de otras
empresas, como papeleras, cárnicas,...
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o Las condiciones de cultivo son baratas de obtener y mantener, en comparación con

las que se necesitaría para las transformaciones químicas. No es necesario
normalmente incrementar la temperatura ni la presión. En muchos casos son los
propios organismos los que provocarán un cambio de la temperatura. En ocasiones
será incluso necesario refrigerar.
Productos y servicios que puede ofrecer la microbiología industrial
1. Producción de células, como por ejemplo levaduras o algas con diferentes finalidades. La
levadura será necesaria para la producción de pan. Las células se usan generalmente para la
alimentación, tanto humana, como en el caso de hongos o algas, como animales, como es el caso
de la SCP, para formar parte del pienso, o para ser directamente el pienso. Otras veces se
producirán células, pero sólo se aprovechará una parte, como puede ser el caso de las esporas para
los bioinsecticidas.
2. Enzimas y otras proteínas de elevado valor añadido. Existen muchos enzimas que pueden
entrañar interés para su producción industrial, y con diferentes usos posibles. Incluso otros tipos
de proteínas pueden ser útiles, como la insulina, el interferón,...
3. Metabolitos primarios y secundarios. Tanto un tipo como el otro pueden tener interés aplicado.
Los metabolitos primarios son componentes relacionados con la síntesis de células microbianas,
con su crecimiento. Aumentan en paralelo al crecimiento celular, o incluso de manera solapada.
Son por ejemplo los productos finales de las fermentaciones como el etanol o los ácidos orgánicos.
Los metabolitos secundarios suelen acumularse en la fase que sigue a la fase de crecimiento activo,
la trofofase, que es la que se denomina idiofase. Las sustancias que se producen en la idiofase no
tienen relación directa con la síntesis de materiales celulares, ni con el crecimiento. Son sustancias
que no son básicas para el crecimiento. La trofofase y la idiofase no son fases del crecimiento
bacteriano, sino que son solo fases de la producción de metabolitos, pueden coincidir con las fases
de crecimiento, pero no son lo mismo.
4. Otros productos. Los anteriores son los productos de mayor importancia, pero existen otros
productos, como:
- polisacáridos, que tienen muchos usos, como por ejemplo aditivos alimentarios.
- Bioplásticos
- Ciertas vitaminas
- Transformación de microorganismos. Se obtienen un producto, pero el microorganismo no lo
ha sintetizado todo, sino que tan solo ha realizado un par de reacciones sobre él. Es el caso de
los esteroides, ácidos grasos,... Pueden tener un gran valor añadido.
5. Depuración de residuos. Los ecosistemas tienen inercia y plasticidad. Cuando sufren alteraciones
tienden a recuperarse. La actividad humana altera los ecosistemas, mediante la industria, por
ejemplo. La industria que se instala al lado de un río y usa el agua de este como refrigerante está
produciendo en el río una contaminación física, ya que está alterando un factor básico, como es la
temperatura del río. El río continuará fluyendo y pasados unos kilómetros, habrá vuelto a la
temperatura que tenía antes de pasar por la fábrica, ha conseguido restaurar el factor temperatura.
Los ecosistemas tienen capacidades de regeneración y recuperación, pero la actividad humana
actualmente ha superado con creces esta capacidad, por lo que los ecosistemas estarán
permanentemente contaminados. Todo esto ha llevado al desarrollo de tecnologías de depuración,
que tratan de reducir el impacto de la actividad humana sobre los ecosistemas. Estas nuevas
técnicas se basan en la mimetización de los procesos que tienen lugar en el río, pero aumentando
la concentración o la intensidad, como en el caso de las plantas de lodos activos.
- Aguas residuales. En los países desarrollados hay una elevada producción de aguas residuales,
ya sean de origen doméstico o industrial. Un elevado porcentaje de esta agua será tratado
biológicamente. El objetivo de estos procesos es la eliminación de la materia orgánica del
agua, que no eliminarla directamente. Actualmente las aguas residuales se tratan siguiendo
una serie de procesos aeróbicos clásicos, como son:
o Lodos activos
o Lechos bacterianos
o Lagunas facultativas
o Reactores de células inmovilizadas
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Estos procesos hacen que la materia orgánica en suspensión en el agua se elimine por procesos
de sedimentación. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuración de aguas
eliminan residuos líquidos, pero los producen sólidos, que deberán ser tratados como otros
residuos sólidos.
- Residuos sólidos. Son otro gran problema de los países desarrollados. Estos residuos pueden
ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuración de aguas,
pasando por residuos agrícolas e industriales. Los residuos sólidos se someten normalmente a
procesos de digestión anaerobia. Este tipo de digestión reduce el volumen de los residuos. En
condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las bacterias
deberá ser dedicado a la obtención de energía, de manera que el crecimiento de bacterias a
partir del sustrato es bajo. Los residuos orgánicos pasan a ser casi totalmente CH4 y CO2, lo
que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo que puede
ser usado como fuente de energía, pero puesto que el principal objetivo es la reducción del
volumen de residuos y su estabilización, la producción de metano no está optimizada, aunque
se debe aprovechar el que se produzca.
- Xenobióticos. Además de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos
puntuales de xenobióticos. Se trata de productos producidos químicamente por el hombre, no
producidos por ningún ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningún ser vivo. También
pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difícil y lenta degradación. Se
han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son inoculados cuando
se produce un vertido. El problema de los xenobióticos se está haciendo desgraciadamente
cada día más común. Un problema que se encuentra también es que para recalificar el suelo
industrial a urbanizable, mucho más rentable, este debe estar limpio de productos
xenobióticos.
6. Aplicaciones analíticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se
pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgánulos unidos a electrodos
de manera que las reacciones biológicas devengan corrientes eléctricas. Esto permite medir
concentraciones de compuestos específicos en diferentes entornos, detectando contaminantes,
aditivos en alimentos,... Los biosensores han despertado un gran interés, pero aún se están
poniendo a punto.
Otro uso analítico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinación
de una sustancia biológicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los
bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala
industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de
dicha sustancia.
- Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en
cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumularía muy
rápidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que
demuestren dicha biodegradabilidad. En términos legales, cuando hablamos de biodegradable,
en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable, pasando a ser tan solo
agua y dióxido de carbono. El 30% restante no se degradará y su composición permanecerá
desconocida. Esto es lo que estipula la ley.
- No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del
ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad.
o Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestión a una concentración muy
elevada, durante un período breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos
una vida de 40 años, el período breve serían 5 minutos
o Crónicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un
largo período de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para ver
el efecto en estos.
Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teoría
debería haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles
del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos
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tests sobre bacterias, de manera que si es tóxico para la bacteria no se comercializará. Pero
pese a no ser tóxico para la bacteria podría ser tóxico para otros organismos.
- Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la
mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la descendencia,
por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El test más empleado
actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo mutantes His - de S.
typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversión elevada de aproximadamente 10 -4, que
Ames tenía muy bien medida. Esta bacteria se ponía en contacto con la sustancia a comprobar.
Si aumentaba la tasa de reversión, se trataba de un producto mutagénico, en caso de no
aumentar era no mutagénico. El problema radica en que muchas sustancias son premutágenos,
que en su forma inicial no son mutagénicas, pero que al llegar al hígado se activan y pasan a
ser mutágenos. Para comprobar que la sustancia no es un premutágeno se le administraba a
una rata. Después se sacrificaba, se extraía el hígado y se sometía a éste a una centrifugación
diferencial. Aíslas entonces la fracción microsomal, que contendrá premutágenos activados y
la compruebas con S. typhimurium.
7. Lixiviación. Podemos usar los microorganismos para la recuperación de metales a partir de
minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundición, el
método tradicional. La biolixiviación la realiza Thiobacillus ferrooxidans.
Breve historia de la biotecnología
Podemos dividir la historia de la humanidad en tres períodos, considerando la manera de conseguir los
alimentos. En una primera etapa de cazadores – recolectores, el hombre debía perseguir y buscar los
alimentos. En una segunda etapa de agricultores – ganaderos, el hombre cultiva los alimentos, lo que implica
un aumento de la población, así como de la esperanza de vida, pero a la vez genera un problema, puesto
que habrá épocas del año en las que no se podrá recolectar alimento, por lo que el que se recoja en tiempos
de disponibilidad deberá durar todo el año. Se empezaron a desarrollar métodos de conservación
rudimentarios. Además, debido a la acción microbiológica, se desarrollaron otras técnicas de conservación,
como pueden ser el queso, el yogurt, los embutidos,... En lo que respecta al vino y a la cerveza, se ha de
tener en cuenta que hasta hace poco eran la forma más sana de beber agua, ya que había una gran posibilidad
de que estuviese contaminada. Actualmente estamos en una tercera etapa, en la que somos ya “gourmets”,
ya que en la alimentación humana el problema no lo representa ya la disponibilidad de alimentos, sino que
actualmente los alimentos han de ser saludables y sabrosos.
Indicadores de desarrollo y calidad de vida
Típicamente, un indicador del desarrollo de un país y de su calidad de vida suele ser la renta per cápita, el
PIB,... pero la producción de basuras por habitante y día puede ser un indicador tan bueno como cualquier
otro. Una producción de basura superior a 1Kg al día indica una buena situación económica, mientras que
valores inferiores indican una situación económica peor.
Otro valor que puede ser de interés es el consumo de agua diario. Un ser humano necesita estrictamente 1,5
l de agua al día, que es la que ha de beber, pero en la práctica, el consumo de agua por individuo al día es
muy superior, sobre todo en países desarrollados. En países en vías de desarrollo el consumo diario oscila
entre los 20 y los 40 litros diarios por persona. En países más desarrollados se alcanzan valores más
elevados. En Barcelona se oscila entre los 170 – 250 litros al día por habitante, pero considerando la
totalidad de España se alcanzarán valores cercanos a los 300, ya que se considerarán también todos los
campos de cultivo. Los países más desarrollados tienen un consumo diario aproximado de 350 litros por
habitante.
Cada vez se usa más agua, por lo que nos enfrentamos a un problema, ya que la precipitación anual en
Barcelona es de 400 – 550 mm. Básicamente se siguen dos técnicas para poder tener el agua necesaria. En
primer lugar el agua se reutiliza, y en segundo lugar puede ser necesario traer agua de otras cuencas más
ricas.
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Fermentaciones Industriales I
En los temas siguientes veremos todas las etapas que componen una fermentación industrial. En la tabla las
vemos todas resumidas.
Etapa Curso de la fermentación
I Preservación del inóculo
II Multiplicación del inóculo a. Cultivo en matraces agitados

b. Formación de esporas en medio sólido
III Cultivo de prefermentación 1 – 3 cultivos de prefermentación
IV Fermentación de producción a. Fermentación discontinua

b. Fermentación continua
Conservación del inóculo

El problema de trabajar con microorganismos es su bajo tiempo de vida, ya que para poder trabajar con
ellos son necesarias sucesivas generaciones del organismo que se mantengan idénticas entre sí. Esto puede
presentar una serie de problemas.
La conservación de cepas de producción a lo largo de un período largo de tiempo es un requerimiento básico
para la fermentación industrial. El objetivo no será solo la supervivencia del organismo, sino que este
mantenga sus capacidades de producción después de la conservación. El objetivo de la conservación es
mantener las cepas sin cambios celulares tanto tiempo como sea posible. Ha de encontrarse el método más
adecuado para cada cepa.
1. Subcultivos. Es el método más fácil. Los microorganismos se mantienen como cultivo por
picadura en agar o en cultivo líquido en nevera, pero presenta dos incovenientes:
- Tiene elevados costes.
- Peligroso: Existe un elevado riesgo de contaminación y de mutación, ya que se producirá una
mutación cada 8 – 16 semanas, o alguna al año. Incluso pueden morir todas las células al haber
tardado en hacer un nuevo subcultivo.
En estos casos los cultivos se mantienen a bajas temperaturas, entre 2º y 6º C, para que las sucesivas
resiembras estén espaciadas en el tiempo, hasta semanas, pero se han de hacer en un momento u
otro.
Una variante de este método es el uso de medios pobres, ya sean medios mínimos o tan solo agua
y agar. Al tener a los microorganismos en medios tan pobres, el crecimiento se verá ralentizado
mucho, pudiendo llegar a alargar el tiempo entre las siembras a meses, entre 3 y 5, pero los riesgos
son los mismos que se han dicho.
2. Esporulación. Solo se puede usar en microorganismos esporulantes. En estos organismos habrá
suficiente con inducir la esporulación Las esporas se almacenan entonces en un medio mineral,
estéril y seco, para que no germinen. Esto permite mantener los microorganismos viables durante
mucho más tiempo, incluso décadas. Los esporuladores son los únicos organismos que no dan
problemas de conservación.
3. Almacenamiento por congelación. Un descenso de la temperatura de 10º C supone un descenso
de la velocidad metabólica del 50%. A temperaturas de ultracongelación el metabolismo estará
totalmente frenado, incluso la actividad química. Existen diferentes temperaturas de congelación.
- Suave:  -18º C, congelador doméstico
- Fuerte:  -80º C, congelador de 2 compresores
- Ultracongelación:  -196º C, congelación en N líquido.
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La congelación en nitrógeno líquido permite conservar incluso microorganismos delicados más de

15 años. Se ha de tener en cuenta, antes de usar este medio, que es caro, ya que se necesita
electricidad para mantenerlo y que el nitrógeno líquido se va perdiendo, por lo que se deberá ir
renovando. En N liquido el organismo no se alterará, pero se ha de considerar si no existe un medio
más económico de conservación, acorde con el valor del cultivo.
La congelación ha de ser rápida pero gradual, para lo que se han de tener en cuenta las siguientes
consideraciones.
a. Los microorganismos deben estar en un medio rico y líquido, donde crecerán en la fase
exponencial hasta llegar a su Nmax, justo antes de llegar a la fase estacionaria.
b. La concentración de microorganismos ha de ser elevada, para lo que se eliminará el medio
por filtración y se repartirá el cultivo en 50 – 100 viales.
c. Adición del crioprotector que evitará la formación de cristales en el interior de la célula,
que puede ser glicerol o DMSO, ya que son los más usados. La concentración de estos
crioprotectores ha de estar entre el 5 y el 20%, ya que concentraciones más elevadas
darían problemas de toxicidad al descongelar.
d. Se congela lo más rápidamente posible.
e. Al cabo de 10-15 días, una vez se haya estabilizado la congelación, se deberán coger 4 o
5 viales al azar, que se cultivarán. Esto es el control de calidad o control de viables y es
básico, ya que así podremos conocer el número aproximado de viables que habrá en cada
vial, ya que al congelar se habrá reducido este número. El número de viables no ha de ser
menor del 70 – 80% del número de viables original. Si se recuperan menos, significará
que algo no habrá ido bien.
f. Si el control de viables da los resultados deseados, se reparten los viales restantes en 2
congeladores, por seguridad.
4. Liofilización. Es el mejor método de conservación existente. Conserva tan bien como la
congelación, pero presenta la ventaja de que no es necesaria la conservación a bajas temperaturas,
con lo que resulta más barato y seguro. En la liofilización o desecación por congelación trabajamos
sobre el punto triple del agua, para pasar del estado sólido al gaseoso sin pasar por el líquido, en
un proceso de sublimación. En primer lugar se congela y después se pasa al vacío provocando la
sublimación del agua.
El protocolo de liofilización es básicamente idéntico al de congelación, hasta el apartado c, aunque
en la liofilización no se usan ni glicerol ni DMSO como crioprotectores, debido a su toxicidad, ya
que al eliminar el agua su concentración sería tóxica para el microorganismo. En lugar de estos
crioprotectores se usan azúcares o leche. Entonces congelamos las muestras, nunca a temperaturas
superiores a –50º C, y si son inferiores mejor. Eliminamos entonces el agua congelada al crear el
vacío en la muestra. Para mantener la muestra liofilizada es básico impedir que se pueda rehidratar,
ya que sin agua no hay metabolismo. Una vez se ha deshidratado se ha de sellar herméticamente
la botella. La temperatura óptima de almacenamiento está entre 0º y 18º C, pero nunca
menor, ya que no se ha de congelar, y siempre en oscuridad. Una vez liofilizado se ha de hacer un
control de calidad, como en el caso de la congelación.
La liofilización es el método que se emplea en la conservación de las grandes colecciones tipo,
porque cuando se puede hacer, hay algunos organismos que no la toleran, es el método óptimo.
Permite mantener la viabilidad a largo plazo, con costes reducidos, y menos trabajo que la
congelación en N líquido, el segundo método con mayor viabilidad a largo plazo.
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Medios de cultivo
Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos
necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la síntesis de material celular y la producción de
metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos químicos, de composición conocida, para la
obtención de medios de cultivo, que son medios sintéticos, pero en las fermentaciones industriales los
medios han de ser lo más baratos posibles. En microbiología industrial raramente se usan medios óptimos,
equilibrados o definidos, sino que en muchos casos los medios usados están formados a partir de
subproductos de otras industrias. Serán medios muy variados en su composición, nunca óptimos ni
equilibrados, ni mucho menos definidos. Esto presenta una serie de consecuencias sobre el desarrollo de
los organismos y sobre el control de la fermentación.
I. Un medio de cultivo óptimo y más o menos equilibrado es obligatorio para conseguir la
máxima producción. Es necesario por lo tanto optimizar los medios industriales, lo que no es
tarea fácil, teniendo en cuenta los ingredientes de los que se parte, muy complejos y variables.
Los medios de cultivo industriales pueden optimizarse usando métodos estadísticos, mediante
programas diseñados con ordenador. En caso de ser necesario pueden añadirse suplementos
de elementos críticos ausentes o insuficientes en el medio.
II. Control de calidad. Los medios se diseñan para conseguir la máxima producción. En todos
los casos, los nuevos sustratos han de ser evaluados precisamente antes de iniciar la
producción industrial, mediante fermentaciones prueba.
III. Represión por el catabolito. Consiste en la represión de la síntesis de determinadas proteínas
como consecuencia de la presencia de una determinada fuente de carbono y energía, como
puede ser la glucosa. La existencia de una fuente de carbono y energía óptima en el medio
puede provocar que algunas proteínas no se expresen, lo que puede reducir la eficacia de
ciertas reacciones de interés industrial, o incluso impedirlas. La represión por el catabolito o
por el producto puede eliminarse optimizando los nutrientes en el medio, de manera que no
haya glucosa, por ejemplo, o por gestión adecuada del fermentador, de manera que se añada
la glucosa poco a poco al medio. Si no funcionase esta aproximación, deberían usarse cepas
mutantes desreguladas para la producción.
Sustratos usados como fuente de Carbono y de Nitrógeno

Los carbohidratos son las fuentes de energía por excelencia en la industria de la fermentación. Por razones
económicas, la glucosa o la sacarosa son usadas muy raramente como única fuente de C, excepto en
procesos que requieran un control muy preciso de la fermentación. Los sustratos usados más
abundantemente en las fermentaciones son:
- Melazas. Subproducto de la industria azucarera, son los restos del refinado del azúcar. Son
una de las fuentes más baratas de carbohidratos. Además de una elevada cantidad de azúcares
contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos traza. En cualquier caso, su
composición varía en función de la materia prima usada para la obtención del azúcar, las
condiciones climáticas, la localidad y el proceso usado en la industria azucarera.
- Extracto de malta. Es el extracto acuoso de la cebada malteada. Se trata de un sustrato
excelente para muchos hongos, levaduras y actinomicetes. El extracto seco de malta contienen
entre un 90 y un 92 % de carbohidratos, concretamente hexosas, que son glucosa y fructosa,
disacáridos como la maltosa y la sacarosa, e incluso trisacáridos como la maltotriosa. Las
sustancias nitrogenadas en el extracto de malta incluyen péptidos, proteínas, aminoácidos,
purinas, pirimidinas y vitaminas. La composición de aminoácidos varía en función del grano
usado, pero la prolina siempre constituye más de un 50%.
Uno de los problemas que presentan los sustratos ricos en azúcares es lo que se conoce como
reacción de Maillard, que se da a bajo pH y elevadas concentraciones de azúcares reductores.
Los grupos NH2 de las aminas, aminoácidos y proteínas reaccionan con los grupos CHO de
los azúcares reductores, lo que resulta en la formación de productos de condensación de color
tostado, empeorando el aspecto del producto y que no pueden ser usados por los
microorganismos, restando así nutrientes.
11
- Almidón y dextrinas. Pueden ser metabolizados directamente por los organismos productores
de amilasas. El almidón ha adquirido importancia en la producción de etanol.
- Líquidos sulfíticos de las papeleras. Se trata de productos residuales que contienen azúcar de
la industria del papel. Los líquidos sulfíticos de coníferas contiene entre el 2 y 3 % de azúcares,
de los cuales el 80 % son hexosas y el resto pentosas. En el caso de los árboles de hoja caduca,
el contenido es principalmente de pentosas.
- Celulosa. Debido a su gran disponibilidad y bajo coste, la celulosa está siendo utilizada como
sustrato de fermentación. Proviene de la paja, restos de mazorcas, turba, papel,... A menudo
no puede ser utilizada directamente como fuente de carbono, por lo que se deberá hidrolizar
en primer lugar, ya sea química o enzimáticamente, dando el jarabe de glucosa, que se usa en
la producción de etanol, butanol, acetona e isopropanol.
Fuentes de Carbono y energía diferentes de los carbohidratos
- Aceites vegetales, como aceite de soja, de algodón o de palmera. Son usados como
ingredientes secundarios, cuando se usa ya una fuente de carbohidratos como principal aporte
de energía.
- Etanol. Es el producto de la fermentación del almidón sacarificado o de la celulosa y puede
ser usado como única fuente de carbono o como fuente complementaria para muchos
organismos.
- Alcanos. Alcanos de 12 a 18 C son rápidamente metabolizados por muchos microorganismos.
Estos alcanos son residuos del refinado del petróleo y su uso como alternativa a los
carbohidratos depende de su precio.
En lo que respecta a los sustratos usados como fuentes de nitrógeno, en muchos procesos industriales se
usan los siguientes.
- NH4+, sales, urea o NH4+ gaseoso.
- Líquido de maceración del maíz. Se trata de un subproducto de la producción de almidón a
partir del maíz. El extracto concentrado tiene un 4% de N y numerosos aminoácidos, como
son: Ala, Arg, Glu, Ile, Tre, Val, Fenil Alanina, Met y Cis.
- Extracto de levaduras. Es un sustrato excelente para muchos microorganismos. Se produce a
partir de levaduras de panificación, induciendo su autólisis a 50 – 55º C o por plasmólisis en
alta concentración de NaCl. Contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y
carbohidratos. El glucógeno y la triohalosa se hidrolizan a glucosa durante la producción del
extracto.
- Peptonas. Se trata de hidrolizados de proteínas, de manera que contendrá aminoácidos y
péptidos. Pueden ser usadas por muchos microorganismos, pero son bastante caras para la
producción industrial, aunque pese a este su uso está muy extendido. Las peptonas pueden
tener dos orígenes.
o Proteínas animales. Caseína, gelatina, queratina.
o Proteínas vegetales. Semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodón y
girasol. Todo esto aún retiene mucho nitrógeno, aun siendo subproductos de otras
industrias.
La composición de aminoácidos y de péptidos variará según el origen. Por ejemplo, la gelatina es rica en
prolina e hidroxiprolina, pero casi no contiene aminoácidos con azufre. En cambio los péptidos de la
queratina tienen una elevada concentración en prolina y cisteína, pero carecen de lisina. La composición
del producto final está determinada también por el tipo de hidrólisis a que se someta, que puede ser ácida o
enzimática. Especialmente afectado se ve el contenido en triptófano, ya que la hidrólisis ácida reduce su
nivel mucho.
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Para poder conocer los componentes que tenemos disponibles para confeccionar nuestro medio, existe lo
que se conoce como la bolsa de residuos, que es un órgano público, donde las empresas deben declarar sus
residuos. Los objetivos de la bolsa son:
- Censar los residuos que se producen, para saber dónde se producen exactamente y en qué
cantidad los diferentes tipos de residuos.
Solucionar el transporte y la reutilización cuando se pueda. Muchos residuos de los que se producen pueden no
tener utilidad para la empresa, pero sí tenerla para otras empresas, lo que pueden implicar el reaprovechamiento.
3 Capítulo 1: Microbiología Industrial. Capítulo 1. Pp 32- 33 ya

Alcoholes
Fermentación alcohólica
La producción de etanol es un proceso industrialmente viejo. El etanol por su uso como materia primera
química se produce por fermentación desde los inicios de la microbiología industrial, y para la producción
de bebidas alcohólicas desde hace miles de años. Pero durante muchos años se ha obtenido por
procedimientos químicos, mediante la hidratación
de etileno. Últimamente se ha retomado la
producción de etanol para su uso químico a través
de la fermentación. El etanol se produce por
fermentación para fabricar bebidas alcohólicas y
alcohol industrial, pero el uso del etanol como
combustible no es rentable, ya que es más
económico comprar petróleo que producir etanol.
Tan solo lo producen algunos países
subdesarrollados.
La producción de etanol por fermentación de la
glucosa se produce por la vía de
Embden - Meyerhof – Parnas (EMP). A través de
esta vía, el piruvato producido pasa a ser
acetaldehído por acción de la piruvato
descarboxilasa. El acetaldehído pasará a alcohol
por acción del alcohol deshidrogenasa.
El 96% de la producción de etanol la llevan a cabo
hongos, diferentes especies de levaduras,
principalmente:
Saccharomyces cerevisiae
Khuyveromyces fragilis
Torulospora
Los sistemas biológicos discontinuos para la producción de etanol se inician en aerobiosis, ara obtener la
máxima biomasa posible, ya que si las condiciones anaerobias empiezan demasiado pronto, la población
no será lo suficientemente grande como para obtener una buena velocidad de conversión a etanol.
Distinguimos por lo tanto 2 fases:
- Fase aerobia: Glucosa € 6 CO2, es una fase de crecimiento
- Fase anaerobia: Glucosa € 2 Etanol + 2 CO2, es la fase de producción de etanol
Por otro lado, incluso en la fase anaerobia será necesaria una cierta presencia de oxígeno, ya que las
levaduras lo necesitan para producir sus esteroles y sus AGs insaturados de membrana.
El principal problema es que el etanol es inhibidor a altas concentraciones. La tolerancia al alcohol de las
levaduras es crítica para obtener rendimientos elevados. La tolerancia al alcohol de diferentes cepas varía
considerablemente. A medida que aumenta la concentración disminuye la velocidad de crecimiento, en
primer lugar, y a ciertas concentraciones, incluso la síntesis de alcohol se ve inhibida. El crecimiento
generalmente se detiene al llegar al 5% de etanol, mientras que la síntesis se detiene entre el 6 y el 10 %.
13
Se ha intentado solucionar este problema de 2 maneras:

- Desarrollo de cepas de levaduras más resistentes al etanol. Su interés radica en la
producción de bebidas alcohólicas de baja graduación y del alcohol industrial. Existen
algunas cepas de Saccharomyces capaces de producir hasta el 12 – 14 %, e incluso algunas
entre el 18 – 20%.
- Uso de Zymomonas fragilis. Es la única bacteria capaz de hacer la fermentación alcohólica.
Usa una vía diferente de la EMP, sino que usa la vía de Entner – Doudoroff, seguida de la
piruvato descarboxilasa y el alcohol deshidrogenasa. Presenta una serie de ventajas que lo
podrían situar por encima de Saccharomyces en la producción:
o Tolera más el azúcar, hasta 400 g/l
o Tolera más el etanol, hasta 130g/l
o Mayor velocidad de crecimiento que las levaduras
o La vía de ED produce en anaerobiosis solo 1 mol ATP/ mol glucosa, de manera que
la cantidad de glucosa que pasa a biomasa es menor.
o Mayor velocidad de formación de etanol
Como sustratos para la producción de etanol industrial se usan:
- Raíces con alto contenido en almidón (tubérculos o granos) hidrolizados
- Melazas o zumo de caña de azúcar o remolacha (residuos agrícolas azucarados)
- Madera o residuos del procesado de madera. Esto ya no se usa mucho porque la industria
maderera lo reaprovecha para hacer conglomerado, de manera que se aprovecha mejor, ya
que como sustrato no es muy rico.
- Residuos agrícolas muy degradados, como paja... No se usa, porque degradar células hasta
azúcares resulta caro, con lo que disminuye el rendimiento.
Lo mejor son las melazas, son los más ricos, y además, generalmente, tiene buenas concentraciones de
otros productos, aunque puede ser que se tengan que suplementar con P o N.
La producción de etanol se hace generalmente por fermentación en discontinuo con almidón hidrolizado
o melazas como sustrato. El volumen de inóculo usado suele ser de un 3%. La fermentación continua se
ha probado en algunos casos, obteniendo un éxito relativo.
En lo que respecta a la recuperación del producto, antes de la destilación, se separa la masa celular por
centrifugado o por sedimentación. La destilación consiste en aplicar calor e una mezcla de líquidos,
idealmente con diferentes puntos de ebullición, de manera que uno pase a vapor y se condense después
en una columna de destilación. En lo que respecta a la destilación, depende del destino:
- Si se trata de alcohol para consumo, se destila por el método tradicional del alambique,
inventado por los árabes. El alambique consta de un recipiente donde se caliente el líquido
a destilar, de manera que los vapores se recojan y se pasen por un refrigerador o serpentín,
donde condensarán.
- Si se trata de alcohol industrial, se usan destiladores en continuo, desde principios del siglo
XIX. Estos destiladores pueden alcanzar alcohol del 96% de pureza, usado como disolvente
en la industria cosmética, química o farmacéutica. Si se quiere alcohol 100% el 4% restante
se ha de eliminar por medios químicos. En una destilación en continuo distinguimos una serie
de etapas.
1. Destilación primaria: El sustrato fermentado diluido se destila a través de la primera
columna, “beer column” en el dibujo, o columna de destilación. En esta primera
columna se concentrará hasta alcanzar el 85%, a la vez que se elimina volátiles no
deseados como aldehídos.
2. Rectificación del destilado de la primera columna. El líquido pasa a temperaturas
cercanas al punto de ebullición. Se obtiene ya el etanol al 96,5 %. Al mismo tiempo,
los aceites de fusel, mezclas de alcoholes de más de 2C, se pueden eliminar por
decantación en agua.
14
3. En la producción de etanol para formar combustible o para otros usos industriales

puede ser necesaria una tercera etapa adicional, para conseguir la deshidratación
del 99,4 %o incluso superiores, mediante el uso de benceno o ciclohexanos. En todo
caso, el destilado se decanta en una etapa adicional de rectificación para recuperar
el agente extractante, que podrá ser devuelta a la columna azeotrópica.
Los residuos se aprovechan tanto como sea posible.
Aplicación de la fermentación alcohólica a la transformación de alimentos

Las bebidas alcohólicas se producen a partir de diversas materias primeras, pero principalmente a partir
de cereales, frutas y productos azucarados. Entre las bebidas alcohólicas hay bebidas no destiladas, como
la cerveza, el vino, la sidra y el sake, y otras obtenidas por destilación como el whisky y el ron, que se
obtienen a partir de cereales y melazas fermentadas, y el coñac, que se obtiene por destilación del vino.
Otras bebidas destiladas, como el vodka o la ginebra se obtienen a partir de bebidas alcohólicas neutras,
obtenidas por destilación de melazas, cereales, patatas o suero láctico fermentado. También se obtienen
una gran variedad de vinos de alta graduación mediante la adición de alcohol destilado a vinos normales,
con el fin de incrementar su contenido de alcohol, hasta el 15 o 20%, como son los casos del jerez, oporto,
o madeira.
Un detalle común muy importante en estas fermentaciones es que en todos los casos se usan levaduras
para la conversión de azúcares en etanol.
4 Capítulo 1: Microbiología Industrial. Capítulo 1. Pp 55 ya

Producción de nucleótidos y biopolímeros
Métodos de producción de nucleótidos
Los nucleótidos son productos muy usados en la industria alimentaria. Se usan principalmente como
saborizantes. A principios del siglo XX, en Japón se dieron cuenta de que los ingredientes activos de todos
los productos saborizantes que usaban eran Glutamato, Lisina o nucleótidos monofosfato de purinas (5’-
IMP, 5’-GMP), por lo que desarrollaron sistemas de producción.
Por ATAQUE QUÍMICO O ENZIMÁTICO de los ácidos nucleicos
Hidrólisis del RNA de levaduras con enzimas microbianos
15
Rotura del RNA celular por enzimas endógenos de la célula y liberación de 5’ mononucleótidos
Hidrólisis química del RNA de levaduras a nucleósidos, con fosforilación química posterior
Por FERMENTACIÓN DIRECTA empleando mutantes con un bloqueo en la síntesis de nucleótidos
Producción de nucleósidos por fermentación y después fosforilación química
Producción directa de 5’ nucleótidos por fermentación
Bioconversión de bases de nucleótidos a 5’ nucleótidos
Las cepas usadas en la producción son B.subtilis y B.megaterium principalmente, aunque se pueden usar
otras, como Micobacterium.
La producción tuvo un pico hace unos años, pero actualmente se ha estancado mucho. La mayor parte de
las empresas están en Asia, ya que se usan principalmente allí para dar sabor a los platos... En Europa se
produce cada vez más.
Producción de biopolímeros
Se trata de un campo muy interesante para la industria. Los polímeros de más interés actualmente son:
- Dextranos
- Scleroglucanos
- Pululanos
- Ácido algínico
- Xantano
Los biopolímero se han usado siempre como estabilizadores de los alimentos, e incluso para hacer plasma
y sangre artificial. El biopolímero más sintetizado actualmente es el xantano, del que se producen
aproximadamente 104 toneladas al año. Este producto es fabricado por Xanthomonas. Los biopolímeros
son mejores que los polímeros químicos, porque son degradables.
Para que se forme el biopolímero es necesario que haya unas condiciones de saturación de oxígeno, así
como que la relación entre C y N se decante hacia C, cuanto más mejor. La relación más adecuada es de
10 a 1. Se forma el polímero unido a un nucleótido, que irán atravesando la membrana hasta llegar al
medio. El medio se va espesando a medida que se produce polímero, con lo que la producción bajará. Ha
de haber una gran regulación del proceso.
5 Capítulo 1: Microbiología Industrial. Capítulo 1. Pp 82 ya

Aditivos alimentarios
Un aditivo es cualquier sustancia química añadida expresamente al alimento. Dentro de esta definición
entran también los condimentos usados en la cocina. Dependiendo de las propiedades de los aditivos
distinguimos 31 categorías diferentes: edulcorantes, emulgentes, conservantes, colorantes,....
Nos centraremos en los conservantes, que son sustancias que se añaden para alargar el tiempo de vida
útil del alimento. Asumiendo una ingesta de 1000 Kg anuales, 36 Kg serían sal y azúcar, los conservantes
más antiguos que se conocen, mientras que 4 Kg serían el resto de aditivos.
Para poder utilizar un aditivo y añadirlo en un producto, debe estar autorizado su uso, porque podrían
tener efecto sobre la salud del consumidor. Los aditivos presentan una serie de ventajas e inconvenientes:
Ventajas
Conservan y mejoran la calidad del producto
Reducen las pérdidas del producto
Mejoran el aspecto del producto, haciéndolo más atractivo al consumidor
Facilitan la manipulación del alimento
Desventajas
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Pueden permitir engaños al consumidor
Pueden enmascarar prácticas de fabricación fraudulentas o poco precisas
Seguridad
El uso de aditivos requiere una autorización previa. Para conseguir la autorización se han de llevar a cabo
3 tipos de estudios de toxicidad, generalmente en 2 modelos animales, usualmente perro y cobaya.
Normalmente se mirará la toxicidad tanto bioquímica como histopatológica.
1. Intoxicación aguda. Miras la dosis letal 50, mediante el producto puro, y compruebas su
toxicidad. Si no hay problemas, se pasa a 2.
2. Intoxicación subcrónica. Se administra el producto durante 9 semanas a diferentes
concentraciones. Si no hay problemas, se pasa a 3.
3. Intoxicación crónica. Se administra el producto durante 2 años, a diferentes concentraciones.
Una vez realizadas las pruebas, se pasará a calcular la ingesta máxima teórica, que será autorizada en un
valor 100 veces menor.
Pese a todas estas precauciones, ciertos consumidores pueden presentar ciertos problemas de toxicidad
y alergia a ciertos aditivos. Se han de mejorar los ensayos.
En cualquier caso, sería muy difícil, si no imposible, para la industria alimentaria funcionar sin aditivos. Lo
óptimo sería utilizarlos en la mínima cantidad posible, y solo cuando fuese necesario.
6 Capítulo 2. Biotecnología, pp 19-23
Biomasa: ¿un sustrato biotecnológico?

2.1 Una estrategia de biomasa
Se ha estimado que el rendimiento neto anual de biomasa vegetal resultante de la fotosíntesis es de al menos 120
mil millones de toneladas de materia seca en tierra y alrededor de 50 mil millones de toneladas de los océanos del
mundo. De la biomasa producida en la tierra, aproximadamente el 50% se presenta en forma compleja de
lignocelulosa. La mayor proporción de biomasa terrestre (44%) se produce como bosque (Cuadro 2.1). Es
sorprendente observar que si bien los cultivos agrícolas representan solo el 6% de la productividad fotosintética
primaria, de esta cantidad se deriva una gran parte de los alimentos para humanos y animales, así como muchos
materiales estructurales esenciales, textiles y productos de papel (Cuadro 2.2). . Muchos productos agrícolas
tradicionales pueden explotarse aún más con la creciente conciencia de la biotecnología. En particular, los nuevos
enfoques tecnológicos indudablemente podrán utilizar el gran volumen de material de desecho del procesamiento
convencional de alimentos que actualmente encuentra poco uso. La agricultura, la acuicultura y la silvicultura de
biomasa pueden tener un gran potencial económico para muchas economías nacionales, especialmente en las
regiones tropicales y subtropicales (Fig. 2.1). De hecho, el desarrollo de procesos biotecnológicos en áreas en
desarrollo donde sobresale el crecimiento de las plantas bien podría provocar un cambio en el equilibrio del poder
económico. Cabe señalar que la energía no renovable y las materias primas petroquímicas de las que la sociedad
moderna es tan dependiente (petróleo, gas y carbón) se derivaron de tipos antiguos de biomasa. Las naciones
industrializadas modernas han llegado a depender en gran medida de las reservas fósiles tanto para la energía como
como materia prima para una amplia gama de procesos de producción. En poco más de un siglo, el mundo
industrializado se ha basado en gran medida en los combustibles fósiles que tardaron millones de años en formarse
debajo de los lechos de los océanos o en las profundidades de la tierra. Además, es un patrón de uso muy desigual.
En la actualidad, Estados Unidos con el 6% y Europa Occidental con el 8% de la población mundial utilizan el 35% y
el 25%, respectivamente, de la producción mundial de petróleo y gas. Si bien las existencias de carbón pueden durar
muchos cientos de años, esto no es cierto para el petróleo y el gas, y con los niveles de uso actuales, las fuentes de
petróleo y gas disponibles conocidas en el mundo se habrán explotado casi por completo para fines de este siglo. La
respuesta a estos problemas debe ser el uso de biomasa derivada de la fotosíntesis para energía y materias primas
industriales. Actualmente, la fotosíntesis genera anualmente más de diez veces más energía de la que consume la
humanidad. En la actualidad, la explotación a gran escala de biomasa para combustible y materias primas químicas
está restringida por el costo de las alternativas fósiles, la naturaleza heterogénea de las fuentes de biomasa y su
distribución difusa. El uso de biomasa directamente como fuente de energía se ha practicado durante mucho tiempo
en las naciones menos industrializadas como América Latina, China, India y África. En los países desarrollados, la
biomasa derivada de la agricultura y la silvicultura se ha destinado en gran medida a usos industriales y alimentarios
(Cuadro 2.3). En la actualidad, la biomasa se utiliza para derivar muchos productos de importancia industrial y
17
comercial (Cuadro 2.3), y los que involucran biotecnología se destacarán y ampliarán en capítulos posteriores.
Tabla 2.3 Importantes productos derivados de la biomasa

Combustible Metano (biogas) especialmente en el mundo en desarrollo.
Productos de pirolisis (Gas, carbón vegetal)
Etanol (a través del jugo de caña y fermentación de celulosa)
Aceites (de hidrogenación)
Combustión directa de biomasa residual
Materias primas Etanol (materia prima potencial de la industria)
Gas de síntesis (de gasificación química)
Fertilizantes Compost
Lodos
Suplementos alimenticios directos
Proteinas unicelulares
18
2.2 Materias primas naturales

Las materias primas naturales proceden principalmente de la agricultura y la silvicultura. Estos son principalmente
carbohidratos de diversa complejidad química e incluyen azúcar, almidón, celulosa, hemicelulosa y lignina. La amplia
gama de subproductos obtenidos a partir de materias primas que se utilizan en procesos biotecnológicos se muestra
en la Tabla 2.4. Las materias primas azucareras como la remolacha azucarera, la caña de azúcar y el mijo azucarero
son las más adecuadas y disponibles para servir como materia prima para el procesamiento biotecnológico. A medida
que los usos tradicionales del azúcar se reemplacen por alternativas más eficientes, el excedente de azúcar en el
mercado de productos básicos dará más incentivos para desarrollar nuevos usos. Muchas economías tropicales
colapsarían si se eliminaran los mercados del azúcar. El azúcar de caña ya sirve como sustrato para el programa de
gasohol brasileño, y muchas otras naciones están viendo rápidamente el inmenso potencial de estas nuevas
tecnologías.
Los productos agrícolas que contienen almidón incluyen los diversos tipos de cereales como el maíz, el arroz y el
trigo, junto con las patatas y otros tubérculos como la batata y la mandioca. Una pequeña desventaja del almidón
es que normalmente debe degradarse a monosacáridos u oligosacáridos por digestión o hidrólisis antes de la
fermentación. Sin embargo, se están desarrollando muchos procesos biotecnológicos que utilizan almidón, incluida
la producción de combustible. No cabe duda de que la celulosa, tanto de origen agrícola como forestal, debe aportar
una fuente importante de materia prima para procesos biotecnológicos como combustibles y productos químicos.
Sin embargo, la celulosa es una sustancia química muy compleja e invariablemente se encuentra en la naturaleza en
estrecha asociación con la lignina. La capacidad de los complejos de lignocelulosa para resistir las fuerzas
biodegradantes de la naturaleza es atestiguada por la longevidad de los árboles, que se componen principalmente
de lignocelulosa. La lignocelulosa es el recurso natural más abundante y renovable disponible para el hombre en
todo el mundo. Sin embargo, deben superarse enormes dificultades tecnológicas antes de que se pueda hacer un
uso económico de este abundante compuesto. En la actualidad, se requieren costosos procesos de pretratamiento
que demandan energía para abrir esta compleja estructura a una amplia degradación microbiana. La celulosa pura
puede degradarse mediante hidrólisis química o enzimática a azúcares solubles, que pueden fermentarse para
formar etanol, butanol, acetona, proteína unicelular (SCP), metano y muchos otros productos. Se están logrando
avances emocionantes en los laboratorios de todo el mundo, y es solo cuestión de tiempo antes de que se superen
estas dificultades. Se ha calculado de manera realista que aproximadamente 3,3 × 1014 kg de CO2 por año se fijan
en la superficie de la Tierra, y que aproximadamente el 6% de esto, es decir, 22 mil millones de toneladas por año,
serán celulosa. A nivel mundial, las plantas terrestres producen 24 toneladas de celulosa por persona al año. El
tiempo seguramente mostrará que la lignocelulosa será la fuente de carbono más útil para los desarrollos
biotecnológicos.
Tabla 2.4 Una gama de subproductos que podrían utilizarse como sustratos en biotecnología
Agricultura Silvicultura Industria
Sorbete Hidrolizado de residuos de madera Melaza
Bagazo Licor de pulpa de sulfito Residuos de destilería
Mazorcas de maíz Corteza, aserrín, ramas Suero
Cascaras de café, cacao y coco Papel y celulosa Aguas residuales industriales de
Fruta, cascaras y hojas Fibras alimentos, industrias ( oliva, aceite
Desechos de te de palma, patata, dátil, cítricos,
Tortas de semillas oleaginosas mandioca)
Residuos de algodón Aguas de lavado (lácteos, enlatados
Salvado confitería, refrescos de panadería,
Pulpa ( tomate, café, plátano, piña, apresto, malteado, maíz empinado)
cítricos, oliva) Efluentes y desechos pesqueros
Residuos de animal Subproductos cárnicos
Basura municipal
Aguas residuales
Residuos del matadero
2.3 Disponibilidad de subproductos

Si bien los procesos biotecnológicos utilizarán muchos productos agrícolas (como azúcares, almidones, aceites, etc.)
como sustratos, la amplia gama de productos de desecho derivados de la agricultura, y que actualmente no se
utilizan de forma creativa, sin duda será sometida a un examen detallado y a una utilización futura. Los desechos
19
agrícolas y forestales vienen en muchos tipos diversos: pajitas de cereales, cáscaras y mazorcas de maíz, desechos
de soja, cáscaras de coco, cáscaras de arroz, cáscaras de granos de café, salvado de trigo, bagazo de caña de azúcar
y desechos forestales, incluidos recortes, aserrín, corteza, etc. ( Cuadro 2.4). Solo una pequeña fracción de estos
desechos se utiliza a gran escala debido principalmente a factores económicos y logísticos. Un objetivo principal de
la biotecnología es mejorar la gestión y la utilización de los grandes volúmenes de materiales orgánicos de desecho
agrícola, industrial y domésticos que se encuentran en todo el mundo. La utilización biotecnológica de estos
desechos eliminará una fuente de contaminación, en particular la contaminación del agua, y convertirá algunos de
estos desechos en subproductos útiles. No todos los procesos involucrarán biosistemas. En particular, los procesos
de ósmosis inversa y ultrafiltración encuentran cada vez más usos. La ósmosis inversa es un método de
concentración de soluciones líquidas en el que una membrana porosa deja pasar el agua pero no las sales disueltas
en ella. La ultrafiltración es un método para separar los compuestos de alto y bajo peso molecular en un líquido al
permitir que el líquido y los compuestos de bajo peso molecular pasen mientras retienen los compuestos de alto y
bajo peso molecular y los sólidos suspendidos. Algunas aplicaciones actuales de estas tecnologías incluyen la
concentración de efluentes de fábrica diluidos, concentración de productos alimenticios diluidos, esterilización de
agua, purificación de agua salobre y separación de sólidos comestibles de efluentes diluidos. Los materiales de
desecho suelen ser importantes por razones económicas y medioambientales. Por ejemplo, muchos subproductos
de la industria alimentaria tienen un valor económico bajo y a menudo se vierten en las vías fluviales, lo que genera
graves problemas de contaminación ambiental. Una característica atractiva de los desechos de carbohidratos como
materia prima es que, si su bajo costo puede combinarse con bajos costos de manipulación adecuados, se puede
obtener un proceso económico. Además, la tendencia mundial hacia medidas de control de efluentes más estrictos,
o el aumento paralelo de las tarifas de eliminación de efluentes, puede llevar al concepto de desechos como una
materia prima de "costo negativo". Sin embargo, la composición o dilución de los desechos puede estar tan dispersa
que el transporte a un centro de producción puede resultar prohibitivo. En estas ocasiones, la biotecnología solo
puede servir para reducir un peligro de contaminación. Cada material de desecho debe evaluarse para determinar
su idoneidad para el procesamiento biotecnológico. Solo cuando un residuo está disponible en grandes cantidades
y preferiblemente durante un período prolongado de tiempo, se puede considerar un método de utilización
adecuado (Tabla 2.5). Dos desechos que se encuentran ampliamente y que ya encuentran usos considerables en la
fermentación son la melaza y el suero. La melaza es un subproducto de la industria azucarera y tiene un contenido
de azúcar de aproximadamente el 50%. La melaza se usa ampliamente como materia prima de fermentación para la
producción de antibióticos, ácidos orgánicos y levaduras comerciales para hornear, y se usa directamente en la
alimentación animal. El suero, obtenido durante la producción de queso, también podría convertirse en una materia
prima de fermentación importante.
7 Capítulo 3. Biotecnología. Pp 35-38
3.4 Ingeniería genética

Los genes son la base fundamental de toda la vida, determinan las propiedades de todas las formas de vida vivientes
y son segmentos definidos de ADN. Debido a que la estructura y composición del ADN en todas las formas de vida
es esencialmente la misma, es probable que cualquier tecnología que pueda aislar, cambiar o reproducir un gen
tenga un impacto en casi todos los aspectos de la sociedad. La recombinación genética, como ocurre durante la
reproducción sexual normal, consiste en la rotura y reagrupación de las moléculas de ADN de los cromosomas, y es
de fundamental importancia para los organismos vivos para el reordenamiento del material genético. La
manipulación genética se ha realizado durante siglos mediante la reproducción selectiva de plantas y animales
superpuestos a la variación natural. Por tanto, el potencial de variación genética se ha limitado a parientes
taxonómicos cercanos. Por el contrario, las técnicas de ADN recombinante, popularmente denominadas clonación
de genes o ingeniería genética, ofrecen oportunidades potencialmente ilimitadas para crear nuevas combinaciones
de genes que por el momento no existen en condiciones naturales. La ingeniería genética se ha definido como la
formación de nuevas combinaciones de material hereditario mediante la inserción de moléculas de ácido nucleico,
producidas por cualquier medio fuera de la célula, en cualquier virus, plásmido bacteriano u otro sistema de vectores
para permitir su incorporación en un organismo huésped. En el que no ocurren naturalmente, pero en el que son
capaces de propagarse de forma continúa. En esencia, la tecnología genética es la modificación de las propiedades
genéticas de un organismo mediante el uso de tecnología de ADN recombinante. Los genes pueden verse como el
software biológico y son los programas que impulsan el crecimiento, desarrollo y funcionamiento de un organismo.
Al cambiar el software de manera precisa y controlada, es posible producir los cambios deseados en las
20
características del organismo. Estas técnicas permiten el empalme de moléculas de ADN de origen muy diverso y,
cuando se combinan con técnicas de transformación genética, etc., facilitan la introducción de ADN extraño en otros
organismos. La construcción de ADN o gen extraño se introduce en el genoma del organismo receptor hospedante
de tal manera que el genoma total del hospedador no cambia excepto por el gen o los genes manipulados. Por tanto,
el ADN puede aislarse de células de plantas, animales o microorganismos (los donantes) y puede fragmentarse en
grupos de uno o más genes. Estos fragmentos de ADN pasajero se pueden acoplar luego a otro fragmento de ADN
(el vector) y luego pasar a la célula huésped o receptora, convirtiéndose en parte del complemento genético del
nuevo huésped (Fig. 3.3). La célula huésped puede luego propagarse en masa para formar nuevas propiedades
genéticas y capacidades químicas que eran inalcanzables mediante las formas convencionales de reproducción o
mutación selectiva. Si bien las técnicas tradicionales de reproducción genética vegetal y animal también cambian el
código genético, se logra de una manera menos directa y controlada. La ingeniería genética permitirá ahora al criador
seleccionar el gen particular requerido para una característica deseada y modificar solo ese gen. Aunque gran parte
del trabajo hasta la fecha ha involucrado bacterias, las técnicas están evolucionando a un ritmo asombroso y las
formas han sido desarrolladas para introducir ADN en otros organismos como levaduras y cultivos de células
vegetales y animales. Siempre que el material genético transferido de esta manera pueda replicarse y expresarse en
el nuevo tipo de célula, prácticamente no existen límites para la gama de organismos con nuevas propiedades que
podrían producirse mediante ingeniería genética. Las formas de vida que contienen ADN "extraño" se denominan
transgénicas y se analizarán con más detalle en capítulos posteriores. Estos métodos permiten potencialmente
agregar funciones totalmente nuevas a las capacidades de los organismos y abren perspectivas para la ingeniería
genética de microorganismos industriales y plantas y animales agrícolas que son bastante impresionantes en su
alcance. Esta es sin duda la nueva tecnología más significativa en biociencia y biotecnología modernas. En
microbiología industrial permitirá la producción en microorganismos de una amplia gama de productos hasta ahora
inalcanzables como proteínas y enzimas humanas y animales como la insulina y la quimosina (cuajo); en medicina,
mejores vacunas, hormonas y mejor terapia de enfermedades; en agricultura, plantas y animales mejorados por
productividad, calidad de productos, resistencia a enfermedades, etc .; en la producción de alimentos, mejora de la
calidad, el sabor, el sabor y la seguridad; y en los aspectos ambientales, se puede esperar una amplia gama de
beneficios como el control de la contaminación. Cabe señalar que la ingeniería genética es una forma de hacer las
cosas más que un fin en sí mismo. La ingeniería genética se sumará a las formas tradicionales de desarrollo de
productos, en lugar de desplazarlas. Sin embargo, hay muchos que ven la ingeniería genética como una transgresión
de los procesos de la vida normal que va mucho más allá de la evolución normal. Estas preocupaciones se analizarán
en capítulos posteriores. La ingeniería genética tiene el potencial de ampliar el alcance y el poder de casi todos los
aspectos de la biotecnología. En la tecnología microbiana, estas técnicas se utilizarán ampliamente para mejorar los
procesos microbianos existentes mejorando la estabilidad de los cultivos existentes y eliminando los productos
secundarios no deseados. Se anticipa con seguridad que dentro de esta década, las técnicas de ADN recombinante
formarán la base de nuevas cepas de microorganismos con propiedades metabólicas nuevas e inusuales. De esta
manera, las fermentaciones basadas en estos avances técnicos podrían volverse competitivas con los petroquímicos
para producir una amplia gama de compuestos químicos, por ejemplo, etilenglicol (utilizado en la industria del
plástico), así como mejorar la producción de biocombustibles. En la industria alimentaria, las cepas mejoradas de
bacterias y hongos ahora influyen en procesos tradicionales como el horneado y la elaboración de queso y aportan
un mayor control y reproducibilidad del sabor y la textura. Una comprensión completa de los conceptos de trabajo
de la tecnología del ADN recombinante requiere un buen conocimiento de la biología molecular. Aquí se intentará
una breve explicación, pero se recomienda a los lectores que consulten algunos de los muchos textos excelentes que
están disponibles en este campo. Las técnicas moleculares básicas para la transferencia in vitro y la expresión de
ADN extraño en una célula huésped (tecnología de transferencia de genes), que incluyen el aislamiento, corte y
unión de moléculas de ADN e inserción en una molécula de vector (portadora) que se puede retener de manera
estable en el célula huésped, se desarrollaron por primera vez a principios de la década de 1970. Estas técnicas se
pueden definir así: Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. Un requisito previo para la tecnología genética in
vitro es preparar grandes cantidades de ácidos nucleicos relativamente puros a partir del organismo deseado.
Después de la rotura de las células, los ácidos nucleicos deben separarse de otros componentes celulares utilizando
una variedad de técnicas que incluyen centrifugación, electroforesis, adsorción y diversas formas de precipitación
(Fig. 3.4). Cortar moléculas de ADN. El ADN se puede cortar mediante métodos mecánicos o enzimáticos. El
cizallamiento mecánico no específico generará fragmentos de ADN aleatorios, que se utilizan con mayor frecuencia
para crear bibliotecas genómicas. Este método crudo no permite el aislamiento de un fragmento específico que
contenga un gen u operón conocido. Por el contrario, cuando se utilizan enzimas endonucleasas de restricción
21
específicas, es posible reconocer y escindir secuencias de bases diana específicas en el ADN de doble hebra (ds). Las
endonucleasas de restricción son capaces de cortar el esqueleto del fosfodiéster de ambas cadenas del ADN para
generar extremos 3 OH y 5 PO4 (Fig. 3.5). Se han extraído y clasificado un gran número de endonucleasas de
restricción diferentes de una amplia variedad de especies microbianas. Las endonucleasas de restricción se nombran
de acuerdo con la especie de la que se aislaron por primera vez, p. Las enzimas aisladas de la cepa Rd de Haemophilus
influenzae se denominan Hind y cuando se aíslan varias enzimas de restricción diferentes del mismo organismo, se
denominan HindI, HindII, etc. Las endonucleasas de restricción pueden distinguir entre el ADN de sus propias células
y el ADN extraño reconociendo una determinada secuencia de nucleótidos. Esto permite romper una longitud de
ADN en fragmentos más cortos que contienen varios genes determinados por la enzima utilizada. A continuación,
dichos fragmentos de ADN se pueden separar entre sí basándose en diferentes pesos moleculares. Empalme de
ADN. Los fragmentos de ADN con extremos romos o con extremos superpuestos cohesivos se pueden unir in vitro
mediante la acción de ligasas de ADN específicas. La ADN ligasa que se usa ampliamente fue codificada por el fago
T4. Tales enzimas aseguran la formación de enlaces fosfodiéster entre sí.
Fig. 3.3 Diagrama esquemático que ilustra el concepto básico de ingeniería genética utilizando ADN de vector y
pasajero. (Fuente: Harwood y Wipat, 2006.
8 Capítulo 9. Biotecnología. Pp 53-57 página ¿
4.2 Principios del crecimiento microbiano

El crecimiento de organismos puede verse como el aumento de material celular expresado en términos de masa o
número de células, y es el resultado de una serie altamente complicada y coordinada de pasos biológicos catalizados
enzimáticamente. El crecimiento dependerá de la disponibilidad y el transporte de los nutrientes necesarios a la
célula y su posterior absorción, y de que los parámetros ambientales como la temperatura, el pH y la aireación se
22
mantengan de manera óptima. La cantidad de biomasa o componente celular específico (X) en un biorreactor puede
determinarse gravimétricamente (por peso seco, peso húmedo, ADN o proteína) o numéricamente para sistemas
unicelulares (por número de células). El tiempo de duplicación (td) se refiere al período de tiempo necesario para
duplicar el peso de la biomasa, mientras que el tiempo de generación (g) se refiere al período necesario para duplicar
el número de células. Los tiempos de duplicación promedio aumentan con el aumento del tamaño de celda (Tabla
4.4) y la complejidad, p. Ej. Bacterias 0,25-1 h; levadura 1 a 2 h; hongos de moho 2-6,5 h; células vegetales de 20 a
70 h; y células de mamífero entre 20 y 48 h. Ahora es posible desarrollar ecuaciones matemáticas para describir las
características esenciales del crecimiento de organismos en biorreactores. La ecuación matemática original descrita
por Monod (1942) da un crecimiento específico (µ) en función de la concentración (S): µ = µmáx S Ks + SS es la
concentración de un sustrato en el medio, que está en concentración límite cuando está en En comparación con
otros nutrientes esenciales, µmax es la tasa máxima de crecimiento específico del organismo, mientras que Ks
representa una constante de saturación. Ks es la concentración de sustrato a la cual µ = µmax / 2. El crecimiento
exponencial se producirá a tasas de crecimiento específicas que tengan cualquier valor entre cero y µmáx si la
concentración de sustrato se puede mantener constante en el valor apropiado, un factor que será importante para
el cultivo continuo. Los nutrientes esenciales para el crecimiento junto con las condiciones óptimas necesarias para
el crecimiento se han identificado en sistemas de biorreactores continuos y discontinuos. La tasa de aumento de la
concentración de organismos (dx / dt) es la tasa de crecimiento, mientras que la tasa de crecimiento específica es la
tasa de aumento / unidad de concentración de organismos (1 / x) (dx / dt). Existe una relación simple entre el
crecimiento y la utilización del sustrato. En sistemas simples la tasa de crecimiento es una fracción constante Y
de la tasa de utilización del sustrato: dx dt = −Y ds dt (1) Y es la constante de rendimiento y durante
cualquier período finito de crecimiento: Y = peso de las células formadas peso del sustrato usado (2)
Sabiendo los valores de las tres constantes de crecimiento µmax, Ks e Y, las ecuaciones (1) y (2) pueden
dar una descripción cuantitativa completa del ciclo de crecimiento de un cultivo discontinuo. En la práctica
normal, un organismo rara vez tendrá las condiciones ideales para un crecimiento ilimitado; más bien, el
crecimiento dependerá de un factor limitante, por ejemplo, un nutriente esencial. A medida que
desciende la concentración de este factor, también disminuirá el potencial de crecimiento del organismo.
En los procesos biotecnológicos hay tres formas principales de cultivar microorganismos en el biorreactor:
discontinuo, alimentado por lotes o continuo. Dentro del biorreactor, las reacciones pueden ocurrir con
cultivos estáticos o agitados, en presencia o ausencia de oxígeno, y en condiciones líquidas o de baja
humedad (por ejemplo, en sustratos sólidos). Los microorganismos pueden estar libres o adherirse a
superficies por inmovilización o adherencia natural. En un cultivo discontinuo, los microorganismos se
inoculan en un volumen fijo de medio y, a medida que tiene lugar el crecimiento, se consumen los
nutrientes y se acumulan los productos del crecimiento (biomasa, metabolitos). El entorno de nutrientes
dentro del biorreactor cambia continuamente y, por lo tanto, a su vez, impone cambios en el metabolismo
celular. Finalmente, la multiplicación celular cesa debido al agotamiento o limitación de los nutrientes y
la acumulación de productos de desecho tóxicos excretados. La naturaleza compleja del crecimiento por
lotes de microorganismos se muestra en la Fig. 4.2. La fase de retraso inicial es un momento en el que no
hay crecimiento aparente, pero los análisis bioquímicos reales muestran un recambio metabólico que
indica que las células están en proceso de adaptarse a las condiciones ambientales y que finalmente
comenzará un nuevo crecimiento. Luego hay una fase de aceleración transitoria a medida que el inóculo
comienza a crecer para ser seguido rápidamente por la fase exponencial. En la fase exponencial, el
crecimiento microbiano procede a la velocidad máxima posible para ese organismo con nutrientes en
exceso, parámetros ambientales ideales e inhibidores del crecimiento ausente. Sin embargo, en cultivos
por lotes el crecimiento exponencial es de duración limitada y, a medida que cambian las condiciones de
los nutrientes, la tasa de crecimiento disminuye entrando en la fase de desaceleración para ser seguida
por la fase estacionaria cuando ya no se puede obtener el crecimiento general debido al agotamiento de
los nutrientes. La fase final del ciclo es la fase de muerte cuando el crecimiento ha cesado. La mayoría de
los procesos biotecnológicos por lotes se detienen antes de esta etapa debido a la disminución del
metabolismo y la lisis celular. En el uso industrial, el cultivo por lotes se ha operado para optimizar la
producción de organismos o biomasa y luego permitir que el organismo realice transformaciones
bioquímicas específicas, como la formación de productos finales (por ejemplo, aminoácidos, enzimas) o
23
la descomposición de sustancias (tratamiento de aguas residuales, biorremediación). Muchos productos

importantes, como los antibióticos, se forman de manera óptima durante la fase estacionaria del ciclo de
crecimiento en el cultivo por lotes. Sin embargo, existen medios para prolongar la vida de un cultivo
discontinuo y así aumentar el rendimiento mediante varios métodos de alimentación del sustrato: (1)
mediante la adición gradual de componentes concentrados del nutriente, p. Ej. carbohidratos,
aumentando así el volumen del cultivo (lote alimentado) - utilizado para la producción industrial de
levadura de panadería (2) mediante la adición de medio al cultivo (perfusión) y la extracción de un
volumen igual de medio libre de células usado - utilizado en mamíferos cultivos celulares. En contraste
con las condiciones por lotes, la práctica del cultivo continuo proporciona un crecimiento casi equilibrado
con poca fluctuación de nutrientes, metabolitos o número de células o biomasa. Esta práctica depende
de que el medio fresco ingrese a un sistema por lotes en la fase exponencial de crecimiento con la
correspondiente extracción de medio más células. Los métodos continuos de cultivo permitirán que los
organismos crezcan en condiciones de estado estacionario (invariables), en las que el crecimiento se
produce a un ritmo constante y en un entorno constante. En un sistema de cultivo continuo
completamente mezclado, el medio estéril se pasa al biorreactor (Fig. 4.3) a una velocidad de flujo
constante y el caldo de cultivo (medio, productos de desecho y organismos) sale de él a la misma velocidad
manteniendo el volumen del cultivo total en la constante del biorreactor. Factores como el pH y las
concentraciones de nutrientes y productos metabólicos, que inevitablemente cambian durante el cultivo
por lotes, pueden mantenerse casi constantes en cultivos continuos. En la práctica industrial, los sistemas
de funcionamiento continuo son
Tabla 4.5 Ventajas de las técnicas de cultivo por lotes y por lotes alimentados en la industria
1. Los productos pueden requerirse solo en cantidades relativamente pequeñas en un momento dado.
2. Las necesidades del mercado pueden ser intermitentes.
3. La vida útil de ciertos productos es corta.
4. Se requiere una alta concentración de producto en el caldo para optimizar las operaciones de procesamiento
posteriores.
5. Algunos productos metabólicos se producen solo durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento.
6. La inestabilidad de algunas cepas de producción requiere su renovación regular.
7. Los procesos continuos pueden presentar muchas dificultades técnicas
de uso limitado e incluyen solo proteínas unicelulares (SCP) y producciones de etanol y algunas formas de
procesos de tratamiento de aguas residuales. Sin embargo, por muchas razones (Tabla 4.5), los sistemas
de cultivo por lotes representan la forma dominante de uso industrial. La gama completa de métodos de
cultivo de microorganismos se muestra en la Tabla 4.6. Genética microbiana aplicada Un aspecto esencial
de la biotecnología microbiana tiene que ver con la obtención de cepas nuevas y mejoradas de
24
microorganismos productores. Esto implicará la selección de microorganismos de fuentes naturales, de

colecciones de cultivos y otras organizaciones, o mediante un mayor desarrollo de cepas "internas" de la
empresa. Se encuentra disponible una amplia gama de técnicas para modificar, eliminar o agregar al
complemento genético de un organismo. Las actividades de selección y cribado siguen siendo una parte
importante de los programas biotecnológicos. El cribado es el uso de procedimientos que permiten la
detección y aislamiento de solo aquellos microorganismos o metabolitos de interés entre una gran
población. Los microorganismos productores deben conservarse con una mínima degeneración de las
cualidades genéticas, y normalmente se conservan en medio de agar, mediante reducción del
metabolismo, secado, liofilización o temperaturas ultrabajas. Los genomas pueden modificarse mediante
mutagénesis o mediante varios tipos de hibridación. Los programas mutacionales están dirigidos
principalmente a la mejora de la cepa, y los mutágenos disponibles incluyen radiación ultravioleta e
ionizante y una amplia gama de mutágenos químicos. La hibridación entre microorganismos es
esencialmente un procedimiento que facilita la recombinación de material genético entre
microorganismos y puede expresarse por mecanismos sexuales y parasexuales. Se han utilizado técnicas
de fusión de protoplastos con muchas células microbianas, así como con células vegetales y animales. Las
velocidades de fusión pueden aumentarse en gran medida mediante el polietilenglicol fusógeno. Las
tecnologías de ADN recombinante permiten el aislamiento, la purificación y la amplificación selectiva en
células hospedadoras específicas de fragmentos discretos de ADN o genes de casi cualquier organismo.
La tecnología básica se describe en otra parte. Las bacterias y hongos recombinantes se utilizan
ampliamente en determinadas producciones de enzimas industriales, mientras que las líneas celulares de
mamíferos se utilizan cada vez más para la producción de proteínas recombinantes. Las manipulaciones
de genes ahora se utilizan ampliamente para (a) mejorar el rendimiento y la calidad de biomoléculas
existentes (por ejemplo, metabolitos, proteínas), (b) mejorar las características de productos existentes
mediante ingeniería de proteínas y (c) alterar las vías de síntesis de productos existentes.
4.3 El biorreactor
Los biorreactores son los vehículos de contención de cualquier proceso de producción basado en
biotecnología, ya sea para elaboración de cerveza, orgánicos o aminoácidos, antibióticos, enzimas,
vacunas o para biorremediación. Para cada proceso biotecnológico se debe diseñar el sistema de
contención más adecuado para proporcionar el entorno adecuado para optimizar el crecimiento y la
actividad metabólica del biocatalizador. Los biorreactores van desde simples recipientes abiertos,
agitados o sin agitar, hasta complejos sistemas asépticos integrados que implican diversos niveles de
control informático avanzado (Fig. 4.4). Los biorreactores se presentan en dos tipos distintos (Fig. 4.4). En
el primer caso, son principalmente sistemas no asépticos donde no es absolutamente esencial operar con
cultivos completamente puros, p. Ej. Elaboración de cerveza, sistemas de eliminación de efluentes;
mientras que en el segundo tipo, las condiciones asépticas son un requisito previo para la formación
exitosa del producto, p. antibióticos, vitaminas, polisacáridos y proteínas recombinantes. Este tipo de
proceso implica desafíos considerables por parte de la ingeniería de construcción y operación. La forma
física de muchos de los biorreactores más utilizados no ha cambiado mucho durante los últimos cuarenta
años; sin embargo, en los últimos años, formas novedosas.
9 Capítulo de fermentaciones Industriales. Pp 19-22 No sé de qué libro

Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluación del producto. En
estos casos es más adecuado realizar las experiencias en erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien
demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en tubos o pequeños frascos son
menos confiables. A veces es posible el diseño de un procedimiento simple de "screening" selectivo para
un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, células no mutadas que mueren en un plaqueo por selección
de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un esfuerzo
mínimo aún de poblaciones donde la tasa de mutación es menor a 1 x 106 . Cuando se comparan los
incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del
25
empleo de un agente tal como la luz ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el
mencionado los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mutación.
2. Mutación inducida. El procedimiento de mutación mediante el empleo de un agente determinado
implica dos etapas, el tratamiento de la población con el mutágeno elegido y luego el aislamiento de los
mutantes para su posterior ensayo y selección. Empíricamente el empleo de diferentes agentes resulta
en el aislamiento de distintos "espectros" de mutantes. La elección de un agente mutagénico depende en
general de consideraciones prácticas. En algunos de los casos es más conveniente el empleo de más de
uno en lugar del uso masivo de uno solo. La técnica a emplear puede producir una alta tasa de mutación
o puede favorecer la separación de un número reducido de tipos deseables de un gran número de
productores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debería utilizar la
característica mejorada del mismo como factor de selección. El incremento de su productividad podría
ser el resultado de una modificación en los mecanismos de control que limitan el nivel de producción y/o
de una variación en los precursores que llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y
mecanismos de control de la biosíntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir en el aislamiento.
Es importante en los programas de búsqueda y selección, tener una alta proporción de mutantes entre la
población sobreviviente al tratamiento, debido a que sólo estos individuos son los estudiados. Con el
aumento de la dosis del mutágeno en general se incrementa esta proporción, aunque para cada mutágeno
y cada organismo hay una dosis óptima. Los agentes mutagónicos pueden ser agrupados en: 1) Físicos,
como la luz ultravioleta, que es un mutágeno muy conveniente. La longitud de onda puede variar de 200
a 300 nm y el tiempo de exposición entre 0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo
y tratando de lograr un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X y rayos v
son actualmente poco utilizados. 2) Químicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de
0.05 M con exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no tóxicos, el grado de mortandad
no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se realiza adicionando el mutágeno a una
suspensión de células, la cual es incubada a temperatura constante un determinado tiempo. Estas
manipulaciones requieren personal con experiencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entre
estos agentes se destacan los siguientes: a) Acido nitroso. Este agente induce transiciones A-T --- G-C y/o
deleciones por uniones cruzadas en el interior de la cadena. b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
Es uno de los mutágenos más potentes, produciendo una alta tasa de mutación con bajo porcentaje de
mortandad. Requiere de un manejo sumamente cuidadoso. c) Análogos de base. Producen transiciones,
como el 5-bromuracilo y la 2-aminopurina, siendo otros análogos menos efectivos. Sus modos de acción
dependen de sus incorporaciones al nuevo ADN formado y del lugar que ocupen al sustituir a la base
normal. d) Mutágenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que no son incorporados
covalentemente al ADN, sino que actúan como agentes de intercalado en la estructura, promoviendo
adiciones o deleciones simples durante la síntesis.
Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios Metabolitos primarios son aquellos
esenciales para la vida de un microorganismo como por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas,
ácidos orgánicos. Antes de considerar la selección de este tipo de mutantes, es necesario conocer los
mecanismos de control involucrados en la biosíntesis de estos metabolitos. Las concentraciones de los
mismos están reguladas por sistemas de control por retroalimentación ("feed back). Los dos principales
sistemas involucrados son inhibición y represión "feed back". En la inhibición, el producto final de una vía
metabólica inhibe la actividad de una enzima (normalmente la primera) de su vía de formación, cuándo
se ha sobrepasado un valor máximo de concentración intracelular de dicho producto (caso de biosíntesis
de aminoácidos). La primera enzima de la vía es de tipo "alostérica", lo que significa que en este caso el
producto final se une a ella en el centro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como
en la llamada inhibición competitiva), afectando la unión de la enzima al sustrato. Es un control fino y casi
instantáneo. La represión es aquella donde el producto final de una vía metabólica previene la síntesis de
una enzima o de todas las que catalizan la vía mencionada. Esto ocurre a nivel de ácido desoxirribonucleico
26
(ADN), impidiendo la transcripción del gen a ácido ribonucleico mensajero (ARNm). Este mecanismo es de
acción más lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas. Los mecanismos de
regulación son más complejos en caso de vías biosintéticas ramificadas donde los productos de cada brazo
son raramente requeridos por el organismo en igual proporción. Los procesos de control de estos son los
siguientes: a) por isoenzimas; b) concertado o multivalente; c) cooperativo; d) acumulativo; e) secuencial.
Para un conocimiento detallado de estos mecanismos de control se remite al lector a la bibliografía. Como
se ve, la concentración de un metabolito microbiano es controlada por una variedad de mecanismos. El
conocimiento de la vía metabólica y su control facilita la construcción del mutante deseado. Estos pueden
tener distintas modificaciones: a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o represor; b) no se
produce producto final, que es el que controla la enzima clave de la vía metabólica; c) el producto final es
eliminado de la célula debido a una modificación en la permeabilidad de la membrana celular. Los
mutantes que no producen inhibidores o represores por producto final pueden ser empleados para la
producción de intermediarios en caminos no ramificados, o de intermediarios y productos finales en
caminos ramificados. Al no producirse el producto final de la ruta, el control de la misma es eliminado,
pero como estos productos son esenciales para el crecimiento, los mismos se deben incorporar al medio
en concentraciones tales que permitan el desarrollo, pero que no ejerzan el control normal por inhibición
o represión. En este caso los mutantes son auxotróficos para uno o más productos finales. El aislamiento
dé estos mutantes puede resultar en la obtención de un cepa altamente productora, si la mutación ocurre
en el sitio correcto. La selección de auxótrofos se puede realizar empleando técnicas de enriquecimiento
o mediante la identificación visual de mutantes. Por ejemplo, la separación mecánica de esporos
auxótrofos y prototróficos de organismos filamentosos ha sido alcanzada por el método de
"enriquecimiento por filtración". Se ha aplicado a Aspergillus, Neurospora, etc... El procedimiento implica
la incubación de una suspensión de esporos mutada, en un medio líquido mínimo; los protótrofos
desarrollan en tanto que los auxótrofos no. La suspensión es luego filtrada a través de un filtro adecuado,
obteniéndose un filtrado enriquecido en auxótrofos, debido a que los esporos germinados por su mayor
tamaño son retenidos en el filtro. Si bien los mutantes auxotróficos se utilizan para producir grandes
cantidades de muchas sustancias de interés, los mismos no son adecuados para la obtención de productos
que controlan independientemente su síntesis. Un caso típico es el que figura a continuación, donde se
sintetiza un producto P. Las letras minúsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso. En este
caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxótrofo. La solución es modificar el
organismo de tal forma que la primer enzima (a) no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El
aislamiento de tales mutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos análogos
y/o de revertantes. Los metabolitos análogos (compuestos similares a otros en su estructura) han
ampliado el rango de inhibidores para los cuales se obtienen mutantes resistentes. En el ejemplo de la vía
metabólica anteriormente presentado si P* es un análogo tóxico de P, un mutante puede ser aislado en
presencia de P* si por ejemplo, la primera enzima de la vía no es suceptible a la inhibición por el análogo.
Esta enzima también podría ser resistente al efecto de control de P, por lo cual habría una producción no
inhibida. Para el aislamiento de este tipo de mutantes se puede emplear la técnica de gradiente en placa,
en la cual existe una variación en la concentración del análogo en un sentido de la placa, presentando la
misma, zonas de escaso crecimiento por altos niveles del análogo tóxico desde donde es posible aislar los
mutantes resistentes. Estos deberán ser posteriormente estudiados en relación a la producción de P. Otra
posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es el empleo de revertantes. En este
caso un mutante auxotrófico para P (no produce la enzima "a") es sometido a una segunda mutación con
el objeto de obtener revertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima "a"
producida no reconoce en control de P).
27
Mutantes resistentes a análogos de aminoácidos han sido empleados en procesos de mejoramiento de

cepas, para la obtención de antibióticos. El mejor ejemplo de mutantes modificados en la permeabilidad
es el caso de la fermentación de ácido glutámico. Se ha aislado un mutante de Corynebacterium
glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de biotina. O sea la permeabilidad
celular es controlada por la composición del medio de cultivo; de esta forma el organismo puede excretar
glutamato (50 g l -1) con bajas concentraciones de biotina (5 ug l-1). Esto sugiere la posibilidad de
modificar genéticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad.
Mutantes productores de enzimas de interés industrial Solamente se tendrán en cuenta las enzimas
degradativas, cuya producción puede ser controlada por inducción, represión "feed back" y/o represión
catabólica. Las técnicas de mutación en este caso pretenden alterar los mecanismos de control para
obtener mutantes que puedan producir enzimas en ausencia de inductor y aún en presencia de
represores. Las mutaciones pueden tener lugar en un gen regulador, eliminando la producción de un
represor activo, o si se producen en el operador, se podría evitar la unión del represor. Los mutantes que
producen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes constitutivos. Los mismos
pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en el cual el sustrato inductor esté en concentraciones
limitantes, lo cual favorece el desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la población inducible;
empleando inductores débiles o utilizando ciclos con y sin inductor, tratando de favorecer el
enriquecimiento en la población del mutante constitutivo, ya que al transferir a un medio con inductor el
tipo inducible requiere un tiempo de inducción que no lo requiere el constitutivo. Para la selección de
mutantes resistentes a la represión catabólica pueden aprovecharse las posibilidades del sistema
continuo empleando un medio de cultivo con el sustrato de la enzima y el represor catabólico. En estas
condiciones el organismo capaz de emplear ambos sustratos tendría una ventaja competitiva y podría ser
seleccionado a una determinada velocidad de dilución.
Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundarios Metabolitos secundarios son

sustancias no imprescindibles para las funciones vitales como por ejemplo alcaloides, toxinas,
antibióticos, giberelinas, etc. La relación entre metabolito primario y secundario presenta todavía
numerosos interrogantes con relación a los mecanismos que controlan la síntesis de estos últimos. Se
deben hacer algunas consideraciones, ya que en ciertas fermentaciones de antibióticos la velocidad de
crecimiento regula la formación de enzimas biosintéticas. En el caso de la gramicidina S (GS), las GS
sintetasas se forman en la última parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas después de
alcanzar un pico en sus actividades específicas desaparecen rápidamente al entrar la población en fase
estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo continuo permitieron establecer una relación
inversa entre la velocidad específica de crecimiento y la producción de sintetasa. Si bien el mecanismo no
es conocido, se estableció que los picos de actividad específica en función de u varían de acuerdo a la
naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y P). Otro factor del proceso de control es la
regulación "feed back" lo que significa que la acumulación de metabolitos secundarios (penicilina,
cloranfenicol, cicloheximida, cte.) es lo que limita su propia síntesis. En el caso de caminos ramificados
10 Capítulo 5. Biotecnología. Pp 73-74 ya
Tecnología enzimática
5.1 La naturaleza de las enzimas
Las enzimas son proteínas globulares complejas presentes en las células vivas donde actúan como catalizadores que
facilitan los cambios químicos en las sustancias. En 1878 Kuhne introdujo el término "enzima" del griego "enzumos",
que se refiere a la levadura del pan. Con el desarrollo de la ciencia de la bioquímica se ha logrado una comprensión
más completa de la amplia gama de enzimas presentes en las células vivas y de sus modos de acción. Sin enzimas no
puede haber vida. Aunque las enzimas solo se forman en células vivas, muchas pueden extraerse o separarse de las
células y pueden continuar funcionando in vitro. Esta capacidad única de las enzimas para realizar sus
transformaciones químicas específicas de forma aislada ha llevado a un uso cada vez mayor de enzimas en procesos
industriales y alimentarios, biorremediación y en medicina, y su producción se denomina colectivamente tecnología
28
enzimática. La actividad de una enzima se debe a su naturaleza catalítica. Una enzima lleva a cabo su actividad sin
ser consumida en la reacción, mientras que la reacción ocurre a una velocidad mucho mayor cuando la enzima está
presente. Las enzimas son muy específicas y funcionan solo en determinados tipos de compuestos, los sustratos.
Una pequeña cantidad de enzima puede reaccionar con una gran cantidad de sustrato. La función catalítica de la
enzima se debe no solo a su estructura molecular primaria, sino también a la intrincada configuración de plegado de
toda la molécula de enzima. Es esta configuración la que confiere a la proteína su función catalítica específica; alterar
la configuración por, por ejemplo, un cambio en el pH o la temperatura, puede resultar en la pérdida de la actividad.
Para algunas enzimas existe una necesidad obligatoria de factores adicionales, denominados cofactores, que pueden
ser iones metálicos, nucleótidos, etc. Debido a su especificidad, las enzimas pueden diferenciar entre sustancias
químicas con estructuras estrechamente relacionadas y pueden catalizar reacciones en un amplio rango de
temperaturas. (0–110 ° C) y en el rango de pH 2–14. En la aplicación industrial, esto puede resultar en productos de
alta calidad, menos subproductos y procedimientos de purificación más simples. Además, las enzimas no son tóxicas
y biodegradables (un atractivo tema "verde") y pueden producirse especialmente a partir de microorganismos en
grandes cantidades sin la necesidad de equipos especiales resistentes a los productos químicos.
La tecnología enzimática abarca la producción, el aislamiento, la purificación y el uso en forma soluble o inmovilizada.
Las enzimas producidas comercialmente contribuirán sin duda a la solución de algunos de los problemas más vitales
a los que se enfrenta la sociedad moderna, p. Ej. Producción de alimentos, escasez y conservación de energía, mejora
del medio ambiente, junto con numerosas aplicaciones médicas. Esta nueva tecnología tiene su origen en la
bioquímica, pero se ha basado en gran medida en la microbiología, la química y la ingeniería de procesos para
alcanzar el estado actual de la ciencia. En el futuro, la tecnología enzimática y la ingeniería genética serán dos áreas
de estudio muy relacionadas que se ocupan de la aplicación de genes y de sus productos. Juntas, estas ciencias
intentarán explotar creativamente el flujo continuo de descubrimientos realizados por genetistas moleculares y
enzimólogos. Se estima que el mercado mundial de enzimas supera los 2.000 millones de dólares estadounidenses
y se duplicará durante la próxima década. La producción y utilización de enzimas es una de las áreas más exitosas de
la biotecnología moderna y ha aumentado en c. 12% anual durante los últimos diez años. En la actualidad, hay más
de 400 empresas en todo el mundo involucradas en la producción de enzimas, dominando las empresas europeas
(60%) y Estados Unidos y Japón con el 30%. La distribución de enzimas a granel en varias industrias se muestra en la
Tabla 5.1, y la producción de enzimas a granel específicas se muestra en la Tabla 5.2.
11 Capítulo 6. Biotecnología. pp 105-108. ya
Generación de combustible biológico

6.6 Metano
El gas metano puede usarse para la generación de energía mecánica, eléctrica y térmica, y ahora se usa ampliamente
como fuente de combustible para fines domésticos e industriales a través de gasoductos nacionales o puede
convertirse en metanol y usarse como combustible en motores de combustión interna. Estas fuentes de gas natural
se derivaron originalmente de la biomasa en la antigüedad. El gas metano también existe en la atmósfera y se deriva
principalmente de la acción microbiana en humedales naturales, arrozales y fermentación entérica en animales,
contribuyendo aproximadamente con 20%, 20% y 15% respectivamente al flujo total de metano. El ganado
doméstico es el principal contribuyente al producir alrededor del 75% de todas las emisiones animales, mientras que
los humanos producen alrededor del 0,4%. Después del dióxido de carbono, el metano se considera el siguiente gas
de efecto invernadero más importante y se espera que contribuya con el 18% del calentamiento futuro. La
29
microbiología de la producción de metano es compleja (Fig. 6.4) e involucra mezclas de microorganismos

anaeróbicos. En principio, se cree que la fermentación anaeróbica de mezclas orgánicas complejas pasa por tres
fases bioquímicas principales, cada una de las cuales requiere parámetros microbiológicos específicos. La etapa
inicial requiere la solubilización de moléculas complejas como celulosa, grasas y proteínas, que constituyen la mayor
parte de la materia orgánica cruda. Los productos de bajo peso molecular, solubles resultantes de esta etapa se
convierten luego en ácidos orgánicos; en la fase final de la actividad microbiana, estos ácidos (principalmente
acético) son descompuestos específicamente por las bacterias metanogénicas en metano y dióxido de carbono. El
sistema de producción de metano más eficiente y complejo de la naturaleza es el rumen. Este sistema anaeróbico
nunca se ha reproducido completamente fuera de la vaca y se sabe que es una interacción compleja de un gran
número de bacterias, protozoos y hongos. Todos los programas de biorreactores intensamente estudiados y
establecidos para crear metano en condiciones controladas han demostrado que las altas producciones de gas
constantes requieren un monitoreo de laboratorio sustancial con un control altamente preciso de las variables
ambientales como la temperatura, el pH, el nivel de humedad, la agitación y la entrada y el equilibrio de materia
prima. Hasta la fecha, la mayoría de las aplicaciones prácticas de la metanogénesis se han realizado a un nivel
tecnológico muy bajo. Hay varias formas posibles de producir metano en una economía planificada: a partir de aguas
residuales, de desechos agrícolas y urbanos y en reactores de biogás. La digestión anaeróbica de las aguas residuales
es una técnica que se practica desde hace mucho tiempo y muchos sistemas municipales han ideado métodos para
capturar el metano y aprovechar la energía para las necesidades de la planta de aguas residuales. Los retornos
energéticos son modestos y no parece probable una expansión a gran escala. En los últimos años, la metanogénesis
de los desechos agrícolas y urbanos abundantemente disponibles ha aparecido como una forma obvia y rentable de
generar energía. Las consideraciones energéticas de la producción de metano a partir de tales desechos son
complejas y están sujetas a muchas limitaciones. El uso de desechos urbanos debería ser posible convertir del 30 al
50% de la energía combustible en metano, mientras que con el uso de ciertos otros materiales vegetales o forrajes
puede ser posible lograr un 70% de conversión. La economía general de la producción de metano debe reconocer
los valiosos subproductos generados por el proceso, a saber, el efluente y el residuo rico en amoníaco, fosfatos y
células microbianas, que pueden usarse como fertilizante, acondicionador del suelo o incluso como alimento para
animales. Además, el proceso puede convertir desechos malolientes y patógenos en materiales inocuos y útiles. Sin
embargo, todavía hay muchos problemas inherentes que deben superarse antes de que pueda haber alguna
esperanza de lograr un equilibrio energético. En la actualidad, el costo de la recolección de materia orgánica solo
con fines de metanogénesis es demasiado elevado; la tasa de producción de metano es inconsistente y baja en la
mayoría de los procesos, y es necesario realizar mucha investigación sobre el equilibrio de nutrientes para la
optimización del proceso. Sin embargo, el principal problema es la presencia de lignina en la mayoría de los desechos
agrícolas y urbanos. Las ligninas no se digieren fácilmente mediante procesos anaeróbicos, y el pretratamiento físico
y químico supone una carga considerable de energía y costes para el proceso global. Cuando el metano se produce
mediante la fermentación de excrementos de animales, los productos gaseosos se suelen denominar biogás y las
instalaciones se denominan plantas de biogás o biorreactores. El biogás es una mezcla inflamable de 50 a 80% de
metano, 15 a 45% de dióxido de carbono, 5% de agua y algunos gases traza. El biogás se produce mediante
biometanización (Fig. 6.4) y, de hecho, es un proceso microbiano simbiótico autorregulador que opera en
condiciones anaeróbicas y funciona mejor a temperaturas de alrededor de 30 ° C. Todos los organismos involucrados
se encuentran naturalmente en los abonos de rumiantes. En tales sistemas, el estiércol animal se mezcla con agua y
se deja fermentar en condiciones casi anaeróbicas. La producción de biogás mediante tales métodos se remonta a
la antigüedad y es de particular importancia en India, China y Pakistán. El sistema Gobar de producción de biogás en
el Lejano Oriente abarca desde pequeños sistemas campesinos hasta plantas bastante grandes que producen
continuamente grandes volúmenes de gas. En términos de energía, el sistema Gobar simple está muy cerca de ser
un productor neto de energía a pequeña escala. En todo el mundo se encuentran en funcionamiento plantas en
pequeña escala del tamaño de una familia, una granja o una aldea. En condiciones ideales, 10 kg de materia orgánica
seca pueden producir 3 m3 de biogás, lo que proporcionará 3 h de cocción, 3 h de iluminación o 24 h de refrigeración
con el equipo adecuado. De hecho, el biogás proporciona una parte considerable de la fuente de energía del mundo;
China es el mayor usuario con más de 7 millones de unidades de biogás que proporcionan la energía equivalente a
22 millones de toneladas de carbón y, con los subsidios actuales, una planta de biogás en China es más barata que
una bicicleta. Los sistemas más grandes de este tipo no logran un balance energético neto. La combustión de biogás
se ha utilizado para calentar vapor para impulsar turbinas eléctricas y en California, EE. UU., Una planta proporciona
electricidad a 20 000 hogares mediante biometanización de estiércol de vaca. También se ha considerado la
posibilidad de cultivar a gran escala para proporcionar una "economía del metano". Se han propuesto cultivos de
30
alto rendimiento en términos de megajulios por hectárea cultivados en grandes extensiones de tierra o agua. Se ha
sugerido que el 65% del consumo actual de gas en los Estados Unidos podría ser proporcionado por una plantación
energética de un área de 260 000 km2 utilizando jacinto de agua con un contenido energético de 3,8 MJ por kg de
material seco. Las algas marinas también han sido objeto de un escrutinio especial. El metano generado a partir de
materiales orgánicos por fermentación anaeróbica ofrece una valiosa fuente de energía que podría utilizarse
directamente para muchos usos. Además, los subproductos asociados pueden ser formas útiles de fertilizantes para
la agricultura. Sin embargo, antes de que se pueda lograr la plena realización de estos sistemas, se deben emprender
estudios biotecnológicos muy importantes. Los aspectos biológicos giran en torno a cultivos mixtos complejos y es
dudoso que se pueda mejorar la eficiencia termodinámica de la fermentación. Por tanto, se debe hacer hincapié en
la mejora del diseño de procesos y en las mejoras tecnológicas de los sistemas de control. Se necesitarán materiales
de construcción nuevos y baratos para digestores (biorreactores) y recipientes de almacenamiento de gas. Con el
tiempo, estará disponible una gama completa de tecnologías anaeróbicas para hacer frente a la mayoría de los tipos
de materiales biodegradables. Aunque el metano será el principal producto final, los combustibles como el propanol
y el butanol, así como los fertilizantes, sin duda aumentarán la rentabilidad del proceso general. El metano como
fuente de energía bien puede tener un valor económico en los niveles de producción local a pequeña escala, pero
existen considerables dudas sobre el futuro de los procesos comerciales a gran escala para la producción de metano.
Algunas de las consideraciones más obvias se muestran en la Tabla 6.3. Sin embargo, la digestión anaeróbica de
desechos municipales, industriales y agrícolas puede tener un valor ambiental positivo, ya que puede combinar la
eliminación y estabilización de desechos con la formación neta de combustible (biogás). Los residuos sólidos o
líquidos pueden usarse además como fertilizante, acondicionador del suelo o alimento para animales. La producción
de biogás seguirá teniendo una alta prioridad en la investigación de energías alternativas.
Tabla 6.3 Argumentos económicos contra la producción de metanol a gran escala mediante procesos microbianos
1. Se produce una abundancia de metano en la naturaleza, particularmente en los campos de gas natural y las superposiciones
de campos de OI.
2. La producción de metano por gasificación de carbón es comercialmente más atractiva.
3. La producción microbiana de metano es más cara que la del gas natural.
4. Los costos de almacenamiento, transporte y distribución de combustibles gaseosos aún no son económicamente rentables.
5. El metano no se puede usar en automóviles y es difícil y costoso convertirlo al estado líquido.
6.7 Hidrógeno
Se ha considerado el uso de hidrógeno como combustible o en pilas de combustible para la producción de
electricidad. La producción de hidrógeno puede ocurrir por medio de bacterias fotosintéticas, biofotólisis del agua y
por fermentación. En los dos primeros sistemas, se ha logrado fomentar la producción de hidrógeno, pero se necesita
mucha investigación para evaluar la importancia de estos métodos a un nivel aplicado. Se ha estimado que se
necesitan al menos 20 a 30 años de investigación antes de obtener cualquier tipo de sistema funcional. Aunque es
posible generar hidrógeno a partir de glucosa por acción bacteriana, la tasa de producción es demasiado pequeña
para hacer económica la génesis microbiana del hidrógeno. La eficiencia de la producción de hidrógeno por
fermentación anaeróbica es mucho menor que la de la producción de metano por el mismo método. Dado que el
metano también tiene un mayor contenido energético, parecería que la producción de metano mediante procesos
microbianos tiene un potencial práctico mucho mayor que el del hidrógeno. Sin embargo, una mayor investigación
bien puede alterar estas consideraciones. El biohidrógeno requiere la invención de un medio de almacenamiento
práctico y económico, sin mencionar una gran mejora en la eficacia de la tecnología actual de pilas de combustible.
Además, la mayoría de las máquinas y los sistemas de transporte del mundo no se construyeron para combustibles
31
como el hidrógeno y el metano. Todavía no se utiliza ningún proceso de biohidrógeno a escala comercial, aunque se
están desarrollando algunos procesos prometedores. Se están poniendo muchas esperanzas en una bacteria
fotosintética, Rhodopseudomonas palustris, que puede producir esto sin ningún aporte de energía.
6.8 El camino a seguir para los biocombustibles

Las necesidades energéticas mundiales en la actualidad están dominadas por la adaptabilidad continua de los
combustibles fósiles, los mismos combustibles fósiles que ahora nos damos cuenta de que están causando daños
continuos y permanentes a los climas del mundo. La capacidad de los biocombustibles para ingresar de manera
realista al mercado de la energía estará determinada por varios factores: (a) la disponibilidad de la cadena energética
existente para los biocombustibles; (b) la resistencia a la adopción de biocombustibles por parte de la gestión
energética actual; (c) la capacidad de reducir los costos de los biocombustibles; y (d) la modernización de la cadena
de suministro de energía existente para adaptarse a los biocombustibles. La entrada de los biocombustibles al actual
sistema de suministro de energía será lenta y gradual, pero el mundo debe iniciar el lento proceso de destete de la
dependencia total de los combustibles fósiles. Si bien seguirá habiendo una confusión arraigada, política, industrial
y comercial, que puede dificultar la gestión óptima de la crisis de la situación energética global, también hay algunos
indicadores positivos provenientes de compañías energéticas establecidas de renombre mundial, por ejemplo BP.
BP planea establecer un laboratorio de investigación de energía biociencia dedicado que se adjuntará a un
importante centro académico de EE. UU. Y gastará 500 millones de dólares durante los próximos diez años. Se
explorarán tres aspectos de la biociencia energética: (1) desarrollar nuevos componentes de biocombustible y
mejorar la eficiencia y flexibilidad de los que actualmente se mezclan con combustibles de transporte (2) diseñar
nuevas tecnologías para mejorar y acelerar la conversión de materia orgánica en moléculas de biocombustible, con
la objetivo de aumentar la proporción de un cultivo que se puede utilizar para producir materia prima (3) utilizando
la ciencia vegetal moderna para desarrollar especies que produzcan un mayor rendimiento de moléculas de energía
y puedan cultivarse en tierras no aptas para la producción de alimentos. También respaldarán la necesidad de que
los nuevos biocombustibles se mezclen con los combustibles de transporte tradicionales basados en fósiles. La
industria de los biocombustibles también obtendrá el apoyo de los fabricantes de automóviles de EE. UU., Ya que
Ford, Chrysler y General Motors han confirmado que la mitad de todos los automóviles que producen para 2010
serán "flexfuel". Debe considerarse una pregunta final: ¿cuán respetuosos con el medio ambiente son los
biocombustibles? Los defensores de los biocombustibles los consideran como alternativas ecológicas a los
combustibles fósiles,
12 Capítulo 7. Microbiología Industrial. Pp 60-72. ya

Existen una serie de factores que intervienen en la selección de los organismos y en la alteración de los
alimentos.
- Factores intrínsecos. Características físicas, químicas y biológicas del alimento.
- Condiciones medioambientales en las que se encuentra el organismo durante la
conservación.
- Los procesos industriales que se realizan con el alimento
- Las interacciones microbianas, ya sean antagonismos o sinergismos.
-
Factores intrínsecos
pH
Es determinante para el crecimiento de los organismos. En cada organismo su tolerancia oscila entre un
máximo y un mínimo, entre los cuales está el valor óptimo de crecimiento. Se ha de tener en cuenta que
al modificar uno de los factores óptimos se estarán variando también los demás. Veamos los márgenes
de crecimiento de los diferentes organismos.
Organismo Margen de pH
Hongos 0 – 11
Levaduras 1,5 – 8,8
Bacterias
32
Bacterias Gram negativas Margen muy estrecho
Patógenos Margen más estrecho
Los valores de crecimiento óptimos están hacia el 7.

Los mismos alimentos tienen características de pH adecuadas, que en muchos casos serán ácidos, para
evitar su degradación. En los vegetales es un proceso que se da mucho. En los animales puede ocurrir,
debido a la glucogenolisis, que formará glucosa, que pasará a lactato.
Una manera de conservar los alimentos es mantenerlos a pH bajo. También se pueden combinar los
cambios de pH con otros factores.
Se ha de tener en cuenta que puede existir un cierto efecto tampón, de manera que cuando un organismo
crece en un alimento, sus metabolitos pueden modificar el pH de éste.
33
Agua
El agua es otro de los factores intrínsecos. Es un elemento básico para la vida, de manera que todos los
seres vivos, incluso los microorganismos la necesitan para vivir. Es
P vapor agua en alimento
básico tener en cuenta en los alimentos lo que se conoce como
AW =
actividad de agua (AW), que es la relación del vapor de agua del
P vapor agua pura
alimento y la presión de vapor del agua pura, que es 1. La AW oscila
entre 0 y 1. Cuantos más solutos
HR = AW x 100
Organismo AW tenga el alimento, menor será su AW.
Podemos establecer una relación
Mayoría de bacterias > 0,90 inversa entre la presión osmótica del alimento y su AW. Los
microorganismos necesitan agua para poderse multiplicar.
Levaduras > 0,88 Con AW < 0,6 no podrá crecer nada, tendremos un alimento estable. Son
alimentos muy desecados o con una elevada presión osmótica. La
Mohos > 0,80 mayoría de los patógenos necesitará AW superiores a 0,9. Una excepción
es S.aureus, que puede crecer con AW de 0,86. Con menos de 0,7 de AW
Bacterias halófilas > 0,75 muy pocas cosas podrán crecer y muy concretas.
Dependiendo de las características de cada alimento tendremos unas
Mohos serófilos > 0,61 condiciones de AW. Los alimentos frescos tiene una AW de 0,98, y a partir
de aquí la AW va bajando.
Levaduras osmófilas > 0,61
El contenido acuoso crítico es el porcentaje que tiene que tener el
alimento a partir del cual sería seguro de conservar sin que se produjesen alteraciones. Este porcentaje
puede variar según las características del alimento.
El contenido acuoso de un alimento se puede regular con humectantes.
Potencial Oxido – Reducción
Se define como la facilidad con la que un sustrato gana o pierde electrones. Se da un diferencial de
potencial. Si este diferencial es positivo se oxida la sustancia. Si es negativo se reduce. Se mide en Eh.
Atendiendo a este potencial distinguimos de más Eh. a menos los siguientes tipos de microorganismos:
aerobias, microaerófilos, aeróbicos facultativos, anaerobios estrictos. En base al alimento crecerán unos
u otros organismos, pero también es importante la presencia de oxígeno en la atmósfera y su capacidad
de penetración en ésta.
Puede darse una típica secuenciación, de manera que en el alimento crezcan en primer lugar alimentos
aerobios, pero a medida que se agote el oxígeno y los componentes del alimento aparecerán otros
organismos en un caso típico de sinergismo.
Contenido de nutrientes de alimentos
Los organismos ven el alimento como un sustrato para su crecimiento, pero para que el alimento pueda
sustentar el crecimiento microbiano, deberá tener una serie de nutrientes y componentes. Los propios
alimentos determinan los organismos que crecen sobre ellos.
Sobre alimentos ricos en carbohidratos pero pobres en nitrógeno sólo podrán crecer organismos que
puedan obtener el nitrógeno de otra manera. En los productos lácteos crecen preferentemente bacterias
lácticas. Los microorganismos pueden requerir vitaminas, como las del grupo B, la B 12 concretamente, que
es muy escasa en los vegetales, de manera que en frutas y en verduras crecerán preferentemente hongos.
Sobre lípidos podrán crecer bacterias lipolíticas,...
34
Sustancias antimicrobianas presentes en los alimentos

Desempeñarán un papel importante en los procesos de invasión de los organismos de los alimentos. Sus
dianas de efecto pueden ser muy diversas, así como sus efectos. Los clasificamos en dos tipos general. Las
sustancias que matan organismos son biocidas, así como las que impiden el crecimiento son biostáticas.
En función de los organismos que afecten hablaremos de bacterio-, fungi-,...
El hecho de que sea biocida o biostática puede depender mucho de la concentración. Muchos vegetales
pueden tener sustancia antimicrobiana, aunque también las podemos encontrar en los animales. Algunos
ejemplos de sustancias con efecto antimicrobiano son inmunoglobulinas, caseína, ya que la caseína y
algunos ácidos grasos libres pueden tener efectos antimicrobianos en determinadas condiciones,
lactoferina y el lisozima, presente en huevos y leche.
Para el consumidor pueden ser más deseables los alimentos a los que no se les añadan conservantes. Por
lo tanto, lo que se hace en muchos casos, es añadir condimentos, como pimienta, orégano, aceites
esenciales y otros, que tienen valor conservante. Actualmente existe un gran interés en el desarrollo de
los conservantes naturales.
Las sustancias antimicrobianas están presentes en los alimentos, aunque es posible que no sea así cuando
están frescos, sino que aparezcan en el proceso de conservación.
Estructuras
Muchos alimentos tienen envueltas naturales que los organismos deben sobrepasar para alterarlos. Es
mucho más fácil para un organismo alterar un alimento que haya visto alterada su estructura. Por lo tanto,
si no alteramos su estructura el alimento será más seguro. Existen algunos alimentos más seguros por su
estructura. En el caso de la margarina, que es una suspensión de microgotas de lípidos en agua, es difícil
que se altere, porque en cada gota no hay nitrógeno suficiente para que se multiplique el organismo, por
lo que la margarina será más o menos estable.
Factores extrínsecos
Son los factores de la conservación de los alimentos. Son 3 típicamente T, HR y atmósfera de conservación.
Temperatura
Siempre será un factor a tener en cuenta para la Organismos T. Mínima T. Óptima T. Máxima
conservación de los alimentos. El margen de
crecimiento de los microorganismos es muy Psicrófilos -15 10 – 15 18 – 20
amplio, va de –34 a 90º C. La tabla que se presenta
a la derecha indica las temperaturas de cada Psicrótrofos -5 20 – 30 35 – 40
organismo, en condiciones óptimas de los demás
factores. Mesófilos 5 – 10 30 – 37 45
Se ha de tener en cuenta que incluso en la nevera
podrían crecer los dos primeros tipos de Termótrofos 15 42 – 46 50
organismos. Normalmente se multiplican sólo los
organismos alterantes, pero existen algunos Termófilos 25 - 42 50 – 80 60 – 85
patógenos capaces de multiplicarse en frío, como serían Salmonella, Vibrio o Yersinia. De hecho existen
organismos capaces de crecer incluso en el congelador, como los psicrófilos. Los organismos dejan de
multiplicarse debido a su necesidad de agua, ya que en condiciones de frío el agua es menos biodisponible,
siendo su AW menor a 0,86.
Si congelamos los alimentos entre –18 y –20º C, estaremos seguros que no se produce crecimiento de los
organismos, pero se podrá producir actividad enzimática. Para estar seguros que no se produce ninguna
alteración, deberemos realizar ultracongelación, a menos de –40º C. Otro factor que se ha de tener en
cuenta son los termótrofos, en los alimentos que se venden calientes.
35
Humedad relativa
Es de sumo interés, ya que como ya hemos dicho, la actividad del agua es la base. La HR se equilibrará con
el agua del alimento, o como mínimo tiende a ello. Será útil entonces usar humidificadores o desecadores
para regular el contenido de agua de la atmósfera. Además para evitar que se equilibre, otra opción es la
de usar envoltorios alrededor del alimento, haciendo que éste tenga una atmósfera aislada.
Atmósfera
La atmósfera a la que se encuentra un organismo es básica para su conservación, sobre todo a nivel de la
presión parcial de oxígeno y su capacidad de difusión.
Se observó que había algunos gases que parecían tener funciones inhibidoras del crecimiento de las
bacterias. Puede ser de utilidad añadir hielo seco, dióxido de carbono sólido, para conservar los alimentos,
como las frutas. Una atmósfera rica en CO2 inhibirá el crecimiento de algunas bacterias, pero también
beneficiará el crecimiento de otras.
Controlando la atmósfera del alimento podemos alargar su vida útil, pero sin alterarlo. Además se ha de
tener en cuenta que un alimento fresco es siempre más caro que uno conservado. En el caso del pescado,
donde se producen puntas de producción, pero es uno de los alimentos que más se altera. En atmósferas
controladas, el pescado puede llegar a durar semanas, sin las atmósferas controladas no pasa de unos
pocos días. Se cambian los organismos que normalmente alterarían el pescado, como Pseudomonas o
Alteromonas, por otras bacterias, con tiempos de generación más largos, de tipo láctico.
En la industria de la fruta o de las flores es básico el controlar la atmósfera para obtener los beneficios
deseados. De hecho, actualmente se usan estos métodos en casi todos los alimentos.
Normalmente será la combinación de la regulación de la atmósfera con el control de la temperatura como
se alargará la vida útil de los alimentos
Procesos industriales
Los procesos industriales que se lleven a cabo pueden afectar a los organismos que crezcan en el
alimento, ya sean procesos de embotellado, calentamiento, ....
No entraremos en más detalle, ya que se verán en algunos ejemplos.
Relaciones entre microorganismos
Una relación que exista entre 2 organismos puede ser de dos tipos. Se puede dar antagonismo, en el que
un organismo actúe inhibiendo el crecimiento de otro o se puede dar sinergismo, si un organismo favorece
el crecimiento del otro. Esto nos va a interesar para evitar el crecimiento de organismos alterantes o
patógenos, ya que hay ciertos patógenos que pueden ser antagónicos del crecimiento de otros
organismos y viceversa. Puede existir una flora autóctona que impedirá el crecimiento de otros
organismos.
Se conoce como bacteriocina a aquellas sustancias producidas por microorganismos, generalmente
codificadas en plásmidos, que se secretan al exterior y tienen efectos antibióticos restringidos. Son
producidas por diferentes géneros y especies bacterianos, como E.coli, Bacillus, bacterias lácticas. Es
casi un antibiótico. Se ha producido en toneladas, como en el caso de la nisina, para ser utilizado como
conservante. Se han añadido antibióticos y bacteriocinas como conservantes, pero no es lo óptimo.
Listeria
Listeria monocitogenes es una bacteria ubicua, que puede crecer en muchos lugares. Puede crecer en
piensos, leche, quesos,... No puede ser eliminada si llega al alimento, por lo que se tuvo que pensar
entonces qué hacer. Se llegó a la idea de que se podía insertar un plásmido que codificase una bacteriocina
en el interior de las bacterias características de ese alimento. De esta manera, se puede evitar la
contaminación por Listeria, pero sin añadir ningún aditivo, lo que le da valor añadido al producto.
36
Alteración de los alimentos: Microorganismos responsables

La alteración de los alimentos es un hecho normal, no es extraordinario. Entre el 20 y el 30 de los alimentos
que se pierden es debido a los microorganismos. En algunos lugares, un porcentaje similar es debido a
roedores y similares.
Veremos ahora los diferentes grupos de alimentos y los organismos que los alteran.
1. Hortalizas, verduras y frutas
En principio, con esta composición podrá crecer una gran

Composición:
variedad de microorganismos. Los microorganismos que
90 % Agua alteren los vegetales deberán enfrentarse
en primer lugar a la envuelta que los Erwinia
8 % Hidratos de carbono recubre. Para una correcta conservación
será básico conservar ese tegumento. Se Xanthomonas
1 – 2 % Proteínas trata de alimentos de carácter ácido, con
escasa capacidad de tamponación. Los Pseudomonas
0,3 % Grasas géneros con más probabilidades de afectar
Bacillus
a estos alimentos son los que se presentan
Resto Cenizas (sales minerales) en la tabla. Erwinia provoca la
Clostridium
podredumbre blanca de los vegetales.
Otros agentes con capacidad para afectar a estos alimentos son los hongos. Botrytis cinnerea
provoca la podredumbre gris en los vegetales. Tiene la capacidad de crecer sobre el fruto. Puede
alterar la fresa incluso aunque esté integra. Proliferará igualmente si las condiciones de
almacenamiento no son adecuadas.
El agente causal de la podredumbre ácida es Geotrichum candidum. En este caso es necesario
que intervenga algún vector, para que el organismo llegue al sustrato. Es necesario que
intervengan moscas u otros insectos.
Rhizopus stolonifera es el agente que provoca la podredumbre blanda de los vegetales. Es
necesario un vector o que el vegetal haya sufrido alguna herida o similar para que el organismo
penetre el tegumento.
2. Carnes
Composición: Las carnes pueden verse alteradas por gran cantidad de

microorganismos, ya que se trata de un gran sustrato para su
55 – 76 % Agua crecimiento. Tienen un gran valor nutritivo y económico. Al ser
sacrificado el animal y conservada su carne, se producirán una
0 – 3 % Hidratos de carbono serie de reacciones:
o Deja de haber circulación, por lo que no
15 – 20 % Proteínas llega oxígeno al músculo, de manera
que se acaba produciendo la rigidez
7 – 25 % Grasas muscular a causa del bloqueo del
complejo actina – miosina.
o Se produce un descenso de la temperatura del organismo, lo que provoca la
solidificación de lípidos.
o Se producen en los últimos momentos de vida del animal la glucogenolísis y la
glucólisis, de manera que se producirá lactato, que provocará una bajada del pH.
o Se produce una liberación de catepsinas, que provocan la desnaturalización de las
proteínas.
El interior del músculo debería ser estéril, pero al salir del matadero tendrá unos índices de
presencia de bacterias entre 104 y 105.
37
Bacterias Los géneros con más probabilidades de alterar la carne son los que se
muestran en la tabla de la izquierda.
Pseudomonas El factor temperatura es el más importante para regular la velocidad y el tipo
de alteración de la carne. Con índices de 104 y 105 serán carnes no alteradas.
Acinetobacter Con 106 hay ligeros signos de alteración, de manera que entre 106 y 107 hay
grandes indicios, mientras que con 108 ya no es consumible la carne. Con 109
Moraxella hablaríamos ya de putrefacción.
Podemos medir los índices de contaminación de la carne con mediciones
Alcanigenes directas de los microorganismos, pero no es práctico, porque tardarían
demasiado, de manera que deberemos buscar un método que nos permita
Aeromonas hacer mediciones a tiempo real. Se puede medir la calidad de la carne de
muchas maneras:
Hongos • Mediante características físicas, como pueden ser
conductividad o pH.
Cladosporium • Mediante métodos químicos, como la puede ser medir la
concentración de algún metabolito, ya que la concentración
Mucor de este metabolito estará en consonancia con la cantidad de
organismos. Usaremos moléculas fácilmente detectables y
Rhizopus que estén en relación con los organismos, como puede ser
amonio,... y sobre todo dos diaminas, que son cadaverina y
Levaduras
putrescina. Estas dos moléculas provienen de la
descarboxilación de dos aminoácidos como la lisina y la
Candida
arginina, llevada a cabo por algunos microorganismos, como
Rhodotorula Clostridium.
Nitritos
La adición de nitritos, que tienen capacidades aditivas y conservantes, inhibirá el crecimiento de
un grupo de organismos, los Gram negativos. La carne sería degradada por otras bacterias, como
las Gram positivas, que tardarían más. Entre éstas podríamos encontrar las bacterias del ácido
láctico.
Si combinamos la adición de nitritos con una atmósfera rica en dióxido de carbono se potenciará
el efecto.
3. Pescados
Composición: Todo el nitrógeno que se podrá encontrar en este

tipo de alimentos será en forma de proteínas, ya que
70 % Agua no hay urea, por ejemplo. El pescado tiene los
microorganismos principalmente en agallas,
0 % Hidratos de carbono escamas e intestinos. En teoría, igual que en la
carne, el músculo del pescado es estéril. Es muy
15 – 20 % Proteínas importante que se produzca una rápida
evisceración, ya que en caso contrario podrían
1 – 2 % Grasas, pero arenque, actuar las catepsinas en el intestino, que tienen una
caballa y salmón hasta el 16% elevada actividad, y los organismos podrían acabar
modificando el sabor del alimento, ya que podrían
2 % Cenizas (sales minerales)
acabar llegando al músculo.
No se aprecian diferencias entre pescados
continentales y marinos, a excepción de las bacterias halófilas detectadas en los marinos.
38
Shewanella En la tabla de la izquierda se pueden ver las bacterias más comúnmente detectadas
en pescados. Los dos primeros géneros acumulan cerca del 50% de los casos,
Pseudomonas mientras que Flavobacterium se da más raramente.
Se podrían hacer recuentos para medir la calidad del pescado, pero no tiene mucho
Alteromonas sentido, porque el pescado dura muy poco. Normalmente se buscan sustancias
producidas por bacterias, como pueden ser alcoholes,... Un ejemplo es la detección
Acinetobacter de TMA-O. La trimetilamina oxidada está presente en el pescado fresco, pero no
en el pescado alterado, ya que por acción bacteriana pasará a TMA, que se puede
Moraxella detectar fácilmente, ya que tiene un olor característico.
Flavobacterium En algunas especies se puede producir una acumulación de histamina.

Normalmente no hay problemas, pero por descarboxilación de la histidina se
puede pasar a histamina, debido a la acción de Morganella morganii o Hafnia. En estos casos se
puede llegar a 400 mg de histamina, sobre los 40 de ingesta máxima diaria. En estos casos se
suelen producir alergias y reacciones similares.
4. Crustáceos y mariscos
Tienen una composición similar a los pescados, pero con hidratos de carbono, de 0 a 1 % en
crustáceos y de 3 a 5 % en moluscos. Esto provocará una cierta facilidad para la alteración.
Además de las bacterias ya mencionadas, podrán aparecer otros géneros, como Protius o
Serratia.
La frescura del alimento dependerá del pH que tenga. De 6 a 5,9 será aceptable. Entre 5, 9 y 5,7
estará alterado. Si está por debajo de 5 estará claramente pasado.
Se ha de tener en cuenta que los organismos que contaminarán un alimento serán los que se
encuentren normalmente en el medio, de manera que será muy importante si el alimento es un
filtrador, porque en ese caso se convierte en un bioacumulador.
5. Huevos
El huevo es un alimento protegido intrínsecamente, debido a su cáscara. Pero además se ha de
añadir la presencia de lisozima, un pH elevado, de carácter alcalino. Debido a todos los nutrientes
que tiene en su interior, el huevo es un medio de crecimiento para los organismos brutal.
En teoría, el interior del huevo es estéril. Pero parece ser que existe la posibilidad de que se
contamine el interior del huevo con Salmonella. Existen más de 1000 serotipos de Salmonella,
de algunos de los cuales el hombre es reservorio, mientras que otros viven en los animales o en
la naturaleza. El problema es que los huevos se contaminan desde el mismo momento de la
puesta con contaminantes fecales.
Por lo tanto, el huevo que se usa a nivel industrial es pasteurizado.
6. Leche
Pueden crecer muchos organismos en la leche. A priori debería ser estéril, si la vaca está sana. Lo
normal es que al principio tenga de 104 a 105 microorganismos. Podremos encontrar
microorganismos fecales debido a la proximidad, así como los organismos que crezcan en el
entorno en que vive la vaca.
Hemos de asegurarnos, pues, de que estos organismos no proliferen e incluso si podemos
eliminarlos de la leche.
7. Cereales y harinas
Tienen un alto contenido en carbohidratos y bajo en proteínas. Aparte de la poco agua que
tienen, lo que ya puede constituir una barrera, muy pocos organismos podrán degradarlos, tan
solo los que tengan amilasas, debido a la forma en que se encuentran los carbohidratos. Un
género de riesgo es Bacillus. El tratar las harinas, hidratándolas, aumentan los riesgos.
39
Análisis microbiológicos
Normalmente, en los laboratorios de análisis, aparte de los servicios de análisis que se ofrecen, se ofrece
también otra cosa. La CALIDAD. Esta calidad la determina la propia empresa, se decide la calidad que se
ofrece. La calidad será un valor fijo que se establece y que se afirma que cumple el producto o servicio.
Es necesario seguir unas pautas preestablecidas para poder garantizar una cierta calidad. En todos los
laboratorios se seguirán las Buenas Pautas de Laboratorio o Good Laboratory Practices. En la industria se
deberán seguir las Buenas Pautas de Fabricación, para garantizar la calidad del producto. Mediante el
cumplimiento de estas prácticas se garantiza que en el laboratorio se hacen las cosas como es debido, se
cumplen las normas, se alcanza un nivel de calidad.
Será importante que todos los laboratorios sigan unas normas estrictas. Se entiende como norma el hecho
de que todos los laboratorios actúan haciendo lo mismo, no por obligación, sino porque así se garantiza
la calidad. Actualmente, la norma a seguir por todos los laboratorios es la ISO 45001. No son más que
reglas que estas son las pautas que se deben seguir. Actualmente, debido a algunos problemas, que han
surgido en su aplicación, a finales del 2002 entrará en vigor la ISO 17025.
Se conoce como normalización al proceso por el que se llegan a establecer las normas a seguir. Para esto
es necesario que existan una serie de organizaciones que se encarguen de establecer esas normas.
Internacionalmente tenemos la International Standarization Organization. En Europa existe la CEN,
mientras que en España existe la Asociación Española de NORmalización. Estas organizaciones prueban,
aprueban y distribuyen las normas.
Hemos de distinguir entre lo que significa homologado y el concepto de acreditado, junto con el de
normalizado.
Normalizado: Es necesario trabajar bajo unas normas, para poder garantizar una calidad.
Homologado: Funcionamiento siguiendo unas normas. Para ser homologado se requiere ser reconocido
por un grupo de personas.
Acreditado: Reconocimiento por parte de algún tercero, mediante algún examen o similar, en algún
organismo acreditador.
A partir de la industria nuclear surgieron lo que se conoce como Procedimientos Normalizados de Trabajo.
Se trata de los procedimientos que se deberán seguir en los diferentes supuestos, en cualquier caso
previsto.
En el momento en que seguimos un procedimiento, debemos poder garantizar una calidad, para lo que
estableceremos una serie de controles internos, tanto de aparatos como de procedimientos. En este
punto es importante la idea del material de referencia. Permite establecer un patrón para comparar con
él los controles.
En un laboratorio es importante también tener un manual de gestión del mismo, donde ha de estar todo
lo concerniente al laboratorio, desde el organigrama a los instrumentos del laboratorio, pasando por los
objetivos del mismo. Todo esto lo deberá escribir el director del laboratorio.
Es muy importante describir y tener la unidad de garantía de calidad. Se trata de la persona o personas
que se encargan de controlar que las cosas se hagan bien, mediante controles internos. Es el encargado
de garantizar la calidad. Este tipo de control es tan solo una auditoría de calidad interna. Dado que en
algunos casos es una figura que no necesitas todo el año, aparece la figura del auditor externo, que
controlará la calidad de las empresas que quieran alquilar sus servicios. Por último, se puede acudir a los
órganos acreditadores para ser el encargado de acreditar a las empresas.
La TRAZABILIDAD es otro concepto muy importante en la industria. Hemos de ser capaces de poder
recuperar la información obtenida de los análisis elaborados de una muestra, mediante informes
recogidos y guardados. Es muy importante para mantener la calidad. Esto implica que se requieren datos
primarios, los obtenidos directamente a partir del análisis. Estos datos NO SE HAN DE ELIMINAR nunca.
Afortunadamente actualmente, mediante los métodos informáticos es más sencilla esta tarea.
40
Indicadores de calidad e inocuidad de un alimento

Los microorganismos que usemos deberán cumplir dos funciones. Por un lado han de tener función
indicadora, ya que pueden indicar el funcionamiento de un proceso o algunos que pueden usar como
trazadores, ya que pueden indicar la presencia de contaminaciones. Además, deberán ser índices, que
estén relacionado con aspectos sanitarios. Pueden estar vinculados a patógenos. En ocasiones ambas
funciones se mezclan. Veremos en primer lugar los indicadores de calidad de los alimentos.
Indicadores de calidad en alimentos
Muchos organismos se pueden usar para medir la calidad de un alimento. Los alimentos pueden tener
unos organismos creciendo sobre ellos, cuya presencia puede indicar una menor calidad del alimento. Si
proliferan perjudicarán la calidad del producto. Existen una serie de características que se han de cumplir
para que pueda ser un indicador de calidad.
Ha de estar presente y ser detectable en los alimentos que queramos valorar su calidad
La multiplicación del organismo y su número deben estar en relación negativa directa a la calidad del
alimento.
La detección y el recuento del organismo han de ser sencillos, y a ser posible que la flora acompañante no
interfiera en el proceso.
El crecimiento del indicador no debe ser obstaculizado por el indicador.
El tiempo de recuento ha de ser lo más corto posible.
Si controlamos la presencia y el crecimiento de los organismos alargaremos la vida útil de los alimentos.
Los indicadores de inocuidad han de seguir una serie de criterios.
Fácilmente y rápidamente detectable
Es esencial que se diferencia de la flora microbiana
Ha de existir una relación entre el patógeno y el indicador
Siempre que esté el patógeno deberá estar el indicador
Ha de haber relación entre el número del indicador y el número de patógenos
Los requerimientos nutricionales y la velocidad de crecimiento del indicador han de ser similares al
patógeno
La tasa de muerte del indicador y el patógeno ha de ser similar, aunque es recomendable que el indicador
persista más que el patógeno
Todos los alimentos exentos del patógeno han de estar exentos del indicador, o este ha de estar en un
número muy bajo.
Los primeros indicadores que se usaron fueron para las contaminaciones fecales, para evitar el cólera,
estos indicadores tenían una serie de criterios.
Debían vivir exclusivamente en el intestino

Debía haber un número elevado de organismos en heces
Debía haber una forma fácil de detección, fiable incluso en número bajos
Debían tener una resistencia elevada en el ambiente extraintestinal
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Veamos ahora algunos indicadores que se podrían usar.
Coliformes
Fermentan lactosa produciendo ácido y gas.

Se usan 4 géneros.
Citrobacter
Enterobacter
Klebsiella
Escherichia
Coliformes fecales. Se usa la prueba de Eijkman, de producción de gas y ácido a 42º
Escherichia
Klebsiella
Citrobacter
Existen organismos exclusivamente intestinales, y otros con distribución mixta, como Enterobacter
aerogenes.
Pueden existir algunas E.coli patogénica, de diversos tipos:
- enterotoxigénicas
- enteroinvasivas
- enterohemorrágicas
- enteropatógenas facultativas
E.coli O157:H7 es una enterohemorrágica, ya que produce una toxina, la shiga toxina o verocitotoxina.
Aparecen en carnes poco cocinadas. Si llegase al riñón podría provocar un fallo renal.
Enterococos
Su presencia en las heces es menor.

Requieren más nutrientes que los coliformes, como por ejemplo algunos AA y vitaminas como las de
tipo B.
En aguas de bajo contenido orgánico no podrán replicarse.
Existirá una relación más pareja entre enterococos y patógenos que no con coliformes.
Su resistencia es superior a la de los coliformes.
E.faecalis En humanos sobre todo, pero también en animales.

En humanos y animales, pero principalmente animales.
E.faecium
En humanos y animales, pero principalmente animales.
E.durans
En aves de corral, como gallinas y pollos
E.gallinarium
En pollos
E.cecorum
En palomas
E.columbae
En aves, pero también en algunos mamíferos
E.avium
En vacas
E.saccharolyticus
En comunidades vegetales y forrajes, y en suelos.
E.casseliflavus
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Bifidobacterium
Se trata de bacterias Gram positivas.

Pueden tener su origen en animales o en humanos, pero son característicos en cada caso, excepto
algunos mixtos.
Su presencia en el agua denota una contaminación fecal reciente, ya que son anaerobios estrictos y
mueren rápidamente con oxígeno.
Son muy abundantes en las heces.
Existen más de 25 especies.
Los medios usados para su detección son, en orden de antigüedad:
- YN6
- YN17
- Beerens. Se trata de agar Columbia con ácido propiónico.
Colifagos
Se trata de fagos que atacan a E.coli.

Se basan en que el mejor indicador para la presencia de un virus será otro virus.
Se trata de virus de morfología similar a los de los animales y su resistencia a muchos tratamientos es
también muy similar.
Por seguridad, algunos alimentos deben pasar por algunos procesos antes de ser consumidos, como es el
caso de la leche, que se ha de pasteurizar. En aves se corren riesgos de Salmonella, de manera similar a
las carnes.
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Análisis microbiológico de los alimentos

Queremos cuantificar los microorganismos, así como identificarlos. Esto no parece tener mucho
problema, pero se ha de considerar que en industria se trabajará en el control de atmósferas y superficies.
Las dos pueden ser focos de contaminación a tener en cuenta.
Se conoce como punto crítico de control a aquél punto en que si no se ejerce el control adecuado, se
alterará el sistema. Tanto la atmósfera como las superficies son puntos críticos de control. No existe una
flora autóctona de las superficies o de la atmósfera. Son bacterias que están en tránsito. Serán bacterias
que estarán muy dañadas, por los procesos que se puedan haber hecho para esterilizar la atmósfera o la
superficie, por lo que para identificarlos deberé revivificarlos. De hecho, siempre se efectuará un recuento
aproximado, debido a que habrá organismos muy lesionados que no podrán revivificarse.
El control del aire es cada vez más importante para muchas industrias diferentes, desde la farmacéutica a
la electrónica, pasando por la alimentaria. Un aire estará muy limpio cuando en él haya menos de 10
microorganismos por metro cúbico. A través del aire se pueden vehiculizar posibles factores de
enfermedades. Existen diferentes métodos para medir la cantidad de organismos en el aire. Por un lado
está el sistema de placa abierta. En este método dejas una serie de placas abiertas con diferentes medios,
durante un tiempo determinado, en diferentes lugares. Mediante este método podemos ver la presencia
de organismos, pero no podemos cuantificar. Otro método usado es el que consiste en el uso de
colectores de aire, mediante sistemas que aspiren el aire, proyectándolo después de manera tangencial
sobre las placas de Petri, a una determinada velocidad. Mediante este método sí se pueden cuantificar
los organismos del volumen de aire.
Al hacer controles de aire se establecen protocolos de muestreo. El análisis es importante, pero si
descansa en un muestreo no válido, no servirá de nada. Se han de hacer planes de muestreos previos a la
toma de muestras, de manera que no quede nada al azar Se han de controlar todos los posibles espacios
en una habitación,...
El control de superficies es necesario porque a menudo ocurren problemas de limpieza, desinfección,
esterilización de superficies,... Ha de haber protocolos que permitan saber si el proceso ha funcionado y
una superficie es estéril. EL método más usual de los que se emplean, el normalizado, es el uso de las
placas RODAC, Replicate Organism Direct Agar Contact. Consiste en llenar la placa de medio y después
poner la placa con el medio sobre la superficie, arrastrando los organismos. Es el método más fácil de
hacer. Además. dada su forma rectangular, permite el control de medios líquidos por inmersión. Otro
método usado es el de los escobillones, “SWAB”. Se pasa el escobillón por la superficie y después se pasa
a la placa de Petri, de manera que las bacterias crecerán en ésta. El problema es que siempre se ha de
hacer igual para que sea válido. Si en lugar de ser algodón se trata de alginato se pueden hacer análisis
totalmente cuantitativos. De hecho es válida cualquier idea que se pueda tener, con el único requisito de
que SIEMPRE se ha de usar el mismo protocolo.
Otro método se basa en la presencia de ATP o en su ausencia. En una superficie limpia ha de haber ATP,
ya que si lo hay, no estará limpia. Usamos el complejo luciferin luciferasa, que en presencia de ATP provoca
luz. Se trata de un medio muy fiable. Además, se puede detectar la cantidad de ATP por la cantidad de
luz. Las ventajas que tiene este sistema son que es rápido, en unos 10’, y que tiene una elevada
sensibilidad, que permite detectar ng de ATP, hasta puede detectar 300 bacterias.
Si nos centramos en el análisis de alimentos, hemos de considerar que el muestreo debe ser siempre
significativo y representativo, para lo que están los estadísticos. A través de diferentes herramientas
podrán llegar a elaborar un plan de muestreo que deberá seguir. Determinados productos podrán ser más
sensibles que otros productos, por lo que deberán ser controlados más a menudo. La importancia del
muestreo depende de la importancia sanitaria, del consumo del alimento y de una cierta estacionalidad.
Siempre se ha de tener en cuenta que el muestreo es tan importante como el propio análisis. La
contaminación se da al azar en el alimento y en los lotes de distribución, por lo que se deberá
homogeneizar la muestra. Todo esto debe estar previsto en los planes de muestreo.
Cuando el alimento es fresco, el análisis debe hacerse enseguida, pero no debe hacerse en el laboratorio,
que puede durar días y días, sino que debe hacerse a tiempo real, como mucho en una jornada de trabajo,
ya que no se puede retener un producto fresco, ya que provoca pérdidas. En el caso de las conservas y
semiconservas el proceso no ha de ser tan rápido. Parte las muestras las analizas, mientras que las otras
las almacenas entre 37 y 42º C semanas o días respectivamente. Se provoca un envejecimiento artificial
del producto.
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El análisis microbiológico tiene 2 aspectos, la cuantificación y la identificación. Se valoran

especialmente los procesos a tiempo real y los automatizados, ya que a través de la rutina se
puede provocar el tedio y la monotonía en el operario, induciéndole a error. Además, si es un
trabajo rutinario, se podrá hacer una máquina que lo haga.
Métodos de cuantificación
Directa Da un número exacto. El problema es que hasta hace poco tiempo los mecanismos usados eran
1, tan solo el recuento manual, que presentaba dos grandes defectos, por un lado la fatiga del operario,
que podía provocar errores, y la baja cantidad de análisis por unidad de análisis que se podían hacer.
Actualmente hay máquinas que se facilitan esto. La platina se mueve sola en las máquinas, facilitando
el trabajo de los operarios. Además, el uso de cámaras de video unidas a microscopios, unidos a su vez
a programas informáticos complejos de recuento permite acelerar el proceso. Adicionalmente,
mediante el uso de marcajes, como puede ser epifluorescencia.
De manera que gracias a todo esto los recuentos directos están volviendo a usarse,
porque son rápidos y la electrónica los facilita mucho.
a. Existen máquinas de análisis de imagen, que permiten con tan solo 1 ml de
muestra y 1 ml de medio, en 6 horas tener resultados. Se pasa la muestra en
forma de portaobjetos. La máquina buscará colonias no visibles al ojo
humano, pero si observables con microscopio. No es necesario esperar tanto
como en las placas normales.
b. Mediante la citometría de flujo se pueden medir y contar componentes
celulares y las propias células en suspensión líquida. La esencia del sistema
consiste en que las células en suspensión son llevadas 1 a 1 a través de un
canal de flujo. Diferentes dispositivos del aparato permiten regular la
trayectoria y la velocidad a la que pasan las células por el conducto. Según los
sensores de que dispongamos podremos medir diferentes propiedades de las
células en suspensión, como puede ser fluorescencia, absorbancia,
dispersión,... En base a estas características pueden ser divididas en grupos.
Además, se puede combinar con la tinción de las células, con lo que se
tendrán más combinaciones.
c. Recuento de UFC. Es un método de recuento directo que se basa en el
supuesto de que cada célula formará una colonia en la placa. Basta contar las
colonias de la placa para saber el número total de bacterias. La calidad de las
placas es básica para la eficacia del recuento, ya que podrán tener diferente
volumen,... Además, debido a que será necesario hacer mucho medio será
necesario desarrollar máquinas dispensadoras.
En cualquier caso será necesario comparar los diferentes medios. Para hacer
esto se hacen los tests ecométricos. Dado que existen diferentes
componentes de medios, hemos de considerar cual es el mejor. Estos tests
funcionan como sigue. Se seleccionan 3 cepas que sean fáciles de recuperar
en ese medio y 3 cepas más que resulten inhibida por ese medio. Se siembran
21 estrías por placa, 4 grupos de 5 y una central. Después contaremos la
cantidad de grupos en los que ha habido crecimiento por placa, de manera
que un medio ideal debería ser 5,5,5,0,0,0, pero de hecho normalmente son
5,3,5,2,1,0 o similar.
El método de las UFC presenta un gran inconveniente, que es la excesiva
intervención del operario, ya que este hace diluciones, extensiones y
recuentos. Es demasiado trabajo monótono para una persona, de manera
que existe un método normalizado. Se trata del método de siembra en espiral
en placa. Se trata de una máquina que distribuye el inóculo líquido en la
superficie de una placa en rotación con el medio adecuado. El brazo
dispensador se mueve desde el centro de la placa hacia el exterior,
depositando la muestra en espiral la cánula asociada al brazo va dejando ir
un volumen decreciente de muestra, de manera que en una sola placa
desciende el orden de magnitud hasta en 4 grados. El recuento se hace
usando una plantilla especial, junto con una máquina, normalmente
equipada con láser para el recuento. Es un método totalmente automatizado,
el hombre no interviene.
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BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
1 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
I - CAPÍTULO 2
1.- Introducción
La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de
especies vegetales. La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrión
cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces
o flores. Estos órganos son inducidos a partir de una célula o de un grupo de células que, según las condiciones de
cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa división. Esta totipotencialidad celular fue enunciada por
Haberlandt en 1902, quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar
plantas completas. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular. Los
medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran aún
desconocidos. Los avances en el cultivo de tejidos vegetales fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo
mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices de tomate. Al mismo
tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y
tabaco in vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo
sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco,
demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la
misma especie, con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la
diferenciación de brotes, raíces o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.
2.- Tipos de morfogénesis. Definiciones

En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones (Fig 1) o brotes, raíces y/o flores
(Fig 2) como respuesta a un determinado estímulo. La regeneración es un proceso que comprende diferentes fases
que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfogénesis citadas. De Klerk y colaboradores, en 1997,
denominaron a estas diferentes fases como adquisición de la competencia; fase de inducción y fase de realización. En
la primera fase, las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase
de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay
una relación directa con el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de
cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano
determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo
adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la
formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce la formación de
embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa (Figs. 1 y 3). Si por el contrario, a partir de
la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función
predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares (Figs. 2 A y 3). La diferenciación de órganos
a partir de callos, denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los
meristemoides. Morfogénesis directa o indirecta fueron términos propuestos por Hicks en1980.
3.- Histología de la morfogénesis

Después de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado, a partir de una célula
epidérmica o del mesófilo foliar, como ocurre en las coníferas, se suceden una serie de divisiones mitóticas. Así se
pueden observar, a través del estudio histológico, pequeñas masas de células que contienen citoplasma denso y
grandes nucleolos. Este conjunto de células, agrupadas a modo de esferas, fueron denominadas meristemoides por
Torrey en 1966, y son responsables de la diferenciación de los nuevos órganos. Este tipo de meristema puede iniciarse
en forma directa, a partir de células diferenciadas pertenecientes a un explante cultivado in vitro, o indirectamente, a
partir de una célula o grupo de células diferenciadas que promueven la proliferación celular (Fig 4 A). Su evolución
determinará el crecimiento de un órgano, por ejemplo, una yema adventicia (Fig 4 B).
Figura 1: A-F embriogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriogénesis somática en diferentes fases
de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B-D-F, embriogénesis
somática obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embriones zigóticos inmaduros cultivados en MS +
0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa inducción en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5
mm.
Figura 2: A-E Organogénesis somática obtenida por cultivo in vitro. A, callo organogénico obtenido en Abelia sp.
(André) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de
“Crimson Gold” (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C, Brotes de Gerbera
jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de capítulos florales en MS 0,05 mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1
mg l-1 de GA3. D, brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (André) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, raíces
(flechas) crecidas de callo de Abelia sp. (André) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente
inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las reglillas representan 5 mm
Las células embriogénicas son similares a las células meristemáticas debido a que no son demasiado voluminosas,
tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucleolo agrandado y pequeños granos de almidón. Estas
células, que en general se agrupan, pueden variar en tamaño y número. Dentro de un grupo de células embriogénicas,
el desarrollo de las mismas no está sincronizado. Estas células son capaces de dividirse o de transformarse en
embriones según las condiciones del medio de cultivo. Aquellas células que no desarrollan proembriones comienzan
el proceso de diferenciación, es decir se vacuolizan, disminuye el volumen de núcleo y nucleolo y desaparecen los
gránulos de almidón. Las experiencias demuestran que las células embriogénicas se desarrollan sólo cuando se
modifican las condiciones de cultivo. En general, cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o se elimina
la auxina. Las células embriogénicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten
que estas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos condiciones ontogénicas diferentes, es decir que el origen de los
embriones sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una célula, la misma se aísla de las demás
por una importante modificación en su pared celular, en particular por la gelificación de la laminilla media. Esta célula,
rodeada por un polisacárido mucilaginoso, sufre divisiones polarizadas formando un embrión globular. Previo a esta
polarización se deposita almidón, luego se forma la epidermis y adquiere simetría bilateral. Sucesivamente se observa
el crecimiento de uno o más cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciación de los ápices radicales
y de tallo y una progresiva acumulación de almidón, lípidos y proteínas. En el caso de un origen multicelular de los
embriones somáticos pueden observarse diversos patrones. Los embriones somáticos se forman a partir de grupos de
células epidérmicas y subepidérmicas (Fig 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comúnmente
budding o embriogénesis adventicia. Estas células pequeñas tienen una alta relación núcleo/ citoplasma, citoplasma
denso y un nucleolo voluminoso que se tiñe fuertemente. Se diferencian de las células embriogénicas por la falta de
sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente división celular. Estas estructuras se denominan
proembriones globulares (Fig 1 A, B). En una etapa posterior desarrollan una epidermis, un tejido provascular,
acumulan material de reserva y se polarizan. Estas estructuras globulares desarrollan cotiledones y se transforman en
embriones somáticos que presentan ápices caulinar y radicular. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo
de inicio según las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrión somático de origen unicelular es comparable a
la de un embrión cigótico.
En dicotiledóneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazón que se corresponde con la adquisición de la
simetría bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y de manera sucesiva el desarrollo del ápice
radical. El ápice de tallo se desarrolla más tarde, durante la etapa cotiledonar. En los embriones somáticos de algunas
especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazón llamada oblonga, que corresponde a la individualización
del ápice de la raíz y al procambium en respuesta a la elongación axial del embrión somático debido al transporte de
auxinas (Fig 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que los
cigóticos, como así también la producción de sustancias de reserva.
Fig. 3: Esquema de los diferentes procesos morfogénicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes
explantes. Las líneas continuas expresan organogénesis o embriogénesis directa mientras que las líneas quebradas
indican que la morfogénesis se obtiene por vía indirecta.
Figura 4: A-E Cortes histológicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A, meristemoides (flechas) observados en
cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B, yemas adventicias (flechas) en ápices
de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C,
grupo de células embriogénicas (flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón. 20
x. D, embriones somáticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x. E,
embriogénesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurón 10 x.
Sin el seguimiento histológico detallado, la formación del embrión somático sólo puede ser confirmada por la
germinación (Fig 1 F). Sin embargo, debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi
imprescindible para una correcta evaluación de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo
empleados. Comparados con los embriones cigóticos de la misma especie, los embriones somáticos frecuentemente
desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomalía más frecuentemente encontrada es la formación doble
o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarización del transporte de auxinas. También se puede encontrar
un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidón y/o proteicas, que el meristema
apical o radical no estén desarrollados o que la embriogénesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E). La falta del
meristema apical o una escasa deposición de sustancias lipoproteicas en los embriones somáticos de algunas especies
no debe ser tomada como una anormalía. Esto puede ser un síntoma de inmadurez debido a la rápida formación de
los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduración de las estructuras formadas permitirá
incrementar el porcentaje de embriones somáticos capaces de germinar.
4.- Factores que afectan los procesos morfogénicos
Los cuatro principales factores que condicionan la obtención y el crecimiento de nuevos órganos in vitro son:
4.1.- el genotipo
4.2.- las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo.
4.3.- las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo.
4.4.- el explante.
4.1.- El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos, desde la capacidad del explante para
su establecimiento en condiciones in vitro a la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos
órganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido a que los medios de
cultivo, así como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser específicos para cada situación en particular. Un
ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp and Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro
de ellos fue posible la obtención de embriones somáticos a partir de embriones cigóticos, pero estos resultados no se
repitieron con el cultivar "Pinot Noir".
4.2.- Varios son los compuestos químicos que influyen en los patrones morfogénicos in vitro dentro de los cuales
podemos considerar:
4.2.1.- la composición salina del medio de cultivo. La composición salina más empleada para inducir la formación de
callo, la organogénesis directa o indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962)
(MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para inducir determinados patrones morfogénicos. Existe
además una estrecha relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de reguladores del
crecimiento agregada al medio de cultivo.
4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfogénesis aún cuando la
concentración salina no sea la adecuada. En condiciones óptimas de cultivo pueden aumentar significativamente la
diferenciación de órganos. Para la inducción de embriones somáticos en muchas especies vegetales es necesario el
agregado de auxinas, como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para otras, como es el caso del crotón (Codiaeum
variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentración de reguladores del
crecimiento empleados están estrechamente relacionados.
4.2.3.- antibióticos. En procesos de transformación con Agrobacterium tumefaciens es muy común el agregado de
antibióticos del tipo cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para la eliminación de la bacteria. En explantes de hoja de
diferentes cultivares de Malus domestica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaxime aumentan significativamente la
regeneración de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbenicilina promueven la formación de callo y la kanamicina
inhibe los procesos morfogénicos.
4.2.4.- carbón activado. En general se usa para adsorber compuestos tóxicos de la micro atmósfera gaseosa o el exceso
de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo pero E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de
la Swedish University of Agriculture, demostraron que puede promover la embriogénesis somática debido a la
incorporación de ciertos compuestos al medio de cultivo por difusión. 4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener
en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semi-sólido o líquido. El agente gelificante
más utilizado en el cultivo in vitro es el agar, extraído de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en
el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras
del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis (en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L
de AIA + 1 mg/L de BAP) cuya respuesta morfogénica varió según el tipo de agar utilizado. Cuando el gelificante
empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias,
mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo. En caso de seleccionar medios
de cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera considerable. El cultivo líquido es
imprescindible cuando se busca promover la morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es
necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que las células se disgreguen y puedan
diferenciar raíces, brotes o embriones somáticos en forma aislada. La elección de un medio de cultivo líquido o sólido
depende, además, de la especie con la que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se ha observado que el empleo de
medio líquido promueve una mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo gelificado. A su vez, este
proceso puede mantenerse durante varios subcultivos, mientras que en medio de cultivo gelificado se observó que
los protocormos tienden a formar tallos.
4.2.6.- atmósfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfogénicos y esta condicionada por el tipo y
tamaño del envase seleccionado para el cultivo, así como también por el sistema de cobertura del mismo. Las tapas
usadas en cultivo in vitro varían desde el tapón de algodón; papel de aluminio; película de resinite transparente o
tapas rígidas de polipropileno. El intercambio gaseoso es diferente para cada tipo de tapa, en consecuencia la
atmósfera interna también sufrirá variaciones. En condiciones in vivo la atmósfera contiene 78 % de nitrógeno; 21 %
de oxígeno y 0,035 % de dióxido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado además, etileno y otros compuestos
hidrocarbonados. El nivel de oxígeno disponible para el explante condiciona el crecimiento y los procesos
morfogénicos. En general se necesita una buena aireación para obtener cualquier tipo de proceso morfogénico. En
alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriogénicas cuando la
solución se satura con 70% de oxígeno. Por el contrario, una tensión de oxígeno del 5 % estimula la producción de
plantas a partir de anteras de tabaco. La concentración de dióxido de carbono (CO2 ) en la atmósfera gaseosa in vitro
varía según la respiración y la actividad fotosintética de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa
mientras que en condiciones de luz, disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado
concentraciones variables, entre 0,5 % y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa empleados. Concentraciones superiores
al 1 %, que son generalmente tóxicas en condiciones in vivo, probablemente no fueron limitantes para la actividad
fotosintética. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Su acumulación tiene
efectos inhibitorios sobre el cultivo de células, callos y anteras, La cantidad de etileno producida in vitro varía con la
especie, el tipo de explante, la concentración de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la
luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a través de la esterilización del material de disección
realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En muchos casos el etileno actúa
como promotor de la morfogénesis pero luego es inhibitorio del crecimiento de los órganos diferenciados
4.3.- Entre las condiciones físicas podemos mencionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz.
4.3.1.- La temperatura de incubación de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en condiciones
naturales las plantas experimentan diferencias térmicas durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se
mantienen casi estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in vitro a las óptimas de
crecimiento de la especie estudiada, mayor será la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x
hybridus sometidos a diferentes temperaturas se observó que la regeneración mayor de brotes se producía a 12 ºC
mientras que por encima de los 30 ºC, prácticamente no se observó diferenciación.
4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa,
es otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o cobertura del envase empleado. Si
este cierre es hermético, la humedad interior será del 100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un intercambio
gaseoso la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso de la HR puede
promover una pérdida veloz de agua del medio de cultivo variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a
niveles tóxicos (Debergh, comunicación personal).
4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y período de suministro.
La respuesta morfogénica de un explante puede variar según si se le proporciona luz o no. Para estimular la formación
de callo, es común que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciación de órganos.
4.4.- Tal como ya se señaló anteriormente, los proceso morfogénicos dependen del genotipo, pero a esto debe
sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y fisiológicas en
las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en
condiciones in vitro. Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfogénica observada en hojas de
Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo, según la porción de la lámina utilizada (Pedroso y Pais,
1993). Estos investigadores cultivaron estas hojas in vitro durante seis semanas previa inmersión del explante en una
solución de IBA (1 mg l–1) durante 20 minutos (Fig 5).
Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas morfogénicas obtenidas después de seis

semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. según la porción de la lámina. 1, callo organogénico. 2
embriogénesis somática directa. 3, regeneración directa de raíces. 4, callo organogénico.
Capítulo 7 Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos: embriogénesis somática y organogénesis
Introducción
En 1902, Haberlandt propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen capacidad para formar plantas
completas, es decir, que tienen totipotencialidad. Sin embargo, esta hipótesis no pudo ser demostrada en aquel
tiempo (Krikorian et al., 1969). White (1939) informó acerca de la inducción de yemas adventicias in vitro a partir de
callos de Nicotiana glauca x N. langsdorfii, y Nobecourt ( 1939) obtuvo raíces adventicias de un callo de zanahoria
(Daucus carota). Estos experimentos respaldaron indirectamente la teoría de totipotencia lidad celular.
Posteriormente, y en forma simultánea, Reinert (1958) y Steward et al. (1958) informaron acerca de la producción de
embriones somáticos (embriones adventicios originados en células somáticas); más tarde se demostró que estos
embriones eran originados a partir de células aisladas (Backs-Husemann et al., 1970; Reinert et al., 1971),
demostrándose la totipotencialidad de las células vegetales. La regeneración de plantas directamente de los explantes,
o a partir de callos, por medio de la organogénesis o de la embriogénesis somática se ha utilizado como una alternativa
en los métodos de propagación; sin embargo, esa aplicación ha sido limitada a causa de la poca estabilidad genética
en los cultivos de callos. Hay, en cambio, necesidad de regenerar plantas a partir de células selectas, como también
necesidad de establecer métodos genéticos celulares aplicables en el mejoramiento de las plantas y en la recuperación
de variantes somaclonales; en consecuencia, existe un considerable interés en definir las vías de regeneración para
varias plantas de importancia económica. La presente revisión se ha enfocado hacia la parte teórica y aplicada de esos
dos fenómenos de regeneración. Existen otras revisiones recientes sobre la embriogénesis somática (Tisserat et al.,
1979; Ammirato, 1983; Raghavan, 1976; Evans et al., 1981; Vasil, 1982) o sobre la organogénesis (Flick et al., 1983;
Thorpe, 1980; 1983; Evans et al., 1981).
Embriogénesis Somática
Como embriones somáticos, asexuales o adventicios se han definido los iniciados a partir de células que no son el
producto de la fusión de gametos (Tisserat et al., 1979). Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, y no
poseen conexión vascular con el tejido materno; las estructuras bipolares deben ser también capaces de crecer y
formar plantas normales.
Aspectos teóricos
La embrionía adventicia es un evento morfogenético que ocurre in vivo a partir de las núcelas en algunas especies de
ciertos géneros de plantas, por ejemplo, Citrus spp., Mangifera indica, Eugenia spp., Garcinia mangostana y Lansium
domesticum, o a partir de los integumentos del óvulo como ocurre en Eugenia malacencis. También se origina de las
sinérgidas (Cooper, 1943), del suspensor (Crete, 1938), y de otros tejidos localizados dentro del ovario como el
endospérma (Muniyamma, 1 977), las antípodas, o el cigoto (Cameron y Garber, 1968). La embrionía adventicia
también ocurre en los ápices de las hojas de la orquídea Malaxispalmosa (Taylor, 1967). La totipotencialidad de las
células vegetales cultivadas in vitro fue establecida por Reinert (1958) y Steward et al. (1958), quienes describieron la
inducción de embriones somáticos a partir de callos derivados del ápice radical de la zanahoria Daucus carota. También
se ha obtenido la regeneración de plantas in vitro por medio de la embriogénesis somática a partir de células
generativas, por ejemplo, en cultivos microspóricos de Datura innoxia (Guha et al., 1964) y en Nicotiana tabacum
(Nitsch, 1969), como también a partir de células de endospérma cultivadas in vitro como en Santalum álbum (Lakshmi
Sita et al., 1979). En ciertos aspectos, los embriones somáticos mantienen una similitud con los embriones cigóticos;
sin embargo, tanto in vivo como in vitro pueden ocurrir algunas anormalidades en el desarrollo, por ejemplo, la
fasciación y la fusión de los cotiledones. En los estudios de embriogénesis somática se sigue utilizando la zanahoria
como un sistema modelo (Sunget al., 1984) no solamente para estudios sobre control de desarrollo, sino también para
determinar los eventos bioquímicos que controlan la morfogénesis. Inicialmente, Steward et al. (1958) consideraron
que para la inducción de la embriogénesis somática era esencial un ingrediente no identificado en el agua de coco (
AC); sin embargo, posteriormente se demostró que el AC, aunque era beneficiosa, no era necesaria para inducir
embriogénesis (Reinert, 1958). El AC todavía se utiliza frecuentemente en los medios de cultivo, no solamente para
estimular la producción de embriones somáticos, sino también para la maduración de los mismos (Thomas et al., 1977;
Vasil et al., 1980, 1981a, 1981b).
Steward et al. (1958) consideraban también que el aislamiento físico de las células a partir de tejidos de plantas
maduras era la causa de que ellas se convirtieran en embriogénicas; sin embargo, las evidencias no apoyan este punto
de vista. Las células que dan origen a los proembriones son ricas en almidón y poseen una vacuola pequeña (Halperin,
1970). Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico. Usualmente se emplea el
2,4-D, el cual aparentemente brinda el estimulo o inicia la inducción de la embriogénesis somática en el callo. Sin
embargo, la maduración de los embriones y la germinación no ocurren en presencia de 2,4-D (Halperin et al., 1964);
en consecuencia, hay que remover la auxina, o usarla en concentraciones más bajas. Tanto la inducción de la
embriogénesis somática como el desarrollo de los estados subsiguientes de los embriones dependen de la presencia
de nitrógeno reducido (Halperin et al., 1965a; Halperin, 1966; Ammirato et al., 1971). Steward et al. (1964) creyeron
inicialmente que la diferenciación o la formación del callo ocurría en un medio con auxina, y que la formación de
embriones y su desarrollo ocurre después de subcultivar el callo en un medio libre de la auxina; actualmente es
evidente que la inducción de embriones ocurre en presencia de la auxina (Halperin, 1966). Los cultivos en suspensión
mantenidos mediante el subcultivo continuo en medios con auxinas están conformados por embriones globulares.
Hay varias interpretaciones acerca de la naturaleza de la diferenciación que da como resultado la embriogénesis
somática. Se cree que dentro de un explante ciertas células están preacondicionadas para los eventos morfogenéticos
que llevan a esta embriogénesis (Thorpe, 1980; Tisserat et al., 1 979). Por tal razón, la presencia de reguladores
exógenos de crecimiento, usualmente el 2,4-D, no solamente inicia el desarrollo de los embriones somáticos, sino que
también estimula la multiplicación clonal de las células predeterminadas. Evans et al. (1981), sin embargo, creen que
la embriogénesis puede derivarse también de tipos diferenciados de células por medio de la predeterminación; este
patrón de desarrollo induce la embriogénesis en determinadas células, y se basa en la suposición de que ciertas células
que conducen a la embriogénesis somática han sido reprogramadas in vitro. Obviamente estas interpretaciones han
sido difíciles de demostrar, a causa de los problemas para determinar las células potencialmente embriogénicas dentro
del explante y del callo. Las interpretaciones de los eventos que ocurren tempranamente en las células y que traen
consigo la diferenciación de plantas a partir de callos siguen siendo hipotéticas. Steward et al. (1958; 1964)
propusieron que la diferenciación dependía del aislamiento físico o fisiológico de las células en cultivo; sin embargo,
los estudios ultraestructurales de la embriogénesis somática en callos de zanahoria no respaldan esta interpretación
(Street et al., 1974). Las células cultivadas que forman estructuras poliémbriónicas poseen paredes celulares gruesas
(Button et al. , 1 974). Las primeras interpretaciones tempranas del fenómeno regenerativo efectuadas por Skoog et
al. (1948 y 19S7) sugirieron que la organización era dependiente de las interacciones cuantitativas entre los
reguladores de crecimiento y otros factores. De esta manera, dentro de un cultivo puede haber gradientes fisiológicos
que determinen la diferenciación. Street (1976) propuso que las células pequeñas isodiamétricas, con un núcleo
prominente y con vacuolas pequeñas que poseen potencialidad para la diferenciación, tienen cierto patrón de
expresión genética y se diferenciarán cuando sean expuestas a las señales apropiadas; esto implica un cambio a un
nuevo patrón de expresión del gene. Thorpe (1980) ha propuesto tres requerimientos para un desarrollo organizado
de novo: la diferenciación celular, la interacción celular y una respuesta a las señales específicas. Hay por lo menos
dos factores que pueden controlar la formación de centros organizados (Street, 1976). Las células en división activa
pueden estimular la división en las células adyacentes, y este grupo de células, que se dividen rápidamente, viene a
ser como un recipiente de nutrimentos o metabolitos de las células ubicadas junto a él, impidiendo que éstas se
dividan.
Factores que afectan la embriogénesis somática
Explante.
Virtualmente, todos los tejidos vegetales tienen capacidad para formar callos in vitro; sin embargo, relativamente
pocos explantes tienen la habilidad para producir callos embriogénicos. Comúnmente se han usado como explantes
partes de plántulas como cotiledones, hipocótilos y embriones; adicionalmente, se han usado ápices caulinares,
segmentos de tallos, hojas, raíces e inflorescencias inmaduras. Según Ammirato (1983), estos explantes se han usado
con éxito para obtener callos embriogénicos en varias especies de la mayoría de las familias de plantas. Los embriones
inmaduros se usan generalmente en los pastos (Gamborg et al., 1970) y en los cereales (Vasil et al., 1980); sin embargo,
también se ha empleado la porción basalde las hojas jóvenes del mijo (Hayduet al., 1981) y del sorgo (Wernicke et al.,
1980), así como las inflorescencias jóvenes (Vasil, 1982). En las gramíneas es importante la posición de los embriones
cigóticos en el cultivo; el eje embrionario debe estar en contacto con el medio. Con las plantas leñosas, la selección
del explante se hace en forma muy restringida. Se ha inducido embriogénesis somática en núcelas aisladas de Citrus
sp. (Rangan et al., 1968) y de Mangifera indica (Litz, 1984a) y a partir de la núcela de óvulos cultivados de Citrus sp.
(Button et al., 1977), Vitis vinifera (Mullins et al., 1976), Ribes rubrum (Zatyko et al., 1975), Malus domesticum
(Eichholtz et al., 1979), Mangifera indica (Litz et al., 1982), especies de Eugenia (Litz, 1984b) y Myrciaria cauliflora (Litz,
1984c). Se ha estimulado el desarrollo de callos embriogénicos a partir de varios tipos de explantes obtenidos de
palmas; entre ellos están los embriones cigóticos (Rabechault et al., 1970), las hojas jóvenes (Pannetier et al., 1982),
las inflorescencias (Branton et al., 1983), los ápices radicales (Smith et al., 1970) y los ápices de los retoños de palma
datilera (Reynolds et al., 1979). También se ha informado que la embriogénesis somática ocurre en el endosperma de
Crotón bonplandeanum (Bhojwani, 1966) y de Santalum álbum (Lakshmi Sita et al., 1980), dando como resultado
plantas triploides. También como resultado de la embriogénesis somática se han recuperado plantas haploides de
varias especies como Datura innoxia (Guha et al., 1964) y Nicotiana tabacum (Nitsch, 1969), a partir de anteras cultiva
das in vitro. La respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de la planta. Algunos cultivares se pueden
regenerar fácilmente en un medio específico, mientras que otros cultivares no responden en el mismo medio (Litz,
1984a). El estado de desarrollo de la planta madre afecta la respuesta morfológica del explante; Banks (1979) observó
que los explantes obtenidos a partir de plantas maduras de Hederá helix formaban callos embriogénicos, mientras que
ello no ocurría con explantes de plantas jóvenes.
Medio de cultivo.
Generalmente se ha usado el medio desarrollado por Murashige et al. ( 1 962) o la modificación de esta formulación
(Evans et al. , 198 1); la concentración alta de sales de este medio parece ser muy benéfica para el crecimiento de
embriones somáticos (Ammirato, 1983). Wetherell (1984) ha demostrado que es posible aumentar el potencial
embriogénico de los callos de zanahoria exponiéndolos a niveles altos de sacarosa o de manitol; la sacarosa se usa en
concentraciones de 2% a 3% y hasta 12%. El nitrógeno, suministrado como nitrato o como ion amonio, es esencial
(Halperin et al., 1965a; Reinert, 1967); el nitrógeno orgánico provisto por la glutamina y la alanina (Wetherell et al.,
1976; Kato et al., 1966), por la caseína hidrolizada (Ammirato et al., 1971) o por el AC (Steward et al., 1959) es también
beneficioso y puede remplazar el nitrógeno inorgánico en el medio. El hierro es también esencial para la embriogénesis
somática (Havranek et al., 1979) ya que en ausencia de ese elemento, los embriones somáticos globulares no son
capaces de desarrollarse hasta la madurez. Los niveles altos de sacarosa parecen tener un efecto comparable al
producido por el ácido abscísico. Las concentraciones altas de esta sustancia estimulan la formación de los callos
embriogénicos (Lu et al., 1982) y reducen la frecuencia de anormalidades de desarrollo tales como la formación de
embriones secundarios, la fasciación y la formación de policotiledones; también inhiben la germinación precoz
(Ammirato et al., 1971). El carbón activado se ha usado para superar problemas específicos de oxidación, los cuales se
asocian con el cultivo de tejidos de palmas (Rey nolds et al., 1979). La adición de esta sustancia a los cultivos
embriogéni cos promueve su desarrollo cuando éste ha sido inhibido, ya que al parecer absorbe del medio los
compuestos fenólicos (Fridborg et al., 1978), las auxinas y citocininas (Weatherhead et al., 1978) que inhiben el
desarrollo del embrión somático. Además, permite la germinación y la maduración de los embriones (Litz et al., 1980;
Fridborg et al., 1975). En estudios recientes se ha demostrado que el uso de poliaminas tales como la espermina, la
putrescina y la espermidina está relacionado con el control de la embriogénesis somática en Daucus carota (Fienberg
et al., 1985). Las poliaminas, incorporadas al medio de callos embriogénicos de zanahoria, inhiben el desarrollo de los
embriones somáticos; los subcultivos, en cambio, en un medio libre de poliaminas pero que contenga arginina,
permiten el desarrollo normal del embrión (Bradley et al., 1984).
Reguladores del crecimiento.

De acuerdo con Evans et al. (1981) la mayoría de los sistemas embriogénicos requieren, para la inducción de los
embriones, de una concentración alta de auxina (generalmente 2,4-D) en el medio. Para las gramíneas, el 2,4-D es la
única auxina que se usa. En Daucus carota han sido efectivas varias auxinas, por ejemplo ANA (Ammirato et al., 197
1), AIA (Sussex et al., 1968) y 2,4-D (Halperin et al., 1965b). Otras auxinas sintéticas tales como el picloram, el 2,4,5-T,
el ácido 2-benzothiazol acético, y el ácido paraclorofenoxiacético han demostrado ser bastante efectivas. La
concentración usual de 2,4-D está, dentro del rango de 0.5-27.6 uM (Evans et al., 198 1), aunque se deben usar
concentraciones más altas, por ejemplo 450 uM de 2,4-D, en caso de que el carbón activado se incorpore al medio
(Reynolds et al., 1979). El papel de las citocininas en el medio primario o inductor del embrión es menos claro, aunque
normalmente este medio incluye una de ellas. Evans et al. (1981) muestran que las citocininas se usan en el medio
primario para el 65.4% de las especies explotadas por el hombre y para 2 1 .4% de las especies no cultivadas; el üso
de estas sustancias en el medio de subcultivo es menos frecuente (en 34.6% de las especies explotadas por el hombre
y en 14.1% en las especies no cultivadas). Fujimura et al. (1980) han sugerido que las citocininas pueden ser esenciales
para la maduración y la germinación de los embriones somáticos. El ácido giberélico (AG) también se ha incorporado
al medio con el fin de ayudar a la maduración normal y a la germinación de los embriones somáticos de Panicum
máximum (Lu et al., 1981), Santalum álbum (Lakshmi Sita et al., 1979) y Citrus sinensis (Kochba et al., 1974). Se han
usado inhibidores del crecimiento tales como el ácido abscísico (ABA), el cual reprime la embriogénesis somática y
reduce la frecuencia de anormalidades de desarrollo como son la formación secundaria de embriones a partir de
embriones somáticos y la germinación precoz (Ammirato, 1973; 1974); las concentraciones de ABA más usadas
fluctúan entre 0. 1 y 1 .0 uM. Las antiauxinas han sido efectivas de la misma forma que el ABA (Fujimura et al., 1979).
Condiciones del medio ambiente.

En contraste con la cantidad de información que se ha divulgado sobre la optimización de los medios de cultivo y del
uso de sustancias de crecimiento, poca atención se ha dedicado a los parámetros físicos que influyen en el crecimiento
y el desarrollo in vitro. Una alta intensidad lumínica ha sido esencial para obtener embriogénesis somática en Nicotiana
tabacum (Haccius et al., 1965), aunque en Daucus carota (Ammirato et al., 1971) y en Carum sp. (Ammirato, 1974) fue
necesaria la oscuridad para el desarrollo y la maduración normal de los embriones. Pretratamientos con frío se han
usado rutinariamente para estimular la embriogénesis somática a partir de anteras cultivadas (Nitsch, 1974). Los
medios de cultivo semisólidos se han empleado para el crecimiento de callos y para estimular la embriogénesis
somática; Ammirato (1983) demostró que cuando se utilizan medios líquidos, el tipo de recipiente usado para el cultivo
tiene un efecto muy grande sobre la embriogénesis. Es preferible agitar suavemente el medio porque así se obtienen
menos anormalidades en el desarrollo que cuando se agita vigorosamente. La adición de ABA previene el desarrollo
anormal, sin importar el tipo de recipiente o el grado de agitación.
Otros factores
Es difícil obtener una sincronización en los cultivos en suspensión. Para obtener una suspensión homogénea, los
cultivos se pasan usualmente por una serie de filtros. También es posible alcanzar un cierto grado de sincronización
por medio de una exposición previa de los cultivos al ABA o a las poliaminas. Tal como lo indicó Ammirato (1983), es
difícil demostrar el control sobre la maduración y la germinación; estos estados son altamente plásticos (adaptables)
dependiendo del genotipo y de las condiciones de cultivo. Después de un período prolongado de cultivo, el potencial
embriogénico del callo declina; Halperin (1966) y Smith et al. (1974) asociaron este hecho con una acumulación de
cambios genéticos que ocurrían en las células en cultivo. Algunas veces es posible restaurar el potencial embriogénico
de los cultivos incrementando la concentración de sacarosa (Jones, 1974), o alterando las proporciones de nitrógeno
y de auxina (Reinert, 1973). Fuera del grupo de las angiospermas se han dado muy pocos ejemplos de embriogénesis
somática, aunque es posible la regeneración de plantas de Pinus palustris (Sommer et al., 1975) y de Zamia integrifolia
(Norstog et al., 1967). Las especies de plantas leñosas, en general, han sido difíciles de regenerar in vitro; se exceptúan
aquellas especies que pueden producir callos embriogénicos a partir de la núcela.
Procedimiento para inducir la embriogénesis somática en zanahoria

Comúnmente se describen dos modelos de los sistemas típicos para inducir embriogénesis somática in vitro. El primer
sistema, que se desarrolló a partir de las núcelas de Citrus, es un ejemplo de embriogénesis somática de células
preembriónicas; en el Capítulo 8 se describe un sistema similar para el mango. Otro sistema modelo es el de la
zanahoria (Daucus carota), que se ha usado para estudiar la inducción, el desarrollo y la bioquímica de los embriones
somáticos. El siguiente es el procedimiento que comúnmente se emplea para establecer callos embriogénicos y para
estudiar el desarrollo embrionario:
1) Esterilice superficialmente los pecíolos (1.0 cm de largo) o los ápices radicales (0.5 cm de diámetro) de zanahoria
(Daucus carota). Para ello, sumerja estos tejidos en una solución al 10% de NaOCl (utilice productos de uso doméstico
al 10%); esta solución debe contener 2 gotas de Tween-20 por cada 100 ml de solución. Diez minutos después,
enjuague tres veces con agua destilada estéril.
2) Cultive los explantes en caj as Petri en el medio sólido de Murashige et al. (1962), suplementado con 1 a 2 mg/ litro
de 2,4-D y 30 mg/ litro de sacarosa. La formación de callos ocurre a los pocos días.
3) Inicie los cultivos en suspensión después de 4 a 5 semanas, cuando haya suficientes callos. Inocule
aproximadamente 30 g de callo en un Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de medio líquido suplementado con
1 a 2 mg/ litro de 2,4-D. Todas estas operaciones se deben efectuar bajo condiciones estériles, en una cámara de
aislamiento.
4) Incube los cultivos en un agitador giratorio ( 1 50 rpm), a 25 °C, con un fotoperíodo de 16 h (1000 lux).
5) Para estimular el desarrollo embrionario, colecte los cultivos en suspensión filtrando a través de un filtro 'Millipore'
estéril. Subcultive a intervalos regulares, usualmente cada 2 ó 3 semanas. Subcultive las células en suspensión en un
medio líquido sin 2,4-D.
6) Después de 2 a 3 semanas, transfiera las suspensiones a un medio sólido para permitir el desarrollo y la germinación
de los embriones somáticos.
7) Transfiera las plántulas resultantes a una mezcla de perlita y arena (1:1) o a una mezcla 'Jiffy' y colóquelas bajo rocío
intermitente durante 10 días, hasta cuando estén en condiciones de ser cultivadas en invernadero.
Organogénesis
En contraste con la embriogénesis somática, la organogénesis comprende el desarrollo de yemas o de meristemas
radicales a partir de los explantes directamente o a partir de los callos.
Aspectos teóricos
Después de las primeras observaciones sobre formación de raíces adventicias (White, 1939) y de raíces principales
(Nobecourt, 1939) en cultivos de tejidos, Skoog, (1944) demostró el efecto estimulante de las auxinas en la formación
de raíces y su efecto inhibidor en la formación de yemas. El estímulo en la formación de raíces adventicias se puede
cambiar usando concentraciones altas de sacarosa o de fosfatos inorgánicos en el medio. Skoog et al. (1948)
demostraron que el sulfato de adenina promueve el desarrollo de yemas, lo cual indicó la posibilidad de obtener un
cierto control en la formación de órganos in vitro. Más tarde se demostró que la organogénesis dependía de la
concentración y de la proporción de estos constituyentes en el medio (Skoog et al., 195 1). El hallazgo del factor que
promovía la división celular en preparaciones degradadas de ADN, identificado como cinetina (Miller et al., 1955),
condujo al estudio realizado por Skoog et al. ( 1 957), en el que se demostró la importancia de las proporciones de
auxinaxitocinina en la determinación de la respuesta morfogenética in vitro. Una proporción alta de auxina comparada
con la de citocinina favorecía la formación de raíces, mientras una proporción baja favorecía la formación de yemas.
Por otra parte, la adición al medio de ciertos compuestos tales como la caseína hidrolizada (CH) modificaba la actividad
reguladora de las proporciones de auxinaxi tocinina. Esto sugirió que el balance de ciertos factores afectaría el proceso
de diferenciación y se consideraba como la base para el desarrollo de un medio definido de organogénesis in vitro.
Varias partes de una planta pueden responder diferentemente a idénticas condiciones de cultivo, y tales diferencias
reflejan el estado fisiológico de la fuente del explante (Tran Thanh Van, 1980). El estado fisiológico determinará
además los factores exógenos que se deben añadir al medio de cultivo, o que deben sustraerse de él, para poder
inducir la respuesta morfogenética requerida. Los factores endógenos podrán variar cuantitativamente de acuerdo
con las condiciones ambientales, el genotipo, el tipo de célula, y otros aspectos. A causa de esta complejidad de las
interacciones entre un gran número de variables que pueden afectar la respuesta de un explante, las influencias del
medio ambiente y los efectos del tejido no se pueden examinar individualmente.
Para que la organogénesis ocurra a partir de un callo, se deben producir cambios que conduzcan a la organización
celular. Thorpe (1980) ha pro puesto que este proceso involucra diferenciación celular, interacción celu lar y reacción
a señales específicas. El término organogénesis de novo en el cultivo de tejidos se refiere a la diferenciación dentro
del explante (Thorpe, 1980). Por ejemplo, a partir del floema externo de segmentos de tallo de tabaco cultivado in
vitro se desarrollan mefistemas primarios (Sterling, 1951), mientras que del protoxilemade raíces de explantes de
Convolvulus spp. se desarrollan raíces y primordios de yemas (Bonnett y Torrey, 1966). La capacidad morfogenético
de algunos tejidos puede pasar desapercibida debido a la asociación de éstos con tejidos diferenciados que están
dentro de un sistema organizado (Chlyah, 1 974a). En contraste, la organo génesis a partir de callos subcultivados no
ocurre generalmente en asociación con las estructuras preexistentes. Nakano et al. ( 1974) distinguieron
morfológicamente, entre varios tipos específicos de callos de arroz, el que era capaz de producir organogénesis. Se ha
informado que divisiones al azar de las células pueden dar como resultado la formación de hileras radiales del tejido;
las regiones de mayor división celular forman 'meristemoides' que hacen que el callo tenga una apariencia nodular
(Thorpe, 1980). En la epidermis de explantes de Torenia sp. las regiones de rápida división celular se inician a partir de
algunas células que, eventualmente, estimulan la división de las células circundantes (Chlyah, 1974b); las células que
se encuentran hacia adentro de estos grupos se dividen rápida mente, mientras que las de la periferia se dividen
lentamente. Estas zonas de división celular resultan de la capacidad misma de células activamente divisorias, las cuales
a su vez estimulan la división en las células adyacentes; éstas toman nutrimentos y metabolitos a partir de las células
periféricas, limitando la potencialidad divisoria de estas últimas (Street, 1976). Una función primaria de la mitosis en
la organogénesis es la formación de un número crítico de células én división activa; éstas son capaces de responder a
las señales de desarrollo (Thorpe, 1983). Los meristemoides o regiones localizadas de células en división activa (Torrey,
1966) se componen de células pequeñas, isodiamétricas, con un citoplasma denso, vacuolas pequeñas y núcleos
prominentes; usualmente contienen varios orgánulos (Asbell, 1977) y grandes cantidades de almidón (Thorpe, 1983),
del cual requieren en cantidad considerable durante su diferenciación (Thorpe et al., 1970). La mayoría de estos
meristemoides se asemejan a meristemas verdaderos y poseen conexiones vasculares con el callo o el tejido
circundante. Bajo condiciones apropiadas de cultivo pueden formar yemas o raíces primarias (Bonnett et al., 1966);
esta plasticidad está de acuerdo con las primeras observaciones de Skoog et al. (1957). Las proporciones internas de
los reguladores de crecimiento y los efectos del tejido dentro de un callo pueden afectar profundamente el desarrollo
(Ross et al., 1973). Así, concentraciones de 0.05-46 nM de citocininas, KIN o BAP por ejemplo, han sido efectivas en el
75% de las especies de plantas que han formado vástagos a partir de callos (Evans et al., 1981), mientras que las
auxinas, por ejemplo AIA y ANA, han sido más efectivas en concentraciones de 0.06 a 27 uM. Los meristemoides
periféricos del cultivo de Petunia inflata dan lugar a la formación de raíces y vástagos (Handro et al., 1973); en los
callos de arroz y de escarola, en cambio, se forman vástagos de la superficie de los meristemoides, mientras que de la
subsuperficie se forman raíces.
2. VARIACIÓN SOMACLONAL
II. Capitulo 5
Variación somaclonal
1 Introducción
El cultivo in vitro representa un momento de estrés para las células y tejidos vegetales y puede desencadenar procesos
mutagénicos durante el establecimiento del explanto, la inducción de callo y la formación de embriones o vástagos
durante el proceso de regeneración de plantas. Algunos de los cambios genéticos ocurridos en las plantas regeneradas
pueden resultar variantes atractivas, con utilidad potencial en el mejoramiento vegetal para el desarrollo de nuevas
variedades. Larkin y Scowcroft (1981) llamaron variación somaclonal a los cambios ocurridos en las plantas
regeneradas y que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de cambios reversibles
que pueden modificar la expresión de ciertos genes. Estos cambios que no implican alteración en la secuencia
nucleotídica se denominan “epigenéticos” (Madlung y Comai, 2004). Algunos autores los consideran variantes
somaclonales mientras que otros sólo incluyen en la misma aquellos cambios que no revierten en ciclos sucesivos de
reproducción sexual. Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido completamente
dilucidados. Sin embargo, se han propuesto varias causas de posible incidencia en la ocurrencia de la misma. Entre
esas causas se citan: el genotipo, la fuente de explanto, el tiempo en cultivo, las condiciones y composición del medio
de cultivo y la vía de regeneración. La comprensión de estas causas ayudaría a mejorar la interpretación de los procesos
celulares de respuesta al estrés y permitiría definir como actúan en los procesos de evolución. Entre los fenómenos
que ocurren durante el cultivo in vitro se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales,
recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, activación de
elementos genéticos transponibles, amplificación y metilación del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello,
aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la morfología floral, etc.) son fáciles
de evaluar, otros cambios no se manifiestan en variantes morfológicas evidentes. Una diferencia estructural en un
producto génico puede no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado, por
lo tanto, la variación debe analizarse a varios niveles. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la
aparición ocasional de variantes no encontradas en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el
punto de vista agronómico, permite utilizar este fenómeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado, en
algunos casos, para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que se incluyen:
resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica
involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del
cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontró
resistencia a la oruga militar en un cultivar que reunía otras buenas características, dando origen al cultivar Brazos-R3.
Si bien desde el punto de vista práctico no es una técnica muy eficiente, dado que no es posible predecir ni dirigir el
tipo de variación y se hace menester trabajar con poblaciones grandes de plantas, es necesaria la compresión del
mecanismo para evitarlo en casos donde se requiere fidelidad genética, como en la micropropagación, la conservación
de germoplasma y la transformación de plantas. En algunos casos puede representar una fuente de variación rápida y
de fácil acceso para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos
limitados o de base genética estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones
naturales o cultivadas puede ser limitada. Los primeros casos de variación somaclonal se registraron en plantas de
reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido observado en monocotiledóneas
como trigo, maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas
como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies.
2 Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal

Hemos mencionado, previamente, algunos de los posibles factores que tienen influencia en la aparición de variación
somaclonal. En este punto trataremos cada uno por separado.
Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo
y de las interacciones que surgen entre el mismo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran
niveles de variación que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10
y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una
herramienta para la obtención de variedades. El nivel de ploidía del genotipo es otro factor a tener en cuenta. Por
ejemplo en raigrás y en papa se observó que, durante el cultivo de tejidos, las variedades diploides muestran
estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías. La explicación más razonable para este
hecho es que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están “tamponados”, y por lo tanto
toleran la ganancia o pérdida de cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la regeneración.
En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las
plantas, llegando con éxito a esta etapa sólo aquellos explantos que tengan su complemento cromosómico completo.
Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados in vitro, si se los compara con las
especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los híbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x
Hordeum jubatum, donde el cultivo in vitro genera entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que suelen
contener sólo el genoma de Hordeum vulgare.
Explanto. La variación observada entre plantas regeneradas puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto
original. Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen diferentes linajes
celulares, esto se debe a una serie de cambios en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares producidos durante el
desarrollo. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las
diferentes líneas celulares pueden dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de
explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente “extra” de variación. Sin embargo, la
recuperación de quimeras a partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir, a partir
de procesos organogénicos, o por causas desconocidas. La utilización de explantos con tejidos organizados, como
esquejes radicales o caulinares, es una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo
in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos “seguros”. El cultivo de
meristemas aislados minimiza el riesgo de variación somaclonal. Esto no debe tomarse como regla, ya que utilizando
técnicas moleculares fue posible detectar variación en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas.
Ell cultivo de protoplastos parecería inducir inestabilidad genética, como fue observado en papa y tabaco; esto se ha
asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos tan
pequeños.
La vía de regeneración
también tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los
géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variación observada en cultivos embriogénicos fue relativamente menor
que la que obtenida en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta
en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. Se cree que el gran número
de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de
mutaciones deletéreas. Sin embargo, también se observaron variantes en plantas de café, apio y caña de azúcar
regeneradas a través de embriogénesis somática. En estos casos se advirtió que algunos fenotipos anormales de
embriones somáticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz. La
mayor parte de la variación obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. Los mecanismos de iniciación de un
callo parecen ser similares a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y
estimulan la inducción de enzimas y productos específicos de situaciones de estrés. La desdiferenciación que ocurre
durante la inducción del callo, altera procesos celulares que resultan en cambios genómicos, uno de los más frecuentes
es la inestabilidad cromosómica. La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida. Un callo
verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera
considerable variación. En varias monocotiledóneas el callo representa, a menudo, una masa de órganos suprimidos
o proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de
estabilidad genética, como se ha observado en espárrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observó que
muchas de las plantas regeneradas a partir de callos provenientes de semillas fueron anormales, mientras que las
obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenían los explantos. En
ocasiones, también fue posible observar variación en plantas obtenidas por regeneración directa, es decir, sin que
medie un proceso previo de desdiferenciación celular ni formación de callo. El estado físico del medio de cultivo
también influye en el nivel de variación obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo
cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad
cariotípica y/o incrementar el número de plantas albinas y también la deficiencia de oxígeno que se genera durante el
transcurso del cultivo. La tensión de oxígeno a la que están expuestas las células superficiales del callo es diferente a
la de las células situadas en profundidad. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría
comportarse como un mutágeno. Un efecto similar podría tener la acumulación de metabolitos producidos por las
propias células durante el cultivo. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4
diclorofenoxiacético), han sido señalados como inductores de inestabilidad. Estos ejercen profundos efectos sobre la
respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular. Por ello se especula acerca de su rol
indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Aparentemente
el 2,4-D induce desdiferenciación y provoca un incremento sustancial en la transcripción. Esto puede alterar la
estructura de la cromatina, por lo cual se lo utiliza en gramíneas como inductor de aneuploidías. La relación
auxina:citosina también suele afectar en este sentido. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido
naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de las citosinas, que
tienen lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores del ADN donde las citosinas se encuentran metiladas en posición
5 son considerados puntos calientes de mutación, ya que la desaminación de una 5-metilcitosina resulta en un cambio
de citosina a timina. Un estudio realizado en papa indicaría que el tipo y la concentración de los reguladores de
crecimiento en los estadios iniciales de cultivo in vitro no generaría variación genética. Los efectos serían más
importantes durante el crecimiento del callo y la iniciación de los vástagos. Estos datos sugieren que la fase de callo
sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas; de
manera que las hormonas inducirían inestabilidad genética sin ser, necesariamente, el origen de la misma. La
deficiencia o exceso de minerales en el medio de cultivo podrían ser causa de variación. Este fenómeno se ha
observado también en plantas creciendo en condiciones de campo. Un ejemplo típico lo constituyen plantas de lino
sometidas a exceso o deficiencias de azufre, nitrógeno, fósforo, calcio y magnesio. En estas plantas se observaron
cambios genómicos estables y heredables. En este caso los cambios fueron inducidos por una fertilización excesiva del
suelo, obteniéndose así líneas estables, denominadas “genotrofos”, caracterizadas por diferente contenido de ADN
nuclear y citoplasmático. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación, aumentando la proporción
de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. Esto se ha
observado en ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrás triploide. La variación puede minimizarse realizando
subcultivos frecuentes de explantos jóvenes. El número óptimo de subcultivos podría estimarse empíricamente luego
de realizar pruebas de fidelidad genética en las plantas regeneradas, a través de subcultivos subsecuentes. Una
observación común es que en los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería
debido a la acumulación de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración. Sin
embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboración con el IBONE, demostró que
en plantas micropropagadas de paraíso gigante las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no
habiendo una relación lineal entre el número de subcultivos y la cantidad de variación obtenida. La variación en este
caso se detectó mediante la técnica de RAPDs a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002).
3 Cambios genómicos producidos durante el cultivo de tejidos
4 Niveles de detección de la variación somaclonalLas plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las
situaciones cambiantes de su entorno, pero en algún momento esa capacidad de amortiguación se vuelve deficiente
y los organismos caen en un estado de crecimiento subóptimo que parece inducir mecanismos de cambios genómicos.
Las bases metabólicas de la interacción entre el estrés y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura
se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses
ambientales, dependiendo de la intensidad del estrés y del estado de diferenciación de las células, en el momento de
experimentarlo. Estos cambios ocurrirían, en parte, debido a una pérdida del control del ciclo celular. Entre las
alteraciones genéticas se citan mutaciones puntuales, cambios en la estructura o el número de cromosomas y
activación de elementos genéticos transponibles. Estos últimos causan reorganizaciones moleculares, no solo por su
transposición, sino también porque generan amplificaciones y deleciones. El cultivo in vitro también incrementa la
frecuencia de intercambio entre cromátidas hermanas o “crossing over" somático. Varias hipótesis han intentado
explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como son las perturbaciones del
ciclo celular, las aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas, la activación de transposones y las mutaciones
génicas. Kaeppler y Phillips (1993) proponen la existencia una base molecular común para todos estos eventos
mutagénicos que comprendería una alteración en los patrones de metilación del ADN. Estos cambios en la metilación
podrían afectar la expresión de genes específicos, incluyendo elementos transponibles o podrían afectar la estructura
de la cromatina de una manera más global, involucrando, por lo tanto, a un gran número de genes. El mecanismo por
el cual suceden estos cambios no ha sido totalmente dilucidado pero se los ha vinculado con una replicación tardía de
la heterocromatina que también provocaría eventos de ruptura cromosómica. Los cambios en los modelos de
metilación causados por el cultivo de tejidos no serían aleatorios y en raigrás se ha propuesto la existencia de puntos
calientes de inestabilidad en el ADN genómico. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrés severo de
nutrientes o de agua no experimentan el mismo tipo de cambios encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro.
El cultivo de tejidos podría representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrés, que podría inducir una respuesta
única y un perfil particular de mutación. Un posible efector de esta variación podrían ser los reguladores de
crecimiento. En cuanto a los cambios en el número de cromosomas, la poliploidía es el más común de estos
fenómenos, y estaría relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploidía puede surgir por segregación
desigual en la mitosis o por fragmentación nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el número
cromosómico pueden afectar el fenotipo. En papa, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploidía o por
duplicación cromosómica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides presentaban cambios
fenotípicos evidentes. La variación somaclonal también puede afectar el genoma de los plástidos y las mitocondrias.
En plantas de sorgo androestériles obtenidas in vitro se observó restauración parcial de la fertilidad y en plantas
androestériles de maíz con citoplasma “ T ” (que eran, además, susceptibles a Helminthosporium maydis) hubo
reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad al patógeno. Estos cambios se correspondían con mutaciones
en el ADN mitocondrial. Otro caso de variación debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta
frecuentemente en el cultivo de anteras de Gramíneas. En plantas albinas de trigo obtenidas por cultivo de anteras se
observaron deleciones y rearreglos en el ADN de los cloroplastos. Si bien parecería que los tejidos somáticos son
menos sensibles a la variación, también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos.
4 Niveles de detección de la variación somaclonal

Los mecanismos que operan para inducir variación son numerosos y diversos y, probablemente, actúan en simultáneo,
conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones
genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico, ya que las mismas podrían
ser potentes fuentes de material para seleccionar variantes de interés y desde un punto de vista teórico, ya que
posibilitarían realizar estudios básicos acerca de las causas de la variación y el posible control de la misma. La
ocurrencia de variación somaclonal puede detectarse con marcadores morfológicos, bioquímicos y moleculares. La
correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante para su implementación en
los programas de mejoramiento. La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales ha
sido exitosa desde el punto de vista del mejoramiento y citada en varios trabajos de investigación. El examen visual y
la utilización de un analizador de imágenes posibilitaron la diferenciación entre fenotipos normales y aberrantes en
Pelargonium. También se detectaron cambios en altura, tamaño de hojas, número y peso de semillas de plantas de
maní obtenidas in vitro. En ananá se observaron cambios estables en el color y textura de las hojas, tamaño de los
frutos y tasa de proliferación de vástagos; el cultivo de tejidos de violeta africana resultó en un 67% de variación en el
color de las flores de plantas regeneradas. A nivel fisiológico, tanto en cereales como en frutales se detectaron y
seleccionaron variantes que presentaron resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales y condiciones de
acidez en el suelo, entre otros. Estos estudios se basaron en la utilización de altas presiones de selección durante la
regeneración, mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración, como
inóculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo
permite revelar cambios en el número de cromosomas (poliploidías, aneuploidías) y en la estructura de los mismos
(translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones). Las alteraciones cariotípicas constituyen una fuente
importante de variación, que muchas veces es subestimada cuando se trabaja con métodos tradicionales de conteo
cromosómico. Las técnicas de bandeo cromosómico brindan más información acerca de la estructura cromosómica y
las alteraciones que pueden surgir en este sentido. Por ejemplo, en plantas de Brachycome dichromosomatica
regeneradas a partir de suspensiones celulares, esta técnica permitió detectar reordenamientos cromosómicos,
mientras el número cromosómico permaneció estable. La hibridación in situ es otra de las técnicas que permiten
examinar los cariotipos de una forma más exacta y resulta particularmente útil para revelar anormalidades en la
estructura de los cromosomas. Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar plantas regeneradas y sus
progenies, se encuentran las isoenzimas. Las mismas permitieron detectar variación en plantas de Populus tremuloides
regeneradas a través de callos. El análisis se realizó mediante electroforesis en geles de almidón, utilizando los sistemas
isocitrato deshidrogenada (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco-
isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6- PGD). Los patrones electroforéticos permitieron diferenciar
las plantas control de las variantes, sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este ensayo no presentaron
polimorfismos en los loci estudiados. Tampoco se encontraron variantes cuando se estudiaron líneas de callos
derivadas de embriones cigóticos y somáticos de abeto. Los 25 loci analizados, utilizando 15 sistemas isoenzimáticos,
mostraron fenotipos isoenzimáticos normales. Otro ejemplo, utilizando esta metodología, se llevó a cabo en líneas
isogénicas de Trifolium pratense L. que diferían en su capacidad de regeneración. En este caso los patrones
isoenzimáticos de esas líneas resultaron idénticos para los sistemas de peroxidasas (PRX), glutamato deshidrogenadas
(GDH), alcohol deshidrogenasas (ADH) y esterasas (EST). Si bien las isoenzimas aportan información útil acerca de la
variación generada in vitro, su análisis refleja los productos de genes expresados, cuya regulación puede estar en cierta
medida afectada por factores ambientales o fisiológicos. Por otro lado, sólo se transcribe y traduce una pequeña
proporción del genoma. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas sobre las isoenzimas ya que permiten
detectar mutaciones en diferentes tipos de secuencias y además, porque no son influenciados por el ambiente, ni por
los estadios fenológicos. Los RAPDs (fragmentos polimórficos de ADN amplificados al azar) permitieron detectar la
existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas de callo. Estos marcadores también se utilizaron
para evaluar la fidelidad genética en plantas regeneradas de pino, abeto, festuca, roble y gingseng,. En caña de azúcar,
los marcadores RAPDs permitieron comprobar la susceptibilidad diferencial del genotipo al pasaje por cultivo in vitro,
además de reunir información para encarar nuevos cruzamientos en programas brasileros de mejoramiento de esta
especie. Existen numerosos ejemplos que indican que la variación molecular no siempre se expresa a nivel fenotípico
y viceversa. Por ejemplo en el género Musa, la técnica de RAPDs reveló polimorfismos en plantas micropropagadas de
fenotipo normal. Del mismo modo, plantas regeneradas de palmera datilera que presentaban fenotipos florales
anormales, tuvieron patrones moleculares normales. Otros marcadores útiles son los AFLP (polimorfismo en la
longitud de fragmentos amplificados de ADN), que permitieron detectar la existencia de diferencias moleculares entre
plantas de banana con fenotipos normales y aberrantes. Los microsatélites o SSRs, iniciales de su nombre en inglés
“simple sequence repeats”, son altamente informativos, ya que son abundantes y están dispersos a través del genoma.
Estos marcadores se utilizaron para el análisis de plántulas de álamo, obtenidas por micropropagación, donde se
observaron microsatélites polimórficos, en plantas fenotípicamente normales. A veces, para detectar una variante
obtenida in vitro es necesario realizar pruebas específicas. Por ejemplo, cuando se evaluaron somaclones de Cynodon
dactylon en laboratorio, invernáculo y a campo, para resistencia a la oruga militar. Un somaclón, el Brazos-R3, tenía
un rendimiento equivalente al del cultivar madre, pero además era resistente a dicho insecto. Esto se debe a que
produce niveles más bajos de un estimulante para la alimentación del insecto. Es decir que mantenía los caracteres
agronómicos positivos del cultivar parental, pero tenía un cambio en la producción de un metabolito secundario que
confería resistencia a la oruga.
5 La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético La base del mejoramiento genético es la

optimización de las interacciones génicas. Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de
diversidad genética. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir
de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADNT, por elementos
transponibles o retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación somaclonal
proporcionaría una fuente adicional de variabilidad genética, potencialmente útil en programas convencionales de
mejoramiento.
Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera: • Es una
técnica poco costosa: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. • Constituye una forma rápida de
generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles de mejorar
a través de técnicas tradicionales. • Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. •
Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. • Las tasas de mutación son relativamente
elevadas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia
de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 –
10-9 mutaciones por par de nucleótidos por generación. • El conocimiento de las condiciones que generan
inestabilidad genética durante el cultivo in vitro, permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y
permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética. • El nivel de cambios no deseados es
menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría
de los cambios deletéreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas. Entre las
desventajas cabe mencionar: En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio
o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica. • La baja tasa
de regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad
morfogénica. • La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los
mejoradores. • Algunos somaclones son inestables (variación epigenética). • Algunos presentan alteraciones no
deseables como aneuploidía, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal
debería cumplir los siguientes requisitos: • Involucrar caracteres agronómicamente útiles. • El nivel de expresión del
carácter debe superar al de sus progenitores. • El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros
caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo. • La variación debe ser heredable y estable
(sin reversión) en la progenie. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia
práctica. El recurso es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta
más sencillo mejorar selectivamente una variedad de uso corriente que crear una nueva.
5.1 Estrategias para la selección de variantes útiles

Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal comprenden:
a) Obtención de plantas por cultivo de células o tejidos, que luego son analizadas para el carácter deseado.
CAPÍTULO 14 VARIACIÓN SOMACTONAL Y SU APLICACIÓN AL MEJORAMIENTO DE CULTIVOS
Variación Somaclonal
Está plenamente comprobado que ocurren modificaciones genéticas en las células y los tejidos cultivados in vitro.
Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas
regeneradas. Este fenómeno se conoce como variación somaclonal (Larkin y Scowcroft, 1981). Las observaciones
hechas indican que esta variación, que se recupera en las plantas regeneradas, resulta tanto de las diferencias
genéticas que preexisten en las células somáticas del explante como de efectos inducidos por los componentes del
medio de cultivo. Por consiguiente, la variación somaclonal puede usarse, con mucha frecuencia, para recuperar la
varia ción genética natural de una variedad. A diferencia de otros procesos de variación genética, se ha encontrado
variación somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurrencia de mutaciones
espontáneas, p. ej., es sólo de una en un millón. La variación somaclonal es superior también al mejoramiento por
mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de células individuales, la ocurrencia de
mosaicos es mínima. En la mayor parte de los casos, por tanto, los somaclones pueden estabilizarse en una generación;
las mutaciones, en cambio, requieren varias generaciones y retrocruces. La regeneración de plantas actúa como un
filtro que elimina casi todos los cambios deletéreos; los cambios genéticos que interfieren con la regeneración de las
plantas —por ejemplo, un bloqueo en el metabo lismo primario— no pasan por variación somaclonal a las plantas
regeneradas. La variación somaclonal puede causar una variación temporal (epigenética) o una variación genética. Por
definición, los cambios epigenéticos no se trasmiten meióticamente, razón por la cual no son útiles en el
fitomejoramiento. Una variación fenotípica tiene valor en el fitomejoramiento si proviene de una verdadera
modificación del material genético, ya que una variación celular puede provenir bien de una mutación, de un cambio
epigenético o de una combinación de ambos procesos (Meins, 1983).
Causas y manifestaciones
Un buen número de revisiones recientes sobre la variación somaclonal han tratado aspectos de este tema como su
ubicuidad, sus posibles causas, y su impacto potencial en el mejoramiento vegetal (Orton, 1984; Evans et al., 1984;
Larkin et al., 1984; Scowcroft et al., 1987; Karp y Bright, 1985). Por su parte, los mecanismos que dan origen a la
variación somaclonal son un tema de gran importancia, cuyo conocimiento permitirá principal mente aumentar el
nivel de variabilidad y lograr una manipulación efi ciente de las características que se desea modificar. Es necesario
entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad genética durante el cultivo de tejidos, por razones de orden
práctico. En primer lugar, la variación somaclonal es deseable para aumentar la ocu rrencia de variabilidad en el
mejoramiento de plantas; es además impor tante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos
sea esencial, como en la micropropagación rápida; es importante, en tercer lugar, para la conservación del
germoplasma in vitro; y es necesaria, finalmente, para controlar el mecanismo que genera esa misma variación. Varios
análisis han revelado un amplio espectro de eventos mutacionales que ocurren durante el cultivo de tejidos. Son ellos,
por ejemplo, los mutantes que obran como clásicos mutantes mendelianos; los cambios genéticos que afectan
caracteres controlados por familias multigénicas y que influyen en determinados rasgos poligénicos; y los cambios que
resul tan de la aparición de elementos trasportables (Scowcroft, 1984). La poliploidía y la aneuploidía, por su parte,
son variantes que ocurren frecuentemente a consecuencia de reordenamientos cromosómicos, tales como
duplicaciones, deficiencias, traslocaciones, y otros intercambios (Scowcroft et al., 1987). El origen de la variación no
siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. Puede ser, por ejemplo, un reordenamiento cromosómico,
considerado el principal mecanismo que genera la variación somaclonal; puede deberse también a un entrecruce
(crossing over) somático, a un intercambio de cromátidas hermanas, a una alteración de los nucleótidos por
metilación, a una perturbación dé la replicación del ADN por culpa de un depósito de nucleótidos alterados, o también
al silenciamiento o activa ción de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas. En varias especies
cultivadas se ha detectado variación somaclonal, y se ha demostrado el control genético de las mutaciones —mediante
pruebas de trasmisión genética o análisis de ADN— sólo en las siguientes: en tomate (color del fruto, resistencia a las
enfermedades), en tabaco (color de la hoja, manchas en la hoja), en alfalfa (color de la flor), en papa (número de copias
del ADN ribosomal, patrón de restricción del ADN mitocondrial), en trigo (patrón de la izoenzima ADH), y en arroz. Se
han detectado cambios en el ADN mitocondrial del maíz y la papa. La poliploidía es el cambio más frecuente observado
en los somaclones. Otra variación significativa encontrada en éstos es la recombinación mitótica, que puede ser causa
de mutaciones homocigóticas de genes individua les. Además, se han detectado mutaciones simples en los genes
nucleares de los somaclones, y también variaciones en los genes citoplasmáticos. Dado que los fitomej oradores han
tenido acceso solamente a la varia ción trasmitida normalmente por meiosis, la recuperación de los produc tos de la
recombinación mitóticaen los somaclones constituye la fuente de una nueva variación genética para el
fitomejoramiento. Una mutación de un solo gen ocurre en los somaclones cuando la variación no aparece en las
plantas regeneradas (SC,) pero sí aparece en una proporción de 3: 1 en la progenie (SC2) de la autofecundación. Para
comprobar que el carácter en cuestión es controlado por un solo gen, se deben realizar pruebas de progenie en plantas
individuales SC2 selecciona das: así se identifican segregantes y no segregantes y se asegura la trasmi sión 3:1 a las
poblaciones segregantes. Las plantas imitantes no deben variar en la generación SC3. El procedimiento general para
buscar y seleccionar la variación somaclonal dentro de una variedad dada es el siguiente: 1) regeneración de plantas
a partir de callos; 2) crecimiento de las plantas en el invernadero hasta la madurez (plantas SC^ e identificación de las
plantas SQ fértiles (por la formación de flores, frutos y semillas); 3) identificación de líneas mejoradas respecto a
caracteres específicos dentro de las plantas SC2, en el invernadero, y traslado al campo de muestras, duplicadas de
semillas SC2, de los nuevos somaclones identificados; 4) pruebas de campo según un diseño experimental apropiado
para evaluar la estabilidad de los somaclo nes; será necesario hacer selecciones en las plantas SC2, para comprobar la
estabilidad hereditaria; 5) reintroducción de las nuevas líneas promisorias en el cultivo de tejidos, para explorar algún
carácter adicional o para mejorar el comportamiento agronómico de un somaclón relacionado con ellas; este último
paso expresa el objetivo del uso de la variación somaclonal.
Potencial para el mejoramiento de plantas

Uno de los mayores beneficios de la variación somaclonal es la obten ción de variabilidad genética en cultivares
agroeconómicamente útiles, la cual se ha obtenido tradicionalmente recurriendo a la hibridación.
Los somaclones mutantes pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro con las siguientes características: resistencia
a enfermedades y a herbicidas, y tolerancia al estrés químico o ambiental. Además, la introgresión de genes de
cultivares silvestres en especies cultivables es posible a juzgar por el reordenamiento de cromosomas observado hasta
ahora en las plantas regeneradas in vitro. En general, esta técnica es relativamente sencilla, comparada con la del DNA
recombinante, y es también una buena fuente de variabilidad genética; las plantas se pueden manipular fácilmente y
se evalúan como parte de un programa de mejoramiento (Evans y Sharp, 1986). La variación somaclonal será muy útil
para incorporar nuevas caracte rísticas a una variedad, o para modificar las que ésta tiene; en efecto, la variabilidad
genética inherente al somacultivo permite mejorar significati vamente el valor agronómico de una especie cultivada.
En conclusión, el futuro desarrollo de la variación somaclonal depende del uso que hagan de ella los programas de
mejoramiento y del estableci miento de una relación provechosa entre los investigadores del cultivo de tejidos, los
genetistas y los fitomejoradores.
Variación Somaclonal en el Género Stylosanthes

El género Stylosanthes contiene algunas especies forrajeras de importan cia económica que han mejorado la
producción ganadera en los países de la zona tórrida. Se caracterizan ellas por su alto rendimiento de materia verde
obtenida por corte, su buen crecimiento en suelos relativamente pobres, su tolerancia a la acidez, su resistencia a la
sequía, su propagación y mantenimiento fáciles, y su buen comportamiento en praderas en asocia ción con las
gramíneas. Producen forraje de gran calidad y de alto valor nutritivo y resisten el pastoreo continuo, pero desaparecen
bajo el pastoreo intenso. Stylosanthes guianensis es una leguminosa forrajera distribuida am pliamente en el centro y
sur de América tropical. Ya fue introducida en Australia, Africa, Asia, y recientemente en los Estados Unidos (Mcllroy,
1973). Esta leguminosa es muy promisoria, especialmente sus cultivares del grupo 'tardío', a pesar de que el ataque
de la enfermedad antracnosis, causada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides, limita un poco su producción
(Lenné et al., 1983). La antracnosis es una enfermedad endé mica, ampliamente difundida en las regiones tropicales
del centro y sur de América. La eficiencia en el mejoramiento de una especie vegetal depende de la disponibilidad de
la variación genética, de la selección, de la fijación genética, y de la rápida propagación de los materiales
sobresalientes. Los métodos de cultivo de tejidos pueden integrarse a un programa de mejo ramiento para aumentar
la eficiencia de algunos de los procesos mencio nados (Jaramillo, 1982). Tres programas de fitomejoramiento se
enfocan actualmente hacia S. guianensis (Cameron et al., 1984). Uno de ellos aplica intensamente la evaluación de
repeticiones vegetativas de cruzamientos al azar, para selec cionar genotipos superiores de S. guianensis; este
programa utilizaría, con grandes beneficios, la repetición en gran escala que proporcionan las técnicas in vitro.
Cualquier programa de fitomejoramiento se puede bene ficiar de las nuevas fuentes de variabilidad genética si éstas
aportan genes que no se puedan obtener fácilmente de fuentes convencionales. De espe cial valor serían los nuevos
atributos genéticos logrados en las variedades ya adaptadas. En este capítulo se estudia la importancia de la variación
somaclonal obtenida mediante el cultivo de tejidos in vitro de S. guianensis. La regeneración de plantas a partir del
cultivo de callos ha sido demos trada en varias especies del género Stylosanthes: S. capitata y S. leiocarpa (Mroginski
y Kartha, 1984), S. hamata (Scowcroft y Adamson, 1976), S. guianensis (Mroginski y Kartha, 1981; Meijer y Steinbiss,
1983), y S. humilis (Meijer, 1982). También han sido regeneradas plantas de suspensiones celulares de S. guianensis
(Mroginski y Kartha, 1984; Meijer y Steinbiss, 1983). En cam bio, los informes sobre cultivo de protoplastos de
leguminosas han sido escasos hasta ahora (Mroginski y Kartha, 1984); se han obtenido resulta dos promisorios en
Trifolium repens (Gresshoff, 1980), en Medicago sativa (Dos Santos et al., 1980; Kao y Michayluk, 1980; Johnson et al.,
1981; Latunde-Dada y Lucas, 1983), y en M. arbórea (Mariotti et al., 1984). El aislamiento y el cultivo de los
protoplastos de Stylosanthes se consi dera difícil (Mroginski y Kartha, 1984); la regeneración de plantas ha sido lograda
solamente de protoplastos derivados de suspensiones celulares de S. guianensis donde la eficiencia de plaqueo fue
relativamente baja (Meijer y Steinbiss, 1983). Szabados y Roca (1986) regeneraron plantas de dos accesiones de S.
guianensis partiendo de mesófilos foliares y de suspensio nes celulares.
3. CULTIVO DE TEJIDOS
IV. Capítulo 1
Micropropagación Sofía Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano
1 Introducción
La micropropagación consiste en la propagación de plantas en un ambiente artificial controlado, empleando un medio
de cultivo adecuado. El cultivo es así una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el
potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa
de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales; esto
es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. Así, las células
somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos de acuerdo con la competencia que
posea y al estímulo que reciban . Dependiendo de las características de la planta que se pretenda propagar y del
objetivo perseguido, la micropropagación puede realizarse a través de tres vías de regeneración: brotación de yemas
adventicias preexistentes, producción de yemas de novo y embriogénesis somática.
El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatización se logren simultáneamente y que raramente
se forme callo en la base de las estacas, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz. Sin
embargo, el estrés asociado a la transpiración acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede
reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero
o cámaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas que permitan lograr la
rusticación de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes substratos, mezclas de
tierra y arena y/o abonos, los cuales convienen que estén debidamente desinfectados.
3 Propagación de especies leñosas

El empleo de clones en programas de reforestación de muchas especies genera al menos un 10 % de incremento en
ganancia genética en relación al empleo de plantas regeneradas por semillas de árboles selectos. Sin embargo, la
máxima ganancia genética puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagación sexual y agámica. La
reproducción sexual es importante para la introducción de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el
mejoramiento de características controladas por efectos aditivos de genes. La reproducción asexual por otro lado
permite la multiplicación de individuos o grupos de individuos seleccionados de una población elite, que exhiben una
significativa ganancia genética debida a efectos no aditivos de genes. Tradicionalmente, las especies forestales fueron
propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en coníferas, así como por
injertos. La propagación por estacas de Cryptomeria japonica (cedro japonés), Populus spp. (álamos) y Salix spp.
(sauces) ha sido llevada a cabo durante siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la mayoría de los árboles propagados
por estacas se observa una rápida pérdida de capacidad de rizogénesis al aumentar la edad de la planta donante de
las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de la micropropagación es la capacidad potencial de
desarrollar protocolos de multiplicación optimizados para multiplicar árboles adultos que han demostrado ser
fenotípicamente superiores. Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron,
en el año 1940, a la formación de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la década del 40 se publicaron
logros adicionales en al producción separada de vástagos y raíces en especies latifoliadas. En 1950 se publicó por
primera vez la obtención de organogénesis en coníferas, con la formación de vástagos a partir de callos de Sequoia
sempervirens. En la década 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de álamo (Populus tremuloides) y Pinus
palustris. En ambos casos la formación de plántulas se logró vía organogénesis. Luego del año 1975 la
micropropagación de especies latifoliadas se realizó a través de la regeneración indirecta, pasando por una etapa de
callo. El principal método utilizado para especies latifoliadas es la brotación de yemas adventicias, empleando ápices
de vástagos, yemas laterales y microestacas. En las coníferas, la elongación de las yemas axilares a partir de
braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los
constituyen las yemas y vástagos en activo crecimiento más que las yemas en estado de dormición. Los vástagos se
colectan en primavera y a principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminación.
Alternativamente las yemas en dormición pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas.
Para la inducción de vástagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas.
La más usada es la N6-benciladenina (BA) o también llamada 6-bencil amino-purina (BAP) y el tidiazurón (TDZ). Los
medios basales más usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog, 1962) o el WPM (Lloyd & McCown,
1981). Para el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrógeno
resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. La inducción de yemas
adventicias es el método más empleado para gimnospermas y angiospermas. En este caso, las yemas se inducen
directamente sobre el explanto en ge-neral sin previo pasaje por una etapa de callo. En general, cuanto más joven es
el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organogénesis de novo. Los explantos más
frecuentes son embriones cigóticos maduros, seguido de cotiledones y epicótilos de plántulas. Generalmente se utiliza
BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como única fuente de inducción o en combinación con otras
citocininas. La adición de auxinas puede ser beneficiosa, aunque en coníferas se ha encontrado que promueve la
formación de callo y reduce el proceso de organogénesis. En algunos casos, como en Populus spp., la formación de
yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El método llamado multiplicación
mediante nódulos meristemáticos es un método también utilizado para Pinus radiata y álamo. En este caso se obtiene
básicamente un tejido meristemático (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego
inducir la producción de vástagos. La disponibilidad de protocolos vía embriogénesis somática para especies forestales
es aún limitada. En la angiospermas los primeros embriones somáticos se obtuvieron de Santalum album, donde sin
embargo no fue posible la obtención de plantas completas. Recién 20 años después pudieron lograrse plantas
completas de abeto (Picea abies), una gimnosperma. En las gimnospermas los mayores éxitos se lograron empleando
como explantos embriones cigóticos maduros e inmaduros. En la mayoría de los casos los embriones se originan en
forma indirecta a partir de callos embriogénicos o bien, directamente desde el explanto. En las coníferas puede ocurrir
un proceso de poliembrionía previa formación de callo que conduce a una alta tasa de multiplicación inicial. En general,
los medios de cultivo más efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales y suministran nitrógeno tanto
como NH4 + y NO3 - . Las auxinas más comúnmente empleadas en el medio de inducción son el 2,4-D y el ANA, en
concentraciones mayores de 2 μM. En algunos casos es necesario además el empleo de alguna citocinina,
generalmente en concentraciones mayores a 1 μM si se trata de BA y entre 0,1-1 μM en el caso del TDZ. Los explantos
jóvenes de especies leñosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles
oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o negros. Se observa también, que en los explantos de árboles adultos
el problema se acentúa. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. Los tipos de explantos más
utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las yemas axilares
obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones cigóticos y plántulas obtenidas de semillas de
origen sexual. La desinfección de los mismos se logra mediante inmersión en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido
de una solución de lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de cloro activo durante 5-30 minutos. En la mayoría
de los casos se emplean agentes tensoactivos, tales como Triton ó Tween 20 , adicionados en la solución de
lavandina. En todos los casos los explantos son lavados finalmente varias veces con agua destilada estéril. Los medios
basales más empleados son el MS, formulado por Murashige & Skoog (1962), diluido a la mitad o a un cuarto de su
formulación original o el WPM, formulado por Lloyd & McCown (1981). Como medios de multiplicación se emplean
además el BTM (broadleaved tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Périnet y Lalonde (1983). Los reguladores de
crecimiento más utilizados son ANA y BA. También han sido efectivas auxinas como IBA y 2,4-D, y citocininas como
2iP, CIN, ZEA y TDZ. En la Fig. 3 se muestran las etapas de la micropropagación de plantas de paraíso gigante, Melia
azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002).
3.1 Problemas asociados a la micropropagación de especies leñosas
Es mucho más difícil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir, difíciles de
regenerar. Sin embargo, aún en estos casos es posible extraer explantos de mayor capacidad regenerativa mediante
dos formas: 1) seleccionando los te-jidos más juveniles dentro de un árbol o, 2) induciendo el rejuvenecimiento del
árbol donante antes de aislar los explantos.
Para seleccionar el material más juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenómeno de topófisis. Este es un
proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo está determinado por la posición que ocupaba en la
planta adulta. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiológico e implica que los explantos más reactivos
in vitro se encuentran en las yemas de las áreas basales del tronco y raíces. A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso
de reversión temporaria de las características
Figura 3: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al.,
2002): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad, provincia de Misiones, Danzer
Forestación S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una población de plantas
donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparación del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad
crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del
cultivo: vástagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 días sobre medio de establecimiento (Medio basal
de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 μM 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 μM ácido giberélico
(GA3 ) + 0,25 μM ácido 3-indolbutírico (IBA). D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de
multiplicación (medio MS suplementado con 2,22 μM BAP, estos vástagos fueron empleados como explantos para los
subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la etapa de
multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicación para los
cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentración de BAP a 0,44 μM. F) Vástago enraizado en medio
de MS con la concentración salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 μM IBA durante 2 días, seguido por el
subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatización adultas que permite
lograr material vegetal en estado de juvenilidad. En general, a fin de contrarrestar los efectos debidos a la topófisis,
se recomienda emplear tejidos juveniles, y un tamaño de explanto muy pequeño. La juvenilidad puede lograrse por
dos métodos. En primer lugar, mediante el empleo de órganos juveniles separados de plantas adultas, la utilización de
estacas enraizadas o bien de brotes epicórmicos. En segundo lugar mediante el rejuvenecimiento de partes adultas,
la iniciación de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un
nuevo ciclo ontogénico), del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de
crecimiento (como citocininas como el BA), por la poda severa (recepado de árboles adultos) y, a través del cultivo in
vitro de meristemas. Tanto los atributos de supervivencia a campo, como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y
la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlación directa con la calidad de los vástagos durante
el cultivo in vitro. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagación es la calidad diferencial de las raíces
de las plantas regeneradas en relación a aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las plantas regeneradas de Pinus
elliottii suelen tener una raíz principal no ramificada y gruesa. En cambio, las plantas obtenidas a través de semillas
tienen raíces más delgadas y de mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una
mayor resistencia a los vientos.
4 Propagación de especies herbáceas
La micropropagación de especies herbáceas está orientada a proveer material libre de patógenos, propagar material
seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar
la diversidad específica en bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiológicos y genéticos y sentar
las bases para la aplicación de técnicas de ingeniería genética. Existe una gran variedad de protocolos, desarrollados
en función de la especie y de los objetivos de la propagación. Existen protocolos generales para monocotiledóneas
como en el caso ciertos cereales (trigo, maíz, cebada, avena, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrás,
pasto llorón) y hortícolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledóneas que incluyen especies
hortícolas (tomate, papa, pimientos y zanahorias) y leguminosas forrajeras (alfalfa, maní, trébol blanco) y protocolos
para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las formas de propagación son las mismas. Se
emplean vías de regeneración por formación de yemas axilares, yemas adventicias y embriogénesis somática. En los
dos primeros casos, el sistema de propagación a través de la organogénesis directa asegura la estabilidad genética de
las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagación clonal a gran escala. La embriogénesis u
organogénesis indirecta, con formación de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de
mejoramiento. En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las etapas de la micropropagación incluyen tanto la
multiplicación de yemas axilares por el cultivo de meristemas, la formación directa de yemas adventicias en explantos
obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formación indirecta de yemas adventicias y/o embriones
somáticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, brotes, placa basal
ó raíces). En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y maní la micropropagación es llevada a cabo por la vía
de la embriogénesis somática, donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y
pecíolos) como explantos. En algunos casos como pasto llorón (Eragrostis curvula) es posible la regeneración de
plantas mediante embriogénesis, organogénesis y regeneración directa a partir de los explantos.
4. HIBRIDOS SEXUALES
II CAPÍTULO 2 Hibridación Somática

Pablo Polci y Pablo Friedrich
1 Introducción
La mejora genética de las plantas cultivadas en procura de incrementar la producción viene siendo practicada por el
ser humano desde hace miles de años, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el hombre ha
empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad genética, paso inicial en el proceso de
mejoramiento. De esta manera la hibridación entre especies diferentes permitió aumentar de modo significativo la
productividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no
resultó exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad genética. La hibridación somática, es decir, la obtención
de plantas híbridas a partir de la fusión de células o de protoplastos derivados de células somáticas, surgió hace unos
30 años como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigótica.. Esta técnica,
si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos
casos, demostró ser útil en la mejora genética de plantas, principalmente por permitir la introgresión limitada de genes
de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o
tolerancia a estreses. También permite la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos). La hibridación asimétrica y
cibridización sirve como puente para la transferencia de genes individuales La técnica de fusión de protoplastos se
desarrolló en la década de 1950-60, a partir de la observación de que ciertos virus pueden inducir la fusión de células
animales. Sin embargo, recién en la década de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparición de métodos químicos
y eléctricos más apropiados para la fusión de células vegetales. La pared presente en estas células representa una
barrera que normalmente impide la fusión entre ellas. Por ello, la obtención de plantas híbridas somáticas requiere
del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestión enzimática de las paredes celulares, para luego proceder
a la fusión de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneración de plantas a
partir de los productos de fusión. La hibridación somática en plantas comenzó a desarrollarse a principios de 1970 con
la aplicación de métodos químicos de fusión, y se extendió en los ´80 con el empleo de métodos de electrofusión. Es
relevante destacar que, a los fines del mejoramiento genético, el sistema de protoplastos no sólo se emplea para la
obtención de híbridos somáticos, sino que también constituye un material apropiado para la incorporación de ADN
exógeno. Asimismo, la fusión de protoplastos tiene un uso mucho más amplio que el estrictamente de interés
agronómico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biología celular así como para otras aplicaciones
biotecnológicas, por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales.
2 Hibridación somática vs. hibridación sexual

En relación a su potencialidad para producir híbridos, existen diferencias importantes entre la fusión de protoplastos
somáticos y el cruzamiento sexual: • La hibridación sexual entre organismos de diferentes especies está limitada por
barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigóticas, es decir, no permiten que se produzca
la fecundación. Tal limitante no existe en la fusión de protoplastos, dado que este proceso es no-específico,
permitiendo la fusión de células de orígenes muy diversos, incluso de organismos muy distanciados filogenéticamente
(por ejemplo, células animales y vegetales). Ello no significa que pueda regenerarse un organismo viable y fértil a partir
de cualquier tipo de combinación entre células. De hecho, la búsqueda de híbridos de interés agronómico ha
demostrado que el principal aporte de esta metodología es la introgresión, en los cultivos, de genes provenientes de
plantas silvestres emparentadas. • La hibridación sexual ocurre normalmente por fusión de células haploides (n + n),
mientras que en la hibridación somática se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno
de ellos conteniendo sólo parte de su genoma. • Otra diferencia está dada por la herencia de los genes extranucleares,
esto es, plastídicos y mitocondriales. Mientras que en la reproducción sexual el genoma citoplasmático es aportado
casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridación somática se combinan organelas de ambos
progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmáticos.
3 Hibridación somática vs. transformación genética

La preponderancia que han tomado las técnicas de transformación genética ha relegado a la hibridación somática a
un papel de menor significación como herramienta biotecnológica aplicada al mejoramiento de los cultivos.
Comparando ambas metodologías, podemos destacar las siguientes diferencias: • En la transformación genética se
incorporan uno o pocos genes exógenos en una planta, mientras que en la hibridación somática el número de genes
introducidos es mayor dado que se transfieren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas
completos. • La hibridación somática permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento
detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresión de dichos caracteres. Por el contrario, la
transformación genética requiere la previa identificación y aislamiento de los genes que determinan la expresión del
carácter de interés. • Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrés, resistencia horizontal
a enfermedades y otros son poligénicos, por lo que su transferencia es factible por hibridación somática pero no por
transformación genética. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genómica se
está avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vías metabólicas. Estos podrían ser
transferidos en conjunto vía transgénesis.
4 Tipos de híbridos somáticos

Cuando se realiza la fusión de protoplastos se obtienen células con el aporte de cromosomas de dos o más núcleos.
Si los protoplastos involucrados en la fusión proceden de distintos tipos parentales se originan “heterocariones”, y si
proceden del mismo tipo parental se originan “homocariones”. Cuando en el heterocarión ocurre la fusión de los
núcleos (cariogamia), se forma una “célula híbrida”. A partir de una célula híbrida, que contiene dos genomas
completos, se puede regenerar una planta que, según cual haya sido el destino del material genético nuclear durante
las divisiones celulares que siguen a la fusión, puede ser de tres tipos:
1. Híbrido simétrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental.
2. Híbrido asimétrico, que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y sólo una parte del genoma
nuclear del otro parental.
3. Cíbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo sólo material genético
extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneración de plantas híbridas ocurra una eliminación
gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, produciéndose de este modo híbridos asimétricos o cíbridos.
La práctica de la hibridación somática en plantas demostró que, en general, los híbridos asimétricos y cíbridos son más
valiosos que los simétricos producidos entre plantas alejadas filogenéticamente. Por esta razón se han desarrollado
métodos para inducir la hibridación asimétrica o cibridación, alterando el genoma de uno de los protoplastos
parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto donante a uno receptor. Por lo
tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusión, pueden producirse tres tipos de células
híbridas:
1. Células híbridas simétricas, por fusión de dos protoplastos con sus genomas completos.
2. Célula híbrida asimétrica, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su
núcleo inviable o sólo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma,
lo que provoca la fragmentación de los cromosomas. Una vez producida la fusión, dichos fragmentos tienden a
eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo
un híbrido asimétrico. El tratamiento de irradiación parece no tener efectos deletéreos o mutagénicos sobre los
genomas de organelas, probablemente debido a que cada célula posee varias copias de ellas. También puede
producirse una célula híbrida asimétrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno
o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formación de micronúcleos por tratamientos
con agentes antimicrotúbulos.
3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo con un protoplasto enucleado o
con su núcleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta
velocidad en un gradiente de densidad isosmótico. Asimismo, el método de irradiación con rayos X o Gamma puede
generar cíbridos en casos en que se produzca la eliminación total de los fragmentos cromosómicos. Los protoplastos
que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados previamente con inhibidores metabólicos.
En este caso sólo pueden sobrevivir, por complementación metabólica, los heterocariones conteniendo el núcleo del
receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregación de los plástidos y mitocondrias de los dos tipos
parentales también constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneración de plantas híbridas. Es
frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco
común entre plástidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo
de pocas divisiones mitóticas las células formadas contengan plástidos provenientes de uno u otro tipo parental. Así,
una célula híbrida origina una colonia de células que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmáticos, pero
con una mayor frecuencia de células que poseen mitocondrias recombinantes y plástidos de uno u otro tipo parental.
El destino que sufre el material genético nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir
de una población de células híbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes
nucleares, plastídicos y mitocondriales. La Figura 1 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridación
somática, las cuales son tratadas a continuación.
5 Aislamiento de protoplastos
El desarrollo de métodos enzimáticos de aislamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad de obtener grandes
cantidades de protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influencia en diferentes áreas de la biología y la biotecnología de
plantas, dada la utilidad de los protoplastos como sistema experimental para estudios fisiológicos, bioquímicos y
moleculares, así como para su aplicación al mejoramiento genético. Los protocolos de aislamiento emplean enzimas
fúngicas con actividad celulasa y pectinasa, siendo necesario en algunos casos el agregado de hemicelulasas. Las
celulasas y hemicelulasas degradan la pared celular, en
tanto que las pectinasas digieren la matriz de pectina que mantiene adheridas a las células. El uso de enzimas
disponibles comercialmente posibilitó el aislamiento de protoplastos de prácticamente cualquier tejido vegetal,
siempre que el mismo no esté lignificado. Se ha podido aislar protoplastos de una gran cantidad de especies vegetales
y regenerar plantas a partir de los mismos, permitiendo el uso de este sistema para la propagación clonal y la
modificación genética de plantas. El número de protoplastos aislados, su viabilidad y la pureza de la suspensión
obtenida dependen de varios factores, debiendo establecerse en forma empírica las condiciones óptimas para un
sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a
continuación:
1. Selección del material de partida. Influye en el resultado del aislamiento así como en el proceso de regeneración
posterior. Generalmente se emplean hojas y células en cultivo líquido o sólido. Cuando se emplean hojas, la edad y las
condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jóvenes
totalmente expandidas que con hojas viejas (Fig. 2A). Para facilitar el contacto de las enzimas con las células, las hojas
suelen cortarse en trozos pequeños, muy finos en el caso de las monocotiledoneas. Algunas veces se extrae la
epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solución enzimática, como sucede con las dicotiledoneas. Cuando se
emplean células en suspensión, se obtienen mejores resultados si se encuentran en la fase exponencial de crecimiento.
2. Tratamiento enzimático. La concentración de la enzima y el tiempo de incubación requeridos para lograr la
liberación de los protoplastos dependen del producto comercial utilizado. El pH generalmente se ajusta en un rango
de 4,7 a 6, y la temperatura entre 25 y 30 °C. La duración del tratamiento enzimático y la relación volumen de
solución/cantidad de tejido influyen en el rendimiento. Durante el aislamiento se produce la lisis de algunas células,
que liberan enzimas hidrolíticas y compuestos oxidantes que pueden dañar los protoplastos, por lo que se suelen
agregar inhibidores de proteasas y antioxidantes tales como el Polivinilpirrolidona-10. El agregado de un estabilizador
osmótico a la solución enzimática es esencial para evitar la ruptura de los protoplastos a medida que son liberados,
siendo más estables si la solución es ligeramente hipertónica. Para ello se utilizan solutos osmóticamente activos,
comúnmente manitol o sorbitol, en concentraciones que varían entre 0,3 a 0,8 M según el tipo de protoplasto. La
solución enzimática es generalmente suplementada con sales, comúnmente CaCl2 , que incrementan la estabilidad de
la membrana (Fig. 2B).
3. Limpieza y purificación de los protoplastos. Una vez lograda la liberación de los protoplastos, se procede a la
remoción de las enzimas y de los restos de tejido y de células rotas. La suspensión se pasa por un filtro de nylon o
metáli
Figura 2: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en
trozos pequeños. B. Digestión enzimática de las paredes celulares. C. Centrifugación y obtención de protoplastos libres
de restos de tejidos vegetales.
co con un diámetro de poro (30-100 µm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos
de células no digeridas. Posteriormente, se efectúan 3 ó 4 lavados centrifugando la suspensión por 5 minutos a baja
velocidad (50-100 g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solución salina que contenga
un estabilizador osmótico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de
la suspensión es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 2C). Para el recuento de protoplastos se
emplea un hemocitómetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados
(rojo neutro, diacetato de fluoresceína) o excluídos (azul de Evan) por las células viables; también pueden evaluarse la
actividad fotosintética (emisión de fluorescencia) y la respiratoria (consumo de O2 ).
6 Métodos de fusión
6.1 Métodos químicos
Los primeros casos informados de fusión controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneración de
híbridos somáticos se produjeron a principios de la década de 1970, empleando nitrato de sodio como agente
fusógeno. La frecuencia de formación de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron
mejores resultados fusionando protoplastos de células del mesófilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta
concentración de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusógeno que alcanzó mayor aceptación es el
polietilénglicol (PEG) debido a que, en comparación con los otros agentes químicos, produce mayor proporción de
heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos tóxico. Además, el tratamiento con PEG genera una
mayor proporción de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre más de dos protoplastos.
El procedimiento de fusión con PEG más ampliamente utilizado es esencialmente una combinación del método original
del PEG y el de Ca++ y pH elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solución conteniendo
15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubación óptima
para inducir la fusión es de 35 a 37 °C pero, en la práctica, suele ajustarse a 24 °C. La densidad de protoplastos adecuada
para la formación de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensión). La remoción
del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de
heterocariones. Para ello, la suspensión se somete a sucesivos lavados con una solución alcalina (pH 9-11) de CaCl2
10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentración de PEG con cada lavado. En la fusión de los protoplastos
ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmáticas de protoplastos adyacentes entran
en íntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados de las mismas, formándose puentes
citoplasmáticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmáticas se expanden, provocando la
fusión. La carga negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsión entre ellas; el tratamiento con
Ca++ y pH elevados neutraliza las cargas superficiales, favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuaría
como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmáticas que promueven la adhesión y
formación de puentes citoplasmáticos entre protoplastos vecinos, produciéndose finalmente la fusión.
6.2 Electrofusión
En 1973 se descubrió que pulsos de elevado potencial eléctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duración
conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular.
Este efecto se denominó ruptura eléctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales
perturbaciones. El voltaje mínimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formación de poros disminuye
a mayor duración del pulso eléctrico.
Este fenómeno de ruptura reversible también es aplicado en la técnica de electroporación, con la que se pueden
introducir en las células construcciones de ADN y otras moléculas de alto peso molecular. El método de electrofusión
en esencia involucra dos pasos: Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos
se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo eléctrico no uniforme.
Las cargas se separan dentro de las células formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana.
La fuerza del campo a ambos lados de una célula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta
que la empuja a una región de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina
dielectroforesis. La polaridad de la célula incrementa el campo local no uniforme, atrayendo a las células vecinas.
Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las líneas de campo aplicadas (Fig.
3A). La fuerza ejercida sobre la célula bajo condiciones dielectroforéticas depende (1) de la intensidad de campo
eléctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto, y (4) de la diferencia entre las constantes
dieléctricas de la célula y su ambiente (así como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). El segundo
paso consiste en la aplicación de uno o más pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 µseg. con una intensidad
de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es
necesario que el voltaje crítico de membrana sea alcanzado en cuestión de nanosegundos a microsegundos. Ocurre
entonces la fusión de las dos células cuyas membranas están en estrecho contacto (1 a 2 nanómetros de distancia). El
proceso de resellado es principalmente atribuído a las moléculas lipídicas debido a que su coeficiente de difusión es
dos órdenes de magnitud mayor que el de las proteínas. Durante este proceso pueden formarse puentes lipídicos
entre las membranas de las dos células. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la
zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmática entre las dos células,
conducen a un radio de curvatura muy pequeño y a altas tensiones superficiales. Como consecuencia se forma una
nueva célula esférica, ya que el proceso es favorecido energéticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el
número y tamaño de los poros es pequeño en relación al total de la superficie de la membrana. Fuerzas de campo
supracríticas, así como largos períodos de exposición, rompen áreas mayores de membrana y pueden producir la
destrucción total de la célula.
Figura 3: Electrofusión de protoplastos de mesófilo de pasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las diferencias en
intensidad de campo eléctrico hacen que las células se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicación de
pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formación de poros en la membrana, generando puentes entre las
membranas de las células adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmática poseen un radio de curvatura
muy pequeño. Las altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formación de una nueva célula
esférica.
La frecuencia de fusión depende de varios factores: • El genotipo. • La procedencia de los protoplastos dentro del
mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuencias de fusión diferentes, aún cuando
provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan más fácilmente
que los provenientes de raíz o de cultivos celulares. • El tamaño de los protoplastos. Los más grandes se fusionan más
facilmente. • La densidad de los protoplastos. • El número, la duración y la fuerza de los pulsos de corriente directa.
La duración del pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. El tiempo requerido para la fusión que sigue a la aplicación de un
pulso varía desde pocos segundos a varios minuntos. Esto probablemente esté relacionado a la diferencia de fluidez
de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la célula. • El medio
de fusión. Un factor limitante en la agregación dielectroforética de las células es la conductividad eléctrica del medio;
si ésta es muy alta, hay mucho flujo de corriente en la solución y se producen calentamientos y turbulencias que
impiden la formación de cadenas. • El potencial osmótico del medio de fusión. La inclusión de iones en el medio puede
incrementar el porcentaje de fusión. Sin embargo, existe la limitación de que la dielectroforesis debe realizarse en un
medio de baja conductividad; el medio de fusión usualmente consiste en manitol (cuya concentración se ajusta según
los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de presión osmótica en el medio de suspensión de los
protoplastos puede favorecer el proceso de fusión. • La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la
dielectroforesis, que además depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del campo eléctrico y
tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas más largas darán mayor frecuencia de fusión que las cadenas cortas.
Pulsos de corriente más largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusión múltiple;
obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. • La composición y
propiedades de la membrana plasmática pueden ser afectadas por la actividad metabólica de los protoplastos y por
el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, influyendo en consecuencia en el proceso de fusión.
Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusión posible (número
de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporción de heterocariones
(productos de la fusión de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusión de
protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusión múltiple (fusión de más de
dos protoplastos). La proporción de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la suspensión puede fijarse a fin de
incrementar la formación de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia
a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relación de 1:5 a 1:10. Así, durante la formación de
cadenas, los protoplastos más fusionables estarán mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y éstos
a su vez estarán ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones -duración y voltaje de los pulsos- que
promuevan sólo la fusión de los protoplastos más fusionables, los productos serán mayormente heterocariones. Sin
embargo, aún cuando las condiciones de fusión puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusión y la
proporción de heterocariones formados, la fusión de protoplastos a gran escala (macrofusión), tanto por métodos
químicos como eléctricos, resultará en una mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto
conlleva la necesidad de emplear métodos de selección de lo híbridos somáticos obtenidos. Una técnica alternativa
que ofrece la ventaja de no requerir una posterior selección de heterocariones, aunque demanda mayor manipulación,
es la microfusión o electrofusión de pares de protoplastos. Esta técnica se basa en los mismos principios que la
electrofusión a gran escala pero está diseñada para inducir la fusión en pares seleccionados de protoplastos. Este
sistema emplea microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio
invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusión sobre un soporte,
recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusión, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una
microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos eléctricos. Después de la fusión, los
heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneración de plantas
híbridas. La tasa de fusión es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de
cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusión cercanas al 50 %.
Ventajas de la electrofusión: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los híbridos pueden
ser facilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el número de
células a ser fusionadas. Las formaciones de dos células son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre
los electrodos. Para obtener productos de multifusión deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusión
es sincrónico, ya que el pulso provoca la fusión de todas las células expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas
plasmogamia (80 - 100 %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las células fusionadas es muy buena. 6. Este método ofrece
ventajas sobre otros como el del PEG, que: - requiere condiciones no fisiológicas, - las frecuencias de formación
heterocariones binucleados son bajas y variables, - resultan tóxicos para diversos tipos celulares, - el fusógeno debe
ser removido antes del cultivo de los protoplastos y - bajo rendimiento de células fusionadas
7 Selección de heterocariones La fusión de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y
productos de fusión. Si no se efectúa una previa selección de las células híbridas, la regeneración de plantas y la
posterior identificación de los híbridos demandará mucho trabajo y recursos. Dicha selección es particularmente
necesaria cuando se emplean métodos químicos, que producen una baja proporción (<10%) de células híbridas. Por el
contrario, los métodos
eléctricos no requieren necesariamente del
posterior proceso de selección dado que normalmente producen frecuencias de fusión muy
elevadas o porque, en el caso de la microfusión, no se generan mezclas heterogéneas de
protoplastos debido a que se fusionan dos células por vez. Cualquiera sea el caso, la condición de híbrido debe
verificarse en la planta
regenerada mediante diferentes análisis que
se explican más adelante. La selección de células híbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes métodos:
• Selección en base a caracteres morfofisiológicos. En ciertos casos es posible diferenciar los callos híbridos de
los
parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos híbridos poseen
un color intermedio al de los parentales.
Cuando se produce un cruzamiento entre
un parental con capacidad para regenerar planta con uno recalcitrante, los híbridos somáticos normalmente
regeneran
plantas, ya que este carácter se comporta como dominante. Si los protoplatos del
genotipo respondedor son tratados con
inhibidores metabólicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.)
no sobrevivirán, y solamente podrán regenerarse los híbridos.
• Selección por complementación. La selección se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el
crecimiento de los parentales pero no para el de los híbridos. La complementación puede lograrse por las siguientes
vías: a) Empleando dos parentales con defectos metabólicos o genéticos no alélicos. Si dichos caracteres son recesivos,
la fusión produce una célula híbrida en la que los defectos se anulan por complementación. Por ejemplo, la fusión de
dos variedades albinas no alélicas (nucleares) de tabaco, permitió obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aaBB (albina)
↓ AaaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos líneas mutantes no alélicas de tabaco deficientes en nitrato reductasa,
se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como única fuente de nitrógeno. b)
Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibióticos o herbicidas. Para
ello se emplea una línea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectuándose la selección de
las células híbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las líneas
parentales. c) Una línea que presente una mutación autotrófica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a nitrato
reductasa) y un carácter dominante (por ejemplo resistencia a antibióticos o herbicidas) es de gran utilidad para la
selección. Los híbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser
seleccionados en medio mínimo suplementado con el antibiótico o herbicida, que no permite el crecimiento de los
parentales. • Selección por aislamiento de los heterocariones o células híbridas. Es el sistema más confiable y de más
amplio espectro de aplicación. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Selección mecánica directa
utilizando técnicas de micromanipulación con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales
presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las células híbridas. Por ejemplo al fusionar
protoplastos del mesófilo (verdes) con protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). También pueden colorearse
las células de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. b)
Citometría de flujo. Los protoplastos parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes, por ejemplo,
rodamina (rojo) y fluoresceína (verde amarillento). El aislamiento de los heterocariones marcados con ambos
colorantes se realiza utilizando un citómetro de flujo (FACS, fluorescence-activated cell sorter), que es preciso y muy
rápido. El equipo posee fotocélulas que detectan fluorescencia, pudiendo separar los protoplastos marcados con un
solo fluorocromo (parentales) de aquellos doblemente marcados (híbridos).
8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de células y tejidos en cultivo es un componente
esencial en la biotecnología para la manipulación genética y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fácil
para las dicotiledóneas herbáceas, pero ha sido bastante difícil para las monocotiledóneas, particularmente las
gramíneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio líquido o semisólido, rico en compuestos orgánicos
e inorgánicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmótico. Suelen ser
cultivados en cajas de Petri con medio agarificado, donde se mezcla la solución de protoplastos con un medio de
cultivo líquido a 40°C conteniendo 1,2% de agar, perferentemente agarosa (Fig. 4A). Los protoplastos quedan, así,
atrapados en el medio semisólido y, luego de varios días, se ven las colonias formadas (Fig. 4B). Sin embargo, el medio
líquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies solo pueden dividirse en medio
líquido, (b) la presión osmótica del medio puede ser fácilmente reducida a los pocos días en cultivo, (c) la densidad
celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las células con especial interés pueden ser aisladas y
cultivadas a alta densidad, (d) la degradación de algunos componentes del medio por la población de protoplastos
puede producir algunas sustancias citotóxicas, cuya concentración alrededor de las células será menor en el medio
líquido. Una técnica muy eficiente que combina medio sólido y líquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los
bloquecitos con los protoplastos inmovilizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio
líquido, donde se cultivan en contínua agitación. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro
días en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una división regular. Luego de dos a tres semanas,
producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una célula, que dos semanas después
se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para
regenerar plantas (Fig. 4). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: • Los
requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el
cultivo de células y tejidos, pero en general son enriquecidos con vitaminas, azúcares, aminoácidos, reguladores de
crecimiento y también con aditivos inespecíficos como leche de coco, hidrolizado de caseína, extracto de levadura,
etc. • El potencial osmótico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de protección osmótica antes de
regenerar la pared celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. • La
densidad celular: la densidad inicial de protoplastos varía de 104 – 105 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los
cultivos con altas densidades producirán, a partir de cada protoplasto, colonias que deberán separarse
tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo
protoplasto, la densidad inicial debe ser baja, de 100 – 500 protoplastos/ ml. Hay protoplastos de varias especies y
tipos que no logran dividirse a bajas
Figura 4: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de mesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas
de agarosa suspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación de callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio
de regeneración. F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. Planta regenerada.
densidades de cultivo. Para estos casos se desarrolló la técnica de cultivo con células nodrizas o alimentadoras. Esta
técnica consiste en exponer una suspensión de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la división celular
pero que quedan metabolicamente activas. Estas células se plaquean en un medio agarificado, y luego se colocan por
sobre éstas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarán las colonias. También suele utilizarse papel de filtro
para separarlas de las células nodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta
un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 µl de medio de cultivo, logrando densidades de 2 – 4 x
103 protoplastos/ml. Con ayuda de un micromanipulador se coloca la célula y se la cubre con aceite mineral para evitar
la deshidratación del medio. • Los tratamientos físicos: tratamientos de choque eléctrico y térmico estimulan la
división de los protoplastos.. • Las condiciones de cultivo: en general los protoplastos son sensibles a la luz, por lo cual
durante el cultivo se los mantiene en oscuridad o bajo luz muy tenue. • El origen de los protoplastos: el estado
fisiológico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada
eficiencia en la respuesta al cultivo.
9 Identificación de las plantas híbridas

La condición de híbrido debe verificarse en la planta regenerada aún cuando se haya efectuado algún tipo de selección
para el cultivo de las células híbridas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una
mejor caracterización del híbrido. Comúnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfológicos. Los híbridos
somáticos pueden presentar rasgos morfológicos característicos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los
parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citológicos. El análisis del complemento cromosómico
permite revelar si el híbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado más de dos
protoplastos, el grado de aneuploidía y posibles translocaciones intergenómicas. Mediante hibridación in situ
empleando sondas de ADN repetitivo específico de especie puede evaluarse con más profundidad la contribución de
los genomas parentales y reestructuraciones cromosómicas en el híbrido. 3. Isoenzimáticos. El patrón de bandas
isoenzimáticas del híbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de
nuevas combinaciones de las subunidades enzimáticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas
ácidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el análisis se deben
emplear los mismos tejidos u órganos, y en el mismo estadío fenológico. 4. A nivel de ADN. La demostración de la
presencia de ADN de ambos parentales es la prueba más directa de la hibridación. El análisis de ADN es independiente
del tejido empleado y de la edad de la planta. Puede llevarse a cabo por RFLP (polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restricción), RAPD (polimorfismos en el ADN amplificado al azar) o Southern blot, empleando sondas
de ADN repetitivo específico de especie o de genes de ARN ribosomal.
10 Logros y tendencias de la hibridación somática

La hibridación somática ha permitido producir híbridos que no se habían podido obtener por cruzamientos sexuales,
incrementando así el flujo de genes en los cultivos. La tabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridos somáticos que
presentan algunas ventajas agronómicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridación somática permitiera
producir nuevas
Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhiben algún carácter de interés agronómico
Híbrido Carácter Híbridos simétricos Solanum tuberosum x S. brevidens Resistencia al virus del enrollamiento de la
hoja de papa (PLRV), al hongo y a la bacteria . Phytophtora infenstans Erwinia cartovora S. tuberosum x S. circaeifolium
Resistencia a y al nemátodo . P. infenstans Globodera pallida S. tuberosum x S. phureja Mayor productividad de
tubérculo. S. melongena x S. integrifolium/S. saintwongseis Resistencia a la bacteria Pseudomonas solanacearum.
Híbridos asimétricos Brassica oleracea x B. campestris Resistencia al hongo Phoma lingam. B. napus x B. carinata/B.
juncea Resistencia a P. lingam. Nicotiana tabacum x N. Repanda/N. glutinosa Hipersensibilidad al virus del mosaico del
tabaco (TMV). Cíbridos B.campestris (silvestre) x B.napus/B. campestris (cultivar) Resistencia al herbicida atrazina y
esterilidad masculina citoplasmática (CMS).
especies que expresaran las características deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridación entre
tomate y papa, se buscó producir plantas que desarrollaran tomates en la parte aérea y tubérculos en la raíz (pomato).
La experiencia mostró que difícilmente puedan lograrse estos híbridos espectaculares, debiéndose más bien dirigir la
técnica hacia la introgresión de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridación asimétrica o
cibridación, manteniendo las características generales del cultivo. Uno de los factores que dificulta la obtención de
híbridos simétricos es la progresiva pérdida de cromosomas de uno de los parentales que normalmente ocurre durante
la regeneración. Si bien la fusión de protoplastos permite sortear las barreras precigóticas, siguen existiendo barreras
genómicas que resultan en la eliminación espontánea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo
que determina la eliminación de cromosomas no está bien comprendido, pero generalmente se retienen los
cromosomas del parental que tiene el ciclo celular más corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad
genómica es el estado de diferenciación de los tipos celulares involucrados en la fusión. Por ejemplo, cuando se
fusionan células en fase de crecimiento activo con células del mesófilo, que no se dividen, generalmente se pierden
los cromosomas de estas últimas. Los híbridos somáticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen
muchas características no deseadas de la primera, además de aquéllas deseadas. El retrocruzamiento con la especie
cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible
debido a que los híbridos suelen ser estériles. La hibridación asimétrica y la cibridación tienen la ventaja de incorporar
sólo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor
fertilidad.. Algunos caracteres deseables están codificados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad
citoplasmática y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad
la cibridación dado que es un método simple para transferir estos genes.
11 Algunos ejemplos Se han obtenido híbridos intergenéricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum
(Ozias-Atkins et al., 1986), Saccharum officinalis (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa oryzicola,
Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum, Festuca arundinacea (+) Lolium multiflorum. El primer caso de
regeneración de plantas maduras de híbridos intergenéricos (simétricos y asimétricos) en gramíneas fue el
Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicación de esta estrategia no ha conducido a la obtención de
nuevos híbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los
métodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el interés en la hibridación somática. Sin embargo
son una excelente herramienta para estudiar las interacciones núcleocitoplasmáticas entre genomas.
5 TRANSGÉNESIS
6 CULTIVO DE TEJIDOS
I - CAPÍTULO 1
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland
1 Introducción
El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que
presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos –
células desprovistas de pared celular– células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en un medio artificial de
composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisión de esta definición
puede generar muchas polémicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es común dividir las técnicas del
cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semisólidos y b) cultivos en medios líquidos, los que a
su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. También es frecuente
dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo
de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en
cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las
condiciones de incubación. La discusión de estos aspectos constituye el objetivo de este capítulo. Adicionalmente se
incluye el tema de la aclimatación de las plantas regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayoría de las
aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura.
2 Explante
Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de los
cultivos in vitro, entre ellos: 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen
con el cultivo de tejidos, se podría esquematizarlas en aplicaciones para: • Estudios básicos. En este caso, los explantes
cultivados pueden ser diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso
fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula viva. En este caso –en que lo único que se busca es la
inducción de callos– lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas en germinación, donde se obtienen
respuestas rápidas y, en general, hay menores problemas de contaminación con microorganismos. A veces se hace
uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los
fenómenos de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta entera. El
explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de
ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento de los frutos.
Asimismo, el cultivo de óvulos ha sido muy útil para estudiar aspectos relacionados con la formación de las fibras en
algodón. El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro. • Obtención de
plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres
de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud)
consistente del domo y de un par de primordios foliares. • Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que
se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos
uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer
perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural
son propágulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintéticas (ver Parte IV,
capítulo 2) el explante original deberá posibilitar la inducción
de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser
frecuentes como explantes. • Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de
tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos
interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el
embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos
fecundados. • Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden
ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo («corazón») como
en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. • Obtención de plantas haploides (considerando como
haploide a un esporofito que contiene el complemento gamético de cromosomas). En este caso, los explantes más
utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados. •
Inducción de variación somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilización
es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la
regeneración de plantas enteras. • Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se puede utilizar una gran variedad
de explantes. Los de raíces suelen ser muy utilizados. • Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre
a la fusión de protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de
suspensiones celulares. • Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos
para el desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (críoconservación con nitrógeno líquido) y para
el intercambio de material genético. • Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar
los cultivos a partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces). 2.
Posibilidad de contaminación con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes
que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra
parte, es recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas crecidas en
macetas o en el campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los
mismos. 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede
decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es
por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la
micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la
micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad
de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes. 4. Tamaño. En general, cuanto
más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración
directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los
cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del
explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de
los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados
medios acondicionados. 5. Epoca del año. Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropa gación
y que generalmente está asociado al grado de dormición que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y
también con la posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos.
3 Asepsia
Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la
contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus).
El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la
proliferación de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. Es difícil
cuantificar el impacto de estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagación se lo
puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero
compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difícil conseguir cultivos
estrictamente asépticos dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus
y fitoplasmas, por lo que en la práctica, cuando se refiere a cultivos asépticos, en general se quiere significar que son
cultivos donde no se produce la proliferación de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a)
microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo
en el laboratorio. La correcta detección de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para
el éxito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminación y por otro lado, ayuda a la
planificación de los procedimientos para controlarlos. Varios géneros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas,
Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium,
Corynebacterium) y de hongos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y
Neurospora) están frecuentemente en los cultivos. Es conveniente inspeccionar visualmente –con la ayuda de un
microscopio estereoscópico– los cultivos en forma periódica (por lo menos semanalmente). También se pueden
realizar pruebas con medios de cultivo diferenciales y «test» bioquímicos específicos. Para evitar y/o minimizar las
contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se trabaja
y los posibles contaminantes específicos. 2) Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes,
cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales
microorganismos endófitos. 3) Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de compuestos
químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor daño posible para el explante. Si bien no es
posible recomendar un procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más popularizado consiste en
una doble desinfección mediante la inmersión de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido
de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de
la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de hipoclorito de
sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada
estéril. En este último punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estéril de reciente preparación, dado que
está demostrado que el almacenaje prolongado del agua estéril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias.
Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfección superficial en una cámara de transferencia con aire estéril.
En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1%- 1,5%).
Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este último compuesto, dado que es altamente tóxico y
además no es removido con facilidad del explante.
En los casos en que no se utilice etanol, la adición de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una práctica
recomendada. Entre los más usados figuran Tween-20 (0,01 – 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los
explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfección. La inmersión de los explantes en
soluciones conteniendo sustancias antibióticas y /o antimicóticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina,
tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil,
carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el
inconveniente de que alteran la composición de los medios de cultivo y además pueden ser metabolizados por los
explantes. Últimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinación
de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endófitos. Uno de estos
compuestos es el PPM (Plant Preaservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de
los furfurales de la caña de azúcar. Este compuesto, químicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno fue
desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro.
En los casos en que se utilicen plántulas crecidas in vitro como plantas donantes de explantes, es necesario desinfectar
las semillas para su cultivo y germinación y luego es aconsejable desinfectar también las plántulas resultantes. En
algunos materiales vegetales se utiliza la preincubación de los explantes mediante lo cual éstos son desinfectados
suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados
nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados
completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la esterilización, en la mayoría de los casos se hace
uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor húmedo (en forma de vapor abierto o bajo presión), calor
seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a microondas. El agua caliente también puede ser usada. En el caso de
sustancias termolábiles, la esterilización se puede hacer mediante filtración a través de filtros bacteriológicos. No es
posible recomendar ningún sistema de esterilización dado que la exitosa destrucción de los microorganismos depende
de múltiples factores entre los que interesan el tamaño del recipiente, el tiempo de esterilización y la naturaleza de la
sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: • La esterilización en estufas mediante calor
seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cápsulas de Petri, tubos). En
estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 ºC brindan excelentes resultados. • La esterilización con calor húmedo con
vapor bajo presión (en autoclave o en una «olla a presión»). Es el procedimiento más empleado para la esterilización
de los medios de cultivo (salvo, como se indicó más arriba, para aquellos que posean componentes termolábiles). En
este caso, lo más común es usar una presión de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prácticamente se
destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura,
para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimétricas. 5) Cultivar los explantes en una cámara de transferencia
con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De
no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca
exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas
previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes
(conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios constituyen
frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes de comenzar
a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se des-
infecten con etanol al 70 %. La utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así
como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los
instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso.
Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear
cuidadosamente en la llama de un mechero. También es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen
los medios de cultivo antes y después de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo,
cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de personas, y
los recipientes con cultivos contaminados deben ser rápidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes
del lavado, estos cultivos sean esterilizados.
4 Medios de cultivo
Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos
para la nutrición y manipulación de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende
entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar
más de 3.000 trabajos científicos describen en dos tomos (casi 1.000 páginas en total) más de 2.000 medios de cultivo.
También dos empresas multinacionales ofrecen para la venta más de 60 medios cada una, listos para su utilización
especialmente en la micropropagación comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy
usados en la actualidad. Básicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: • Una
fuente de carbono • Nutrientes minerales • ·Sustancias vitamínicas • Sustancias reguladoras del crecimiento • Agente
gelificante (en el caso de medios semisólidos)
Tabla 1: Composición de tres medios básicos usados en el cultivo in vitro de tejidos.
• Otros compuestos. Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos
pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones
de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el
empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un
mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los mismos macro y
micronutrientes que son esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las
concentraciones relativamente
altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. También se pueden utilizar
urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado juntamente con un agente
quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible es un amplio rango de pH. Sustancias vitamínicas: De todas las que
comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen
crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayoría de los casos los medios utilizados
para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, Dicamba, Picloram) y/o
citocininas (BA, KIN, ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones
para el cultivo de meristemas o para la elongación de brotes. El ABA, es usado en algunos casos. Agente gelificante (en
el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse
«Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» (2,0-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-
0,20%). Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química, suelen ser adicionadas a los medios
básicos. Además de la glicina, otros aminoácidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina
y cisteína, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbón
activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos tóxicos para los
cultivos. En algunos medios se incorporan ácidos orgánicos como el málico, el cítrico, el pirúvico y el succínico y es
frecuente el empleo de L-glutamina y de caseína hidrolizada. Aún hoy se siguen utilizando ciertos componentes de
composición química no bien definida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y puré de banana. También en
ocasiones es necesaria la incorporación de agentes antioxidantes (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona) para
prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidación de polifenoles presentes en los explantes. Este
ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparación de los medios de cultivo puede llevarse a cabo
de diferentes maneras, en «lecturas recomendadas» se citan manuales de laboratorio donde se describen
detalladamente este punto.
5. Condiciones ambientales para la incubación.

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a
temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran
con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una
buena y uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminación
en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-
28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo
«luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80- 90%).
6 Aclimatación de las plantas regeneradas in vitro.
Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo.
La atmósfera interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO2,
humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto
por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de micropropagación),
sales y reguladores del crecimiento,
sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las
plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este período de adaptación al nuevo hábitat
es llamado fase o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá
contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que
permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido
crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático
que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiración
que puede ocasionar la muerte por deshidratación. El control de este proceso fisiológico es de vital importancia
durante la aclimatación, teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá de la
rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la cutícula. El equipamiento necesario estará sujeto
a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la
transpiración (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas (Fig.1)
equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar
necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo
de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este último caso
deberán tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad. Resulta
imprescindible evitar la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. Mediante el
empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la
temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es
necesario, a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para
mantener la temperatura por encima de los 18-20 ºC. Sin lugar a dudas, la opción más económica es el empleo de la
luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No
obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los días son cortos durante una parte
considerable del año, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares
fluorescentes del tipo «luz día» son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas
tubulares de sodio alta presión presentan una distribución espectral de la energía adecuada para estimular fotosíntesis
y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye
la elección del substrato, siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se
puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaución de realizar una
esterilización previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a través del substrato (fertilizantes de liberación
controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo
(N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de las plantas. En
todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose antibióticos, fungicidas e insecticidas
de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cámara de aclimatación diseñada por los autores y empleada
por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botánica del Nordeste. Básicamente, está compuesta por una
fase aérea construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que contiene gránulos de
arcilla expandida a fin de facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cámara
puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicación, así como
también, para el enraizamiento convencional (a «raíz desnuda») de estacas de tallos u hojas.
La humedad relativa de la fase aérea es controlada por un sensor (6) ubicado por encima de la tubería de riego (4). El
sistema humidificador está compuesto por picos tipo «fog» y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta
presión (13). Con el propósito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las cañerías, el sistema
consta de una válvula solenoide de descarga y desagüe (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente
mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cámara (3) los que, conjuntamente, introducen
o extraen aire, generando un movimiento masal. Debido a la latitud geográfica en que se encuentra, la cámara está
equipada con un acondicionador de aire (3000 frigorías) para evitar situaciones de estrés térmico en época estival. A
su vez, y dado que la mayoría de las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema
cuenta con mantas térmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato
durante el invierno. En este último caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal
manera de dirigir el calor hacia la fase aérea.
Capítulo 3 Medios de cultivo: generalidades, composición y preparación
Principios Generales y Estrategias de Diseño

Para crecer, las células requieren una variedad de nutrimentos orgánicos e inorgánicos; estos requerimientos se
demuestran fácilmente en órganos y tejidos extirpados de plantas superiores e inferiores. Los nutrimentos orgánicos,
al igual que los inorgánicos, se requieren en dos niveles: uno macro y otro micro. Generalmente, las células en
crecimiento pueden fabricar sus proteínas a partir de fuentes adecuadas de nitrógeno y carbo hidratos suministradas
por el medio de cultivo; sin embargo, existe además una cantidad de sustancias orgánicas adicionales que se requieren
en cantidades mínimas y que son muy activas en el crecimiento. A menudo, la necesidad de los factores orgánicos de
crecimiento se hace evidente sólo cuando se considera un crecimiento laTgo y continuado o potencialmente
indefinido. Aunque una planta verde intacta es autótrofa, las células de sus regiones de crecimiento pueden ser
acentuadamente heterótrofas y requerir la aplicación de un número de estimulantes orgáni cos complejos que, en el
caso de la planta intacta, generalmente se derivan de las células verdes. En consecuencia, la nutrición orgánica de las
plantas es un tema muy amplio que se extiende desde la nutrición de bacterias y hongos, los variados requerimientos
nutricionales de partes aisladas de plantas, los requerimientos especiales de embriones aislados, los tejidos cultivados,
las células y protoplastos hasta el tema tan discutido de si las plantas superio res obtienen un beneficio especial de las
complejas sustancias orgánicas que se encuentran presentes en el estiércol natural y en las coberturas protectoras.
Este último punto incluye problemas diversos y de controver sia como el del papel de la micorriza y el que discute si
el papel de las sustancias orgánicas en el suelo es directo o si se debe a su efecto positivo en la solubilidad y
disponibilidad de ciertos elementos esenciales. En cuanto a los tejidos de plantas, desde 1940 se ha desarrollado una
gran cantidad de trabajos sobre sus requerimientos nutricionales en medios estrictamente definidos. En términos
generales, la mayor parte de tales tejidos se pueden cultivar exitosamente en un medio que contenga cualquiera de
varias mezclas de sales minerales diseñadas para mantener el crecimiento de tejidos y órganos. A menudo se utiliza la
sacarosa como una fuente de energía. Algunos tejidos se pueden cultivar exitosamente en un medio completamente
definido, mientras muchos otros no presentan crecimiento en soluciones salinas relativamente simples, a menos que
se complementen con ciertos njicroelementos, vitaminas y otras sustancias promotoras del crecimiento de naturaleza
completamente indefinida, tales como el agua de coco (AC), la caseína hidrolizada (CH), los extractos de levadura y de
malta, el endosperma líquido de la castaña de Indias, y otros semejantes. ¿Dónde se empieza? La literatura sobre el
cultivo de tejidos en plantas se ha vuelto inmensa y desde hace mucho tiempo no ha podido ser examinada por una
sola persona; es rica y muy variada. En este capítulo se trata de describir el desarrollo alcanzado en cuanto al diseño,
la composición y la preparación de medios de cultivo, desde la perspectiva de las actuales bases clásicas. Es obvio que
se hace referencia a publicaciones recientes más o menos especializadas en su tema, pero se le concede una atención
especial a la literatura pionera sobre los fundamentos y principios al respecto. Tam bién se han incluido algunos títulos
que tratan de la química y de la acción de los reguladores del crecimiento. Es lamentable que no exista una sola fuente
global de información libre de errores a la que se pueda dirigir un principiante; el problema se agrava por el hecho de
que existen diversas filosofías o enfoques en los laborato rios y no hay uno solo que se prefiera sobre otro: "De un
éxito nacen otros" (De Fossard, 1976; Evans et al., 1983; Sharp et al., 1984; Ammirato et al., 1984; Vasil, 1984, 1985,
1986; George et al., 1984). Posiblemente, la formulación del medio para el cultivo de tejidos es más un arte que una
disciplina por derecho propio; la experiencia es el mejor maestro en este tipo de trabajo, y éste es el mejor consejo u
orientación que se le puede dar a un principiante. Se debería interpretar el problema desde una perspectiva tan amplia
como sea posible y comprender la parte básica del sistema biológico con el que se trabaja. Se debería, además, trabajar
con materiales que estén definidos con precisión desde el punto de vista taxonómico, genético y del desarrollo; existen
muchas evidencias que sugieren que la variación en la respuesta al cultivo de tejidos según el genotipo utilizado
depende de la forma como se haga el cultivo. Sólo mediante una caracterización rigurosa del material biológico se
puede empezar a investigar, tabular y comprender el rango y la magnitud de esta variación. Al escudriñar la amplia
literatura existente sobre cultivo de tejidos, a menudo se afronta el problema de interpretar con precisión qué material
biológico o qué medio se ha utilizado en un conjunto dado de pruebas o experimentos. Son abismales a menudo las
descripciones morfológicas de los orígenes del explante. La designación de fórmulas, generalmente por el nombre o
los nombres de los investigadores que primero las publicaron,
resulta frecuentemente enredada por las adiciones, supresiones, o modifi caciones de varios o de muchos de los
componentes; adicionalmente, muchas publicaciones oscurecen, voluntaria o involuntariamente, lo que realmente
constituyó una falta de precisión en el informe. Para los informes, se debería adoptar en lo posible el sistema de taqui
grafía, ya que permite tanto una precisión en el informe mismo como una claridad en el pensamiento en relación con
el diseño del medio. Uno de tales sistemas útiles debería incluir la designación de las sales minerales utilizadas, el tipo
y la cantidad de hierro, la fuente de carbono, los suple mentos del crecimiento y el pH. Este sistema se explicará en
detalle más adelante.
Medio Basal: Elementos Minerales

El primer objetivo en la preparación de un medio de cultivo es suministrar los nutrimentos minerales en
concentraciones adecuadas. Se deben incluir los macroelementos (C, H, O, P, K, N, S, Ca, y Mg) y los microelementos
(B, Zn, Mn, Cu, Mó, Fe, Cl); además, existe evidencia de que se debería añadir níquel en la lista (Eskew et al., 1984). En
los primeros tiempos del estudio de la nutrición mineral, los investi gadores solían suministrar los elementos por medio
de soluciones de cultivo de 'tres sales': KH2PO4, Ca(N03)2 y MgS04; se incluía un poco de hierro, generalmente como
fosfato ferroso Fe3 (P04)2. Actualmente se sabe que los microelementos se suministraban involuntariamente como
contaminantes. El conocimiento acerca de los requerimientos de nutri mentos minerales y de la formulación de las
soluciones ha progresado mucho desde esos primeros tiempos (Hewitt, 1966; Lauchli et al., 1983; Saric et al., 1983),
pero cabe recordar la base tan antigua de las fórmulas más recientes.
Nomenclatura general
Existe una variedad de fórmulas de sales minerales que se utilizan corrientemente en el cultivo de tejidos vegetales
(Dougall, 1972; Kruse et al., 1973; Gamborg et al., 1976; Rechcigl, 1977, 1978; Thorpe, 1981; George et al., 1984).
Según se mencionó antes, estas fórmulas general mente recibieron su nombre de investigadores; hubiese sido
preferible que nunca se hubieran adoptado estos nombres como códigos de fórmulas específicas, pero el hecho
histórico es que se han utilizado así.
Con el fin de evitar cualquier posible confusión se definirán aquí las sales minerales como el medio basal; una B
mayúscula indica que se trata de sales minerales. Si se utiliza la fórmula de sales minerales de Murashige et al. (1962),
la designamos como B\fs; si se utilizan las sales minerales de White entonces escribimos B\y; las de Shenck y
Hildebrandt (1972) se reducen a B§h y así sucesivamente. Si la concentración dé las sales se disminuye á un cuarto o
a la mitad, o si se aumenta al doble o a otro factor, se deben hacer los respectivos ajustes al subíndice; por ejemplo:
B^g^ o BMSi + o BMSx2- Como ha habido una confusión considerable en relación con las fórmu las de hierro que se
han utilizado o se utilizan actualmente en varios laboratorios, se recomienda suministrar con precisión la que se utilice
(Singh et al., 1980). A continuación se presenta como ejemplo la prepara ción de quelato de hierro (200X) según la
fórmula de Murashige et al. (1962). Disuelva 7.45 g de Na2-EDTA.2H20 en 900 mi de agua destilada, en un recipiente
caliente; añada 5.57 g de FeS04.7H20 mientras revuelve. Después que se haya formado el complejo, y se haya disuelto
y enfriado, ajuste el volumen a 1000 mi. Consérvelo en una botella ámbar o en un recipiente oscurecido con papel de
aluminio; puede almacenarlo a la temperatura del laboratorio. Utilice 5 mi de esta solución madre para la preparación
de un litro del medio final. Con esta fórmula se obtiene una solución 0.1 mM Fe-EDTA Nota: si se forma un precipitado,
deberá preparar una solución más diluida (por ejemplo 10X). Cuando se utiliza Na2EDTA (anhidro), sólo se requieren
6.72 g. La fuente de carbono se designa más convenientemente por el porcen taje del peso en el volumen (p/ v). La
fórmula original de MS (1962) para los callos del tabaco utilizaba 3% de sacarosa, pero se hace necesario ensayar otros
niveles para diferentes partes de la planta, especies o cultivares. Aditivos como las vitaminas, el nitrógeno reducido
en forma de caseína hidrolizada (ácida o enzimáticamente) o el inositol pueden designarse por + CH (seguido por la
cantidad exacta), o + INOS (seguido por la cantidad exacta), respectivamente. Los aditivos tales como el AC y los
reguladores del crecimiento (auxinas, citocininas o giberelinas) también pueden desig narse por las abreviaturas
correspondientes.
Si se sigue ese procedimiento, existen pocas posibilidades de malenten didos. Por ejemplo, Bjyisi + AC 10%v/v + 2,4-
D(l mg/ litro) + inositol (500 mg/ litro) + CH (200 mg/ litro) enzimática + 5% sacarosa + tiaminaHC1 (0.1 mg/ litro) +
FeNa2-EDTA (0.1 mM), ajustado a un pH 5.0, significa, claramente que se utilizaron las sales minerales de MS a la mitad
de la concentración, pero se utilizó el hierro a la concentración completa. Se suplementó con agua de coco en 10% del
volumen final. Se utilizó 1 mg/ litro de 2,4-D, 500 mg/ litro de inositol, y así sucesivamente. Se añadieron 5 g de
sacarosa por cada 100 mi de medio preparado. Este método no sólo suministra una información más comprensible y
precisa de la composición del medio, sino que permite comparar y hacer contrastar los resultados de diferentes
ensayos con relativa facilidad. Los efectos de los componentes simples sólo se pueden comparar si se cambia uno solo
de los factores o pocos a la vez.
Componentes del medio de cultivo

Casi cualquiera de las fórmulas salinas básales de las soluciones de cultivo que se tienen actualmente como estándar
debería ser más que suficiente para suministrar un mínimo esencial de los elementos requeri dos. Sin embargo, sería
útil ensayar estas soluciones a diferentes concen traciones totales; por ejemplo, el de Murashige es un medio con
relativa mente 'alto contenido de sal', mientras el medio de White (Singh et al., 198 1) generalmente se considera
como de 'bajo contenido de sal'. Muchos explantes crecen mejor si se les suministra nitrógeno reducido, lo que se
puede hacer agregando sales de NH4+ o suplementando con urea o CH. El valor del medio de MS se atribuye en parte
a sus altos niveles de NH4+ (y de K). Todos los medios parecen beneficiarse en cierto grado con los suplemen tos
vitamínicos, a menos que las células se vuelvan verdes o hasta que ello ocurra; los aditivos mínimos usuales son la
tiamina, el ácido nicotínico y la piridoxina. Por consiguiente, los suplementos vitamínicos son más o menos estándar;
en realidad, la tiamina-HCl, como única vitamina aña dida, puede ser suficiente en muchos casos (Linsmaier et al.,
1965). Algunos de los primeros aditivos orgánicos como la glicina se conside ran actualmente dañinos. El uso frecuente
del inositol en cantidades bastante altas (100 mg/ litro) se explica ampliamente por su presencia en cantidades grandes
en el suplemento del AC, que por sí sola o en combina ción con otros compuestos estimula la división celular (Steward
et al., 1955; Shantz et al., 1964; Pollard et al., 1961).
Las principales diferencias entre los medios de cultivo se relacionan con los diferentes compuestos utilizados para
estimular la división celular. Para esto, se emplean generalmente: AC (5-15% v/w), o también 2,4-D, ANA, AIA, o
benzotiazol-2-oxiacético (BTOA) solos o en combinación con el AC; éstos han resultado, generalmente, adecuados para
iniciar y mantener cultivos de callos de la mayoría de los tejidos de plantas. Sin embargo, se sabe que es un problema
mayor estudiar todas las interacciones de los componentes (orgánicos e inorgánicos) de un medio de cultivo, y
generalmente no es rentable hacerlo en esta etapa del conoci miento. No obstante, normalmente se puede utilizar un
medio sencillo y luego complementarlo de diferentes formas; el 'arte' consiste en llegar empíricamente a la fórmula
que le brinde al tejido la mejor oportunidad de desplegar su capacidad intrínseca para crecer. Algunos ejemplos recalca
rán estos puntos. Mientras que el medio basal de White sustenta el crecimento activo de tejidos como los trozos
explantados de la raíz de zanahoria (Daucus carota var. sativa), con tejidos y células de otras plantas se obtiene un
mejor crecimiento en un medio de alta salinidad; este hecho resalta la importan cia de reevaluar algún día los
componentes minerales básicos del medio del cultivo de tejidos para cada tejido en particular. Un caso al respecto
son los explantes del floema de raíces de zanahoria que crecen en un medio libre de calcio. El medio de Nitsch (1951)
es esencialmente una modificación de la solución de Knop, una de las primeras soluciones en el cultivo hidropónico
(cerca de 1865). Este medio fue útil en el cultivo de partes de flores de tomate; la concentración de sacarosa utilizada
era de 5% en lugar de 2% ó 3% utilizado en muchos otros medios. El medio de Braun et al. ( 1 962) es un medio de
White modificado, ya que contiene 845 mg/ litro de KC1, 1800 mg/ litro de NaN03, 300 mg/ litro de NaH2P04.H20 y
790 mg/ litro de (NH4)2S04, además de lo que se encuen tra en un medio (mineral) basal de White. También se añaden
algunos suplementos orgánicos, por ejemplo la glutamina y la asparagina, y los dos nucleótidos ácido cítidílico y ácido
guanílico; el inositol también está presente (100 mg/ litro). Braun et al. ( 1 962) encontraron que las células normales
(no habituadas) de Vinca rosea L. (Catharanthus roseus G. Don.) crecían rápidamente sin una fuente exógena de
auxina. Ello se conseguía mediante el refuerzo del medio de White con las sales ya mencionadas, inositol y KIN; un
examen cuidadoso de los cultivos mostró que los tejidos podrían sintetizar canti dades significativas de auxina. Los
mismos investigadores encontraron
también que el efecto del NH4~'~ en el crecimiento de las células era sorprendente; cuando éste se añadía al medio
básico que contenía niveles elevados de KC1, NaN03 y NaH2P04 (como también KIN e inositol), el crecimiento era el
doble del que se encontraba en un medio similar con (NH4)2S04. Se especuló que el inositol facilitaba sobremanera la
absorción o la utilización de iones esenciales para activar ciertos sistemas biosintéticos en tejidos de Catharanthus
(Braun et al., 1962). Murashige et al. (1962) recomendaron un medio MS para ensayos de médula de tabaco con el fin
de obtener una alta tasa de crecimiento y un aumento en la respuesta a los factores orgánicos de crecimiento con un
mínimo de interferencia con otros nutrimentos orgánicos e inorgánicos. Los extractos foliares del tabaco producían
un aumento en el crecimiento de tejido medular aislado o en cultivos de callo de Nicotiana tabacum var. Havana
Wisconsin 38; esto se debía, en parte, a constituyentes inorgánicos del extracto, especial mente el N y el K. El medio
'revisado' que propusieron Murashige y Skoog es esencial mente una modificación de la fórmula basal original de
White, a la que se añadieron 1650 mg/ litro de NH4N03 al igual qué 170 mg/ litro de KH2P04. El CaCl2 remplazó al Ca
(N03)2; por consiguiente, este medio es de alta salinidad y puede esperarse que sustente el crecimiento de ciertos
cultivos que requieren concentraciones más altas de iones. Una modificación del medio MS (Lin et al., 1962) ha sido
útil para la iniciación y mantenimiento de callos de menta {Menthapiperita). £1 uso de una alta concentración de
inositol (5 g/ litro) en estos cultivos plantea un interrogante en relación con los efectos osmóticos globales del medio
de alta salinidad, en combinación con el inositol; no obstante, el efecto benéfico de la composición mineral de este
medio en la iniciación del callo en la menta parece ser real.
Microelementos suplementarios
Los microelementos presentan un problema especial. Se supone que todos los conocidos y necesarios para las plantas
enteras lo son también para las células y tejidos cultivados; sin embargo, los estudios detallados de Steward et al.
(1968) se relacionan solamente con los requerimientos de Mn, Mo, Cu y Fe en explantes del floema radical de la
zanahoria. En términos generales, muy raras veces las soluciones basal de White modificada y otras son limitantes
respecto a los elementos anteriores; en el agua de coco, mediante un procedimiento rígido de purificación y resumi
nistro, se pueden obtener con dificultad cultivos deficientes en Mn, Mo y Cu; el requerimiento de Mo se reduce
sobremanera en presencia de nitró geno orgánico. En resumen, un medio de cultivo general (preparado con reactivos
analíticos), con un suplemento de AC, muy raras veces resulta tóxico o deficiente a causa de los microelementos.
Nuevamente, el crecimiento está más limitado por las sustancias promo toras de la división celular que por los
microelementos; sin embargo, cuando estas sustancias se conozcan totalmente, se puéde investigar acerca de sus
interacciones con los macro o los microelementos. Cuando parezca aconsejable utilizar elementos inorgánicos
adicionales, se puede emplear la fórmula de Heller (1954) para los microeíeméñtós (Cuadró 3. 1).
Agua de Coco (AC) y Otros Endospermas Líquidos
En 1942, van Overbeek, Conklin y Blakeslee mostraron que los embriones en desarrollo de Datura se podían cultivar
in vitro hasta su madurez, utilizando el endosperma líquido del coco (Cocos nucífera) como suple mento de un medio
de cultivo estándar (van Overbeek et al., 1942; van Oberbeek, 1942). Rápidamente aparecieron otros usos del AC (Ball,
1946). En 1948, Caplin y Steward se dieron cuenta del potencial del AC (erróneamente llamado leche de coco) para
inducir la división celular en tejidos diferenciados; lo observaron por primera vez en el parénquima del floema
secundario de la raíz de la zanahoria cultivada. Se sabía que el AC era sólo uno de los líquidos que, al ser nutritivos
para los embriones inmaduros, podía producir el mismo efecto en tejidos y en células explantadas. El endosperma
líquido de Zea mays suministra una fuente alterna del AC para promover el crecimiento, pero con una diferencia
importante. En el coco, una gran cantidad de endosperma líquido se desarrolla muy precozmente, y sirve para
almacenar nutrimentos para el embrión en desarrollo; mientras el embrión siga latente, el endosperma líquido del
coco inducirá la división celular. En el maíz, el endosperma crece inmedia tamente después de la fertilización, y sólo
en la llamada 'etapa lechosa' presenta una actividad estimuladora del crecimiento; esto generalmente ocurre, como
máximo, dos semanas después de la polinización. En la madurez del grano, la actividad casi desaparece. Los
endospermas líquidos de los Juglans (nuez) (Steward et al., 1952a) y de Aesculus woerlitzensis (castaña de Indias)
(Steward et al., 1959) provo can respuestas similares a las del AC (Shantz et al., 1964). Un paso importante en el
desarrollo de las técnicas actuales para estimu lar la división celular de explantes fue la observación de que el AC, a
niveles relativamente bajos (5%-10% v/v), podía interactuar con las auxinas y promover el crecimiento, en situaciones
en que por sí sola era ineficiente. El uso del AC y de 2,4-D en tubérculos de papa (Steward et al., 1951) y del AC y ANA
por Morel et al. (1951) en las monocotiledóneas, fueron otros progresos importantes. Estas observaciones constituyen
las bases para el uso del AC y sus sinergias en la nutrición de células y tejidos cultivados in vitro.
Composición del AC
El agua de coco (AC) es un medio muy complejo, con una amplia gama de componentes orgánicos e inorgánicos
(Cuadro 3.2); tiene buena capaci dad de amortiguación (buffer) y no es raro encontrar sales en ella. Aunque el AC es
muy rica en magnesio y fosfato, no todos los elementos minerales que contiene son indispensables, y se pueden
remplazar por un medio salino basal. El contenido de azúcar, de alrededor de 2.5%, no es algo fuera de lo común y se
puede remplazar (se han identificado sustitutos como glucosa, fructosa, sacarosa y otros azúcares). Adicionalmente,
se encuen tra en ella nitrógeno no proteínico soluble en forma de aminoácidos. El Cuadro 3.3 suministra un análisis
representativo de ciertos compues tos de nitrógeno libre en el AC de nueces maduras provenientes de Puerto
Rico y de Filipinas. Se puede observar que en el agua de coco de Puerto Rico hay más aminoácidos totales
(aproximadamente tres veces) que en la de Filipinas; ambas aguas son particularmente ricas en alanina y ácido
aminobutírícp. La ornitind también está presente en cantidades sustancia les en ambas ¿nuestras (se trata de una
identificación cualitativa obtenida sólo por la posición dela columna de elución). Dependiendo del origen, el AC es rica
o pobre en arginina.
a. Todas las determinaciones se hicieron en el analizador automático de aminoácidos Spinco. Régimen de análisis
de columna larga: pH 3.25 ± 0.01 (concentración de citrato de sodio 0.20 N) y pH 4.2S ± 0.02 (concentración
de citrato de sodio 0.20 N); cambio de temperatura (30-50 °C cambio de amortiguación) a las 13 horas y 20
minutos. Régimen de la columna del medio: pH 4.26 ± 0.02 (concentración de citrato de sodio 0.38 N); cambio
de temperatura (30-50 °C) a las 11 horas y 20 minutos.
En las muestras de AC de ambos sitios hubo dos aminoácidos que no se pudieron identificar críticamente. Uno de
tales aminoácidos fue eluido a 139 mi y estaba presente en cantidad sustancial, como se evidenció por su reacción
a la ninhidrina; el otro 'desconocido' apareció aproximadamente a 646 mi y mediante su reacción a la ninhidrina
se comprobó que no era abundante. En el material de Filipinas se presentaba un aminoácido en la posición de la
dihidroxifenilalanina (DOPA), es decir, en su punto de elución, pero no en el de Puerto Rico; tal sustancia pudo
haber sido dihidroxifenilala nina aunque ello es cuestionable, ya que el AC rara vez se oscurece al exponerla al aire
o a la oxidación. Aunque en las muestras de coco incluidas en el Cuadro 3.3 no estaba presente el ácido pipecólico,
E. M. Shantz, quien trabajaba en el laborato rio F. C, Steward en la Universidad de Cornell, lo aisló en gran cantidad
del agua de coco entera. También se ha logrado el aislamiento masal de ácido aminobutírico, alanina y ácido
glutámico. Se puede observar que la fuente geográfica de los cocos que se usaron para obtener el AC y, más
probablemente, la época del año en que se cosecharon pueden tener una influencia significativa en los
aminoácidos solubles presentes en el endosperma líquido; la etapa de desarrollo tam bién desempeña un papel
importante. Debido a esta variabilidad y a la falta de precisión en la composición de los lotes, muchos
investigadores han abandonado el uso de aditivos naturales e incompletamente definidos. Steward y Shantz
dividieron los componentes de los líquidos que nutren a los embriones inmaduros en dos clases de compuestos:
los sinergísticos y los activos, y han designado tales clases como fracciones 'neutras' y 'acti vas'. En un ensayo con
floema radical de zanahoria (Steward et al., 1954a), estas clases resultaron inactivas por separado, pero muy
activas en combi nación. Adicionalmente, el efecto de esta combinación se estimula aún más por la presencia de
nitrógeno reducido en forma de CH. Pollard et al. (1961) aislaron mioinositol, siloinositol, manitol y sorbitol de la
fracción neutra del AC; esos alcoholes de azúcar se identificaron críticamente y se encontró que contribuyen de
manera apreciable al potencial de esa frac ción en la promoción del crecimiento. Del AC se han aislado varias
purinas (por ejemplo: adenina y uracilo) y hay fracciones que muestran la presencia de compuestos polifenólicos
como las leucoantocianinas, que pueden promover la división celular. Se han identificado las adenilcitocininas,
ZEA y ribosidozeatina (Letham, 1974; van Staden et al. , 1974), y muchos investigadores consideran que, en la
promoción de la división celular, estas sustancias se pueden sustituir por sustancias químicas. Sin embargo,
utilizando ZEA en combinación con otras sustancias que se reconocen como presentes en el AC, nunca se puede
alcanzar ni siquiera el crecimiento equivalente en sistemas tales como el del
ensayo del floema radical de zanahoria; este hecho refuerza la idea de que en el AC hay otras sustancias que
todavía están por descubrir, Sin embargo, de los varios componentes del AC que promueven el crecimiento de
muchos tejidos en cultivo, sólo la fracción activa requiere una identifi cación más completa (Shantzet al.,
1964;Stewardetal., 1971 y referencias allí citadas). De lo anterior se puede ver que, aunque todavía no se conocen
comple tamente todas las fracciones del AC, se sabe bastante sobre ellas. Llegará el día en que este líquido
nutritivo sea remplazado por un medio completa mente identificado; mientras tanto, su uso se justifica, no sólo
por su excelente capacidad amortiguadora sino también porque sus cualidades promotoras del crecimiento
frecuentemente son superiores en su totalidad a las de otros medios conocidos. Además, en aquellas áreas donde
crece, el coco es significativamente más barato que compuestos purificados o sinté ticos tales como la zeatina o
el inositol.
Preparación del AC para el medio de cultivo

El procedimiento es el siguiente: Consiga cocos pelados, preferiblemente recién cosechados y maduros. Abralos
perforando dos o tres agujeritos en la parte final de la nuez, por medio de un taladro eléctrico. Drene
separadamente el líquido de cada nuez a un vaso de laboratorio y examine su apariencia y olor para ver si hay
daño, antes de combinarlo con los otros en un recipiente mayor. Cuele el líquido empleando dos o tres capas de
lienzo para extraer pedacitos de cáscara o fibras y otros componentes que caen en el agua durante el
procesamiento. Coloque el agua en un matraz, tápela con algodón no absorbente y esterilícela en el autoclave a
15 libras de presión, durante 20 minutos. Este proceso precipitará gran cantidad de proteínas presentes en el AC.
Después de dejar que el agua se enfríe (preferiblemente a la mañana siguiente), se filtra con papel filtro Whatman
no. 2; primero se decanta el líquido claro de la parte superior y, finalmente, la porción que contiene el precipitado
floculento. Los embudos Buchner al vacío facili tarán la filtración de la porción inferior. Recombine las porciones,
mezcle bien y coloque el agua preparada en cajas o recipientes de congelador (cualquiera que se utilice para
congelar vegetales o frutas puede servir). No llene en exceso el recipiente: permita alrededor de una
pulgada de espacio superior, para la expansión durante el congela miento. Almacene estas cajas o recipientes en
el congelador hasta cuando se necesiten. Cuando se prevea el uso del AC, se descongela (lentamente) un reci
piente cada vez, calentando con agua tibia y trasfiriendo todo el conte nido a un vaso de laboratorio de acero
inoxidable o Pyrex. Cuando se haya derretido, se cuela el AC una vez más con tres o cuatro capas de lienzo y se
distribuye el contenido en pequeñas botellas (capacidad de 50- 1 00 mi) , que puedan quedar paradas en el
compartimiento del congelador. En algunas ocasiones se requiere filtrar con Whatman no. 2. Se utiliza el ACde las
pequeñas botellas según las necesidades, teniendo la precaución de no dejarla a la temperatura del cuarto durante
mucho tiempo, ya que se contamina muy rápidamente con bacterias. Cualquier cantidad de agua que quede en la
botella se vuelve a almacenar en el compartimiento del congelador.
Aminoácidos como Suplementos del Medio Basal

Generalmente se ha reconocido que los aminoácidos, suministrados como extracto de levadura (Sandstedt et al.,
1960) o como CH (Shantz et al., 1959), pueden promover el crecimiento de ciertos cultivos; en algunos sistemas
de cultivo de tejidos como el del tabaco, dos constituyentes del medio de cultivo (el ácido aspártico y el ácido
glutámico) promueven el crecimiento en la misma forma en que lo hace el complemento aminoácido completo
presente en el extracto de levadura. Otros investigadores han encontrado que algunos aminoácidos en forma
individual pueden ser inhibidores mientras que otros no lo son. Steward et al. (1958) discuten los efectos de varios
compuestos nitrogenados en el crecimiento de los cultivos. Se puede encontrar una fácil explicación para tales
contradicciones. Frecuentemente, y por razones que no son claras, los aminoácidos adicio nados al medio de
cultivo corresponden a la forma DL, la cual es a menudo inhibidora, mientras la forma L es benéfica; además,
obtener muestras estrictamente puras de muchas de estas sustancias es más difícil de lo que se espera. Por otra
parte, si los aminoácidos se esterilizan en un autoclave en contacto con un medio de cultivo, a menudo los
compuestos de nitrógeno simples producen muchos otros que pueden ser inhibidores. Por ejemplo, la urea,
ensayada como urea-C14, produjo por lo menos 25 sustancias, una de las cuales es poderosa inhibidora de la
división celular (Pollard, 1962);
por otra parte, el triptófano puede producir sustancias que son estimula doras (Nitsch et al., 1957; Shantz et al.,
1964)
.
Algunos aminoácidos y sus efectos
En cualquier caso, el papel de los aminoácidos en la nutrición de los tejidos y células vegetales cultivadas se debe
considerar como un problema complejo, ya que muchos tejidos responden diferentemente a los suple mentos de
aminoácidos. La interpretación de la literatura no siempre es fácil, debido a sus contradicciones inherentes.
Trabajando con células tumorales de abeto, Risser et al. (1964) encon traron que de 17 aminoácidos, la tirosina,
la glutamina, la fenilalanina, la asparagina, y los ácidos aspártico y glutámico eran necesarios y no se podrían
remplazar. Se encontró que la alanina, la glutamina y los ácidos glutámico y aspártico, así como el ácido
aminobutírico tenían un efecto sobresaliente en el crecimiento de los tejidos de zanahoria, en ausencia de nitratos.
Las funciones estratégicas de estos aminoácidos (especialmente la alanina y la glutamina) en el metabolismo
ofrecen una explicación directa de la actividad de estos compuestos. Aunque es interesante observar que los
cultivos de zanahoria pueden sintetizar la glutamina a partir del ácido aminobutírico (o de la urea), puede no haber
un requerimiento específico para la glutamina como tal. La asparagina también serviría como una fuente de
nitrógeno, pero sus efectos son un poco menores que los de la glutamina. Los beneficios aparentes de L-asparagina
(180 mg/ litro) en cultivo de tejidos de frutos (Letham, 1960) ilustran este caso. Igualmente, aunque la alanina es
un buen estimulante del crecimiento, puede prescin dirse de ella ya que es fabricada fácilmente por los cultivos
de tejidos a partir de otros sustratos (Bidwell et al., 1964). Se ha encontrado que los aminoácidos leucina y glicina
tienen efectos muy profundos en la morfogénesis. Waris (1962), trabajando con la umbelífera Oenanthe lachenalii
encontró que L-leucina, en una concentración muy crítica, inducía la reproducción vegetativa de nódulos similares
al calló, que presentaban constricción y se desprendían de los ápices de vástagos de la planta original. El cambio
morfológico era irreversible. La glicina también indujo estos llamados 'neomorfos' pero sus efectos fueron
reversibles. Es interesante observar que la glicina es un constituyente normal de los suplementos orgánicos de
White (White, 1963; Singh et al., 1981). El
motivo principal por el que White (1939; 1943) utilizó el extracto de levadura fue que lo encontró especialmente
benéfico en algunos casos, tales Como en los cultivos de raíces de tomate, donde la glicina represen taba alrededor
del 0.5% de su contenido de aminoácidos; sin embargo, Linsmaier et al. (1965) encontraron que no tenía efecto
benéfico y que incluso era tóxico para los cultivos de tabaco, por lo que suprimieron del medio basal todas las
sustancias 'microorgánicas' con excepción de la tiamina. Aunque las proteínas de las plantas contienen cantidades
bajas de aminoácidos sulfúricos como la cisteína y la metionina (Durzan et al., 1983), éstos son necesarios para un
crecimiento y desarrollo normales. Se ha demostrado que la cisteína puede tener dos efectos completamente
diferentes según la modalidad de esterilización (Nitsch et al., 1957); cuando se esteriliza con filtro, es inhibidora al
nivel de 1 -2¿imol, y cuando se usa el autoclave, aparentemente se descompone y actúa como una fuente de
azufre. Letham (1960) consideraba que la cisteína, a un nivel de 10 mg/ litro, era necesaria para el cultivo de tejidos
de manzana; sin embargo, la cisteína no tiene un efecto aparente en muchos otros tejidos que crecen en cultivos.
No obstante, parece razonable que para cualquier tejido recalcitrante se debería ensayar una fuente de
aminoácido con azufre como la cisteína o la metionina. La mayoría de los suplementos aminoácidos estándar y,
por supuesto, los complejos contienen una o ambas de estas dos sustancias. Asimismo, los aminoácidos
aromáticos, especialmente la tirosina, el triptófano y la fenilalanina, presentan problemas para su interpretación.
Skoog y su grupo clasificaron la tirosina como efectiva para promover el desarrollo de yemas en el cultivo de tabaco
(Skoog et al., 1957); en comparación, la fenilalanina sólo tenía un pequeño efecto y el triptófano (que es
desaminado oxidativamente para producir AIA) era inactivo. Un informe anterior de Reinen y White (1956) decía
que la tirosina permitía el crecimiento de tejido tumoral de abeto, que de otra forma sería recalcitrante; se
suponía, con poca evidencia, que esta sustancia retrasaba o evitaba la formación de melanina en los tejidos de
Picea glauca y así les permitía crecer. Sin embargo, aquí la lógica parece inconsistente con lo que se sabe sobre la
formación de melanina; en realidad, ese mismo medio puede ocasionar ennegrecimiento en algunos tejidos. Por
otra parte, la amplia gama de suplementos propuesta por Reinert y White (1956) pone en tela de juicio la pureza
de los componentes utiliza dos. Estos investigadores no han tratado de purificar adicionalmente tales
compuestos; en el Cuadro 3.4, que presenta los numerosos suplementos del medio usado por ellos, se puede ver
fácilmente la justificación de nuestro cuestionamiento sobre las conclusiones de sus experimentos. Aun así, los
cuadros suministran un buen ejemplo de las varias fórmulas de este tipo, complejas 'a la fuerza1, que se
encuentran ocasionalmente. Cuadro 3.4. Suplementos de Reinert y White (1956) utilizados para el establecimiento
de cultivos de Picea glauca, y su dosis de medio mineral basa] 1942 de White. Todos los suplementos se esterilizan
mediante filtración.
Caseína hidrolizada (CH)

De los pocos ejemplos mencionados anteriormente se puede deducir que, por lo menos, se debería ensayar un
suplemento de los aminoácidos, como la CH (200 mg/ litro); ésta se puede aplicar, en forma rutinaria, en muchos
casos en que se desee ver si se puede aumentar el crecimiento por medio del suministro de una fuente de
nitrógeno reducido. El Cuadro 3.5 muestra la composición de la caseína hidrolizada ácida y enzimáticamente,
según se ha determinado en un analizador de amino ácidos. La CH digerida enzimáticamente se ha utilizado de
forma rutinaria como un suplemento de medios de cultivo para plantas (Steward et al, 1954b); se prefiere esta
caseína porque la hidrólisis ácida destruye el
Cuadro 3.3. Componentes nitrogenadosa de la caseína hidrolizada con ácidos y con enzi mas.
a. Se expresan en términos de mg de aminoácidos o mg de N por 100 mg de CH. Las determinaciones se
efectuaron en un analizador automático de aminoácidos Spinco. Los compuestos no identificados
eluidosa40,43,99, IOS, 1SS, 162, 195,210, 430, 442 mi. y otros picos, se identificaron como citrulina, ácido
amino-n-butírico y cistationina sólo por la posición en que estaban presentes en la caseína hidrolizada
enzimáticamente; estaban ausentes en la caseína ácido-hidrolizada.
triptófano presente en la sustancia. Sin embargo, en la caseína digerida enzimáticamente hay un gran número de
compuestos que no se han identificado, aunque están presentes en cantidades mínimas; en las mues tras
mencionadas aquí, se han identificado algunos únicamente en forma tentativa, mientras otros simplemente se
mencionan como una interro gante de 'X' mi de eluido. Se desconoce la importancia que las sustancias presentes,
pero no identificadas, tienen como promotoras del crecimiento y generalmente estamos obligados a suponer que
simplemente se añaden al suministro de nitrógeno total disponible.
Además, ya que la CH puede tener contenidos bajos de algunos aminoá cidos como la metionina, el triptófano y
la fenilalanina, éstos se pueden añadir a los cultivos recalcitrantes (3 mg/ litro de L-metionina, 4 mg/ litro de L-
triptófano, y 5 mg/ litro de L-fenilalanina).
Levadura y extracto de malta

La levadura y el extracto de malta de cebada generalmente se suminis tran en concentraciones respectivas de
0.5% hasta l%yde0.1%v/v. Estas dos sustancias se pueden considerar también como buenas fuentes de nitrógeno
reducido, de precursores potenciales de las adenil-citocininas, e incluso de las mismas adenil-citocininas. Van
Staden et al. (1975) identifi caron en el extracto de malta Difco la ZEA y los compuestos relacionados; pero
Sandstedt et al. (1960) ensayaron los L-aminoácidos en el cultivo de tejidos de tabaco, en las proporciones
presentes en el extracto de levadura Bacto, y encontraron que los ácidos aspártico y glutámico podían por sí solos
sustituir a la mezcla entera. Muchos investigadores encontraron que el extracto de malta de cebada era benéfico
cuando se utilizaba como un suplemento (Lowenberg et al., 1952; Gautheret, 1959). Sin embargo, en otros casos,
cuando el extracto de malta de cebada se utilizaba como una fuente de nitrógeno reducido en los cultivos, los
tejidos podían oscurecerse y morir. Por otra parte, las maltas de otros cereales pueden ocasionar diferentes
respuestas; por ejemplo la malta del ragi (Eleusine coracaná), un cereal ampliamente utilizado en la India, ha
mostrado ser una fuerte estimuladóra de algunos tejidos (Murthy Reddy et al., 1973). Por consiguiente, esto
refuerza el hecho de que diversos tejidos responden diferentemente a varios suplementos.
Vitaminas Las plantas verdes se consideran normalmente autótrofas para las vitami nas, pero puede ser necesario
añadir al medio algunas de ellas, hasta cuando los cultivos crezcan o se hayan vuelto verdes. En la mayoría de los
medios, la tiamina, la piridoxina y el ácido nicotínico se consideran benéficas y se añaden de forma rutinaria, por
conveniencia. Desde hace mucho tiempo se sabe que las puntas radicales escindidas son incapaces de sintetizar
la tiamina y presentan un requerimiento definitivo por la misma cuando se van a cultivar continuamente. En
realidad, en la planta intacta las raíces deben obtener su tiamina del vástago donde es sintetizada.
Otras vitaminas (ácido pantoténico, biotina, riboflavina y colina) pue den ser útiles pero no absolutamente
necesarias. El ácido ascórbico (10 a 100 mg/litro) se considera benéfico en algunos casos, debido probable mente
a su capacidad para actuar como un agente reductor y para retrasar la formación de sustancias similares a la
melanina, que inhiben el creci miento, y no debido a su papel como 'vitamina'. También se ha sugerido que los
efectos estimuladores del crecimiento que tiene el jugo de tomate (Vacin et al., 1949; Nitsch, Í954) probablemente
se deben a una respuesta de este tipo, y no a la presencia de alguna sustancia de división celular (Arditti, 1966). El
ácido ascórbico no parece ser tan bueno como el glutatión (10 a 100 mg/litro) para retrasar el oscurecimiento de
algunos tejidos recalci trantes, ya que se autooxida más rápidamente que este último. Otros afirman que la
vitamina B12 es benéfica para el establecimiento de los cultivos de tejidos y células (Reinert et al., 1956). En
cualquiera de los suplementos mencionados hay que tener en cuenta su termolabilidad. La glutamina, la
asparagina, la hipoxantina y el ácido ascórbico deben considerarse termolábiles en cualquier experimento; es
decir, deberán esterilizarse por filtración y añadirse separadamente al medio enfriado, teniendo las precauciones
adecuadas para mantener la esterilidad. El pantotenato de calcio, la tiamina HC1, la riboflavina, y el triptófano
también se encuentran afectados por el calor, aunque su degra dación se considera leve.
Purinas y Pirimidinas
Generalmente se ha reconocido que la levadura, la malta y los extractos selectos de tejidos, al igual que el
endosperma líquido, pueden suministrar purinas o pirimidinas. Del extracto del endosperma líquido del maíz se
ha logrado el aislamiento masal de las purinas, adenina, adenosina, uracilo, xantina e isoguanina; éstas son activas
separadamente o en combinación con otras fracciones del extracto de maíz (Shantz et al., 1964). Las purinas, la
adenina y el uracilo también se han aislado, en forma cristalina, del AC. Un trabajo anterior mostró que,
generalmente, es posible aumentar levemente las propiedades estimuladoras del crecimiento del AC entera
añadiendo adenina, adenosina o ácido adenílico. Los experimentos di señados para determinar si la actividad de
varios tipos de compuestos promotores del crecimiento se podía aumentar al combinarlos con una
mezcla general de purina, mostraron que cantidades equimolares de adenina, guanina, ácido adenílico, guanosina,
xantina, hipoxantina, adenosina y ácido guanílico no tenían un efecto promotor del crecimiento cuando se añadían
al medio basal en concentraciones de 20 mg/ litro. Al añadir la mezcla de purina a los compuestos estimuladores
(difenilurea, .4escu/wí-leucoantocianina, ácido indol-3-acético, y ácido benzotiazolil-2-oxiacético) tampoco se
aumentó de manera significativa la respuesta del crecimiento, a excepción de la correspondiente al ácido
benzotiazolil-2-oxiacético. Con este último la mezcla de purina parecía ser significativamente sinergística, aunque
en presencia de la CH este efecto desapareció notoriamente. Por lo tanto, aunque parece que no hay razón para
pensar que cual quiera de los promotores específicos de la división celular corresponden directamente a
cualquiera de las purinas libres o a las sustancias relaciona das con las pirimidinas que ocurren naturalmente, es
dogma corriente que las sustancias asociadas con el metabolismo del ácido nucleico pueden, al menos, ser
limitantes, y que por tanto se puede requerir su suministro para asegurar el crecimiento de los cultivos. Sería
razonable añadir ciertos precursores como el ácido orótico, la glicina y los compuestos de amonio. Igualmente,
pueden ensayarse los derivados del ácido nucleico o análogos suyos como la KIN (6-furfurilaminopurina, 6-
anilinopurína, 6-succinilaminopurina), o sustancias com prometidas en la biosíntesis del ácido nucleico (por
ejemplo, el ácido nicotínico o el ácido fólico) en casos especiales en que los tejidos son recalcitrantes. El Cuadro
3.6 da la composición de tres soluciones de tales compuestos, ideadas de manera arbitraria. Se han elaborado
como soluciones madre 10X en agua destilada, para usarlas en concentraciones de 1 , 10 y 50 mi de solución por
litro de medio basal. En algunos casos no se observa un beneficio aparente al añadir cual quiera de los suplementos
por separado o en combinación; en otros casos parece presentarse un efecto tóxico que se manifiesta por el
oscurecimiento de los tejidos, y en otros casos se observa un efecto benéfico. Por consi guiente, pueden existir
casos en los que combinaciones sutiles de los compuestos presentados en el Cuadro 3.6 (lo que llamamos nuestro
'coctel purina-pirimidina') resulten benéficas, pero siempre y cuando se añadan en cantidades extremadamente
diluidas.
Cuadro 3.6. Mezclas de purinas y pirimidinasa que se pueden añadir a los medios de cultivo.
a. Pueden elaborarse como soluciones 10X en agua destilada y emplearse solas o en combinación, usando
concentraciones de 1, 10 y 50 mi por litro de medio basal. Todas las soluciones se esterilizan por filtración.
Auxinas, Citocininas y Otros Reguladores del Crecimiento

Se sabe que las líneas habituadas y los tumores son capaces de proliferar en un medio compuesto estrictamente
de sales inorgánicas, una fuente de carbono y una o dos vitaminas. Por otra parte, hay una gran cantidad de tejidos
que no crecen en este medio mínimo; estos últimos tejidos, que se supone son 'normales', sólo crecerán cuando
se les suministre alguna sustancia reguladora del crecimiento. Las sustancias reguladoras se pue den suministrar
en forma de endospermas líquidos como el AC o de compuestos químicos más definidos. En el trabajo de cultivo
de tejidos, el uso de promotores del crecimiento naturales y sintéticos está bien documentado. No se pretende
revisar esta literatura tan voluminosa (Steward et al., 1971; Abeles, 1973; Crozier, 1981; Addicott, 1983; Nickell,
1983; Scott, 1984; MacMillan, 1984); sin embargo, se harán algunas consideraciones generales sobre las diversas
clases de sustancias promotoras del crecimiento que se han encontrado útiles para el establecimiento y
mantenimiento de cultivos de tejidos.
7. CULTIVO IN VITRO
Capítulo 2
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales ¡n vitro
1. Introducción
La amplitud de la definición de 'cultivos de tejidos' y los numerosos objetivos que éstos persiguen constituyen
serios escollos en cualquier intento de generalización sobre los factores que afectan el establecimiento de tales
cultivos in vitro, y obligan a consideraciones previas para delimitar los alcances de los mismos. En primer término,
el cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo grupo de técnicas mediante las
cuales un explante (parte separada de un vegetal, por ejemplo: protoplasto, célula, tejido, órgano) se cultiva
asépticamente en un medio de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
Esta acepción amplia, si bien imprecisa, es actualmente aceptada; sin embargo, existen sugerencias de algunos
autores (Street, 1977a; Steward, 1983) para restringir su empleo. En segundo término, los objetivos perseguidos
con la utilización del cultivo in vitro de tejidos vegetales son numerosos y diferentes. Breve mente, las posibilidades
de aplicación de tales cultivos se pueden resumir así: a) estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica, y
ciencias afines; b) bioconversión y producción de compuestos útiles; c) incremento de la variabilidad genética; d)
obtención de plantas libres de patógenos; e) propagación de plantas; y f) conservación e intercambio de
germoplasma. De estas consideraciones surge que el establecimiento de los cultivos de tejidos, es decir, la
separación del explante y las operaciones relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida del
tipo de explante y del sistema de cultivo que se emplee, los que a su vez dependerán del objetivo perseguido. En
otras palabras, las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son exactamente las mismas que se usan
para cultivar meristemas; del mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran utilidad para el
logro de un objetivo pero puede no ser útil para otro. Las características particulares de los diferentes sistemas de
cultivo se tratarán en capítulos específicos, mientras en el presente se discutirán aspectos comunes al
establecimiento de los cultivos. De manera especial se harán consideraciones generales sobre: a) el explante; b)
las normas de asepsia; c) los medios de cultivo; y d) las condiciones ambientales de incubación; la interacción de
estos factores determinará las respuestas que se obtengan in vitro, algunas de las cuales se ilustran en la Figura
2.1.
La respuesta obtenida con el cultivo in vitro de un determinado explante decidirá sobre su utilidad para el logro
de un objetivo propuesto. Es indudable que las respuestas del tipo a o b de la figura son indeseables; pero
respuestas del tipo c (proliferación de callos), serán de gran valor práctico para estudios básicos, para la iniciación
de suspensiones celulares o para la bioconversión y producción de compuestos útiles. Algunas respuestas del tipo
d (proliferación de múltiples vástagos) pueden ser ideales si se pre tende micropropagar plantas. Es necesario
recalcar que, para su aplicación en la agricultura, cualquier sistema de cultivo in vitro debe lograr como producto
final la regeneración de plantas enteras. Por lo tanto, en este capítulo se hará énfasis en ese aspecto. Literatura
suplementaria sobre explante, asepsia, medios de cultivo y condiciones ambientales de incubación puede
encontrarse en la obra clá sica de Gautheret (1959) y en algunos manuales como los de Thomas et al., 1975; Dodds
et al., 1982; Reinert et al., 1982; y Wetter et al., 1982. Asimismo existen varias revisiones (entre ellas Street, 1977;
Yeoman et al., 1977; Gamborg et al., 1976; Dougall, 1980; Martin, 1980; Seibert et al., 1980; Seabrook, 1980;
Biondi et al., 1981; Evans et al., 1981; Gamborg et al., 1981; y Hughes, 1981) en las cuales se tratan en forma
parcial o conjunta los aspectos antes mencionados.
Explante
La elección de un explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos; en primera
instancia, dicha elección está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Si el objetivo
final es la producción de callos, es factible la utilización de una vasta gama de explantes que, cultivados en
condiciones apropiadas, permiten la proliferación callosa. Cualquier explante que contenga células nucleadas vivas
se puede emplear potencialmente para la obtención de callos; por ejemplo, en el caso de numerosas
dicotiledóneas herbáceas (Figura 2.2) se puede lograr la proliferación callosa con relativa facilidad mediante la
utilización de explantes provenientes de diversas partes del vegetal. Es muy frecuente la utilización de ápices o
meristemas caulinares, hojas, entrenudos, cotiledones, raíces, anteras e inclusive tejidos altamente diferenciados
como los provenientes de frutos. Esta facilidad para la proliferación callosa puede hacerse extensiva a células y
protoplastos, con el empleo de técnicas y medios de cultivo más elaborados.
En el caso de vegetales en los cuales la obtención de callos no esté limitada por el tipo de explante, éste se
seleccionará por razones prácticas como disponibilidad, facilidad de manipulación, homogeneidad, baja con
taminación con microorganismos, y rápida respuesta in vitro; es probable que en estos casos se opte por explantes
provenientes de plantas jóvenes que crecen en invernaderos, y una alternativa interesante sería usar los
provenientes de semillas germinadas en condiciones asépticas. Sin embar go, hay otros vegetales más
recalcitrantes en lo que respecta a la obtención de callos, y en estos casos se hace necesario utilizar ciertos
explantes; esto ocurre con muchas plantas leñosas y algunas gramíneas. La elección de un explante apropiado se
complica si se pretende la regeneración de plantas a partir de callos. Son pocas las especies que pueden sumarse
a Nicotiana tabacum (Figura 2.2) en su característica de permitir el uso de una gran variedad de explantes para
producir callos capaces de regenerar plantas enteras; entre tales especies se encuentran: Daucus carota,
Stylosanthes guianensis, Brassica napus, Medicago sativa, y Trifolium repetís. El modelo representado en la Figura
2.2 con el maní (Arachis hypogaea) muestra que no todos los explantes que producen callos posibilitan la
regeneración de plantas. La soya (Glycine max) se puede considerar como un excelente ejemplo de la facilidad con
que se obtienen callos por cultivo de diferentes explantes, pero en el cual la regeneración de las plantas está
limitada al empleo de explantes que contengan meristemas apicales caulinares o laterales; respuestas similares
se obtienen en muchas especies de interés económico (entre ellas Vigna unguiculata, Phaseolus vulgaris, Cicer
arietinum, Vicia sativa, Desmodiutn canum, y Manihot escalenta). Por último, la Figura 2.2 muestra el caso de
Phaseolus lunatus, en el cual es factible inducir el crecimiento calloso pero no se ha logrado aún la regeneración
de plantas, a pesar de que se han ensayado unas 40 variantes que involucran medios y sistemas de cultivo.1 Es de
esperar que futuras investigaciones permitan ampliar la lista de especies vegetales que se ajusten al modelo
representado en el tabaco, para aumentar así las posibilidades de aplicación de las técnicas del cultivo in vitro de
tejidos. El establecimiento de cultivos que persiguen determinados objetivos puede limitar aún más la elección
del tipo de explante. Para la obtención de
haploides se cultivan anteras y, en menor medida; inflorescencias, microsporas u ovarios; también con el mismo
objetivo sé pueden cultivar en el caso de la cebada embriones haploides derivados del cruzamiento de Hordeum
vulgare x H. bulbosum (Jensen, 1977; Yeung et al., 1981). Para la obtención de plantas libres de patógenos se
cultivan meristemas, lo mismo que para la conservación de germoplasma (ver Capítulos 9, 1 1 , 12 y *5)- ' ... . \ ' ..'
,. En relación con la especie vegetal utilizada, es importante tener en cuenta la variabilidad asociada con el
genotipo de las plantas. Es muy frecuente que, en idénticas condiciones de medio y ambiente, las respuestas
invitro del cultivo de un determinado explante de una especie difieran con el cultivar enípleado. Entre cultivares
de mandioca o yuca {Manihot esculenta Crantz) se encuentran diferencias hasta de 100% en el peso seco de los
callos (Rey et al., 1980), y en el pimiento (Capsicum annuum) tales diferencias llegan hasta 250%.2 También se
aprecian diferencias en la regeneración de plantas por cultivo de hojas jóvenes entre cultivares de máflí (Arachis
hypogaea) (Mroginski et al., 1981c; Pittman et al., 1983) y arveja (Pisum sativum) (Rubluo et al., 1982), como
también por cultivo de. discos foliares de Lycopersicon esculentum (Frankenber^er et al., 1981a; 1981b). Otros
buenos ejemplos son el cultivo de meristemas de frutillao fresa (Fragaria x ananassa) (Boxus et al., 1977). y el
cultivo de anteras de trigo {friticum vulgare L.) (Clapham, 1977). En cultivos in vitro de alfalfa (Medicago sativa) las
respuestas varían con el cultivar (Bingham et al., 1975), e inclusive hay diferencias entre plantas de un mismo
cultivar (Kao et al., 1980; 1981). Ligeros cambios en la composición de los medios de cultivo, especial mente en lo
que se refiere a los reguladores de crecimiento, pueden ser de utilidad para obviar este efecto del genotipo del
material vegetal. Las respuestas de los explantes cultivados in vitro pueden variar nota blemente con el estado de
desarrollo y edad ontogénica de los mismos. El éxito en la obtención de plantas haploides por cultivo de anteras
depende en gran medida de su estado de desarrollo al momento de su cultivo (Mroginski, 1975; Sunderland, 1974).
La propagación invitro déla mayo ría de las plantas leñosas requiere de la utilización de explantes provenien tes
de materiales juveniles (Bonga, 1980; Dodds, 1983); en plantas herbá ceas como el maní o la arveja, la
regeneración de plantas a partir de hojas
está limitada al empleo de, espiantes jóvenes (Mroginski et al., 1981b; 1981c; Rubluo et al., 1982). El tamaño del
explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el establecimiento de los cultivos; cuanto más grande
sea, madores son las posibilidades de obtener proliferación callosa, aunque ello trae aparejadas mayores
probabilidades de heterogeneidad y de contaminación don microorganismos. Existe un tamaño mínimo del
explante, variable según el material vegetal, por debajo del cual no se obtienen proliferación callosa u otras
respuestas deseables. El efecto del tamaño del explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e
independientemente de la fuente dé donde proviene dicho explante; su importancia ha sido señalada en cultivos
de mérTstemas (Hu et al., 1983), anteras (Xuet al., 1982), suspensiones celulares (Street, 1977b), embriones
(Monnier; 1976) y pfbtoplastos (Kao et al: ,1 980). En general, el cultivo de explantes muy pequeños requiere el
empleó dé medios más complejas o de los denominados medios acondicionados (Street, 1977b); otra alternativa
es el cultivo de variosexplantes en un mismo recipiente, en lugar de su incubación en forma individual. Se debe
tener en cuenta la incidencia de otros factores que a menudo pueden alterar las respuestas délos éxplahtes
cultivados; entré estos facto res están la épbca del año en que se realizan los cultivos, especialmente cuando los
explantes se obtienen de plantas de invernadero o campo. Otro factor serían los pretratamientosl a los éxplantes
y las condiciones dé crecimiento de las plantas dbftantes de los mismos.
Asepsia
La asociación explante-medio y las condiciones físicas en que normal mente se incuban los cultivos' conforman un
ambiente propicio para la proliferación de microorganismos (bacterias, hongos), los cuales pueden destruir tales
cultivos, competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo. Evitar las contaminaciones con
microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito, no solamente en el
establecimiento de los cultivos sino en su ulterior incubación y manipu lación: '■ Es difícil lograr cultivos
completamente estériles en el estricto sentido de la palabra; por ejemplo, es probable que los virus presentes en
el explante persistan en los cultivos. Hecha esta salvedad, para establecer cultivos
asépticos es conveniente o necesario: a) trabajar en ambientes adecuados; b) esterilizar los medios de cultivo; c)
desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos de bacterias y hongos exógenos; y d) realizar los cultivos
respetando ciertas normas de asepsia (ver Capítulo 1). Hay una vasta gama de compuestos químicos que se
pueden utilizar como desinfectantes para los explantes, pero en la actualidad es casi generalizado el empleo de
etanol (70% v/v) y de hipoclorito de sodio (NaOCl) del 1% al 3% contenido en productos de uso doméstico (agua
de lavandina). Con menor frecuencia se usan el hipoclorito de calcio [Ca(OCl)2, 6% a 12%] y el cloruro de mercurio
(HgCl2, 0.1% a 1.5%), aunque hay que recalcar que este compuesto es altamente tóxico y que no es fácilmente
removible del explante. En algunos casos resulta útil el agregar algún agente tensoactivo (por ejemplo, Tween-20,
del 0.01% al 0.1%), pero puede ser innecesario en los procedimientos de desinfección que incluyan un primer paso
con etanol 70%. Asimismo, es conveniente agitar (80-150 rpm) el explante conjunta mente con la solución
desinfectante. Después de tratar el explante con las soluciones desinfectantes es nece sario remover de él los
restos del producto, mediante varios lavados con agua destilada estéril y operando en la cámara de trasferencia.
Es aconse jable lavar los explantes con un volumen por lo menos 10 a 20 veces mayor de agua estéril, haciendo
un mínimo de tres enjuagues sucesivos. Los antibióticos aplicados al medio de cultivo pueden ser de utilidad para
la desinfección de los explantes. Sin embargo, en general, su empleo solamente se justifica en casos de excepción
y en cultivos de corta dura ción, ya que la alta especificidad de los antibióticos implica que no previe nen la
proliferación dé todos los microorganismos; además, tales produc tos modifican la composición de los medios de
cultivo y pueden ser metabolizados por los explantes. El procedimiento para la desinfección superficial de los
explantes debe permitir eliminar los microorganismos con el menor daño posible para los explantes. No es factible
recomendar un procedimiento general para este propósito, y se deben considerar de manera especial las especies
vegetales y el tipo de explante. En el Cuadro 2. 1 se incluyen varios procedimientos utilizados para la desinfección
de explantes. Es interesante observar que, si bien en ocasiones se emplea sólo etanol, o solamente NaOCl, lo más
frecuente es la utiliza ción de ambos, es decir, una inmersión (generalmente de corta duración) en etanol 70%,
seguida de una en NaOCl y de varios lavados con agua estéril.
Otros procedimientos incluyen una doble desinfección, como ocurre con el cultivo de hojas jóvenes del maní
(Arachis hypogaeá) (Mroginski et al., 198 1 c). En este caso las semillas se sumergen en etanol al 70% ( 10 seg),
luego en NaOCl al 1.2% (10 min), y posteriormente se lavan y se ponen a germinar asépticamente. A los 3-5 días,
las plántulas resultantes se desin fectan con NaOCl al 0.6% (10 min.) y después se lavan con agua destilada estéril;
luego se retiran de ellas las hojas jóvenes para los cultivos. Un procedimiento similar se utilizó en arveja (Pisum
sativum) (Mroginski et al., 1981b). Algunos procedimientos emplean la preincubación de los explantes. En el caso
de las hojas del café, se desinfectan con Ca(OCl)2 al 1 %( 1 5 min), se lavan con agua estéril y se cortan en pequeños
trozos que se incuban en una solución salina (sales de Murashige et al., 1962, diluidas a la mitad) y sacarosa; al
cabo de 48 h se seleccionan los éxplantes no contaminados y que mantienen la coloración normal, para establecer
los cultivos (Sondahl et al., 1979). Litz et al. (1979) emplearon un procedimiento similar para la desinfección de
pecíolos de Carica stipulata. Los ápices caulinares del manzano utilizados en micropropagación se desinfectan
levemente, se incuban por 24 h en el medio de cultivo, se desinfectan de nuevo, y se cultivan (Jones et al., 1977).
Los explantes provenientes de vegetales que crecen en invernaderos o en cuartos climatizados son relativamente
más fáciles de desinfectar que los provenientes de plantas que crecen en el campo; también es más fácil la
desinfección de explantes de órganos jóvenes que la de explantes prove nientes de materiales adultos. Las
aplicaciones de fungicidas o bacterici das, aplicadas previamente a las plantas, pueden ser de utilidad. Por asepsia
en el establecimiento y ulterior manipulación de los cultivos es preciso adoptar algunas precauciones durante las
tareas que se llevan a cabo en la cámara de trasferencia, así: 1) Antes de comenzar a trabajar, desinfectar la mesa
y las paredes de la cámara con etanol 70%. Igualmente es conveniente desinfectar la parte externa de los
recipientes que contienen los medios de cultivo o el agua estéril, antes de introducirlos en la cámara. 2) Es
necesario que las manos y, eventualmente, los antebrazos del cultivador sean desinfectados con etanol 70%. El
uso de máscaras y gorros no es imprescindible, pero reduce la contaminación si se opera en flujos laminares de
aire estéril. 3) Los instrumentos metálicos empleados se deben flamear previamente con etanol 95%. El material
de vidrio utilizado como soporte para las
Otros procedimientos incluyen una doble desinfección, como ocurre con el cultivo de hojas jóvenes del maní
(Arachis hypogaeá) (Mroginski et al., 198 1 c). En este caso las semillas se sumergen en etanol al 70% ( 10 seg),
luego en NaOCl al 1.2% (10 min), y posteriormente se lavan y se ponen a germinar asépticamente. A los 3-5 días,
las plántulas resultantes se desin fectan con NaOCl al 0.6% (10 min.) y después se lavan con agua destilada estéril;
luego se retiran de ellas las hojas jóvenes para los cultivos. Un procedimiento similar se utilizó en arveja (Pisum
sativum) (Mroginski et al., 1981b). Algunos procedimientos emplean la preincubación de los explantes. En el caso
de las hojas del café, se desinfectan con Ca(OCl)2 al 1 %( 1 5 min), se lavan con agua estéril y se cortan en pequeños
trozos que se incuban en una solución salina (sales de Murashige et al., 1962, diluidas a la mitad) y sacarosa; al
cabo de 48 h se seleccionan los éxplantes no contaminados y que mantienen la coloración normal, para establecer
los cultivos (Sondahl et al., 1979). Litz et al. (1979) emplearon un procedimiento similar para la desinfección de
pecíolos de Carica stipulata. Los ápices caulinares del manzano utilizados en micropropagación se desinfectan
levemente, se incuban por 24 h en el medio de cultivo, se desinfectan de nuevo, y se cultivan (Jones et al., 1977).
Los explantes provenientes de vegetales que crecen en invernaderos o en cuartos climatizados son relativamente
más fáciles de desinfectar que los provenientes de plantas que crecen en el campo; también es más fácil la
desinfección de explantes de órganos jóvenes que la de explantes prove nientes de materiales adultos. Las
aplicaciones de fungicidas o bacterici das, aplicadas previamente a las plantas, pueden ser de utilidad. Por asepsia
en el establecimiento y ulterior manipulación de los cultivos es preciso adoptar algunas precauciones durante las
tareas que se llevan a cabo en la cámara de trasferencia, así: 1) Antes de comenzar a trabajar, desinfectar la mesa
y las paredes de la cámara con etanol 70%. Igualmente es conveniente desinfectar la parte externa de los
recipientes que contienen los medios de cultivo o el agua estéril, antes de introducirlos en la cámara. 2) Es
necesario que las manos y, eventualmente, los antebrazos del cultivador sean desinfectados con etanol 70%. El
uso de máscaras y gorros no es imprescindible, pero reduce la contaminación si se opera en flujos laminares de
aire estéril. 3) Los instrumentos metálicos empleados se deben flamear previamente con etanol 95%. El material
de vidrio utilizado como soporte para las
disecciones (generalmente cajas Petri) debe estar esterilizado al igual que las pipetas que comúnmente se usan
en trabajos con suspensiones celulares y protoplastos. 4) Realizar las operaciones de trasferencia y disección lo
más cerca posible a la llama de un mechero. Evitar exposiciones prolongadas de los explantes o de los, medios de
cultivo en recipientes abiertos. Para más detalles sobre estos temas, ver Capítulo 1.
Medios dé Cultivo
Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un determinado explante, es necesario elegir un
medio apropiado de cultivo, en el cual hay que considerar no sólo sus componentes sino su preparación.
Componentes del medio En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene
entre 15 y 35 compuestos químicos que suministran: a) Carbono. b) Nutrimentos minerales. c) Vitaminas. d)
Agente gelifícante (en el caso de medios semisólidos). e) Sustancias reguladoras del crecimiento. f) Otros
compuestos. Generalmente se hace referencia al conjunto de componentes a+b+c como al medio basal (MB), y
algunas de sus formulaciones se encuentran en el Cuadro 2.2. Fuentes de carbono. Muy pocos cultivos in vitro son
autótrofos, y por lo tanto es necesario agregar al medio una fuente de carbono. La sacarosa (2% a 5%) es el azúcar
que más se utiliza, y se puede reemplazar por glucosa y en menor medida por fructuosa; en general, la maltosa y
la galactosa son menos efectivas. La incorporación de mioinositol al medio (100 mg/ litro) generalmente da como
resultado un mejor crecimiento de los callos y suspensiones celulares. Nutrimentos minerales. Cualitativamente
los medios de cultivo aportan los mismos elementos (macro y micronutrimentos) que se consideran
Cuadro 2.2. Composición de cuatro medios básicos (MB) para el cultivo in vitro de tejidos.
esenciales para el crecimiento de plantas enteras. En los medios de reciente desarrollo (MS, B5, N6) cabe destacar
las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio con respecto al medio de White (Cuadro 2.2). El
nitrógeno se suministra en forma de nitrato y amonio; aunque los cultivos pueden prosperar con solo nitrato o
solo amonio como fuente nitrogenada, en este último caso el medio debe contener también ácido cítrico, succínico
o málico. Otras fuentes de nitrógeno incluyen glutamina, urea y caseína hidrolizada (CH).
Los medios de cultivo contienen fósforo, calcio, magnesio y azufre en concentraciones de 1 a 3 mM. La adición de
hierro conjuntamente con un agente quelante (Na2EDTA) lo hace disponible en un amplio rango de pH. Vitaminas.
Si bien los medios de cultivo contienen comúnmente varias vitaminas, es probable que en forma general sólo sea
esencial la incorpora ción de tiamina. Agente gelificante. En los medios semisólidos comúnmente se adiciona agar
(0.6% a 1 .0%). Se debe considerar especialmente la pureza del agar, ya que es frecuente la presencia de impurezas
de naturaleza variada; la marca comercial y las concentraciones del agar utilizado pueden alterar las respuestas in
vitro de los cultivos (Debergh, 1982). Reguladores de crecimiento. En algunos casos se obtienen en los culti vos in
vitro las respuestas deseadas mediante el empleo del MB sin regula dores de crecimiento; entre otros, es el caso
de la obtención de plantas por cultivo de meristemas de Vigna unguiculata (Kartha et al., 1981b) y por cultivo de
anteras de tabaco (Nitsch, 1969). Sin embargo, en la mayoría de los casos se hace necesario agregar al medio
sustancias reguladoras de crecimiento, generalmente del tipo de las auxinas o las citocininas. Las auxinas que más
se utilizan en el establecimiento de los cultivos son: 2,4-D, ANA, AIA, y AIB; las citocininas que más se emplean
son: KIN, BAP,yZEA. Las giberelinas, especialmente el AG3, han demostrado ser necesarias para el cultivo de ápices
o meristemas caulinares de varias especies vegeta les como Phaseolus vulgaris, Solanum tuberosum, Fragaria x
ananassa, Manihot esculenta y otras (ver revisión de Styer et al., 1983). El ácido abscísico (ABA) se emplea en
ocasiones. Otros componentes. Existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a
los medios de cultivo, como fuentes de nitrógeno reducido, factores de crecimiento, carbohidratos, y otros. Entre
ellos están el agua de coco, AC, (5% a 15%, v/v), el jugo de frutos de tomate, el extracto de levadura, y el extracto
de tubérculos de papa. Además de glicina, en ocasiones se incorporan al medio otros aminoáci dos como
asparagina, cisteína y L-tirosina. En general, no son constitu yentes esenciales de los medios e inclusive, en
concentraciones relativa mente altas, pueden tener efectos inhibitorios sobre los cultivos. En algunos medios se
adicionan ácidos orgánicos como el cítrico, el málico, el succínico y el pirúvico, como precursores de aminoácidos;
también es frecuente la adición de L-glutamina y de caseína hidrolizada (0.1% a 1%). El empleo de sustancias
antioxidantes (ácido ascórbico, L-cisteína, polivinilpirrolidona) puede ser de utilidad para el cultivo de explantes
con alto contenido de polifenoles, cuya oxidación produce oscurecimiento y eventual muerte de los explantes. En
estos casos también es útil usar las soluciones antioxidantes durante la preparación del explante, como tam bién
incubar los cultivos en la oscuridad o a bajas intensidades de luz. También se suele acortar el intervalo de tiempo
entre subcultivos, como un medio para disminuir los efectos nocivos de la oxidación de polifenoles. El carbón
activado (0. 1% a 5%), incorporado al medio, ha mostrado ser de utilidad en el cultivo de diferentes explantes,
posiblemente por absorber metabolitos tóxicos. Una amplia discusión sobre medios de cultivo se encuentra en el
Capí tulo 3.
Preparación del medio de cultivo

Es necesario preparar el medio utilizando agua bidestilada o agua desmineralizada-destilada (H20, DD) (ver
Capítulo 1). Se debe evitar el almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de contaminantes;
todas las sustancias químicas usadas para su preparación deben ser de un alto grado de pureza. El procedimiento
para la preparación de los medios dependerá, en primera instancia, del tipo de medio, de su consistencia y de la
presencia de componentes termolábiles. En general, se pueden distinguir: a. Medios semisólidos sin sustancias
termolábiles; su preparación consta de los siguientes pasos: 1) Incorporación del medio basal (MB), de los
reguladores de creci miento o de otros compuestos. Ajuste del pH. 2) Adición y disolución del agar. Distribución
en los recipientes de cultivo (tubos de ensayo, cajas Petri, etc.). 3) Esterilización en el autoclave (ver Capítulo 1).
b. Medios líquidos con o sin sustancias termolábiles. Para su prepara ción se sigue el mismo procedimiento de a.,
pero sin adicionar agar, y haciendo la esterilización por filtración (ver Capítulo 1) en el caso de medios que
contengan sustancias termolábiles.
b. Medios semisólidos con una o más sustancias termolábiles; para su preparación se sugieren las siguientes
operaciones: 1) Incorporación de los compuestos que pueden ser esterilizados en el autoclave (tanto los del
MB como los reguladores de creci miento u otros compuestos). Ajuste del pH. 2) Adición y disolución del agar.
3) Esterilización en él autoclave. 4) Incorporación (operando en la cámara de trasferencia) de la(s) sustancia(s)
termolábil(es), previamente esterilizada(s) por filtra ción (ver Capítulo 1). Los componentes esterilizados (paso
3) se deben mantener a una temperatura entre 40 y 50 °C. 5) Distribución (operando en la cámara de
trasferencia) del medio en los recipientes de cultivo (tubos de ensayo, cajas Petri, etc.) pre viamente
esterilizados en el autoclave.
Preparación del medio basal (MB).

En esta sección, y a manera de ejemplo, se describirá el procedimiento de Murashige et al. (1962) para preparar el
medio basal (fuente de carbono + nutrimentos minerales + vitaminas); la composición de este medio se detalla en el
Cuadro 2.2, columna MS. Si bien la preparación "se puede llevar a cabo de diversas maneras, de acuerdo con el
consumo y las facilidades disponibles en cada laboratorio, generalmente es conveniente prepararlo 10 veces más
concen trado (MS x 10), procediendo de la siguiente manera: 1) Pesar, teniendo presente que se prepara MS x 10:
NH4N03 16,500 mg KN03 19,000 mg KH2P04 1,700 mg MgS04.7H20 3,700 mg Disolver en aproximadamente 300 mi
de H20, DD. 2) Adicionar 10 mi de una solución de CaCl2.2H20 (44 g/ 100 mi de H20, DD). 3) Adicionar 10 mi de una
solución que contenga 3.73 g de Na2EDJA y 2.78 g de FeS04.7H20, disueltos en 100 mide H20, DD. Esta polución se
debe guardar en el refrigerador.
4) Adicionar 10 mi de una solución de KI (83 mg/ 100 mi de H20, DD). Esta solución se debe conservar en el refrigerador,
en frascos a prueba de luz. 5) Adicionar 10 mi de una solución (conservada en refrigerador) que contenga: H3BO3 620
mg/ 100 mi H20, DD MnS04.4H2O 2,230 mg/100 mi H20, DD ZnS04.7H2G • 860 mg/ 100 mi H20, DD Na2Mo04.2H20
25 mg/ 100 mi H20, DD CuS04.5H20 2.5 mg/ 100 mi H20, DD CoCl2.6H20 2.5 mg/100 mi H20, DD 6) Adicionar 10 mi
de una solución (conservada en el refrigerador), que contenga: Glicina 200 mg/ 100 mi H20, DD Tiamina-HCl 10 mg/
100 mi H20, DD Piridoxina-HCl 50 mg/ 100 mi H20, DD Acido nicotínico 50 mg/ 100 mi H20, DD Mioinositol 10,000 mg/
100 mi H20, DD 7) Adicionar 300 g de sacarosa. 8) Completar hasta 1000 mi con H20, DD. 9) Repartir el medio así
preparado en recipientes de diferente capacidad (10, 50, 100 ce, de acuerdo con las necesidades del laboratorio).
Rotular "MS x 10" y almacenar en congelador (-5 a -20 °C) hasta cuando se utilice. Es aconsejable preparar el
MBnecesario teniendo en cuenta el consumo del laboratorio en un lapso determinado (un mes, por ejemplo).
Condiciones Ambientales para la Incubación

Es conveniente que los cultivos sean incubados en ambientes controlados (ver Capítulo 1), por lo menos en lo que se
refiere a la luz y a la tempera tura; estos dos factores están relativamente poco estudiados, y la informa ción existente
sobre ellos suele ser fragmentaria y a menudo contradictoria. Las respuestas morfogenéticas pueden ser alteradas por
la temperatura de incubación (Martin, 1980; Hughes, 1981), así como por la calidad, intensidad y duración de la luz
(Seibert et al., 1980; Hughes, 1981). El
Cuadro 2.3 ilustra los efectos de algunos factores sobre la regeneración de plantas a partir de diferentes explantes de
algunas leguminosas. Cuadro 2.3. Efecto de la intensidad de la luz y de la temperatura en la regeneración de plantas
por cultivo in vitro de meristemas y hojas.
Para propósitos generales se sugiere utilizar, en el establecimiento de los cultivos, una fuente luminosa compuesta de
lámparas fluorescentes (del tipo 'luz de áídT) y lámparas incandescentes que brinden entre 1000 y 4000 lux de
iluminación. Comúnmente se utiliza un ciclo de fotoperiodo/ escotoperíodo de 16/8 h. En general, temperaturas entre
25 y 28 °C son adecuadas para el establecimiento de los cultivos.
9 MEJORA GENETICA
Capítulo 34
Manipulaciones genéticas con protoplastos
Introducción
Los protoplastos ofrecen una excelente oportunidad para aplicar los con ceptos y técnicas de la genética microbiana
a las plantas superiores. Se pueden manipular grandes poblaciones de protoplastos como si fueran células individuales
y regenerar luego plantas de las células que se seleccio nen. Las manipulaciones genéticas in vitro de las plantas
superiores son importantes no sólo en los estudios de genética básica, sino también en programas aplicados de
fítomejoramiento. Las posibilidades que abre él uso de sistemas de protoplastos para el mejoramiento de las plantas
de especies cultivadas —y los problemas asociados con ellos— se han discu tido y revisado ampliamente (Chaleff,
1983; Negrutiu et al., 1084; Sybenga, 1983; Thomas et al., 1979; Evans et al., 1983). Los pasos que se siguen en un
programa de manipulación genética de plantas (Figura 34.1) son:
1) Aislamiento de los protoplastos partiendo de cultivos celulares o de cultivos de hoja (ver el Capítulo 10).
2) Modificación genética de los protoplastos aislados: mutagénesis, fusión, trasformación.
3) Selección del fenotipo deseado.
4) Regeneración de las plantas a partir de los clones seleccionados.
Protoplastos y Aislamiento de Mutantes

Las células mutantes se han utilizado extensivamente para estudios bio químicos y genéticos. Hay diversas razones
para aislar mutantes bioquími cos de los cultivos de protoplastos o de células:
- Para el estudio del metabolismo celular.
- Para programas genéticos que emplean células somáticas.
- Por su importancia agronómica.
El uso de protoplastos para el aislamiento y la selección de mutantes tiene varias ventajas: a) los protoplastos existen
como células individuales; b) es posible aislar poblaciones uniformes y numerosas de protoplastos haploides partiendo
de tejidos mesófilos de plantas androgénicas; c) los protoplastos recién aislados son generalmente poblaciones
homogéneas que no presentan la variabilidad genética observada en cultivos celulares prolongados; d) los sistemas
de protoplastos son adecuados para la inter pretación estadística (Negrutiu et al,, 1984; Maliga, 1984; Maliga et al.,
1982a). Para aislar mutantes, sin embargo, se requieren grandes cantidades de protoplastos que estén dividiéndose
activamente. El aislamiento de proto plastos y la técnica de su cultivo deberían mejorarse hasta un nivel tal que la
liberación de protoplastos, la viabilidad y la eficiencia de su cultivo sean reproducibles en grado sumo. En un sistema
de alta eficiencia, la progre sión del ciclo celular de la población de protoplastos presenta cierta sincronía durante las
primeras mitosis, fenómeno que permite aplicar el tratamiento mutagénico en varios puntos del ciclo celular.
Poblaciones de protoplastos haploides, aptas para experimentos de aislamiento de mutantes, se han aislado de
Nicotiana plumbaginifolia (Maliga, 1984; Negrutiu, 1981) y de Hyosciamus muticus (Strauss et al., 1981; Shimamoto
et al., 1983).
En esos sistemas de protoplastos se han aplicado diferentes tratamientos mutagénicos. La irradiación es un método
limpio y efectivo para inducir mutaciones. Negrutiu (198 1) utilizó luz ultravioleta para irradiar los pro toplastos
haploides de N. plumbaginifolia. Bourgin (1978) obtuvo muta ciones en protoplastos de mesófilo de tabaco haploide
empleando luz ultravioleta, tanto el día del aislamiento como uno, dos o tres días después de iniciado su cultivo. La
irradiación gamma ha sido utilizada por Maliga et al. (1982a) y por Marton et al. (198*2) para la mutagénesis de los
protoplastos haploides de N. plumbaginifolia. Varios mutágenps químicos se han utilizado para inducir mutagenésis
en protoplastos de plantas. Uno de ellos es N-etil-N-nitrosourea (Cséplo et al., 1982;Evola, 1983;Ohyama, 1982) cuyo
resultado ha sido exitoso; este mutágeno pierde su actividad aproximadamente 48 horas después de aplicado y puede
usarse en el medio de cultivo de los protoplastos sin que sea necesario lavarlo. N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG) o el sulfonato de etilmetano (EMS) también se han utilizado como mutágenos químicos para la obtención y
aislamiento de mutantes partiendo de proto plastos (Ohyama, 1 982; Strauss et al., 1 98 1 ). Gebhardt et al. ( 198 1)
encon traron que el tratamiento con MNNGes más efectivo en las poblaciones de protoplastos en división —dos días
después, por ejemplo, de la iniciación del cultivo— que en las de protoplastos recién aislados. Las condiciones de
cultivo, la programación del tratamiento mutagénico, el tipo de mutágeno y su dosis se deberían optimizar
experimentalmente para cada sistema de protoplastos. Frecuentemente, los protoplas tos se incuban en altas
densidades durante los primeros días de cultivo, en el momento de la mutagénesis. Una vez que han empezado a
dividirse, se cultivan en bajas densidades para permitir la separación de las colonias originadas de células individuales
y para hacer la selección. Los protoplastos de N. plumbaginifoliá se han utilizado para estos experimentos. Se han
aislado mutantes auxótrofos que requieren una base de ácido nucleico y aminoácidos. El procedimiento de aislamiento
consiste en cultivar los protoplastos que han experimentado mutaciones para producir colonias en un medio
completo; más tarde se realizan pruebas individuales para conocer sus requerimientos nutricionales en un medio
mínimo. Tres colonias auxótrofas seleccionadas se han identificado como líneas que requieren uracilo, ísoleucina y
leucina (Maliga et al., 1982a, Sidorov et al., 1981a). Mediante un procedimiento similar se han aislado mutantes que
requieren histidina, triptofano y nicotinamida de protoplas tos haploides de H. muticus (Gebhardt et al., 1981).
Shimamoto y King (1983) aislaron también de H. muticus mutantes auxótrofos que requieren histidina.
Líneas celulares deficientes en nitratoreductasa se aislaron de protoplas tos de mesófilo de N. plumbaginifolia haploide
sometidos a mutación (Maliga et al., 1982a; Marton et al., 1982a), de H. muticus haploide (Strauss et al., 1981), y de
N. tabacum dihaploide (Evola, 1983). En los tres casos, las líneas aisladas se seleccionaron por su resistencia al ion
clorato. La nitratoreductasa reduce el clorato a clorito, que es tóxico para las células de las plantas. Por otra parte, las
células deficientes en nitratore ductasa son resistentes al clorato y, por tanto, se puede utilizar este ion para una
selección indirecta de células deficientes en esa enzima. VaVios mutantes resistentes a los antibióticos, a algunas
drogas, y a los análogos de aminoácidos se han seleccionado a partir de protoplastos. Líneas resistentes a la
lincomiciria se seleccionaron en cultivos de proto plastos foliares del tabaco (N. plumbaginifolia) por su capacidad para
tomar un color verde en el medio de regeneración, en presencia del antibió tico (Cséplo y Maliga, 1982). Este tipo de
resistencia se trasmitió por vía materna a la población Las líneas resistentes a S-aminoetil-cisteína de N.
plumbaginifolia fue ron seleccionadas de clones de protoplastos de mesófilo foliar sometidos a mutación con luz
ultravioleta (Negrutiu, 1981). Colonias celulares resis tentes a concentraciones tóxicas de L-valina ó L-lisina más L-
treonina fueron seleccionadas a partir de cultivos de protoplastos de mesófilo de tabaco haploide (N. tabacum)i que
sufrieron mutación con luz ultravioleta (Bourgin, 1978; Bourgin et al., 1980). Ciertos resultados indican que las
variaciones provenientes de los culti vos de protoplastos, ya sea espontáneas o inducidas, tienen una importan cia no
sólo científica sino también práctica en el fitomejoramiento (Chaleff, 1983).
Fusión de Protoplastos e Hibridación Somática

La hibridación somática en las plantas superiores fué posible cuando los métodos enzimáticos permitieron el
aislamiento de grandes números de protoplastos viables de los cuales podían regenerarse las plantas, y cuando se
desarrollaron los métodos de fusión de los protoplastos. Schieder (1982) consideró cuatro aspectos importantes de la
fusión de protoplastos:
1 . La producción de híbridos somáticos anfidiploides y fértiles de espe cies sexualmente incompatibles.
2. La producción de líneas heterocigóticas dentro de una especie que normalmente sólo se propaga por vía vegetativa,
como la papa.
3. La trasferencia de sólo una parte de la información nuclear, de una especie a otra, mediante el fenómeno de la
eliminación cromosómica.
4. La trasferencia de información genética citoplásmica de una línea o especie a otra.
Fusión de protoplastos
En la Figura 34.2 se representan esquemáticamente los distintos pasos de la fusión de protoplastos. En los primeros
trabajos se utilizaron sales inorgánicas, especialmente el nitrato de sodio, como agentes inductores de la fusión (Power
et al., 1970). Posteriormente, Kelleretal. (1973) propusie ron la aplicación de un medio con alto contenido de Ca++ y
alto pH para inducir la fusión de los protoplastos. Kao et al. (1974) y casi al mismo tiempo Wallin et al. (1974) utilizaron
por primera vez polietilenglicol (PEG), como un potente agente de fusión. Desde entonces, el PEG se ha utilizado
exitosamente para fusionar diferentes protoplastos vegetales. Los protoplastos pueden fusionarse en un tubo de
centrífuga, mezclando la solución del PEG con la suspensión de protoplastos (Burgess et al., 1974b). Otro método
consiste en fusionar los protoplastos en cajas Petri como una monocapa celular (Kao y Michayluk, 1974; Kao et al.,
1974; Menczel et al., 1981; 1984; Ashmore y Gould, 1982). A causa de los fosfolípidos de la membrana, que tienen
carga negativa, los protoplastos tienden a repelerse mutuamente a pH fisiológico. Los iones calcio pueden compensar
las cargas negativas y así favorecer una leve agregación de protoplastos (etapa de adherencia en un punto). El PEG
puede propiciar una agregación adicional que sirva como un puente entre las membranas celulares de los protoplastos
adyacentes (etapa de adhesión superficial, Figura 34.3, A). Durante el proceso de elución, especialmente cuando se
añade una solución rica en calcio y con un pH alto, puede ocurrir una redistribución de las cargas y la formación de
puentes de Ca++ que conducirían a distorsiones de la membrana y, más adelante, a la fusión de las membranas
adyacentes (Keller et al., 1973; Koblizt, 1980). El proceso de fusión empieza con la formación de canales de fusión en
los puntos o áreas de agregación. Más adelante, estos canales se extienden a toda la superficie de las membranas que
se hallan en contacto (Burgess et al., 1974a). Ocurrida la fusión de la membrana, el citoplasma se mezcla en un período
de varias horas y se forman los heterocariontes (Figura 34.3, B y C).
En los últimos años, la investigación sobre la inducción de la fusión de protoplastos mediante un campo eléctrico ha
progresado hasta el punto de merecer una seria consideración como alternativa del PEG. La dielectroforesis se emplea
para obtener un estrecho contacto entre los protoplastos; luego se induce la fusión misma aplicando un impulso corto
de corriente directa (Zimmermann et al., 1981). La electrofusión evita la toxicidad que posiblemente causa el PEG y
permite fusionar un rango más amplio de protoplastos con mayor eficiencia (Zimmermann, 1982; Zachrisson y
Bornmann, 1984). Varjos factores pueden influir en la frecuencia de la fusión: a) sólo los protoplastos completamente
aislados tienen capacidad para fusionarse; b) los protoplastos que presentan residuos no digeridos de pared celular o
que ya han sintetizado la nueva pared celular, no se fusionan; c) la concentración y el tipo de enzimas tienen efectos;
profundos en la fusión de los protoplastos y en la viabilidad de los heterocariocitos; d) el tratamiento de las células
cultivadas en suspensión con soluciones enzimáticas que contengan driselasa da como resultado, en algunos casos,
una frecuencia de fusión más alta, aunque los protoplastos tratados con esta enzima son generalmente más débiles
(Kao et al., 1974). La fluidez de la membrana es importante en el proceso de fusión de los protoplastos. La temperatura
de cultivo y los fosfolípidos que componen la membrana tienen gran influencia en la fluidez de ésta (Keller et al., 1973);
por eso, el efecto benéfico de temperaturas relativamente altas en la fusión se debe a la mayor fluidez de la membrana
(Keller et al., 1973; Senda et al., 1980). Ashmore et al. (1982) encontraron que los protoplastos, en ciertas fases del
ciclo celular, participaban en las fusiones con mayor frecuencia de lo que se esperaba. Además, si los protoplastos se
hallaban en una misma fase del ciclo celular, se fusionaban con mayor frecuencia que si estaban en diferentes fases.
No obstante, con el ñnde estudiar los procesos de regula ción, es interesante fusionar los protoplastos en diferentes
etapas del ciclo celular. La interacción entre los protoplastos mitóticos y los de interfase dio como resultado la
inducción de la condensación cromosómica prema tura (CCP) en el núcleo interfásico (Szabados y Dudíts, 1980; Dudits
et al., 1982). Se ha informado también sobre la fusión de protoplastos de plantas con diferentes células animales, que
resulta en la formación de heterocariontes planta-animal. Dudits et al. (1976) fusionaron células de HeLa con proto
plastos de zanahoria y observaron laformación de una nueva pared celular a los 3 dias después de la fusión. Davey et
al. (1978) fusionaron células anfibias con protoplastos de plantas superiores y realizaron un estudio ultraestructural
sobre lafusión. Hadlaczky et al. (1980) fusionaron células de Drosophila sp. y protoplastos de soya; pudieron observar
en esa fusión la continuación de la síntesis del ADNy las divisiones de los heterocariontes. La fusión de las células
mitóticas de HeLa con protoplastos de zanaho ria o soya condujo a la inducción de la CCP en el núcleo de la planta en
interfase (Dudits et al., 1982). También se ha informado sobre la fusión de esferoplastos bacterianos con protoplastos
de plantas superiores (Hasezawa et al., 1983; Hain et al., 1984); este tipo de fusiones pueden ayudar a superar las
limitaciones del rango hospedante de los sistemas de trasformación. Los heterocariontes que resultan de la fusión de
protoplastos pueden experimentar divisiones celulares si se cultivan adecuadamente. Las inves tigaciones sobre el
comportamiento del núcleo en los heterocariontes revelaron que, en general, el núcleo se divide sincrónicamente.
Depen diendo de la orientación de los husos, la mitosis sincrónica puede resultar en la yuxtaposición de cromosomas
heteroespecíficos en una figura de la metafase y en una verdadera hibridación celular (Kao et al., 1974). Igual mente,
se ha observado la fusión nuclear en los heterocariontes (Constabel et al., 1977).
Selección de híbridos somáticos

El proceso de fusión resulta en una variedad de productos de fusión homocariontes y heterocariontes. Las verdaderas
colonias híbrido-somá ticas deberían seleccionarse, tan pronto como fuese posible, de las pobla ciones resultantes. Se
han establecido dos procedimientos principales de selección:
• Selección mecánica directa.
• Selección de comrjlementación.
Selección mecánica.
El aislamiento mecánico de los heterocariontes se ha utilizado en los experimentos de fusión cuando no se dispone de
mutantes adecuados para la selección de complementación. Kao (1977) fusionó los protoplastos incoloros (de cultivos
celulares) de la soya y los protoplastos verdes del mesófilo del tabaco. Los protoplastos fusionados se pueden
distinguir fácilmente puesto que presentan color y apariencia diferentes. La trasferencia, con micropipeta, de los
protoplastos fusiona dos a los pequeños alvéolos de las placas de +Cuprac ha permitido el cultivo y la observación de
las células híbridas individuales. Un sistema similar se utilizó para la selección y el cultivo individual de heterocariontes
de Arabidopsis thaliana y Brassicacampestris (Gleba y Hoffmann, 1978). Menczel et al. (1978) aislaron heterocariontes
de N. knightiana y N. silvestris usando micropipetas y los cultivaron separadamente. Las colo nias que se originaron de
los heterocariontes podían distinguirse por su color verde. Patnaik et al. (1982) utilizaron un marcador fluorescente
para la identificación de los heterocariontes de las plantas. Los productos de fusión se seleccionaron mediante un
patrón apropiado de coloración y se aislaron con un micromanipulador.
Selección de complementación.
Con este método, sólo las colonias híbridas pueden crecer en un medio que es selectivo para ellas o pueden
distinguirse fácilmente de las colonias progenitoras. Carlson et al. (1972) utilizaron por primera vez, y con éxito, la
complementación para aislar híbridos somáticos auxotrófícos a auxinas, después de la fusión de dos especies <le
Nicotiana que requieren auxinas.
Un procedimiento utilizado con frecuencia es la complementación de los mutantes albinos no alélicos: en ella se
seleccionan los híbridos, como colonias verdes, entre los albinos blancos (Douglaset al., 1981a; 1981b). A menudo se
combina el uso de un marcador albino con otra presión selectiva. Dudits y sus colaboradores utilizaron un mutante
albino de Daucus carota para realizar varios experimentos de hibridación; los pro toplastos derivados de suspensiones
celulares de este mutante se fusiona ron con protoplastos foliares que no se dividían de. Daucus capillifolius, de
Petroselinum hortense, o de Aegopodiumpodagraria. Las colonias verdes regeneradas se seleccionaron e identificaron
como híbridos (Dudits et al., 1979; Dudits et al., 1980a; 1980b). Un procedimiento de selección similar se utilizó en la
hibridación somática de N. glauca y N. tabacum (Evans et al., 1980). El empleo de mutantes auxotrófícos para la
selección de híbridos somá ticos es promisoria, porque sólo las líneas híbridas pueden sobrevivir en el medio selectivo,
y de esta manera la selección de híbridos puede efectuarse en un período temprano del cultivo. Según varios informes,
la hibridación somática se obtiene mediante el empleo de mutantes deficientes en nitratoreductasa, por una parte, y
la complementación de esta deficiencia enzimática, por la otra (Glimelius et al., 1978; Guptaet al., 1982; Marton et al.,
1982b). Los híbridos somáticos interespecíficos de Nicotiana + Hyosciamus se obtuvieron empleando auxotrofia
(nicotinamida) y deficiencia (nitratoreductasa) como marcado res selectivos complementarios (Potrykus et al., 1984).
los mutantes con resistencia estable contra los análogos de aminoáci dos, los inhibidores metabólicos o los antibióticos
suministran otros pro cedimientos de selección. Harms et al. ( 1 98 1 ) y Celia et al. ( 1 983) utilizaron diferentes
mutantes de zanahoria resistentes a los análogos de aminoáci dos. Evola et al. (1 983) emplearon para la hibridación
somática íntraespecífica líneas celulares de tabaco resistentes, por una parte, a la hidroxiurea y al picloram, y que
además utilizan glicerina. Horn et al. (1983) hibridaron protoplastos de N. tabacum resistentes a 5-metiltriptofano con
protoplastos de N. glutinosa y seleccionaron los híbridos por su resistencia a 5-metiltriptofano. Kameya et al. (1981)
utilizaron la resistencia a 5-metil triptofano y a acetidina-3-carboxilato para seleccionar híbridos somáticos de D. carota
y de D. capillifolius. Maliga y sus colaboradores emplearon mutaciones de marcadores de cloroplastos que poseían
resistencia codificada a los antibióticos, para la selección de híbridos somáticos de especies de Nicotiana. La resistencia
de N. silvestris a la kanamicina se utilizó para seleccionar los híbridos de esa especie con N. knightiána (Maliga et al.,
1977). La resistencia a la estrep tomicina sirvió también para la selección de híbridos de N. tabacum (SR 1) y N. silvestris
(Medgyesy et al., 1980). Los marcadores fenotípicos no selectivos se han Utilizado en la hibrida ción de D. innoxia y
Atropa belladonna; Los callos híbridos se reconocie ron poí la producción de vellosidades, típicas de D. innoxia, y por
el color verde derivado de A. belladonna (Krumbiegel y Schieder, 1979). Cuando los marcadores genéticos no están
disponibles, la complementación metabólica puede ayUdar en la recuperación de los productos de fusión (Nehls,
1978). Sidorov et al. (198 Ib) fusionaron protoplastos de N. plumbaginifolia tratados con yodoacetato, e irradiaron
protoplastos de N. tabacum. Los protoplastos progenitores tratados no pudieron dividirse, pero los heterocariontes
podían formar colonias híbridas debido a la complementación metabólica. En otros experimentos sólo un progenitor
fue inactivado por tratamientos con yodoacetato (Celia et al., 1983), con yodoacetamida (Lazar et al., 1981), o por
irradiación (Zelcer et al., 1978; Guptaet al., 1982).
Análisis de los híbridos somáticos

La naturaleza híbrida de las plantas seleccionadas puede verificarse con varios métodos.
Análisis morfológico.
Generalmente, las plantas híbrido-somáticas regeneradas difieren de las plantas progenitoras en el hábito de creci
miento y en el vigor. Frecuentemente, presentan un fenotipo intermedio (Douglas et al., 1981b; Dudits et al., 1977;
Gleba et al., 1979; Horn et al., 1983). Ejemplos conocidos son los híbridos somáticos entre la papa y el tomate. Las
flores, frutos, hojas y raíces tienen características morfológi cas que se asemejan tanto a un progenitor, el tomate,
como al otro, la papa (Melchers et al., 1978). Cuando se disponga de marcadores morfológicos, deberían compararse
con los de los híbridos sexuales, labor que sólo es posible en los híbridos de especies estrechamente relacionadas
(Evans et al., 1982).
Análisis isoenzimático.
El análisis isoenzimático ha sido utilizado extensivamente para verificar la naturaleza híbrida de los regenerantes
seleccionados. Se han hecho estudios con esterasa (Douglas et al., 1981b; Menczelet al., 1978), aspartato-
aminotransferasaysuperóxidodismutasa (Douglas et al. , 1 98 1 b), con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y
glutaminaoxaloacético transaminasa (Dudits et al., 1980a), con alcohol deshidroge nasa (Gleba et al., 1978; Menczel
et al., 1978), lactato deshidrogenasa y peroxidasa (Gleba et al., 1978), y con otras enzimas. La ribulosa-l,5-bifosfato
carboxilasa (Rubisco) es interesante porque su subunidad mayor es codificada por un gen localizado en el ADN del
cloroplasto, mientras que la subunidad menor lo es por genes nucleares. Por tanto, el análisis de las isoenzimas Rubisco
suministra información sobre la expresión de los genes, tanto del núcleo como del cloroplasto, y sobre la herencia
(Melchers et al., 1978; Glimelius et al., 1978; Hórn et al., 1983). Aunque las isoenzimas varían dentro de los tejidos de
las plantas —razón por la cual los zimogramas deberían interpretarse cautelosamente— éstos se consideran como
una prueba de la presencia, y de la expresión, de diferentes alelos de ciertos genes y, en consecuencia, como prueba
de la naturaleza híbrida de la planta. Frecuentemente, el patrón de las isoenzi mas no es sólo una suma de las bandas
progenitoras: se ha observado en los híbridos la desaparición de ciertas bandas progenitoras y la aparición de nuevas
bandas denominadas híbridas (Douglas et al., 1981b).
Análisis cromosómico.
En la mayoría de los híbridos somáticos selec cionados se encontró un alto número de cromosomas. En general, se
han utilizado protoplastos diploides para los experimentos de fusión y se esperaba, por tanto, obtener híbridos
somáticos predominantes tetraploides o anfidiploides; esta condición cromosómica se ha encontrado, en efecto, en
varios híbridos somáticos intraespecíficos e interespecíficos (Douglas et al., 1981b; Evans et al., 1980; Lazar et al.,
1981). En las combinaciones intergenéricas, la naturaleza del híbrido somático de las colonias seleccionadas podría
confirmarse por medio del tamaño diferente de los cromosomas de ambos progenitores (Gleba y Hoffmann, 1978;
Krumbiegel y Schieder, 1979).
Análisis del ADN nuclear.

Se han desarrollado métodos bioquímicos para comprobar la presencia de un tipo particular de ADN en los híbridos
somáticos. Estos métodos tienen la ventaja de que poseen una alta resolu ción y de que no dependen de la expresión
de genes particulares. Saúl et al. (1984) utilizaron sondas de hibridación no cruzada de H. muticus y N. tabacum en
una prueba sencilla de hibridación de ADN para caracterizar los híbridos somáticos posibles.
Variabilidad genética y eliminación de cromosomas

La variabilidad se ha observado como un fenómeno común en los híbridos somáticos. Kao (1977) describió la
eliminación aleatoria de cro mosomas de N. glauca en híbridos de soya x N. glauca. Las primeras divisiones fueron
asincrónicas y condujeron a pérdidas cromosómicas. En las líneas híbridas estabilizadas, los cromosomas de N. glauca
estaban en sincronía con los cromosomas de soya. Los datos citológicos y bioquímicos, han confirmado la inestabilidad
genética y la segregación cromosómica no específica de los cromosomas progenitores en las líneas híbrido-somáticas
(Douglas et al., 198 1 b; Dudits et al., 1980a; Gleba et al., 1978; Evans et al., 1983). El patrón y la tasa de segregación
cromosómicos y el grado de estabilidad genética son diferen tes en diversas líneas híbridas. Mayor estabilidad
cromosómica se ha encontrado en N. tabacum x soya (Chien, 1982) que en los híbridos de N. glauca x soya (Kao, 1977).
Diferentes líneas de células híbridas podrían seleccionarse dentro de un experimento, cada una con diferente tasa de
segregación. En los híbridos celulares de N. chinensis x A. belladonna, las células de la mayoría de los líneas
conservaron los cromosomas de ambos progenitores, mientras que en tres líneas fueron eliminados casi todos los
cromosomas de A. bella donna (Gleba et al., 1983). La inestabilidad genética observada general mente en las células
de plantas cultivadas puede conducir a la variabilidad cromosómica y a la segregación de características de los
progenitores en los híbridos somáticos intraespecíficos (Bayliss, 1980).
Se ha observado recombinación cromosómica en varios híbridos somá ticos. Además de la segregación cromosómica,
el reordenamiento cromosómico puede ser responsable de la variabilidad observada (Evans et al., 1981; Evans et al.,
1983; Hoffmann et al., 1981). Las fusiones entre los protoplastos en división, los mitóticamente inactivos o los
irradiados con rayos X, conduce a la rápida y extensiva eliminación de los cromosomas de los progenitores de división
inactiva. En los híbridos somáticos de Aegopodium x Daucus, los marcadores bioquímicos y morfológicos indicaron la
presencia de genes de Aegopo dium; en cambio, sólo se encontraron cromosomas de Daucus en las plantas
regeneradas. Se ha sugerido que una condensación cromosómica prematura podría ser la causa de la pérdida
repentina de los cromosomas de un progenitor (Dudits et al., 1979; Dudits et al., 1980b; Dudits et al., 1982). En los
híbridos de Petroselinum x Daucus, la mayor parte de los cromosomas de Petroselinum fueron eliminados mediante
la irradiación de sus protoplastos antes de la fusión. Sin embargo, las características morfológicas y las isoenzimas
confirmaron la presencia de genes de Petro selinum en dichos híbridos (Dudits et al., 1980b). En un experimento
similar, Gupta et al. (1982) describieron la trasferencia de fragmentos del genoma de los protoplastos irradiados de
Physalis mínima y Datura innoxia a la línea cnx-68 de N. tabacum. La fusión de protoplastos, seguida por la eliminación
y la recombinación cromosómicas, puede llevar a la trasferencia de unidades de material genético, más pequeñas que
los cromosomas completos. El análisis de la endonucleasa de restricción del genoma nuclear sirve también como un
método sensitivo para caracterizar los híbridos somáti cos. Uchimiya et al. (1983) utilizaron los genes ribosomo-
nucleares del ARN para identificar las líneas celulares híbrido-somáticas de N. glauca y N-. langsdorfii.
Regeneración de plantas y problemas de incompatibilidad

Generalmente, la regeneración de plantas es fácil cuando se producen híbridos somáticos intraespecíficos o
interespecíficos. La regeneración de las plantas híbrido-somáticas es difícil cuando la distancia filogenética entre los
progenitores de fusión es grande. Parece que se presenta una interacción entre la diferenciación celular y las
reacciones incompatibles; la fusión de protoplastos puede producir líneas celulares híbridas, pero no se observa una
respuesta morfogenética en las combinaciones interfamilia res (Kao, 1977; Chien et al., 1982). Las plantas híbrido-
somáticas de diferentes géneros podrían regene rarse si se obtiene una reducción significativa en el tamaño de uno
de los genomas parentales, introducido en los híbridos (Krumbiegel et al., 1979; Gleba et al., 1978; Dudits et al., 1980a).
La regeneración de plantas híbrido-somáticas interespecíficas (Cuadro 34.1, Figura 34.3, D) e inter genéricas ha sido
posible en varios casos (Cuadros 34.2 y 34.3).
19/4/2021 García-Águila
Biotecnología Vegetal, Vol. 7, Núm. 2
Artículo Científico Biotecnologí
ISSN 1609-1841 (Versión impresa)

ISSN 2074-8647 (Versión electrónica)
Aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma

vegetal
Leyanis García-Águila¹*, Manuel de Feria, Karen Acosta². *Autor para la correspondencia.
¹ Instituto de Biotecnología de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas, Carretera a
Camajuaní km. 5.5. Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: leyanis@ibp.co.cu
² Facultad de Ciencias Agropecuarias. Centro Universitario Vladimir I. Lenin. Las Tunas, Cuba.
RESUMEN
La conservación in vitro constituye parte esencial de la estrategia general de conservación y el

intercambio de recursos genéticos en todo el mundo. Entre otras ventajas, ofrece la posibilidad de
almacenar un gran número y variedad de muestras en un área reducida, además de garantizar la sanidad
de las muestras e incrementa la posibilidad del intercambio de materiales vegetales. Existen dos métodos
de conservación in vitro, cuya utilización varía en dependencia de la duración que requiera el
almacenamiento. El método de crecimiento mínimo se emplea con más frecuencia para conservar
durante un período de tiempo corto, mientras que la crioconservación garantiza la conservación in vitro
por largos períodos de tiempo. En particular, la crioconservación ha sido aplicada en muchas especies
para la conservación de polen, meristemos, ápices, embriones cigóticos, embriones somáticos y
suspensiones celulares. Se reconocen dos grupos de técnicas en la crioconservación: las técnicas
clásicas basadas en la deshidratación química parcial con el congelamiento programado y las técnicas
basadas en la vitrificación con congelamiento rápido. Esta última técnica evita la formación de cristales de
hielo en el interior de los tejidos, los cuales son los responsables del daño mecánico que se produce a las
membranas celulares durante la congelación. Es por ello, que el éxito de la conservación in vitro se
encuentra estrechamente relacionado con el período de tiempo requerido para el almacenamiento y con
la adecuada selección del método de conservación. Este trabajo resume algunos aspectos básicos de la
conservación in vitro de germoplasma vegetal, así como los principales resultados descritos por la
comunidad científica nacional e internacional en la conservación in vitro de diferentes especies vegetales.
Palabras clave: crecimiento mínimo, crioconservación, deshidratación, vitrificación
ABSTRACT
The in vitro conservation constitutes essential part of the general strategy for the conservation and the
exchange of genetics resources in the entire world. It offers the possibility to store a great number and
variety of samples in a reduced area. It guarantees the sanity of the samples and it increases the
exchange of plant materials. Two conservation methods in vitro exist, whose use varies in dependence of
the duration that requires the storage; the method of minimum growth is used with more frequency to
conserve a little time, while, the cryopreservation guarantees the in vitro conservation for long periods of
time. In particular, the cryopreservation has been applied in many species for the conservation of pollen,
meristems, apexes, zygotic embryos, somatic embryos and cellular suspensions. Two groups of
techniques in the cryopreservation are recognized: the classic techniques based on the partial chemical
dehydration and the programmed freezing and the new techniques based on the vitrification that consist
on the change from the liquid state to a vitreous denominated intermediate state and that it avoids the
formation of glasses of ice responsible for the mechanical damage to the cellular membranes during the
freezing. It is known that the membranes of the vegetable cells can be damaged by the action of different
biophysical and biochemical factors and they need a special chemical protection during the cycle of
freezing-unfreezing with treatments cryoprotectors with substances of a heterogeneous group of
compounds that have great affinity for the water and that to certain concentrations they are not toxic.
Some basic aspects of plant germplasm in vitro conservation and the main results decribed by the national
and international scientific community about in vitro conservation of different plant species are sumarized
in this research.
Key words: cryopreservation, dehydration, minimum growth, vitrification
INTRODUCCIÓN
La conservación de germoplasma vegetal como actividad científica fue propuesta en los años 70 del siglo
XX con el objetivo de prevenir la erosión genética y mejorar la productividad agrícola de muchas especies
a partir de la conservación de diferentes especies y genes de interés. Existen dos estrategias básicas
para la conservación de germoplasma vegetal, la conservación in situ y la conservación ex situ (Nodarse
et al., 1998).
En la conservación in situ las especies se mantienen en su hábitat natural, generalmente en parques
nacionales, reservas biológicas y reservas ecológicas. Mientras que, en la conservación ex situ las
https://revista.ibp.co.cu/index.php/BV/rt/printerFriendly/359/727 1/12
especies se preservan fuera de su hábitat natural, en bancos de semillas botánicas, bancos de plantas en
campo o en bancos de plantas in vitro.
Los bancos de semillas botánicas resultan de gran utilidad en especies que se propagan sexualmente y
cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento, pero no deben
aplicarse para conservar especies de plantas con semillas botánicas de corta supervivencia, ni pueden
emplearse en caso de trabajar con plantas autoincompatibles, o plantas de propagación vegetativa
obligada. En estos casos, la diversidad genética de estas especies se puede conservar mediante bancos
de plantas en campo o mediante técnicas de conservación in vitro (Graudal et al., 1997).
Los bancos en condiciones de campo tienen como limitante que se necesitan grandes extensiones de
tierra, los costos por mantenimientos asociados a las labores agrotécnicas son altos, se hace necesario
controlar plagas y enfermedades y además son vulnerables a los desastres climáticos. Es por ello, que el
desarrollo de nuevas técnicas de conservación, han permitido preservar mejor los recursos genéticos
importantes para muchos países (Ortiz, 2000).
En particular, los avances alcanzados en el cultivo in vitro en diferentes especies vegetales dieron la
posibilidad de desarrollar nuevas alternativa para la conservación ex situ, al permitir disponer de
suficientes individuos en períodos de tiempo relativamente cortos y facilitar la manipulación del material
vegetal al ser plantas con un desarrollo fisiológico homogéneo. Desde entonces, la conservación in vitro
de germoplasma vegetal constituyó una herramienta de trabajo que apoyó la conservación de semillas
botánicas y la conservación en campo, ya que permitió tener duplicados seguros de aquellos genotipos
de particular interés (Engelmann y Takagi, 2000).
Esta vía de conservación puede efectuarse a través de dos métodos: el crecimiento mínimo y la
crioconservación.
El método basado en el crecimiento mínimo es el más generalizado, se basa en modificar las condiciones
óptimas de cultivo, para disminuir la velocidad de crecimiento normal de la especie objeto de estudio, con
lo cual se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco.
A mediados de los años 90 del siglo XX, la conservación de germoplasma vegetal implicó además, la
inmersión directa de los explantes en nitrógeno líquido (crioconservación) y dentro de este método de
conservación, el procedimiento de vitrificación demostró ser el más efectivo y empleado por muchos
autores (Lambardi et al., 2000; Tsukazaki et al., 2000; Hirai y Sakai, 2003; Wang et al., 2004; Caccavale et
al., 2005).
Teniendo en cuenta los aspectos anteriormente descritos este trabajo tuvo como objetivo mostrar a través
de una descripción bibliográfica aspectos básicos de la conservación in vitro de germoplasma vegetal, así
como los principales resultados descritos por la comunidad científica nacional e internacional en la
conservación in vitro de diferentes especies vegetales.
IMPORTANCIA DE LA CONSERVACIÓN IN VITRO DE GERMOPLASMA VEGETAL
La conservación in vitro constituye parte esencial de la estrategia general para la conservación y el
intercambio de recursos fitogenéticos a nivel mundial. La misma ofrece la posibilidad de almacenar un
elevado número y variedad de muestras en un área reducida y facilita el acceso a ellas para su
evaluación. Sus condiciones asépticas garantizan mayor sanidad de las muestras y en consecuencia
permiten incrementar el intercambio de materiales vegetales sanos. Sin embargo, para establecer
cualquier estrategia de conservación in vitro, se hace indispensable el dominio de una metodología de
propagación que garantice altos porcentajes de supervivencia.
El principal objetivo de los bancos de germoplasma in vitro es conservar las especies que presentan
semillas botánicas de corta y poca viabilidad, cultivos de propagación vegetativa o clonal, o que son
altamente heterocigóticos y requieren ser propagados vegetativamente para conservar su integridad
genética. También se han incluido raíces y tubérculos de corta vida en el proceso de almacenamiento,
como Solanum tuberosum L. (papa), Ipomoea batata L. (boniato) y Manihot esculenta Crantz (yuca)
(Frankel, 1995).
Características fisiológicas de los tejidos vegetales para la conservación in vitro
El origen del material vegetal a conservar puede ser in vivo o in vitro, especialmente este último ofrece la
ventaja de estar en condiciones asépticas, libres de microorganismos contaminantes (Dereuddre y
Engelmann, 1987). Como regla general, debe ser escogido en estado juvenil. Las células meristemáticas
en activa división son más resistentes a las bajas temperaturas por tener un tamaño pequeño, citoplasma
denso y pocas vacuolas, razones por las cuales el contenido de agua intracelular es bajo, aspecto
importante a tener en cuenta para evitar daños durante el proceso de congelación (Engelmann, 2000).
Las plantas cultivadas in vitro para ser conservadas deben haber sido objeto de un subcultivo reciente a
medio de cultivo fresco. En este sentido, Harding y Staines (2001) expresaron que la susceptibilidad de
los ápices de papa a la congelación aumentó a medida que las plantas in vitro tenían un mayor número
de días de subcultivadas a medio de cultivo fresco.
MÉTODOS DE CONSERVACIÓN IN VITRO
Existen dos métodos de conservación in vitro cuya utilización varían en dependencia de la duración que
requiera el almacenamiento.Para corto o mediano plazo el objetivo es reducir la velocidad de crecimiento
del material vegetal, en este caso, puede ser empleado el método de crecimiento mínimo, por su parte la
crioconservación garantiza la conservación in vitro por períodos prolongados de tiempo.
Método de crecimiento mínimo
El método de crecimiento mínimo ha sido ampliamente utilizado en la práctica para la conservación de
germoplasma, existen varios ejemplos de su aplicación en la creación de bancos in vitro. Entre otros, se
pueden mencionar los casos de Saccharum sp. (caña de azúcar) (Taylor y Dukin, 1993), yuca (Roca et
al., 1994) y papa (Toledo y Golmirzaie, 1998).
Este método constituye una de las principales variantes que puede garantizar el éxito de un programa de
conservación, debido a que es relativamente sencillo y puede ser establecido con facilidad con el
equipamiento que normalmente existe en un laboratorio de cultivo de tejidos.
Para reducir la velocidad de crecimiento de las plantas in vitro es necesario alterar las condiciones
óptimas de cultivo. Para ello se realizan modificaciones en la composición del medio de cultivo, como
pueden ser la disminución del contenido mineral (Rayas et al., 2002), la adición de agentes osmóticos
activos y/o la incorporación de retardadores de crecimiento (Espinosa et al., 2002).
Este método es conocido también como crecimiento reducido pues como se ha explicado se basa en la
disminución de la división celular y el metabolismo de la planta. Tiene como objetivos incrementar la
longevidad in vitro de los cultivos sin que se produzcan cambios genéticos, por tanto, no hay una
detención total de los procesos celulares sino una disminución en la velocidad conque ocurren los
mismos y así se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco (Roca et
al., 1994).
La modificación en la composición de los medios de cultivo es una forma de limitar el crecimiento, por
ejemplo, el crecimiento in vitro de plantas de yuca disminuyó proporcionalmente con el contenido de
nitrógeno total del medio de cultivo; concentraciones por debajo de 10mM, en término de número de tallos
y nudos por tallos resultaron perjudiciales (Roca et al., 1994).
Autores como García et al. (2004) conservaron, con calidad y durante seis meses sin realizar subcultivos,
plantas in vitro de caña de azúcar, con la reducción de las sales propuestas por Murashige y Skoog
(1962) entre 25 y 50% de su concentración normal.
La limitación del crecimiento por efecto de la concentración osmótica se debe a la reducción de la
adsorción de agua y nutrientes del medio de cultivo. La sacarosa como es altamente metabolizable,
puede actuar como agente osmótico en concentraciones elevadas. Otros agentes osmóticos no
metabolizables, como el manitol y el sorbitol, son más efectivos en la limitación del crecimiento, porque
interactúan con el contenido de sacarosa y la temperatura de conservación (Bhat y Chandel, 1993).
Autores como Bertrand et al. (1992), estudiaron la respuesta de microesquejes de cafeto en presencia de
diferentes concentraciones de sacarosa y su interacción con la temperatura, ellos observaron que las
bajas concentraciones redujeron el crecimiento, enraizamiento y porcentaje de supervivencia, después de
siete meses de conservados a 20 oC. Los mejores resultados los obtuvieron en un medio de cultivo que
contenía como mínimo 20 g.l-1 de sacarosa y una temperatura para el crecimiento de 20 oC.
Por su parte, Panis et al. (1996) trabajando con Musa sp. indujeron la formación de brotes meristemáticos
en presencia de altas concentraciones de 6-bencilaminopurina (6-BAP) y estas estructuras fueron más
resistentes a las bajas temperaturas que los propios meristemos.
Suksa et al. (1997), lograron altos porcentajes de supervivencia en ápices in vitro de Carica papaya L.
(papaya), después de 12 meses de conservación a 16 ºC y comprobaron que la adición 5.0 μM de ácido
absícico al medio de cultivo influyó satisfactoriamente en la disminución del crecimiento de los ápices.
Estos autores observaron además, una severa suculencia de los ápices de papaya conservados en
medio de cultivo que contenía manitol y comprobaron que la adición de altas concentraciones de
sacarosa al medio de cultivo no mejoró la resistencia de los ápices al frío.
De igual forma, García et al. (2004) redujeron el crecimiento en longitud de plantas in vitro de caña de
azúcar con el incremento de la concentración de manitol en el medio de cultivo, de esta forma las plantas
se pudieron conservar durante 12 meses consecutivos a una temperatura de 15 ºC.
Eventualmente en los cultivos conservados in vitro, debido a las bajas temperaturas, la alta concentración
osmótica, la reducción de la concentración de sales inorgánicas y la presencia de inhibidores del
crecimiento, se puede producir un oscurecimiento de los tejidos, seguido por desfoliación. Esto se
atribuye a la oxidación fenólica y a la inducción de senescencia por la presencia de determinadas
concentraciones de gases como el etileno, especialmente cuando se utilizan frascos pequeños o han sido
sellados herméticamente. Roca et al. (1994), observaron una disminución de la desfoliación y una
reducción de la tasa de crecimiento a la mitad, en dos variedades de yuca, al adicionar al medio de cultivo
un 0.25% de carbón activado.
La intensidad y calidad de la luz, son otros factores importantes en el control de la velocidad de
crecimiento, especialmente en su interacción con la temperatura, que como ya se ha expresado, es otro
de los factores más utilizados en la conservación mediante el método de crecimiento mínimo.
Método de crioconservación
Para conservar a largo plazo se emplea la crioconservación (almacenamiento en nitrógeno líquido a -196
ºC), ya que se detienen todos los procesos metabólicos y la división celular, además, el material vegetal
crioconservado se puede preserva en espacios reducidos, en condiciones seguras, sin variabilidad
genética y sin grandes costos de mantenimiento (Hirai y Sakai, 2000).
Según Engelmann y Takagi (2000), se reconocen dos grupos de técnicas en la crioconservación: las
técnicas clásicas basadas en la deshidratación química parcial con osmoprotectantes y congelamiento
programado y las nuevas técnicas basadas en la vitrificación, que consisten en el cambio del estado
líquido a un estado intermedio llamado vítreo que evita la formación de cristales de hielo, los cuales son la
principal causa del daño mecánico a las membranas durante la congelación (Towill, 1996).
Dentro de estas nuevas técnicas se reconocen siete procedimientos que incluyen: encapsulación-
deshidratación, vitrificación per se, encapsulación-vitrificación, desecación, precrecimiento,
precrecimiento-desecación y técnica de la microgota (Engelmann, 2000).
La crioconservación en nitrógeno líquido, ha sido aplicada en muchas especies para la conservación de
polen, meristemos, ápices, embriones cigóticos y somáticos, suspensiones celulares (Huarte y Rigato,
2001; Baek et al., 2003; Martínez et al., 2004; Keller et al., 2005; Ochatt, 2005).
Existen mecanismos que determinan cómo los sistemas biológicos responden ante la disminución de las
temperaturas y la solidificación del agua líquida, por ello, es necesario conocer los aspectos básicos que
tienen lugar durante la congelación del agua como evento decisivo para desarrollar una metodología de
crioconservación. En este sentido, se destacan los procesos de nucleación y vitrificación.
Nucleación
Diferentes autores han realizado definiciones aclaratorias sobre los fenómenos que ocurren durante la
formación de los cristales de hielo a bajas temperaturas. Por ejemplo, Zachariassen y Kristiansen (2000)
explicaron que para ellos la definición de punto de congelación de una solución, es la temperatura donde
el último y más pequeño cristal de hielo se derrite cuando una solución congelada se calienta lentamente,
a este momento también se le denomina temperatura de congelación en equilibrio o punto de fusión.
Estos autores plantearon que el fenómeno por el cual las soluciones se encuentran aún en estado líquido
a la temperatura de congelación en equilibrio se le conoce como subenfriamiento y la temperatura es
denominada como punto de subenfriamiento de la solución. Además, diferencian que de manera no
generalizada pueden aparecer cristales de hielo a determinada temperatura sin afectar el punto de fusión
de la solución y denominan a este fenómeno como histéresis térmica y la temperatura a la que ocurre
como punto de congelación de histéresis.
Otros autores como Belous et al. (1987) plantearon que existen diferencias entre los procesos de
nucleación homogénea (formación espontánea de núcleos de cristales de hielo) y heterogénea (adición
de algún catalizador para inducirlos). Zachariassen y Kristiansen (2000) apoyan estas diferencias y
definen que la nucleación homogénea es causada por las propiedades de atracción electrostática entre
las partes polares de las moléculas de agua para formar agregados en forma de cristales de hielo a
medida que disminuye la temperatura y que la nucleación heterogénea es cuando la agregación de las
moléculas de agua se cataliza por sustancias diferentes a estás moléculas.
Posteriormente, Wilson et al. (2003) se oponen a esta diferenciación y demostraron que la nucleación en
las soluciones biológicas son todas heterogéneas y el término de nucleación homogénea debe ser
evitado. Estos autores plantean que en la práctica la nucleación homogénea es poco probable de lograr
en condiciones de laboratorio y solamente el término debe utilizarse en situaciones muy precisas como en
el caso de pequeñas muestras de agua ultra-pura emulsionadas en aceite que tiene una temperatura
alrededor de los -40 ºC.
Vitrificación
Cuando una solución está altamente concentrada y por ende viscosa, ésta no permitirá la iniciación de
cristales de hielo ni su crecimiento. Si se disminuye rápidamente la temperatura a valores muy bajos, la
solución puede llegar a convertirse en un sólido amorfo (vítreo) sin la formación de cristales de hielo
(Franks, 2003). Este proceso se denomina vitrificación y tiene lugar a la temperatura de transición vítrea
(Tg).
Para realizar la crioconservación mediante la vitrificación, Fahy et al. (2000) propusieron que se requiere
de una congelación por debajo de la temperatura de transición vítrea de la mezcla crioprotectora y un
recalentamiento sin la formación de hielo. Ellos plantean además, que el problema de la toxicidad del
crioprotector se minimiza cuando se utiliza la menor concentración posible de la mezcla crioprotectora y
que esta concentración mínima se determina por la concentración donde la temperatura de nucleación
homogénea (Th) se intercepta con la temperatura de transición vítrea.
A concentraciones más bajas, la muestra debe atravesar la zona entre Th y Tg donde la nucleación
homogénea del hielo es inevitable. A concentraciones altas, la vitrificación es teóricamente posible a
cualquier velocidad de congelación o recalentamiento si la nucleación heterogénea no está presente.
Sin embargo, según Franks (2003), en la práctica la nucleación heterogénea siempre está presente como
obstáculo a la vitrificación. Este autor explica, además, que después de la vitrificación se necesita una
velocidad de calentamiento rápida para evitar el crecimiento de los cristales de hielo (desvitrificación) que
comienza a temperaturas cercanas a la terminación de la congelación e inicio del recalentamiento.
El proceso de vitrificación es de gran importancia para la supervivencia de las células vegetales
congeladas hasta -196 oC, ya que previene la formación intracelular de cristales de hielo. El sólido amorfo
(vítreo) presenta una menor presión de vapor de agua que el correspondiente sólido cristalino, y no
permite la sobre-deshidratación causada por la congelación extracelular. Como consecuencia, el sólido
amorfo además disminuye la contracción celular, el aumento de la concentración de solutos internos y las
alteraciones en el pH de la célula. Además, como la formación vítrea es muy viscosa, ésta puede detener
todas las reacciones químicas que requiere una difusión molecular, de esta forma, la vitrificación de las
células vegetales garantiza la dormancia y estabilidad durante el tiempo de almacenamiento en nitrógeno
líquido (Franks, 2003).
Estrategia de deshidratación del material vegetal
Una metodología única de crioconservación que sea aplicable de manera exitosa para los diferentes tipos
de tejidos vegetales aún no se ha desarrollado. Sakai (2000) distinguió cuatro estrategias posibles: I)
deshidratación osmótica del material vegetal previa a la congelación; II) deshidratación del material
vegetal por congelación lenta; III) deshidratación del material vegetal por vitrificación completa; IV)
deshidratación del material vegetal por secado al aire. De las cuales, las más utilizadas se describen a
continuación:
Estrategia de deshidratación del material vegetal por vitrificación completa
Se refiere a la formación tanto intracelular como extracelular de una estructura sólida amorfa estable
(vítrea) cuando se someten las células a la temperatura del nitrógeno líquido (Sakai, 2000).
Ello se logra al deshidratar el material vegetal y de forma rápida por la acción de una solución vitrificadora
altamente concentrada la temperatura del mismo se hace variar de 25 a 0 oC antes de colocar las
muestras directamente en nitrógeno líquido. Las soluciones vitrificadoras no sólo reducen el contenido de
agua en la célula sino que también penetran en los espacios intersticiales y contribuyen a inhibir la
formación de los cristales de hielo en el medio intra y extra-celular durante el enfriamiento rápido (Panis,
1995). Sin embargo, el problema fundamental de la vitrificación completa radica en la necesidad de
controlar la duración del tiempo de exposición a las soluciones vitrificadoras ya que pueden causar daños
por una deshidratación excesiva o por toxicidad debido a una alta concentración de la misma (Reed,
2001).
Los primeros estudios sobre la crioconservación de plantas basada en la vitrificación completa fueron
realizados por Uragami et al. (1989) con embriones somáticos de Asparagus officinalis L. y Langis et al.
(1989) con suspensiones celulares de Brassica campestris. Desde entonces, la aplicación de esta
estrategia ha permitido que hayan sido almacenados un elevado número de materiales vegetales como
células nucleares de Citrus sinensis (Sakai et al., 1990) y protoplastos de Secale sereale (Langis y
Steponkus, 1991), ápices vegetativos de Ananas comosus (piña) (González et al., 1998), yuca
(Charoensub et al., 1999), boniato (Pennycooke y Towill, 2000) y Anigozanthos humilis (Turner et al.,
2001), entre otros.
Diferentes soluciones vitrificadoras se han utilizado, pero la reconocida como Plant Vitrification Solution #
2 que contiene 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de dimetilsulfóxido y 0.4 mol.l-1 de sacarosa ha
sido la más empleada (Sakai, 2000).
Estrategia de deshidratación del material vegetal por congelación lenta
Se basa en la disminución de la temperatura mediante un enfriamiento lento hasta una temperatura de
precongelación (-40 ºC), seguido de la inmersión rápida de las muestras en nitrógeno líquido (Sakai,
2000).
La reducción lenta de la temperatura durante el enfriamiento conduce a la deshidratación de las células
por la aparición de cristales de hielo extracelulares, que causan la disminución del volumen celular
isotónico y producen el incremento de la concentración de solutos.
Generalmente una velocidad entre 0.5-2.0 oC.min-1 se considera como lenta aunque en ocasiones
velocidades tan bajas como 0.1oC.min-1 o tan rápidas como 10oC.min-1 también se aplican (Withers,
1980). Cuando se obtienen temperaturas entre -35 ó -40oC, el material vegetal se transfiere al nitrógeno
líquido y se asume que en estas condiciones toda el agua congelable abandonó la célula y el medio
intracelular está altamente concentrado (Sakai, 2000).
La principal limitante para aplicar la estrategia de deshidratación por congelación lenta en un gran número
de laboratorios a nivel internacional radica en que se necesita un equipamiento programable de la
velocidad de enfriamiento con un alto costo, por lo que los centros de investigación-desarrollo con
escasos recursos no pueden utilizar esta modalidad criogénica (Reed et al., 2001).
Tratamientos crioprotectores
La mayoría de los tejidos vegetales hidratados necesitan una protección química especial durante el ciclo
de congelación-descongelación, para ello se emplean tratamientos crioprotectores con sustancias de un
grupo heterogéneo de compuestos que tienen gran afinidad por el agua y que a determinadas
concentraciones no resultan tóxicos al sistema (Chen y Kartha, 1986). Estos tratamientos pueden
aplicarse mediante pre-cultivos en base semisólida o líquida que sirven de medio de suspensión para las
células y los tejidos durante la congelación.
Han sido descritas dos categorías de sustancias crioprotectoras: penetrantes y no penetrantes (Panis,
1995). En el primer grupo se encuentran el dimetilsulfóxido, metanol y el glicerol y en el segundo están
presentes los azúcares, alcoholes azucarados y aditivos de alta masa molecular.
La aplicación de los crioprotectores penetrantes incrementa el volumen de la solución intracelular, evitan

una excesiva concentración de electrólitos tóxicos en la fase no congelable o aumentan la permeabilidad
de la membrana citoplasmática contribuyendo a la deshidratación. Adicionalmente, a los crioprotectores
penetrantes se les atribuye la acción de disminuir el punto de fusión de la solución intracelular, factor
decisivo para evitar la formación de cristales de hielo en el medio intracelular (Mazur, 1984).
Los compuestos no penetrantes actúan fundamentalmente como agentes osmóticos desde el medio
externo y contribuyen a reducir la cantidad de agua intracelular que puede congelarse. Sin embargo,
según Panis (1995), no existía una explicación convincente de cómo funcionaban las sustancias
crioprotectoras o dónde se encontraban los sitios críticos de protección. Estas interrogantes aún no
cuentan con respuestas comprobadas.
Generalmente, se han empleado con buenos resultados las mezclas de sustancias crioprotectoras. Esto
se debe a las ventajas que ofrece la combinación de las sustancias clasificadas como penetrantes y las
no penetrantes, como por ejemplo, la mayor estabilidad física de las mezclas a las bajas temperaturas en
relación con la de un componente simple y la acción protectora ante la toxicidad de unos compuestos con
respecto a otros (Kartha et al., 1988). Sin embargo, según Reed et al. (2001) hasta entonces, la selección
del tipo y concentración de los agentes crioprotectores aún se realizaba de manera empírica en
dependencia de la tolerancia de las células a crioconservar.
Descongelación
La descongelación es un proceso sencillo, pero está considerado como el paso más crítico durante la
crioconservación. Mazur (1984) explicó que el objetivo fundamental es evitar la fusión de los
microcristales de hielo formados durante la congelación, fenómeno conocido como re-cristalización. Si tal
fusión llegara a ocurrir, entonces se podrían formar grandes cristales de hielo que dañarían la integridad
celular.
Tratamientos de post-congelación
Se basan en cultivar el material vegetal descongelado en condiciones que permitan una correcta
recuperación. En general, es importante tomar todas las medidas para recuperar la especie vegetal en
cuestión en esta etapa del proceso, por ejemplo, incubar a niveles bajos de luz o en algunos casos en la
completa oscuridad (Benson, 2000); atenuar el choque osmótico causado por una inmediata transferencia
a un medio de cultivo con bajo potencial osmótico mediante la sucesiva transferencia a medios de cultivo
con menos concentración de sacarosa (Schrijmakers y Van Iren, 1995); utilizar cambios de medio de
cultivo semisólido a líquidos para mejorar el recrecimiento (Dussert et al., 1992) y eliminar
progresivamente las sustancias crioprotectoras mediante lavados (Gnanapragasam y Vasil, 1992).
Se recomienda que posterior a la descongelación los explantes se cultiven sobre papel de filtro colocado
en un medio de cultivo semisólido. Esto posibilita la transferencia simple del material vegetal hacia un
medio de cultivo fresco y la lenta difusión de los crioprotectores, lo cual es beneficioso para la
recuperación celular ya que evita un estrés osmótico (Withers, 1987).
Efecto del genotipo
Autores como Reed et al. (2001) plantearon que se necesita siempre tener en cuenta el factor genotipo
para validar cualquier protocolo de crioconservación. Turner et al. (2001) demostraron que resultó
eficiente utilizar primero una especie indicadora (en su caso Anigozanthos viridis que tenía un alto
coeficiente de multiplicación in vitro) para mejorar un protocolo de crioconservación y después aplicarlo a
otras especies relacionadas, pero clasificadas como material vegetal de gran valor. Engelmann (2000)
explicó que en una metodología de crioconservación se debe tener en cuenta el genotipo y que existe un
rango de temperatura en que la especie vegetal se puede conservar mejor y que sobre esa base podría
ser conveniente mejorar la eficiencia del procedimiento para un genotipo élite, lo cual justificaría la
realización de ajustes al protocolo de crioconservación.
CRIOCONSERVACIÓN DE ÁPICES
Método de vitrificación
El principio del método por vitrificación es deshidratar un ápice por la exposición de este a una solución
de vitrificación con alto potencial osmótico (Wang y Deng, 2004). El método incluye básicamente los
siguientes pasos: 1) Preparar y seleccionar los ápices; 2) precultivar los ápices para el desecado con
agentes osmóticos; 3) tratamientos con soluciones con crioprotectores; 4) deshidratar por exposición a
una solución de vitrificación con una disminución de la temperatura desde 25 hasta 0.0oC; 5) inmersión
directamente en nitrógeno líquido y almacenaje; 6) descongelación rápida; 7) remover la solución de
vitrificación y finalmente poner los ápices en condiciones apropiadas para su recuperación.
Este método ha sido descrito para la crioconservación de cultivos embriogénicos de especies de
coníferas (Cyr, 2000; Häggman et al., 2000; Touchell et al., 2002).
Método de encapsulación-deshidratación
Este método se basa en la encapsulación del ápice para protegerlo y precultivarlo en un medio de cultivo
enriquecido con agentes osmóticos lo cual lo hace más tolerante al desecado con aire (Wang et al.,
2005).
El método consiste básicamente en: 1) preparar y seleccionar los ápices; 2) encapsular los ápices de
brotes desecados en gotas de alginato; 3) precultivar en presencia de agentes osmóticos (sacarosa,
sorbitol, glicerol, entre otros); 4) desecar en una cabina de flujo laminar o con sílica gel; 5) inmersión
rápida en nitrógeno líquido y almacenar; 6) descongelación rápida y 7) colocar los ápices en condiciones
apropiadas para su recuperación.
Este método ha sido aplicado para suspensiones celulares, embriones somáticos y ápices de numerosas
especies vegetales de orígenes templado y tropical (Shibli et al., 2001).
Otros métodos desarrollados y aplicados con éxito
Existen otros métodos que a pesar de ser operacionalmente simples, han sido aplicados a un limitado
número de casos para ápices de brotes. Ejemplo de ello es el método de precrecimiento-desecación
descrito en Asparagus officinalis L. por Uragami et al. (1990) que consistió en: 1) Precultivo con agentes
osmóticos, 2) deshidratado en cabina de flujo laminar, (3) inmersión directa en nitrógeno líquido, (4)
descongelación rápida y 5) cultivo en condiciones apropiadas de recuperación, o el método mejorado por
Escobar et al. (1997) para ápices de brotes de yuca que combinó además de los pasos anteriores, una
lenta congelación en sustitución del tercer paso anteriormente descrito.
Con la aplicación de otros métodos como la encapsulación-vitrificación se han podido crioconservar
brotes apicales de plantas in vitro de boniato (Pennycooke y Towill, 2001) y yuca (Danso y Ford, 2003;
Charoensub et al., 2004). Otros autores como Wang et al. (2005) se han referido a este método de
encapsulación-vitrificación como el procedimiento de mayores resultados en la crioconservación de brotes
apicales in vitro para la especie Rubus idaeus L. (frambuesa) donde obtuvieron una alta supervivencia
(85%) y regeneración (75%) de los brotes apicales crioconservados.
La papaya (Carica papaya L.)es uno de los cultivos en los que se han experimentado notables avances.
Autores como Ashmore et al. (2000) desarrollaron técnicas y procedimientos para la conservación in vitro
y crioconservación de brotes axilares y yemas apicales de plantas in vitro través de un simple protocolo
de vitrificación. Igualmente, Buerhing (2003) desarrolló un protocolo de crioconservación para el
suministro continuo de cultivos embriogénicos para realizar transformación genética y Wang et al. (2004)
emplearon ápices de cuatro a seis semanas de cultivo de plantas in vitro de seis cultivares que fueron
crioconservados con éxito también por vitrificación.
DETERMINACIONES ANALÍTICAS COMO INDICADORES DE LOS DAÑOS INDUCIDOS POR LA
CRIOCONSERVACIÓN EN LAS MEMBRANAS CELULARES
Durante la crioconservación, las membranas celulares de las células vegetales pueden dañarse por la
acción de diferentes factores (Leunufna y Keller, 2005) entre los que se encuentran la exposición de las
células a las bajas temperaturas, la formación de cristales de hielo y una severa deshidratación durante la
congelación. Además, puede ocurrir la formación de radicales libres, desacoplamiento metabólico y
peroxidación lipídica.
Para todas las células, Mazur (1970) propuso la hipótesis de dos factores de daño por congelación
basado en los efectos biofísicos de la formación de los cristales de hielo y en los efectos dinámicos de la
velocidad de enfriamiento. Al utilizar una velocidad de enfriamiento rápida aparecen cristales de hielo
intracelulares de un tamaño considerable que causan daños irreversibles y por lo tanto, constituyen el
primer factor de esta hipótesis.
El segundo factor se atribuye a la deshidratación causada por la formación de los cristales de hielo. Si se
emplea una velocidad lenta de enfriamiento, la formación de los cristales de hielo se induce primero en el
compartimiento extracelular, el daño se atribuye entonces a una extrema deshidratación osmótica
(también denominada efecto de solución), provocada por la salida del agua hacia el exterior de la célula
para compensar el déficit de vapor que produce el evento de congelación (Steponkus y Webb, 1992).
La respuesta de las células a la congelación, depende de las propiedades de las membranas celulares.
Los lípidos de las membranas sufren una transición de fase desde líquida-cristalina hasta gel. La
coexistencia de ambas fases, en la estructura de las membranas, causa la pérdida de electrolitos y por lo
tanto, las células mueren (Steponkus y Webb, 1992). Debido a que no todos los lípidos tienen la misma
temperatura de transición de fase, la separación de las fases puede tener lugar, formando dominios ricos
en fases en estado de gel.
Durante el calentamiento, estos dominios pasarán a formar estructuras no-lamelares, lo cual causa
también la pérdida de electrolitos y la muerte celular (Quinn, 1985). Según Usami et al. (1995) durante la
exposición a las bajas temperaturas, las proteínas de las membranas se pueden inactivar.
Una crioconservación exitosa durante una congelación lenta de las células vegetales con sustancias
crioprotectoras puede ser posible, si se evita la formación del hielo en las células con la nucleación en el
medio extra-celular. Sin embargo, las membranas pueden sufrir daños por las fuerzas mecánicas de los
cristales de hielo en crecimiento y su adhesión a la superficie de las membranas (Grout, 1995).
La etapa de deshidratación es necesaria para evitar la formación de hielo intracelular, que provoca el
aumento de la concentración de solutos en las células y una fuerte plasmólisis de éstas (Towill, 1990).
Los problemas asociados a las plasmólisis aumentan durante la congelación, cuando las células se
desplasmolizan. Por ejemplo, la contracción osmótica conlleva a la formación de vesículas endocitóticas,
lo cual provoca la lisis celular durante la expansión osmótica debido a que el material membranoso no
está disponible rápidamente para facilitar la desplasmólisis. También, las membranas pueden sufrir
fusiones cuando están en contacto cercano durante la plasmólisis (Steponkus y Webb, 1992).
Eventos bioquímicos tales como la formación de radicales libres, desacoplamiento metabólico y
peroxidación lipídica promueven varios cambios sub-letales como el desacoplamiento metabólico que
conlleva a la producción de radicales libres tóxicos. Estas moléculas tienen electrones impares que
causan daño por la extracción de electrones en macromoléculas esenciales como lípidos, proteínas y
ácido desoxirribonucleico. El acoplamiento metabólico estable y una protección antioxidante eficiente,
bajo condiciones fisiológicas normales para las células, aseguran que los daños por los radicales libres no
ocurran (Dumet y Benson, 2000).
El estrés a que está sujeto el material vegetal durante la crioconservación puede promover la producción
de radicales libres (Benson, 2000). Los más importantes son el radical hidroxilo, el radical superóxido y el
peróxido de hidrógeno. Estos radicales libres atacan la fracción lipídica de las membranas, lo que trae
como resultado la formación de los peróxidos de lípidos y éstos a su vez son inestables y forman
productos tóxicos de la oxidación secundaria (Esterbauer et al., 1988). Los productos de la peroxidación
lipídica son aldehídos muy citotóxicos, entre los más dañinos se encuentran el malondialdehido y el
hidroxi-2-nonenal (Adams et al., 1999).
Existen evidencias que sugieren la presencia de los radicales libres mediados por el estrés oxidativo
durante la aplicación de protocolos de crioconservación, desecación y manipulación en el cultivo de
tejidos (Benson, 2000). Esto se ejemplifica por la detección indirecta (Benson y Dutra, 1988) y directa
(Magill et al., 1994) de los radicales libres en células vegetales que han sufrido tratamientos de
congelación, crioconservación y desecación. También, se han detectado productos de peroxidación
lipídica secundaria en suspensiones celulares (Benson et al., 1995) y en tejidos estresados por el cultivo
in vitro (Robertson et al., 1995).
Debido a la pérdida de agua, los componentes celulares se concentran y se convierten en agentes
tóxicos, que coagulan o se precipitan. Varios trabajos sobre el estudio del comportamiento de las
proteínas durante la deshidratación por la congelación convergen en que las enzimas solubles, las
proteínas asociadas a la membrana y al citoesqueleto y las subunidades ribosomales se encuentran
sujetas a cambios con el incremento de los solutos celulares (Guy, 1999).
Importancia de las técnicas analíticas para elucidar las bases biofísicas y bioquímicas de los
daños inducidos por la crioconservación
Como se ha mencionado, los daños a la membrana durante la congelación-descongelación son
numerosas; por lo tanto, un estudio mediante técnicas analíticas ayudaría a comprender y elucidar las
bases biofísicas y bioquímicas de los daños inducidos por la crioconservación. Sin embargo, hasta la
fecha las investigaciones realizadas no son numerosas y algunas que se ejecutaron son caras y
complejas (Dumet y Benson, 2000) y tuvieron como objetivo detectar y visualizar en tiempo real los daños
celulares, razón por la cual, la mayoría de las investigaciones solo hacen uso de técnicas analíticas
indirectas.
Entre estas técnicas utilizadas para evaluar el efecto del estrés de la deshidratación y las bajas
temperaturas, se encuentran la determinación de la pérdida de electrolitos (Sun, 1999), de la peroxidación
lipídica (Ait Barka et al., 2000) y la de cambios en el metabolismo de las proteínas (Sun et al., 2002;
Svensson et al., 2002).
La pérdida de electrolitos, se ha utilizado para estudiar la sensibilidad a la desecación y al frío en semillas
botánicas poco viables de Quercus rubra (Sun, 1999). Además, se han usado para evaluar los daños en
las membranas por las bajas temperaturas a diferentes genotipos de Coffea sp. (Scotti et al., 2003).
Los cambios de peroxidación lipídica por su parte, traen asociado la formación de aldehídos tóxicos
durante una oxidación secundaria (Cassells y Curry, 2001; Gaspar et al., 2002). Entre los aldehídos más
citotóxicos se encuentra el malondialdehído (Adams et al., 1999).
Otras investigaciones han involucrado también los cambios en el metabolismo de las proteínas, los cuales
pueden resultar en la adquisición de tolerancia al proceso de crioconservación (Thierry et al., 1999;
Watanabe et al., 1999). Además, se ha informado que las plantas poseen proteínas anticongelantes que
son potentes inhibidores de los cristales de hielo (Clarke et al., 2002).
ESTABILIDAD GENÉTICA EN EL FENOTIPO DE MATERIALES VEGETALES CRIOCONSERVADOS
Harding (2004) manifestó que el concepto de estabilidad genética aún no tiene una correcta definición
científica cuando se refiere a juzgar la estabilidad de las plantas después de la crioconservación. Este
autor propone el término de Criobionómica a la ciencia biológica que estudia el comportamiento de los
organismos crioconservados y su hábitat después de su reintroducción a las condiciones naturales del
medio ambiente.
Esto se debe básicamente a que existe poca información sobre los efectos de la crioconservación en la
estabilidad genética del material vegetal y las diferentes técnicas utilizadas para medirla poseen algunas
limitaciones lo que hace muy difícil una evaluación acertada (Engelmann, 2000; Turner et al., 2001; Helliot
et al., 2002a; Harding, 2004).
Además, Harding (2004) plantea que son necesarias las investigaciones sobre la estabilidad genética de
las plantas regeneradas a partir del material vegetal crioconservado para que se inicien las bases
aceptables de un consenso internacional donde sea aprobada su liberación y reintroducción en el medio
ambiente y su uso en las diferentes aplicaciones tecnológicas.
Autores como Fukai et al. (1994) encontraron modificaciones fenotípicas que afectaron el color en las
flores del crisantemo después de la regeneración de ápices crioconservados. Sin embargo, la mayoría de
los estudios realizados indicaron que las plantas no presentaron cambios morfológicos después de la
crioconservación.
De igual forma, plantas regeneradas in vitro a partir de ápices de plantas del género Prunus mostraron un
desarrollo competente normal y crecieron iguales al progenitor (Helliot et al., 2002b).
En otras muchas especies como caña de azúcar (Paulet et al., 1993), cafeto (Dussert et al., 1998), papa
(Benson et al., 1998), arroz (Al-Forkan et al., 2001), kiwi (Wu et al., 2001), uva (Zhao et al., 2001) y
Eucalyptus (Blakesley y Kiernan, 2001), tampoco se han observado diferencias en el desarrollo de los
caracteres morfológicos y agronómicos entre las plantas derivadas de un control no crioconservado y las
obtenidas de ápices crioconservados.
Sin embargo, la mayoría de los estudios fenotípicos carecen de exámenes detallados cuando se
comparan las plantas controles y las obtenidas del material vegetal crioconservado y se caracterizan
como análisis cualitativos sin realizar análisis estadísticos de los aspectos morfológicos (Harding y
Staines, 2001). La aplicación de estudios biométricos de conjunto con los caracteres fenotípicos se ha
utilizado por pocos autores para evaluar las variaciones genéticas, aunque éstos son más indicadores de
los cambios fenotípicos como resultado de las interacciones totales del genotipo y de los cambios
temporales en la expresión génica (Harding, 2004).
CONCLUSIONES
La aplicación de diferentes métodos de conservación in vitro se ha convertido en una alternativa para la
preservación de material vegetal con fines investigativos, para la propagación masiva de plantas e
intercambio de germoplasma y han permitido el fomento y desarrollo de bancos de germoplasma in vitro
que han tributado a la comunidad científica y al mantenimiento de una importante biodiversidad.
REFERENCIAS
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Artículo Técnico Díaz Granados, C.; Chaparro-Giraldo, A.: Transformación genética de plantas
Métodos de transformación GENÉTICA

DE plantas
Plant GENETIC transformation Methods

Cristina Díaz Granados1, Alejandro Chaparro-Giraldo2
1 Microbióloga Industrial, M.Sc., cPh.D. Grupo de Ingeniería Genética de Plantas, Departamento de Biología & Instituto de
Genética, Universidad Nacional de Colombia. E-mail: ecdiazg@una.edu.co 2 Ingeniero Agrónomo, M.Sc., Ph.D. Grupo de
Ingeniería Genética de Plantas, Departamento de Biología & Instituto de Genética, Universidad Nacional de Colombia, sede
Bogotá. E–mail: achaparrog@bt.unal.edu.co
Rev. U.D.C.A Act. & Div. Cient. 15(1): 49 - 61, 2012
RESUMEN SUMMARY
Con el propósito de hacer más eficiente la transferencia In order to streamline the transfer of DNA into plant cells
de ADN hacia células vegetales, se han desarrollado have developed different methods for genetic transformation
diferentes métodos de transformación genética en plantas. in plants. These methods can be divided into two classes:
Los métodos indirectos son basados en la utilización de indirect methods based on biological vectors known as, and
vectores biológicos y los métodos indirectos son basados en direct methods based on physical and chemical elements.
elementos físicos y químicos. Esta es una revisión actualizada This work presents an updated review of the methods used
de los métodos de transformación genética de plantas, for genetic transformation of plants, aimed at those interested
dirigida a los interesados en el mejoramiento genético de in crops breeding. To do this we reviewed databases “Science
cultivos. Para ello, se revisaron las bases de datos “Science Direct”, “Hinari” and “Medline” available on the website of
Direct”, “Hinari” y “Medline”, disponibles en el portal del the national library system (SINAB) of the Universidad
sistema nacional de bibliotecas (SINAB), de la Universidad Nacional de Colombia. Keywords used in English were:
Nacional de Colombia. Se usaron las palabras claves “plant transformation”, “genetic engineering”, “transgenic
en inglés “plant transformation”, “genetic engineering”, plants”, “genetically modified crops”, to search for general
“transgenic plants”, “genetically modified crops”, para la documents. Search was further refined by using more
búsqueda de documentos generales. Posteriormente, se specific keywords, like “particle bombardment”, “biolistic”,
refinó la búsqueda con el uso de palabras claves específicas, “Agrobacterium”, “sonication”, etc. Also conducted some
como “particle bombardment”, “biolistic”, “Agrobacterium”, research complementation in Spanish, using the search
“sonication” y otras. También, se realizaron algunas “google” for the key words “cultivos genéticamente
pesquisas de complementación en idioma español, usando modificados” and “ cultivos transgénicos”. Were reviewed
el buscador “google”, para las palabras claves “cultivos scientific articles and reviews between 1997 and 2010. There
genéticamente modificados” y “cultivos transgénicos”. Se is a long list of processes used in the transfer of foreign genes
examinaron artículos científicos y revisiones publicadas, into the genomes of plant species, including: viral vectors,
entre 1997 y 2010. Existe una larga lista de procesos usados liposomes, electroporation, sonication, chemical-mediated
en la transferencia de genes foráneos a los genomas de transfer, silicon carbide fibers, microinjection and microlaser.
especies vegetales, que incluye: vectores virales, liposomas, However, GM crops are released commercially, have been
electroporación, sonicación, transferencia mediada por produced through the use of two technologies: biolistic and
compuestos químicos, fibras de carburo de silicona, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.
microinyección y microlaser; sin embargo, los cultivos
transgénicos que se han liberado comercialmente, se han Key words: Transgenic plants, GM crops, genetic transforma-
producido mediante el uso de dos tecnologías: biobalística tion.
y transformación, mediada por Agrobacterium tumefaciens.
INTRODUCCIÓN
Palabras clave: Plantas transgénicas, cultivos genéticamente
modificados, transformación genética. La ingeniería genética de plantas está dirigida a la produc-
49
Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica 15 (1): 49 - 61 2012
ción de genotipos que expresen características de interés, Según Díaz et al. (2004), para obtener una planta transgénica
mediante la integración en el genoma vegetal, de segmentos deben ocurrir tres procesos indispensables en la misma
de DNA foráneo, proveniente de cualquier origen. Este DNA célula: el casete de expresión debe ser transferido al interior
altera las características de la planta, mediante la modifica- de la célula; el casete de expresión se debe integrar al DNA
ción dirigida y controlada de su genoma, al añadir, al elimi- celular y se debe regenerar una planta, a partir de la célula en
nar o al modificar alguno o algunos de sus genes (Danilova, la que han ocurrido los dos procesos anteriores.
2007; Karimi et al. 2007). No hay limitación para la transfe-
rencia de genes entre plantas de la misma especie y especies Para todas las técnicas de transformación vegetal es necesario
cercanamente emparentadas, ya que genes de especies no disponer de un gen de interés, que puede ser endógeno
relacionadas evolutivamente, pueden ser introducidos. Ello modificado o un gen foráneo aislado de grupos filogenéticos
permite usar genes de diferentes especies, géneros y reinos, variados (Karimi et al. 2007). Este debe ir flanqueado por
eliminando las barreras de incompatibilidad sexual y fertili- los elementos reguladores necesarios para su expresión: una
dad (Vasil, 2007). región promotora, cuya función general es el reconocimiento
del sitio de unión de la DNA polimerasa con el consecuente
La principal ventaja de la ingeniería genética es que no implica inicio de la transcripción del gen en RNA mensajero y una
la transferencia de cientos de miles de genes, algunos con región terminadora que da la señal de finalización de la
características no deseadas, sino que involucra el traspaso transcripción, y es la encargada del mantenimiento de la
de uno o pocos genes que confieren la característica de estabilidad del mRNA y su transporte al citoplasma para
interés (Danilova, 2007). Es un instrumento valioso que su posterior traducción en una molécula proteica. Esta
permite acelerar procesos que, lentos y laboriosos, ofrece construcción Región promotora - Región codificante o gen
la posibilidad de introducir en una planta una característica de interés – Región terminadora, es conocida como casete
deseada, mediante transformación genética, en un solo de expresión (Sharma et al. 2002; Chaparro et al. 2005).
paso. La ingeniería genética de plantas comprende una
serie de técnicas complementarias con los procedimientos La fuente de los segmentos génicos que componen el casete
del mejoramiento genético convencional (Jauhar, 2006; de expresión puede corresponder a orígenes biológicos di-
Livermore, 2002). ferentes, caso en que se denomina construcción quimérica.
Este casete de expresión debe ir en un vector que permita su
La transformación de plantas usa una amplia gama de he- clonación o transferencia, mediante los métodos de transfor-
rramientas, mediante, las cuales, es posible la introducción mación. Los vectores más utilizados en la transformación de
de información genética foránea, sin afectar las cualidades plantas son plásmidos, donde fueron clonados los genes que
agronómicas y de mercadeo de los cultivos. La transforma- serán introducidos en el genoma vegetal (Larik et al. 2004;
ción de plantas se ha definido como la incorporación esta- Job, 2002; Karimi et al. 2007). La construcción quimérica,
ble de genes foráneos y la expresión de estos en las plantas usualmente, se encuentra acompañada con otra construcción
transformadas (Sharma et al. 2002; Rommens, 2004). funcional, que corresponde a un gen marcador de selección.
La introducción de este gen responde a la necesidad de iden-
Desde 1983, cuando se reportó por primera vez la producción tificar las plántulas que hayan sido regeneradas, a partir de
de una planta transgénica, se ha logrado la transformación células que insertaron el transgen dentro del conjunto del ma-
de más de 120 especies y 35 diferentes familias vegetales, terial vegetal sometido al proceso de transformación (Bhat &
tanto de dicotiledóneas como de monocotiledóneas (Bhat & Srinivasan, 2002; Martínez et al. 2004; Karimi et al. 2007).
Srinivasan, 2002; Jauhar, 2006). Esto no significa que sea un
proceso sencillo, por lo contrario, es un proceso complicado Los métodos de transformación utilizados, en la actualidad,
que involucra varias etapas: identificación y aislamiento se basan en la obtención de células transgénicas y posterior
del gen de interés, desarrollo del casete de expresión o recuperación de plantas completas y fértiles, a través del
construcción quimérica, vectores apropiados que permitan cultivo de tejidos y selección in vitro. En la mayoría de
el clonaje o transferencia de la construcción quimérica, especies, se observa una importante influencia del genotipo
método para la introducción del DNA de manera estable en en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa
el genoma de la célula vegetal (protocolo de transformación), esta tecnología, con fines de mejoramiento genético es
sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas muy importante conocer la respuesta morfogenética de
completas, procedimiento para la distinción de los individuos los distintos genotipos (Eapen, 2008; Gutiérrez et al. 2002;
transformados de aquellos no transgénicos (selección de Filipecki & Malepszy, 2006). Una vez se logra la regeneración
transformantes) y métodos analíticos para detectar el gene de las plantas transgénicas a partir de células transformadas,
foráneo y sus productos en la planta transformada (Díaz et se debe realizar la verificación del estatus transgénico de
al. 2004; Larik et al. 2004; Jauhar, 2006). estas plantas, mediante el uso de técnicas moleculares,
50
como PCR o “Southern blot”, para determinar la inserción usando las bases de datos “Science Direct”, “Hinari” y
del transgen, RT-PCR o “Northern blot”, para verificar su “Medline”, disponibles en el portal del sistema nacional de
transcripción y “Western Blot” o ELISA, para detectar la bibliotecas (SINAB), de la Universidad Nacional de Colombia.
producción de la proteína (Díaz et al. 2004; Danilova, 2007). Para esta primera fase, se emplearon las palabras claves en
idioma inglés “plant transformation”, “genetic engineering”,
Se denominan plantas transgénicas a aquellas plantas que “transgenic plants”, “genetically modified crops”. Con
fueron modificadas genéticamente por la introducción de base en los hallazgos de la primera fase, se organizó una
uno o varios genes (con sus respectivas secuencias regu- segunda fase, refinando la pesquisa, de acuerdo con
ladoras), por técnicas moleculares, que les confieren una(s) palabras clave relacionadas con los métodos específicos:
nueva(s) característica (Martínez et al. 2004; Vain, 2007). Las “particle bombardment”, “biolistic”, “Agrobacterium”,
plantas transgénicas fueron desarrolladas por primera vez a “sonication”, “viral vectors”, “electroporation”, “microlaser”,
comienzos de los 80, por cuatro grupos que trabajaban de “microinyection”, “chemical-mediated transfer”, “silicon
manera independiente. Se produjeron células de plantas de carbide fibers”, “liposomes”. Finalmente, se hicieron algunas
tabaco y plantas de petunia resistentes a kanamicina; tam- indagaciones complementarias en idioma español, usando
bién, por primera vez, se insertó un gen del fríjol en una plan- el buscador google, para las palabras claves “cultivos
ta de girasol (Birch, 1997; Nielsen et al. 2001; Vasil, 2007). genéticamente modificados” y “cultivos transgénicos”. Se
examinaron artículos científicos y revisiones entre 1997 y
La obtención de plantas transgénicas ha permitido desarrollar 2010, que cubrieron las publicaciones mundiales en revistas
nuevas variedades de plantas, cultivadas con características indexadas y páginas web de organizaciones reconocidas, por
de interés, como son resistencia a factores bióticos y abióticos, su dedicación al tema de los cultivos transgénicos, como
aumento en la calidad y rendimientos más altos. También, se Agrobio (Asociación de Biotecnología Vegetal Agrícola) e
ha demostrado la utilidad de las plantas transgénicas para ISAAA (International Service for the Acquisition of Agri-
producir vacunas u otras sustancias terapéuticas y para la biotech Applications).
producción de materias primas de interés industrial, como
plásticos biodegradables. De acuerdo a lo anterior es claro RESULTADOS Y DISCUSIÓN
el alto potencial y la amplia aplicabilidad de las plantas
transgénicas, no solo en la agricultura sino en la industria en Se han desarrollado diferentes métodos de transformación
general (Job, 2002; Sharma et al. 2002; Vain, 2007). genética, con el propósito de hacer más eficiente la
transferencia de ADN hacia células o tejidos vegetales. Se
La disponibilidad de esta tecnología permitió importantes busca transformar una variedad más amplia de plantas con
avances en el mejoramiento genético de plantas. El gran mejores resultados. Los sistemas de transformación con los
esfuerzo realizado, en este sentido, tuvo como consecuencia que se cuenta en la actualidad, se clasifican en métodos
la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros indirectos y métodos directos, de acuerdo con el mecanismo
cultivos transgénicos (James, 2005; 2008; Vain, 2007). En utilizado para la transferencia del material genético hacia la
el 2010, se sembraron 148 millones de hectáreas de cultivos célula vegetal (Mohan Babua et al. 2003; Rao et al. 2009).
GM, por 15,4 millones de agricultores, en 29 países (James, La cisgenesis que es la introducción de genes con sus
2010). Según Agrobio (2011), para el 2010, se sembraron en promotores nativos aislados desde la planta cultivada en sí
cultivos transgénicos en Colombia, 37.657ha del algodonero, misma o desde especies hibridar, con las cuales, la planta
38.896ha de maíz y 4ha de clavel y de rosas. cultivada se puede natural (Jacobsen & Schouten, 2007), no
es considerada un método de transformación genética en
El presente trabajo tiene como propósito ofrecer una esta revisión, sino una de los formas de ingeniería genética
visión actualizada de los diferentes métodos usados para de plantas. Ello, debido a que para desarrollar la cisgenesis
la transferencia de genes hacia los genomas de especies se puede utilizar cualquiera de los métodos descritos.
vegetales, para los especialistas y los interesados en el
mejoramiento genético de plantas. No existe este tipo de MÉTODOS INDIRECTOS
documentos en idioma español y esto dificulta la comprensión
de esta importante aplicación de la biotecnología vegetal, Son métodos basados en la utilización de vectores biológi-
asunto de interés para países megadiversos, como Colombia, cos, empleando sus característica naturales de patogenicidad
en el que se utilizan los cultivos transgénicos en la agricultura. en plantas, para la introducción de los genes de interés al ge-
noma vegetal (Veluthambi et al. 2003; Rao et al. 2009). Entre
MATERIALES Y MÉTODOS estos sistemas de transformación se han descrito el uso de la
bacteria Agrobacterium tumefaciens y el uso de virus.
Se hizo una búsqueda inicial, procurando revisiones generales,
51
Sistema Agrobacterium con las proteínas y sistemas propios de la célula vegetal a ser
Debido a la capacidad y a la eficiencia de este género en infectada (Gelvin, 2003b; Gelvin, 2010).
infectar diversos organismos vegetales surgió la idea de
utilizar Agrobacterium como mediador para la introducción Para utilizar el sistema de transformación mediado por
de genes de interés en plantas (Hellens & Mullineaux, Agrobacterium, se requiere de cepas desarmadas, que
2000; Tzfira et al. 2004). La transformación mediada por son aquellas, en las que el T-DNA ha sido eliminado. Para
Agrobacterium fue el primer sistema de transferencia de obtenerlas, el plásmido residente Ti debe ser modificado
genes en producir una planta modificada genéticamente mediante un proceso de recombinación, que permite eliminar
en 1983, cuando reportaron la transferencia de genes los genes responsables de la formación de tumores en la
bacterianos a plantas y de una especie vegetal a otra planta, denominados ONC (oncogenes) y los genes OPS
(Valentine, 2003; Vasil, 2007). para la síntesis de opinas, que se encuentran en la región del
T-DNA. Para esto es introducido a la cepa de Agrobacterium
La infección por Agrobacterium en una planta es el resultado a desarmar, un plásmido foráneo con regiones de homología
de un proceso de evolución altamente especializado: la con el T-DNA y un gen para resistencia a antibióticos. Dado el
transferencia horizontal de genes desde bacterias hacia proceso de recombinación entre el plásmido TI y el plásmido
plantas (Gelvin, 2000; Zupan et al. 2000; Gelvin, 2003a; foráneo, se elimina el T-DNA y se introduce en el plásmido
Tzfira & Citovsky, 2002). El segmento de DNA transferido TI el gen para resistencia a antibióticos que, posteriormente,
es conocido como la región T-DNA (DNA de transferencia) y va permitir identificar la bacteria desarmada, mientras que
se encuentra en el plásmido residente de la bacteria llamado plásmido foráneo con la región T-DNA es eliminado (Gelvin,
plásmido Ti (inductor de tumores). Esta región contiene 2003b; Jacobs, 2003; Gelvin, 2010; Pitzschke & Hirt, 2010).
genes que codifican para la biosíntesis de fitohormonas y
opinas (carbohidratos únicamente metabolizables por la En la transferencia de genes, a través del sistema A.
bacteria). Para que se dé una transferencia efectiva de esta tumefaciens, se emplean dos tipos de vectores: los de co-
región es necesaria la expresión de los “genes Vir” contenidos integración (sistemas en cis) y los binarios. Los vectores
en la región Vir (región de virulencia), la cual, se encuentra co-integrados resultan de la integración de un plásmido
en el plásmido TI (Gelvin, 2000; Hellens & Mullineaux, 2000; foráneo pequeño al plásmido TI de la cepa desarmada de
Gelvin, 2010). Agrobacterium, mediante un proceso de recombinación.
Estos vectores, se obtienen a partir de un plásmido Ti
Este proceso inicia cuando se producen heridas en las células desarmado, que contiene el borde izquierdo y el plásmido
de la planta, se liberan al medio compuestos fenólicos y foráneo, que contiene el gen de interés flanqueado
monosacáridos, que son reconocidos por Agrobacterium, por el borde derecho y una región homóloga al borde
induciendo una unión entre la bacteria y las células vegetales. izquierdo; la recombinación se lleva a cabo por un evento
Este proceso de anclaje no ha sido dilucidado claramente de entrecruzamiento de regiones homólogas de los dos
(Citovsky et al. 2007; Escobar & Dandekar, 2003; Karami plásmidos, dando como resultado un solo plásmido (Gelvin,
et al. 2009). Los compuestos fenólicos, monosacáridos y 2000; Gelvin, 2003a; Gelvin, 2010).
condiciones de pH que presenta el medio circundante son
importantes para la activación del sistema de regulación de Los vectores binarios (sistemas en trans) es la estrategia
dos componentes VirA/VirB, que activa la transcripción del más empleada. Estos vectores, se derivan de plásmidos
regulon Vir (Valentine, 2003; Tzfira et al. 2004; Pitzschke & que se replican en E. coli y en A. tumefaciens, no necesitan
Hirt, 2010). Posteriormente, por la acción cooperativa de integrarse al plásmido Ti y se mantienen como plásmidos
las proteínas VirD1 y VirD2 permite la síntesis del T-DNA; independientes, dentro de la célula bacteriana. Esta estrategia
la proteína VirD2 se une covalentemente al extremo 5’ del consiste en el uso de dos plásmidos en la bacteria, uno de
T-DNA, mientras que la proteína VirE2 cubre a toda la hebra ellos, el vector binario, contiene los bordes del T-DNA en el
de T-DNA. Finalmente, este complejo es translocado a las que se incluye el casete de expresión o genes de interés y, el
células vegetales, mediante un sistema de secreción tipo otro, el plásmido residente es el que contiene los genes “Vir”,
IV, que está constituido por un Pili y un canal de secreción, que son los encargados de mediar la transferencia efectiva
formados por las proteínas VirB y VirD4. Una vez el T-DNA del casette de expresión hacia las células vegetales (Hellens &
ha llegado a la célula vegetal, las proteínas VirE2 y VirD2 Mullineaux, 2000; Komori et al. 2007). Una versión mejorada
contribuyen al direccionamiento del T-DNA hacia el núcleo y de los vectores binarios son los vectores superbinarios, los
posterior integración en el genoma vegetal (Tzfira & Citosky, cuales, son los responsables de la supervirulencia de las
2002; Tzfira et al. 2004; Citovsky et al. 2007; Escobar & cepas de Agrobacterium, debido a que portan un segmento
Dandekar, 2003). Cabe anotar que durante todo el proceso de de DNA con los genes de virulencia VirB, VirC y VirG. Estos
infección de Agrobacterium, se da una continua interacción vectores, se obtienen a partir de la recombinación homóloga
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entre un plásmido pequeño que porta el T-DNA con los genes diferentes tipos de tejidos vegetales; la integración del T-DNA
de interés y un plásmido de mayor tamaño que posee la es un proceso relativamente preciso; la región de DNA a
región de supervirulencia, formando un vector co-integrado, ser transferido es definida; baja probabilidad de rearreglos;
que se introducirá a una cepa de Agrobacterium desarmada, permite la introducción de segmentos largos de DNA; bajo
como vector binario (Komori et al. 2007). número de copias del T-DNA transferido. La gran mayoría
de las ventajas que presenta este sistema, se explican por el
La transformación, mediada por Agrobacterium, requiere de proceso de infección de las células vegetales por la bacteria
un periodo de co-cultivo, en el cual, la cepa de Agrobacte- y la posterior integración del el T-DNA en el genoma vegetal
rium, que contiene el vector con los genes de interés, es pues- (Hansen & Wright, 1999; Veluthambi et al. 2003; Filipecki &
ta en contacto con el tejido vegetal a transformar, para que Malepszy, 2006).
se realice la transferencia de T-DNA a algunas de las células
vegetales expuestas a la infección. El uso de diferentes tipos Entre las desventajas del sistema de Agrobacterirum, se han
de tejido vegetal está dado por las características de éstos, en reportado: el tejido a infectar debe presentar daño físico;
cuanto a su capacidad de regeneración y fácil manipulación. los vectores están diseñado solo para infectar el núcleo; se
El co-cultivo, se debe dar en un medio apropiado que favorez- requiere la eliminación de la bacteria de los tejidos infectados
ca el proceso de transformación, como la presencia de mo- mediante el uso de antibiótico; el rango de hospederos está
léculas señal, como la acetosiringona y las heridas en el tejido limitado a que estos sean susceptibles a la infección; sin
vegetal que activa el sistema de virulencia de Agrobacterium embargo, muchas de estas deficiencias han sido superadas
(Vasil, 2007; Sharma et al. 2002; Hansen & Wright, 1999). con la implementación de nuevas técnicas y procedimientos
(Hansen & Wright, 1999; Pitzschke & Hirt, 2010).
Después del co-cultivo, el tejido vegetal es transferido
a un medio de cultivo de tejidos vegetales que propicie la Con el propósito de mejorar el sistema Agrobacterium,
regeneración, que consiste en la obtención de una planta algunos investigadores proponen combinarlo con
completa a partir de una célula vegetal. Para la regeneración otras técnicas de transformación. Es así como surge la
de plantas completas es necesaria la adición de hormonas Agroinfiltración, que combina el sistema Agrobacterium
vegetales o reguladores de crecimiento al medio de cultivo. con la aplicación de vacío. Se emplea tejido floral joven o
Estos reguladores son del tipo citoquininas, que promueven en desarrollo, sobre el cual, se aplica vacío, mientras se
la división celular en el cultivo de tejidos no meristemáticos encuentra sumergido en una solución concentrada de
e inducen la formación de órganos en una gran variedad Agrobacterium. Esto permite que se produzcan heridas en
de cultivo de tejidos o auxinas, que promueven la división el tejido, facilitando e incrementando la infección, además
y crecimiento celular, y las giberilinas involucradas en la como se realiza en plantas ya desarrolladas, no es necesaria
regulación de la elongación celular específicamente auxinas la utilización de cultivo de tejidos. Finalmente, lo que se logra
y citoquininas (Arias et al. 2006; Eapen, 2008; Pitzschke & es la infección del tejido floral femenino, partir del cual, se
Hirt, 2010). El factor más importante para la regeneración van a obtener semillas potencialmente transgénicas (Sharma
es el balance adecuado de los reguladores de crecimiento. et al. 2002; Grabowska & Filipecki, 2004; Rao et al. 2009).
Entre los factores que pueden afectar de manera
considerable la regeneración están la fuente del explante Otro método en el que se combina el sistema Agrobacterium
y su estado fisiológico, al igual que las condiciones de luz con ultra sonido es llamado “transformación mediada por
y de temperatura a que sean sometidos. Adicionalmente, Agrobacterium asistida con sonicación” o SAAT, por sus siglas
estos medios deben contener antibióticos, que permita la en idioma inglés. En este sistema, el tejido a transformar es
eliminación de Agrobacterium, debido a que no es requerido sometido a periodos cortos de ultrasonido, ocasionándole
más, puesto que el proceso de transformación se llevó a cabo pequeñas fisuras o heridas en el tejido vegetal, lo que facilita
en el periodo de co-cultivo y agentes selectivos, que permitan la infección por Agrobacterium (Beranova et al. 2008; Liu et
la selección de las posible plantas transgénicas, que debe al. 2006).
estar de acuerdo con los genes de selección presentes en
el casete de expresión empleado (Bhat & Srinivasan, 2002; Un sistema de transformación basado en las característica
Filipecki & Malepszy, 2006). propias del sistema Agrobacterium es el sistema
TransBacter™, que emplea otros géneros bacterianos, como
El sistema Agrobacterium es el más empleado en la Rhizobium sp., Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium
producción de plantas transgénicas, debido a que posee loti, para transferir material genético a células vegetales. Estas
varias ventajas frente a los otros sistemas de transformación. bacterias, se pueden volver competentes para integrar genes
Entre estas están: simplicidad técnica de los protocolos; no en las plantas si se les introduce un plásmido Ti desarmado
requiere de equipos sofisticados; pueden ser empleados y un vector binario. Este sistema de transformación se
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encuentra disponible para la comunidad internacional de y principal aplicación de este sistema está en la producción
investigación y desarrollo, como una “tecnología común de proteínas heterólogas, como biofármacos (Sattar et al.
protegida”, bajo una licencia BIOS, que es licencia para 2006).
innovaciones en biotecnología basada en el concepto de
código abierto (Broothaerts et al. 2005; BiOS, 2008). Otro sistema de transformación que ha surgido a partir de
la combinación de las características de los vectores víricos
Vectores virales y del sistema Agrobacterium es la Agroinfección. En esta
Algunos virus que afectan especies vegetales han sido metodología, se emplea el sistema de transferencia del
empleados como vectores para la transformación de DNA de Agrobacterium para infectar células vegetales con
plantas, con el objetivo de producir proteínas de interés, vectores virales. El vector viral es introducido en el T-DNA,
por la expresión transitoria de genes foráneos, mediante la el cual, es transferido a las células por el proceso normal
replicación de los virus en las plantas. Los virus deben ser de infección, mediada por Agrobacterium. Este sistema es
modificados para que sean capaces de transportar el gen empleado cuando los vectores virales provienen de virus que
de interés al interior de la célula vegetal. Se han desarrolla no son transmisibles mecánicamente (Larik et al. 2004; De
dos estrategias para la construcción de vectores virales. En Oliveira et al. 2008).
la más empleada, el gen foráneo, es introducido dentro del
virus completo, por lo general, precedido por el promotor MÉTODOS DIRECTOS
duplicado de la proteína de la capside del virus (promotor
fuerte) o fusionado a ésta, para que el gen de interés sea Debido a la dificultad de transformar monotiledóneas
expresado como un RNA subgenómico separado. La segunda por medio de Agrobacterium, se desarrollan sistemas de
estrategia y las más recientemente desarrollada, el virus es transferencia de genes, en los que se emplea procedimientos
completamente reconstruido eliminando o sustituyendo de naturaleza química, fisicoquímica y mecánica. El
regiones virales, además de la inserción del gen de interés. desarrollo de estos métodos, se basó en las técnicas físicas
Finalmente, estos vectores virales pueden ser empleados en usadas en la transformación de células animales en cultivo
la transfección de la planta, como una partícula viral madura (Díaz et al. 2004; Gutiérrez et al. 2002; Danilova, 2007; Rao
o como copias del vector viral (Gleba et al. 2004; Gleba et et al. 2009).
al. 2007).
Liposomas
Los mayores avances se han logrado con Geminivirus y Los liposomas o vesículas lipídicas están conformadas
Caulimovirus, debido a que estos son virus DNA y se pueden por varias bicapas de lípidos que encapsulan agua o gas,
clonar directamente; dentro de estos ha sido especialmente poseen diámetros del orden de nanómetros, con diferentes
utilizado el virus del mosaico de coliflor, con el cual, se ha formas y tamaños. Pueden estar formados por fosfolípidos,
logrado transferir genes con resistencia a antibióticos. fosfatidiletanolamina, ácidos grasos o cationes bivalentes.
También los virus RNA que son muy abundantes en el reino Los liposomas presentan característica muy similares a las
vegetal, se han empleado como vectores virales aunque membranas biológicas, con una tendencia natural a ligarse
estos debe ser clonados como cDNA, los más empleados a células y tejidos interactuando con estos por absorción,
son los del mosaico de la cebada y el virus del mosaico del fusión o intercambio lipídico. (Morigaki & Walde, 2007;
tabaco (Sattar et al. 2006). Hotani et al. 2003).
Entre las ventajas que presentan los vectores virales, se Entre los métodos para transformación vegetal, la transfe-
reportan: facilidad en la infección; rango de hospedadores rencia de genes, mediada por liposomas, es uno de los más
más amplio; producción de altos niveles de proteína; los difíciles y aunque en un principio éste mostró ser eficaz, su
genes transmitidos no se limitan a una célula se esparcen utilización ha sido muy limitada. En este método, el casete de
por toda la planta; mayor velocidad en la expresión; sin expresión es encapsulado en una esfera lipídica (liposoma),
embargo, existen varias limitaciones importantes: el tamaño que permite o facilita su paso, a través de la célula vegetal
del gen de interés debe ser limitado para que no afecte por endocitosis, ya sea por el plasmodesma o directamente
la infectividad; pueden provocar síntomas específicos por la pared celular, hasta el núcleo (Rao et al. 2009).
de enfermedad o ser letales para la planta huésped; alta
frecuencia de errores durante la síntesis del ARN vírica puede Los métodos de transferencia mediados por liposomas
dar lugar a la expresión incorrecta del gen introducido; el poseen algunas ventajas, como son: protección contra la
gen de interés no se integra en el genoma vegetal y no se degradación por nucleasas; capacidad de portar grandes
transfiere necesariamente a la descendencia (Sattar et al. fragmentos de DNA; biocompatibilidad con membranas; no
2006; Gleba et al. 2004). Es importante anotar que la mayor requiere de un portador para el DNA. Los problemas que
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se han reportado con este sistema de transformación, son: membrana celular. Todo el sistema funciona en un vacío
frecuencia de transformación muy baja; inserción del DNA moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones
en tandem; preparación de los liposomas; encapsulación que las células vegetales soportan durante uno o dos
del material genético a transferir. Estos problemas se han minutos. Tras el bombardeo, el DNA se desprende de los
solucionado parcialmente con la implementación de nuevas microproyectiles, debido a las modificaciones del entorno
técnicas y la utilización de nuevos compuestos, para la iónico. De acuerdo con la localización de los microproyectiles
preparación de liposomas (Vasil, 2007). en la célula, el DNA se puede integrar de forma estable en
núcleo, cloroplastos o mitocondrias de las células vegetales,
Pese a las dificultades que presenta este sistema, la fusión mediante recombinación al azar. Finalmente, los tejidos son
de liposomas que contienen ADN con protoplastos está colocados en condiciones adecuadas para la regeneración
bien establecida en la producción de plantas transgénicas. de plantas, mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales.
Menos exitosa ha sido la fusión de los liposomas con tejidos Cabe anotar que los tejidos vegetales empleados son
y células vegetales intactas. La eficacia del método aumenta sometidos a un tratamiento osmótico pre y pos bombardeo,
al combinarlo con otras técnicas, como el tratamiento con con el fin de evitar el daño de las células por el procedimiento
PEG (Polietilenglicol) o la electroporación (Mok & Park, 2008). (Taylor & Fauquet, 2002; Altpeter et al. 2005; Sanford, 2000;
Rao et al. 2009).
Biobalística
El término biobalística proviene de la unión de “biología y El bombardeo de micropartículas es considerado un
balística”. Este método fue ideado y refinado en la década mecanismo universal por su naturaleza física, que permite
de 1980, por un grupo de investigadores de la Universidad introducir DNA sin necesidad de vectores especializados, en
de Cornell (E.U.) e introducido por Sanford, en 1987, cualquier tipo de tejido o célula, alcanzando capas profundas.
por primera vez. Esta técnica, se basa en la utilización de Con un disparo, se pueden producir múltiples integraciones.
microproyectiles recubiertos del DNA que se desea transferir, En este método de transformación, las construcciones
que son disparados sobre los tejidos vegetales a altas genéticas son más simples, incluyen los genes de interés
velocidades, atraviesan la pared y la membrana celular y y de selección con sus secuencias reguladoras respectivas,
llevan al interior de la célula los genes de interés para su pueden ir incluidas en plásmidos o en forma de molécula
posterior integración en el genoma vegetal (Sanford, 2000; lineal (Altpeter et al. 2005; Sanford, 2000; Taylor & Fauquet,
Martínez et al. 2004; Vasil, 2007). 2002).
Este sistema de transformación requiere de un dispositivo Esta técnica fue propuesta, inicialmente, para introducir
mecánico que permita realizar el bombardeo de los tejidos material genético en el genoma nuclear de plantas
vegetales. Para que los microproyectiles puedan atravesar las superiores, pero en los últimos años se ha usado para
membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, transformar bacterias, protozoos, hongos, algas, insectos,
deben ser impulsados a velocidades supersónicas. Para ello, tejidos animales y plantas in vivo. Además, en la actualidad,
se desarrollaron tres sistemas: por explosión de pólvora seca, constituye el único método de transformación, que permite
por variación de fuerza de aceleración, a través de descarga transformar organelos celulares (Mohan Babua et al. 2003;
eléctrica o por liberación de gas comprimido a alta presión Larik et al. 2004).
(aire, helio, CO2 o N2). Los microproyectiles empleados
son partículas aproximadamente esféricas (microesferas), Entre las desventajas que presenta este sistema, se
elaboradas de materiales densos, como el oro o tungsteno, encuentran: porcentaje de éxito variable; es frecuente la
de diámetro variados, que pueden ir desde los 0,4 μm hasta inserción de varias copias del casete de expresión variando
4 μm. El casete de expresión con los genes de interés puede desde 1 hasta 20, que pueden ir en tandem, causando
ir o no en un vector, ya que no es requerido para el proceso silenciamiento génico; muchas veces no se consigue una
de transformación. El casete de expresión debe ser adherido introducción estable del transgen; se presentan rearreglos
a los microproyectiles y, para esto, se han diseñado varias en el DNA transferido que difieren en tamaño; se puede
metodologías, entre las más utilizada es la que emplea presentar daño en los tejidos; el sistema es cotoso (Hansen
cloruro de calcio y espermidina, para la precipitación del & Wright, 1999; Veluthambi et al. 2003; Danilova, 2007).
DNA sobre los micorproyectiles (Bhat & Srinivasan, 2002;
Altpeter et al. 2005; Sanford, 2000; Rao et al. 2009). Un sistema de transformación que ha surgido a partir de
integrar las características de este sistema con el sistema
En la actualidad, el mecanismo de disparo se basa en una Agrobacterium es la Biolistica o Agrolistica. En éste, se
pistola especial que lanza las partículas a más de 400m/s emplea la biobalística para producir daños mecánicos
sobre el tejido de forma, que penetran sin destruir la al disparar proyectiles sin ADN sobre el tejido vegetal a
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transformar, luego, a través del sistema Agrobacteriumk, cabo la permeabilización de la membrana plasmática. El
como mecanismo de transmisión génica, se lleva a cabo la empleo de protoplastos conlleva a la implementación de
transformación del tejido vegetal. (Taylor & Fauquet, 2002; técnicas de cultivo engorrosas (Mohan Babua et al. 2003;
Sharma et al. 2002). Larik et al. 2004).
Electroporación Sonicación
Con esta metodología, se busca permeabilizar las Es un método nuevo de transferencia de genes, utilizado
membranas, mediante el aumento significativo de la con éxito en la transformación de tejidos vegetales, células
conductividad eléctrica, causado por un campo eléctrico intactas y protoplastos. Se emplea ultrasonido con frecuencias
aplicado externamente. Las membranas, se desestabilizan superiores a 20 KHz, para generar permeabilidad en las
originando una pérdida temporal de la permeabilidad membranas, mediante la inducción de poros transitorios,
produciendo poros reversibles, por los que se produce a través de los cuales, el DNA foráneo puede ingresar al
el paso de macromoléculas, fuga de iones, escape de interior de la célula vegetal. Este fenómeno también es
metabolitos y mayor absorción de DNA, por parte de las conocido como Sonoporación. El dispositivo empleado
células (Krassowska & Filev, 2007; Fox et al. 2006). para la producción de los pulsos de ultrasonido empleados
durante este proceso es conocido como sonicador (Mehier-
Durante la electroporación, las células son tratadas con Humberta et al. 2005; Deng et al. 2004)
impulsos eléctricos controlados de alto voltaje y pulsos
cortos de duración de microsegundos a milisegundos, El mecanismo por el que se ocasiona la permeabilización
utilizando campos entre los 200 V/cm hasta los 600 V/cm. de las membranas por la acción de ultrasonido no se
Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática dilucidado por completo. Se cree que el mayor efecto de la
excede su rigidez dieléctrica, siendo esta la resistencia que sonicación es debido a la cavitación acústica, siendo esta la
oponen los materiales a transmitir la electricidad, se forman propagación de las hondas del ultrasonido, por medio de un
poros en la membrana. Si la fuerza del campo eléctrico medio líquido en reposo, particularmente a bajas energías
aplicado y la duración de la exposición al mismo se eligen acústicas. Por causa a este fenómeno, se producen burbujas
correctamente, los poros formados por el pulso eléctrico se que crecen, con rápidas oscilaciones en su tamaño, lo
sellan tras un corto periodo de tiempo, durante, el cual, los que las hace colapsar. Durante este colapso, las burbujas
compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar producen ondas de choque muy fuertes, así como pequeños
a la célula; sin embargo, una exposición excesiva a campos chorros de líquido a altas velocidades, produciendo daños
eléctricos puede causar daños irreversibles a las membranas, severos en la superficie de objetos sólidos cercanos (Mehier-
causando la muerte de las células (Tarek, 2005; Chen et al. Humberta et al. 2005; Miller et al. 2002).
2006).
Los efectos fisicoquímicos que este proceso puede ocasionar
La electroporación se lleva a cabo en un dispositivo llamado a las células vegetales son: formación de radicales libres;
electroporador, aparato que utiliza descargas de capacitores daños en la pared celular; alteraciones en la permeabilidad
para producir pulsos de alto voltaje, originando una corriente de la membrana; aberraciones cromosómicas menores;
eléctrica, que se hace pasar a través de la suspensión, que cambios de tipo fisiológico. Dado que se ha logrado mediante
contiene las células, a las cuales, se les desea permeabilizar este procedimiento la introducción de manera eficiente de
sus membranas y así permitir o facilitar la entrada del DNA ADN foráneo y del hecho que se pueden utilizar protoplastos,
foráneo, con el que se pretende transformar las células. El células en suspensión y fragmentos de tejido, es factible que
DNA foráneo a introducir debe estar presente en la solución esta técnica pueda tener un potencial futuro (Liu et al. 2006;
con las células a transformar; este DNA o genes de inertes, Deng et al. 2004).
por lo general, se encuentran contenidos en un plásmido,
aunque también pueden estar en forma de molécula lineal Transferencia mediada por compuestos químicos
de DNA (Fox et al. 2006; Chen et al. 2006). Es una de las metodologías más empleada para la introduc-
ción de DNA foráneo en protoplastos y en células intactas.
El proceso de electroporación es aproximadamente diez Se basa en el uso de compuestos químicos que induzcan
veces más efectivo que la transformación mediada por permeabilidad en la membrana. Para esto, las células ve-
métodos químicos; es un método muy eficiente de fácil getales deben ser tratadas con la sustancia química en las
operación y relativamente simple, que se utiliza con mucha concentraciones y en las condiciones pre-establecidas. Entre
frecuencia. La principal limitación que presenta este método los compuestos químicos más empleados tenemos: Polieti-
para la transformación de plantas es la necesidad de emplear lenglicol (PEG), Fotostato de calcio y Poly-L-omotina. Estas
protoplastos (células sin pared), para que se pueda llevar a sustancias ayudan a inducir permeabilidad en las membra-
56
nas, mediante la inducción de poros transitorios o daño re- de las células. La microinyección utiliza microcapilares
versible de la membrana, lo que permite o favorece el paso o microagujas de vidrio y sistemas de microscopia para
del DNA foráneo y de macromoléculas, a través de la mem- depositar el DNA foráneo, en el interior de células vegetales.
brana hacia el interior de la célula. Esta fue la primera técnica Además, el hecho que junto al DNA desnudo se puedan
alternativa que se empleó para transformar gramíneas, en la inyectar otros elementos genéticos, como plastidios,
década de los 80 (Chakrabarty et al. 2008; Danilova, 2007). mitocondrias y cromosomas, hace de la microinyección
una técnica interesante y muy útil para la transformación de
El más empleado de los compuestos químicos es el plantas. El equipo que se requiere para realizar el proceso de
Polietilenglicol (PEG), un agente de fusión que modifica microinyección es llamado micro manipulador, compuesto
químicamente las membranas al interaccionar con los por un microscopio y por los accesorios de guía, para realiza
fosfolípidos que las componen. Durante el tratamiento desplazamientos (Sharma et al. 2002; Holm et al. 2000).
con PEG, la membrana de la célula es deformada por
fuerzas de tensión superficial, causadas por las diferencias Entre las ventajas que presenta esta técnica, se han reportado:
de densidades entre la solución de PEG y la solución que se puede optimizar la cantidad de DNA descargado; se puede
contiene los protoplastos a transformar y el DNA foráneo escoger la célula a transformar; la descarga del DNA foráneo
que se desea introducir. Es común que se emplee un pH es precisa y predecible; el proceso se realiza bajo control
alcalino, que contribuye al daño en la membrana; también visual; se emplean cantidades micro. Pero también presenta
se adicionan iones de calcio, que facilitan la entrada del algunas desventajas, tales como: solamente una célula recibe
DNA foráneo al interior de la célula. Pese a que este sistema el DNA por cada inyección; el manejo de la técnica requiere
presenta algunas desventajas, como baja eficiencia, poca personal entrenado y mayor instrumentación (Mohan Babua
reproducibilidad, requerimiento de protoplastos y toxicidad et al. 2003; Larik et al. 2004).
para las células, se continúa empleando intensivamente
(Danilova, 2007). Uno de los grandes avances que se han logrado con este mé-
todo ha sido la implementación de microinyección de liposo-
Fibras de carburo de silicona mas, en los que se ha depositado el DNA de interés, facilitando
Es una metodología recientemente descrita, en la que se así la descarga o introducción del DNA foráneo en la célula
emplean fibras de carburo de silicona de 10 a 80 μm de (Gutiérrez et al. 2002; Larik et al. 2004; Rao et al. 2009).
longitud, con un diámetro de 0,5μm, mediante, la cual, el
DNA foráneo es introducido en las células vegetales, a través Microláser
de los poros o agujeros que hacen las fibras de carburo de El objetivo de esta metodología es la permeabilización de las
silicona, que actúan como microagujas. El tamaño, la forma membranas, que se lleva a cabo mediante la utilización de un
y la composición química de las fibras de carburo de silicona chorro de microláser enfocado en el sistema de iluminación
es lo que permite que penetren directamente al interior de un microscopio, permitiendo así abrir orificios o poros
de la célula, sin ocasionarle daño alguno (Danilova, 2007; transitorios en la pared celular y en la membrana plasmática
Lutsenko, 2005). de las células vegetales, que se desean transformar. Así,
se facilita la posterior entrada del DNA foráneo hacia el
La metodología por la que se realiza el proceso de trans- interior de las células. Como en este sistema no requiere de
formación empleando las fibras de carburo de silicona es vectores o portadores del DNA de interés, para el proceso
bastante sencilla; mediante una fuerte agitación del cultivo de transformación, se pueden emplear moléculas de DNA
celular en suspensión, en presencia del DNA plasmídico y las lineales (Kajiyama et al. 2007; Mohan Babua et al. 2003).
fibras de carburo de silicona, se logra que por fuerzas hidro-
dinámicas penetre a las células el DNA foráneo y las fibras No hay datos concluyentes acerca de la eficacia de este mé-
de carburo de silicona. Esta técnica es rápida, sencilla y poco todo. Pero en combinación con el sistema de biobalística, se
costosa. Aunque es necesario aclarar los mecanismos mole- han obtenido logros importantes en procesos de transforma-
culares que actúan en estas transformaciones, así como en- ción. Así se emplea este método para abrir poros en los teji-
sayar nuevos materiales fibrosos que mejoren los resultados dos vegetales, para que posteriormente los microproyectiles
obtenidos y permitan eliminar el uso del material carburo de cargados con el Dna foráneo, penetre las células vegetales
silicona que es toxico (Mizuno et al. 2005; Rao et al. 2009). (Kajiyama et al. 2007; Mohan Babua et al. 2003).
Microinyección CONCLUSIONES
La microinyección es una de las técnicas más precisas
para la introducción de DNA foráneo o de macromoléculas Existe un gran número de métodos de transformación de
dentro de los compartimentos intracelulares específicos plantas que se encuentran disponibles para su uso, aunque
57
la mayoría son muy poco utilizados en el laboratorio. Los 6. BIOS. 2008. BiOS: a framework to collaboratively
métodos más empleados son la transformación mediada solve our shared challenges. CAMBIA (Australia).
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de nuevos métodos pueden cobrar interés, ya que son
más sencillos, contribuyen a la reducción de costos y 7. BIRCH, R. 1997. Plant transformation: Problems and
a una demanda más baja, en el uso de equipos. Aunque Strategies for Practical Application. An. Rev. Plant
para muchos de estos métodos se deben realizar ensayos Physiol. Plant Mol. Biol. (Estados Unidos). 48:297-
y estudios para su optimización, empleando diferentes 326.
genotipos, puesto que la mayoría presenta un gran problema,
que es la baja eficiencia de transformación. La eficiencia de 8. BROOTHAERTS, W.; MITCHELL, H.; WEIR, B.;
estos sistemas está supeditada a los métodos de cultivo de KAINES, S.; SMITH, L.; YANG, W.; MAYER, J.; ROA-
tejido que se empleen y a los avances que en esta área se RODRIGUEZ, C.; JEFFERSON, R. 2005. Gene
tenga sobre el genotipo a transformar. transfer to plants by diverse species of bacteria.
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Conflictos de intereses: El manuscrito fue preparado y
revisado con la participación de todos los autores, quienes 9. CITOVSKY, V.; KOZLOVSKY, S.; LACROIX, B.;
declaran que no existe ningún conflicto de intereses que ZALTSMAN, A.; DAFNY-YELIN, M.; VYAS, S.;
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61
Fitorremediación con humedales
artificiales para el tratamiento de
aguas residuales porcinas
Phytoremediation with artificial wetlands for the treatment of
swine wastewater
Recibido: 01-07-10 Aceptado 19-10-10
Sergio Adrián Arias Martínez 1, Resumen

Ferney Mauricio Betancur Toro 2, Este artículo es el resultado de la investigación aplicada en la búsqueda de
Gonzalo Gómez Rojas 3, soluciones a problemas ambientales a través de tecnologías sostenibles. Consistió
Juan Pablo Salazar Giraldo 4, en el diseño e implementación de un sistema de humedales artificiales para el
Marta Lucía Hernández Ángel 5 tratamiento de las aguas residuales de la unidad productiva de cerdos del Centro
de los Recursos Naturales Renovables La Salada, basado en un ensayo piloto
de fitorremediación. El propósito del proyecto es evaluar la efectividad de los
humedales para reducir la carga contaminante como sistemas económicos de
tratamiento en las granjas porcícolas en Colombia.
Palabras clave: Fitorremediación, humedales artificiales, tratamiento de aguas
residuales, sector pecuario, tecnologías de tratamiento alternativo; ambiental;
tecnologías limpias.
Abstract
This article is the result of applied investigation looking for the so-
lution of environmental problems through sustainable technologies,
and consisted in the design and implementation of a system of artificial
wetlands to treat wastewater from pig production unit of the Centre
Renewable Natural Resources “La Salada”, based on a pilot essay of
phytoremediation. The purpose of the project was to evaluate the effectiveness
of wetlands to reduce the pollutant load, as economic systems of treatment for
1,2
Técnico y Tecnólogo en Control Ambiental hog producers in Colombia.
del SENA.
3
Ingeniero Forestal de la Universidad Nacio- Key words: phytoremediation; constructed wetlands; wastewater treatment;
nal. Profesional del Centro de los Recursos livestock; alternative treatment technologies; environmental; clean technologies
Naturales RenovablesLa Salada – SENA.
4
Geólogo, especialista en Evaluación del
Impacto Ambiental y candidato a PhD en
Ingeniería ambiental de la Universidad de
Antioquia. Profesional del Centro de los Introducción
Recursos Naturales Renovables La Salada El desarrollo de la industria porcícola en Colombia es desde hace tres décadas
– SENA.
5
Ingeniera Química de la Universidad
una de las actividades agropecuarias de mayor importancia en la producción
Nacional. Especialista en Ingeniería Am- y comercialización de ganado porcino con un gran impacto en la generación
biental y MsC en Ingeniería Ambiental de fuentes de trabajo para aquellos granjeros y agricultores que ven en esta
de la Universidad Pontificia Bolivariana.
Coordinadora del Laboratorio de Servicios actividad una fuente de sustento económico para sus familias.
tecnológicos del Centro de los Recursos La producción porcícola genera en desarrollo de sus actividades diversos
Naturales Renovables La Salada.
Autores para correspondencia: mhernan- problemas y el tratamiento de las aguas residuales uno de ellos, pues su mal
dez@sena.edu.co; jpsg050@gmail.com manejo produce el deterioro de los suelos cuando son regados con estas cau-
12
S. Arias, F. Betancur, G. Gómez, J. Salazar, M. Hernández: Fitorremediación con humedales artificiales
sando con ello la contaminación de aguas subterráneas y mósfera. Ello conlleva la remoción de sólidos suspendidos
superficiales por escorrentía. La carga orgánica presente por sedimentación y filtración, a la biodegradación de la
en estas aguas origina una variación en las propiedades materia orgánica a partir de microorganismos aeróbicos y
fisicoquímicas y microbiológicas del suelo y del agua, lo anaeróbicos y a la eliminación de microorganismos patóge-
cual suscita un desequilibrio ecológico que difícilmente nos por sedimentación, filtración y la acción depredadora
se puede remediar en el corto plazo. Otro de los impactos de otros organismos, además de que se logra la remoción
ambientales generados son los malos olores que de ellas de metales pesados por precipitación y absorción, y una
y de los campos regados se desprenden como producto disminución de los hidróxidos y sulfuros. Estos módulos
de la descomposición de las excretas porcinas. Por esta para el tratamiento de aguas residuales pecuarias consti-
razón se hace necesario contar con un sistema de trata- tuyen igualmente una solución económicamente viable.
miento factible de construir en zonas rurales que permita
la remoción de contaminantes y a su vez cumplir con la Fitorremediación
legislación ambiental sobre vertimientos líquidos. Las técnicas de fitorremediación se caracterizan por ser
En la búsqueda de una solución al problema de con- una práctica de limpieza pasiva y estéticamente agradable
taminación de los suelos y de las fuentes de agua por las que aprovechan la capacidad de las plantas y la energía
descargas de las aguas residuales porcinas del Centro de solar para el tratamiento de una gran variedad de conta-
los Recursos Naturales Renovables La Salada y de casos minantes del medio ambiente (EPA, 1996). En esta técnica
similares en el departamento de Antioquia, este trabajo las plantas actúan como trampas o filtros biológicos que
de investigación se planteó como objetivo la selección y descomponen los contaminantes y estabilizan las sustan-
evaluación de las especies vegetales nativas, con vistas a cias metálicas presentes en el suelo y agua al fijarlos en
diseñar e implementar un sistema de humedales artificia- sus raíces y tallos, o metabolizándolos tal como lo hacen
les para el tratamiento de aguas residuales producto de la los microorganismos para finalmente convertirlos en com-
explotación de la actividad porcina. puestos menos peligrosos y más estables, como dióxido de
Dentro de las tecnologías que se utilizan en el mundo carbono, agua y sales minerales (Peña, 2001).
para el tratamiento de las aguas residuales porcinas los En la fitorremediación se identifican varios tipos de
humedales artificiales ocupan un lugar importante ya que procesos de remediación que varían según las partes de la
con ellos se busca aprovechar los procesos físicos, químicos planta que participan o los microorganismos que contribu-
y biológicos que se presentan al interactuar entre sí el agua, yen con la degradación de los contaminantes, algunos de
el medio filtrante, las plantas, los microorganismos y la at- los cuales se presentan en la Tabla 1 que describe los proce-
sos involucrados y los contaminantes que se pueden tratar.
Tabla 1. Procesos de fitorremediación
Tipo Proceso involucrado Contaminación tratada

Las plantas se usan para concentrar los contami-
Diversas aguas contaminadas con cadmio, cobalto,
Fitoextracción nantes en las partes cosechables (principalmente
cromo, níquel, mercurio, plomo, plomo selenio y zinc
la parte aérea).
Las raíces de las plantas se usan para absorber,
Aguas contaminadas con cadmio, cobalto, cromo,
precipitar y concentrar los contaminantes a partir
Rizofiltración níquel, mercurio, plomo, plomo selenio, zinc, isótopos
de efluentes líquidos contaminados y degradar
radioactivos y compuestos fenólicos.
compuestos orgánicos.
Lagunas de deshecho de yacimientos mineros, aguas
Las plantas tolerantes se usan para reducir su movi-
Fitoestabilización residuales. Propuesto para fenólicos y compuestos
lidad y evitar el pasaje a capas subterráneas o al aire.
clorados.
Se usan los exudados radiculares para promover el Hidrocarburos derivados del petróleo y poliaromáti-
Fitoestimulación desarrollo de microorganismos degradativos (bac- cos, benceno, tolueno, atrazina, etc, aguas residuales
terias y hongos). agropecuarias.
Las plantas captan y modifican los contaminantes o Aguas residuales agropecuarias, aguas con mercurio,
Fitovolatilización compuestos orgánicos y los liberan a la atmósfera selenio y solventes clorados (tetraclorometano y tri-
con la transpiración. clorometano).
Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan Aguas residuales agropecuarias, Municiones (TNT, DNT,
Fitodegradación y degradan compuestos orgánicos para dar subpro- RDX, nitrobenceno, nitrotolueno), atrazina, solventes clo-
ductos menos tóxicos o no tóxicos. rados, DDT, pesticidas fosfatados, fenoles y nitrilos, etc.
Fuente: (Reigosa, 2004)
13
Informador Técnico (Colombia) Vol. 74, Diciembre 2010, p 12 - 22
Humedales artificiales orgánica biodegradable ya que la descomposición

Los humedales son áreas que se caracterizan por tener microbiana provoca condiciones anóxicas (Figura 2).
un suelo saturado de agua y una comunidad viviente
(plantas y animales) adaptados a la vida acuática o a un
suelo saturado. El término humedal (wetland, en inglés) se
usa para definir áreas que tienen tres componentes típicos
(CIEMA, 2005):
• Presencia de agua: el área permanece inundada perma-
nente o periódicamente con una profundidad menor
de un metro.
• Suelos característicos: clasificados como hídricos. Figura 2. Humedal de flujo superficial con macrófitas sumergidas
(CIEMA, 2005).
• Vegetación: prevalecen las plantas macrófitas adaptadas
a las condiciones hidrológicas y del suelo.
Existen dos tipos de humedales artificiales desarrollados Humedal artificial de flujo subsuperficial
para el tratamiento de aguas residuales: los de flujo super- Este tipo de sistemas con macrófitas emergentes que
ficial (FWS – Free Water Surface) y los de flujo subsuperficial consiste en un filtro biológico relleno de un medio poroso
(SFS – Sub Surface Flow). A continuación se explicará cada (por ejemplo piedra volcánica, grava), en el cual las plantas
uno de ellos. macrófitas se siembran en la superficie del lecho filtrante
y las aguas residuales pretratadas atraviesan de forma
Humedal artificial de flujo superficial horizontal o vertical el lecho filtrante, en estos sistemas el
Consiste en canales con la superficie del agua expuesta a nivel del agua se mantiene por debajo de la superficie del
la atmósfera y el fondo constituido por suelo relativamente medio granular.
impermeable, o con una cubierta impermeable, vegetación Estos humedales se clasifican a su vez en humedales
emergente y niveles de agua poco profundos que oscilan artificiales de flujo horizontal y humedales artificiales de
entre 0.1 y 0.6 metros (Ñique, 2004). El tratamiento se pro- flujo vertical, según la manera como las aguas residuales
duce durante la circulación lenta del agua a través de los pretratadas atraviesen el lecho filtrante.
tallos y raíces de la vegetación. • Humedales de flujo horizontal
Este sistema se puede dividir, de acuerdo con el tipo de En este tipo de humedal las aguas residuales fluyen len-
macrófitas (CIEMA, 2005), en: tamente desde la zona de distribución en la entrada de
• Sistemas con macrófitas flotantes: formados por gran- la pila, en una trayectoria horizontal a través del lecho
des lagunas con bajos niveles de agua y provistas de filtrante, hasta la superficie de recolección del efluente
plantas macrófitas que flotan libremente en la super- (Figura 3).
ficie. Sus raíces sumergidas tienen un buen desarrollo
(Figura 1).
Figura 1. Humedal de flujo superficial con macrófitas flotantes

(CIEMA, 2005)
Figura 3. Humedal subsuperficial de flujo horizontal (CIEMA, 2005)
• Sistemas con macrófitas sumergidas: compuestos por
lagunas con bajo nivel de agua y plantadas con plantas • Humedal artificial de flujo vertical
macrófitas cuyo tejido fotosintético está totalmente Aquí las aguas pretratadas se distribuyen de manera
sumergido. Estas plantas solo crecen bien en aguas que uniforme e intermitente sobre la superficie del lecho
contienen oxígeno disuelto, por lo cual no se utilizan filtrante y luego percolan hacia la zona de recolección
para aguas residuales con alto contenido de materia (Figura 4).
14
• La eliminación de patógenos se da por adsorción sobre

las partículas del sustrato así como por el efecto dele-
téreo que sobre los organismos patógenos ejercen los
antibióticos producidos por las raíces de las plantas y
por la acción depredadora de bacterias y protozoos.
Características de las excretas porcinas

Para realizar el diseño de un humedal es muy importan-
te saber las características de las aguas objeto del proceso.
A continuación se resaltan algunas de ellas:
Las aguas residuales de las porquerizas están formadas
Figura 4. Humedal subsuperficial de flujo vertical (CIEMA, 2005).
por heces fecales y orina mezcladas con el material utiliza-
do como cama, residuos de alimento, polvo, otras partículas
Sistema experimentado y una cantidad variable de agua proveniente de las labores
En la investigación se compararon los diferentes sis- de limpieza y por pérdidas desde los bebederos.
temas de humedales y por sus condiciones y ventajas se La orina representa aproximadamente el 45% de la
seleccionó el humedal subsuperficial de flujo horizontal. excreta y las heces el 55%. El contenido de humedad de la
Dentro de las ventajas de estos humedales se tienen: excreta es de alrededor del 88% y el contenido de materia
• Mínima presencia de plagas. seca es del 12%. Cerca del 90% de los sólidos se excretan en
• Ausencia de malos olores en la zona de los lechos las heces; la orina contiene el 10% de los sólidos.
• Facilidad de operación La densidad de la excreta fresca es levemente menor
• La condición de modular permite adicionar nuevas de 1.0 (aunque son comunes las referencias de valores
unidades de acuerdo con las características de las aguas ligeramente superiores). El total de los sólidos tiene una
residuales finales. densidad baja, de 0.84 kg/l. La excreta porcina contiene
• Las aguas obtenidas se pueden usar nuevamente. sólidos que flotan y sólidos que se sedimentan, además
Estos humedales funcionan basados en mecanismos de sólidos en suspensión (Ministerio del Medio Ambiente,
en los cuales las plantas juegan un papel importante al Vivienda y Desarrollo Territorial, 2002).
contribuir en la depuración de las aguas residuales junto
con la función realizada por los microorganismos que se Parámetros físico-químicos
generan dentro de los medios filtrantes. Algunos de estos Se ha estimado que se producen por día 0,25 kg de demanda
procesos son: biológica de oxígeno (DBO) y 0,75 kg de demanda química de
• La eliminación de los sólidos en suspensión por filtra- oxígeno (DQO) por cada 100 kg de peso vivo. Por lo general,
ción a través de los medios sobre los cuales crecen las la DBO es un tercio de la DQO y cerca de un tercio de los só-
plantas y las raíces. lidos totales (STT) en las excretas porcinas frescas (Ministerio
• La eliminación de materia orgánica por la acción de del Medio Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial; 2002).
microorganismos, principalmente bacterias aerobias El pH varía entre 6 y 8. Cuanto más frescas sean las ex-
favorecidos por la aireación obtenida por las plantas a cretas, más neutro será su pH. El nitrógeno es el elemento
través de sus raíces. Solo en las zonas más profundas se de fertilización más importante debido a que el alimento
presenta, después de llevar algún tiempo en operación, suministrado a los cerdos contiene volúmenes altos de pro-
una zona anaerobia donde igualmente se dan procesos teína. En las excretas, el nitrógeno total se compone prin-
de degradación de la materia orgánica. cipalmente de nitrógeno orgánico y amoniacal (TAN). Del
• La eliminación de nitrógeno que en el caso de las aguas nitrógeno total producido, el 60% está en forma amoniacal
porcinas es el principal contaminante. Esta se realiza (TAN) y el 40% en forma orgánica (TON). La gran mayoría
por absorción directa por las plantas las cuales generan del nitrógeno de las heces fecales es orgánico mientras que
procesos de nitrificación-desnitrificación favorecidos la totalidad de la orina es amoniacal.
por la existencia de zonas aerobias y anaerobias.
• La eliminación de fósforo se produce mediante la Metodología desarrollada
transformación directa que las plantas realizan y por los durante la investigación
fenómenos de adsorción que efectúan los componentes A continuación se presenta la metodología con la cual se
del suelo. realizaron los procedimientos para el desarrollo del diseño
15
de un sistema piloto de fitorremediación con humedales e inicialmente regadas con agua y una solución nutritiva
artificiales para la remoción de contaminantes de las aguas que les permitiera la adaptación al medio. Posteriormente
residuales generadas en las explotaciones porcinas del fueron regadas con las aguas residuales porcinas para iden-
Centro de los Recursos Naturales Renovables La Salada. tificar la capacidad de las especies nativas de adaptarse a
cada medio filtrante y la utilización de las aguas residuales
Caracterización las aguas residuales de la unidad realizada (Fotos 1 y 2)
productiva de cerdos del Centro
Para el desarrollo de este proyecto se tomaron durante
un mes muestras compuestas conformadas por muestras
simples (una por cada área de la explotación: ceba, levante,
cría y reproducción) con las cuales se evaluaron las caracte-
rísticas mayores y menores presentadas para los diferentes
parámetros en la explotación, entre los que se encuentran
temperatura, pH, conductividad, oxígeno disuelto, DBO,
DQO, sólidos totales (ST), sólidos suspendidos (SS), dureza
total, dureza cálcica, acidez, alcalinidad, nitrógeno total,
sulfatos, fósforo, zinc, manganeso, potasio, sodio, y una
caracterización microbiológica para coliformes, mesófilos
y hongos.
Selección de las especies vegetales y de los medios Foto 1. Ensayo preliminar

granulares con posibilidades de ser utilizados en el
humedal artificial
La selección de las especies vegetales y de los medios
granulares estuvo orientada a la búsqueda de información
sobre algunas especies de plantas nativas en humedales de
quebradas y ríos cercanos al Centro La Salada, que por sus
características tuviesen potencial para ser utilizados en el
proceso de fitorremediación en los humedales artificiales
(Cerón y Vivas, 1995).
Los medios granulares fueron seleccionados teniendo
en cuenta el costo de cada material, la disponibilidad en
las zonas cercanas a los ensayos y las características de los
terrenos donde se encontraban las plantas seleccionadas,
con el fin de que estos no cambiaran mucho y fuera más
fácil la adaptación de las plantas. Foto 2. Proceso de siembra de plantas
Evaluación del proceso de propagación Las aguas resultantes de cada planta fueron evaluadas
y adaptación de las plantas a los medios en los diferentes parámetros para estimar los cambios ob-
de cultivo y al agua residual tenidos al pasar por cada planta y por cada medio filtrante.
Esta actividad se desarrolló por medio de un ensayo En esta etapa se llevó a cabo una evaluación de las va-
preexperimental con el cual se identificaron y selecciona- riaciones fisiológicas de las plantas.
ron tres especies de plantas y un medio de cultivo para el
diseño y la construcción de la unidad piloto. Establecimiento de los parámetros físicos,
Este ensayo consistió en seleccionar cinco tipos de me- químicos e hidráulicos útiles para el diseño y
dios filtrantes, a saber: grava, verniculita, arena, arenón, construcción de la unidad piloto
cisco de arroz y diez plantas: matandrea, pasto pará, ce- En esta etapa se aplicaron los resultados obtenidos en
bollita, coquito, flor amarilla (semilla), pasto taner, ponte- los ensayos anteriores los cuales permitieron seleccionar
deriácea nº 1, pontederiácea nº2, coquito miniatura y flor tres plantas y los medios filtrantes más adecuados. También
moradita (semilla). Estas plantas se sembraron en macetas se diseñó y construyó la unidad piloto de los humedales
en los cinco tipos de medios filtrantes (todos por triplicado) según los cálculos de los requerimientos mínimos de área,
16
marcando de este modo la diferencia con los sistemas de Tabla 2. Resultados de los análisis físico-químicos y microbiológicos
humedales artificiales convencionales sin que por ello se del agua residual de la unidad productiva
sacrifique la eficiencia del tratamiento. FISICOQUÍMICO
El diseño se basó en el modelo para la remoción de
Análisis Unidades Valor
DBO en humedales de flujo subsuperficial empleado por
Sherwood C. y Reed (Lara, 1999). Temperatura °C 23
pH 8,12
Evaluación del comportamiento del agua OD mg/l 0,25
residual durante el paso por la unidad piloto y Conductividad ms/Cm 5,23
determinación de la eficiencia y el porcentaje de DBO mg/l 116,1
remoción de los contaminantes DQO mg/l 377.5
Las tres unidades piloto fueron montadas con los medios ST mg/l 7476
filtrantes seleccionados y al ser tres plantas las adaptadas SS mg/l 3444
su disposición se hizo en canecas con adaptaciones de
Dureza total mg/l 35,6
tubería. En cada unidad piloto había una planta pero los
Dureza cálcica mg/l 28,8
medios filtrantes eran iguales en las tres unidades (Foto 3.).
Acidez mg/l 16
Alcalinidad mg/l 128
Nitrógeno total mg/l 392
Sulfatos mg/l 619,61
Fosforo mg/l 116,2
Zinc (Zn) mg/l 3.257
Fe (Hierro) mg/l 2.776
Cu (cobre) mg/l 0.475
Mn (manganeso) mg/l 0.412
K (potasio) mg/l 11.850
Na (sodio) mg/l 6.423
MICROBIOLÓGICO
Análisis Unidades Valor
Foto 3. Unidades del sistema piloto del humedal artificial Coliformes UFC >10000
La experimentación de la unidad piloto se llevó a cabo Mesófilos UFC >10000
con la adaptación de las plantas a las características y con- Hongos UFC 113
centraciones del agua residual. Posteriormente se evaluó Fuente: Los autores
el comportamiento de la calidad del agua tratada por la
unidad con diferentes tiempos de retención hidráulica, Como se puede advertir son aguas con un alto contenido
para lo cual se realizaron caracterizaciones fisicoquímicas y de materia orgánica, sólidos suspendidos, nitrógeno total,
microbiológicas en el laboratorio de servicios tecnológicos sulfatos y potasio entre otros.
del Centro La Salada. Con los datos resultantes se estimó
la eficiencia de remoción de los contaminantes. Delimitación de especies vegetales y medios
granulares
Resultados Las especies seleccionadas para la preexperimentación
fueron identificadas y recolectadas en los humedales na-
Caracterización del agua residual de la unidad turales ubicados en las laderas del río Aburrá en la vereda
productiva La Clara del municipio de Caldas, Antioquia (Tabla 3 y
Los resultados obtenidos en los análisis de laboratorio Figura 5).
se muestran en la Tabla 2, en la cual se pueden observar
con mayor detalle las características físicas, químicas y Medios filtrantes
microbiologías del agua residual generada en la unidad Los medios granulares fueron seleccionados por sus
productiva de cerdos del Centro de los Recursos Naturales características y por la disponibilidad del material en la
Renovables La Salada. zona (Figura 6).
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Tabla 3. Especies vegetales identificadas y evaluadas en la preexperimentación

NOMBRE VULGAR FAMILIA GÉNERO ESPECIE
Matandrea Zingyberaceae Hedychium montana
Pasto pará Gramineae Brachiaria mutica
Cebollita Cyperaceae Erioporuhorum schechzeri
Coquito Cyperaceae Cyperus rotundus
Flor amarilla (semilla) Asteraceae Taraxacum officinale
Pasto taner Gramineae Brachiaria arrecta
Pontederiácea Nº 1 Pontederiáceae Heterantera sp.
Pontederiácea Nº2 Pontederiáceae Eichhornia sp.
Coquito miniatura Cyperaceae Garex sp.
Flor moradita (semilla) Poligonaceae Peñigonun sp.
Fuente: Los autores.
Hedychium montana BrachIaria mutica
Erioporuhorum schechzeri Cyperus rotundus
Taraxacum officinale Brachiaria arrecta
Heterantera sp Eichhornia sp.
Garex sp. Peñigoniun sp.

Figura 5. Plantas evaluadas durante la preexperimentación.
18
Figura 6. Medios granulares evaluados durante la preexperimentación
Resultados de la preexperimentación
En la Tabla 4 se pueden observar las plantas selecciona-
das para el tratamiento. Se caracterizaron por tener mayor
adaptabilidad al ambiente y el agua residual de cerdos.
Tabla 4. Plantas seleccionadas tras la preexperimentación

NOMBRE
FAMILIA GÉNERO ESPECIE
VULGAR
Matandrea (M) Zingyberaceae Hedychium montana
Pasto pará (P1) Gramineae Brachiaria mutica
Pasto taner (P2) Gramineae Brachiaria arrecta
Figura 8. Remoción de contaminantes combinando la especie
Los mejores medios filtrantes seleccionados fueron la Brachiaria mutica (Pasto pará) al comparar los medios arena (BMA-
vermiculita y la arena. Sus ventajas son: Brachiaria mutica con arena) vs vermiculita (BMV- Brachiaria mutica
con vermiculita). Al igual que con la especie Hedichun montana, para
• Poseer mayor capacidad de retención hidráulica lo que ambos medios se presenta una alta remoción de contaminantes
favorece mayor remoción de la DBO. como sólidos suspendidos (mayor al 86 %), nitrógeno (mayor al 97
• Ser los medios donde las plantas tuvieron mejor adap- %) y fósforo (mayor al 89 %).
tación y desarrollo de raíz, tallo y hojas.
• Permitir una mayor retención y sedimentación de sóli-
dos totales, gracias a la porosidad y el diámetro de los
materiales filtrantes.
Esta relación entre los dos medios filtrantes y las tres
especies vegetales dieron diferentes porcentajes de remo-
ción para los principales contaminantes del agua residual
de la unidad porcícola (Figuras 7, 8 y 9).
Figura 9. Remoción de contaminantes combinando la especie

Brachiaria arrecta (Pasto taner), al comparar los medios arena (BAA –
Brachiaria arrecta con arena) Vs vermiculita (BAV - Brachiaria arrecta
con vermiculita). Al igual que con las especies Hedichun montan y
Brachiara mutica para ambos medios se presenta una alta remoción de
contaminantes como sólidos suspendidos (mayor al 83 %), nitrógeno
(mayor al 96 %) y fósforo (mayor al 92 %).
Diseño y construcción de la unidad piloto

Figura 7. Remoción de contaminantes combinando la especie He- El diseño y la construcción de la unidad piloto se hi-
dichun montana (Matandrea) al comparar los medios arena (HMV cieron según el modelo de Sherwood C. y Reed (Lara,
– hedichun montana con vermiculita) vs vermiculita (HMA- hedichun 1999). A continuación se muestran las variables (Tabla 5)
montana con arena). Nótese para ambos medios la remoción de
contaminantes como sólidos suspendidos (mayor al 80 %), nitrógeno y los cálculos de diseño de la unidad piloto y del humedal
(mayor al 90 %) y fósforo (mayor al 92 %). (Fotos 4 y 5).
19
n: Porosidad.
w: Ancho.
L: Largo.
As: Área superficial.
kt = k20 * (1.60) (T-20)

kt = 1.104 * (1.60) (22-20)
kt = 2.83 d-1
Q x (ln DBOa - ln DBOa)

As =
(kt) x (y) x (n)
Foto 4. Construcción del humedal As x (kt) x (y) x (n)

Q=
(ln DBOa - ln DBOa)
0.651 x (2.83) x (0.15) x (0.35)

Q=
(ln116.1 - ln 23.22)
60l
Q=
día
Tiempo de retención hidráulica TRH:

As x y x n
TRH =
Q
0.651 x 0.15 x 0,35
TRH =
0.06
24h
Foto 5. Unidad piloto en funcionamiento TRH = 0.57 día x = 13.68 h
1 día
Tabla 5. Variables de diseño de la unidad piloto
DBOa: 116.1 mg/l n: 0.35 ks: 5000m3/m2*día
La unidad piloto está compuesta por tres subsistemas y
EDBO5 : 80% Temperatura: 22ºc en cada uno se ubica una especie de planta de la siguiente
DBOe: 23.22 mg/l Q: K20: 1.104d-1 manera:
SSt: 7476mg/l L: 0.62m
m: 0.001 W: 0.35 Brachiaria mutica
Subsistema Nº 1 (S1)
y: 0.15 m As:0.651m2
Notas:
KT: Constante de reacción de primer orden dependien-
te de la temperatura, d-1. Brachiaria arrecta
T: Temperatura. Subsistema Nº 2 (S2)
DBO: Concentración DBO5 a la entrada al sistema.
EDBO5: Eficiencia requerida de % remoción DBO5 (Decreto
1594 de 1984).
DBOe: Concentración DBO5 a la salida del sistema.
Q: Caudal. Hedichum montana
Subsistema Nº 3 (S3)
m: Pendiente.
y: Profundidad del humedal.
20
El escalonamiento se debe principalmente al compor- tes, donde al final del S3 se presenta una remoción
tamiento que tienen las plantas respecto de las concentra- superior al ochenta por ciento.
ciones de los contaminantes del agua residual de cerdos,
pues Brachiaria mutica (S1) posee un excelente desarrollo
de raíces, tallos y hojas en presencia de aguas con alto
contenido de microorganismos. Brachiaria arrecta (S2) no
presenta cambios importantes en su morfología aunque
tuvo un lento crecimiento. Finalmente Hedychium montana
(3) se caracterizó por poseer un estado de estrés al estar
en contacto con el agua residual, sin embargo la planta
seguía con su desarrollo normal. El material filtrante de
las tres unidades pilotos del humedal (S1, S2 y S3) está
compuesto por capas de vermiculita, arena, arenón chino
y grava, aumentándose el tamaño de la partícula a mayor
profundidad (Figura 10)
Figura 11. Porcentajes de remoción de contaminantes del resultado

de la experimentación.
El nitrógeno orgánico que entra en el humedal

está típicamente asociado con la materia orgánica
del agua residual y con algas. La remoción inicial de
estos materiales como sólidos suspendidos es más o
menos rápida, gran parte del nitrógeno orgánico sufre
descomposición o mineralización y se convierte en
nitrógeno amoniacal en el agua (Lara, 1999). Por lo
tanto la remoción del nitrógeno se encuentra asociada
con la remoción de sólidos suspendidos SST la cual
en el S1 presenta una tasa superior al 50% y en nitró-
Figura 10. Perfiles del material filtrante en los subsistemas de la
geno del 59%. Posteriormente en los S2 y S3 merced
unidad piloto de humedal artificial. Nótese las fracciones usadas de
cada material. a procesos de amonificación seguidos de nitrificación
microbiana y desnitrificación se alcanza una remoción
de nitrógeno superior al noventa por ciento.
Resultados de la experimentación El fósforo presentó una remoción del 90%. De este total
Los porcentajes de remoción de contaminantes obteni- el 75% se fijó en el lecho filtrante y el resto fue asimilado
dos en el sistema de tratamiento por humedales artificiales por las plantas.
en un mes de funcionamiento fueron los siguientes: En la Figura 12 se observa el agua de salida en cada
La Figura 11 muestra los resultados obtenidos luego uno de los subsistemas del humedal artificial objeto de la
del análisis realizado al agua de salida de cada uno de los experimentación.
subsistemas de la unidad piloto de humedal artificial. En
ella se advierte una importante remoción de los principales
contaminantes de interés sanitario.
En el sistema la remoción de materia orgánica fue
rápida gracias a la deposición y filtración en cada uno
de los subsistemas. Cerca del 35% de la DBO aplicada
es removida en el S1 del humedal (esta materia orgá-
nica es descompuesta aeróbica y anaeróbicamente)
y el resto se encuentra en estado disuelto o en forma
coloidal. Igualmente continúa siendo removida del
Figura 12. Agua de salida de los subsistemas. De izquierda a derecha:
agua residual al entrar en contacto con los microor- agua de entrada, agua tras el tratamiento en el sistema S1, agua tras el
ganismos que crecen en los dos subsistemas siguien- tratamiento en el sistema S2 y finalmente agua tras el tratamiento S3.
21
Conclusiones ciencias sanitarias y ambientales con vistas a conseguir los

Las plantas que se seleccionan para los humedales artifi- mejores resultados.
ciales deben estar acordes con el clima y las características En futuras investigaciones se deben estudiar en detalle
fisicoquímicas y microbiológicas de las aguas que se van todos los procesos que ocurren entre las raíces, el agua
a tratar debido a la presencia de componentes que hacen residual, los microorganismos y el material filtrante.
difícil la sobrevivencia de las plantas y del sistema de filtro
biogeoquímico.
La cascarilla de arroz fue descartada para ser empleada Referencias
en la unidad piloto como medio granular en tratamientos CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS EN MEDIO AM-
de agua residual por incidir negativamente en la calidad BIENTE (CIEMA). Tecnología sostenible para el tratamiento
de aguas residuales. Proyecto ASTEC SUCHER & HOLZER.
del efluente, ya que presentó elevados niveles de color (> Austria - Nicaragua. Managua, Nicaragua: 2005. 43 p.
65 Pt-Co) y olor (característico de agua residual en des- CERÓN VIVAS, A. Y ROJAS SÁNCHEZ, P. Uso de macrófitas en
composición anaerobia). depuración de aguas residuales. Santiago de Cali, Colombia,
Los medios filtrantes deben ser inertes y poseer con- 1995, 114 p. Trabajo de grado (Ingeniero Sanitario). Universi-
dad del Valle. Facultad de Ingeniería. Programa académico
diciones que no aporten nutrientes, color o cambios en de ingeniería sanitaria.
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humedales artificiales demuestran nuevamente ser una [en línea]. Estado Unidos, 1996. Disponible en http://www.
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duales producto de las actividades del sector pecuario, LARA BORRERO, J. A. Depuración de aguas residuales Muni-
cipales con humedales artificiales. Barcelona, España, 2009,
las cuales se caracterizan por poseer un alto contenido de 122 p. Trabajo final (Titulo Máster en Ingenieria y Gestión
materia orgánica. Ambiental). Universidad Politecnica de Cataluña. Instituto
Los humedales artificiales al combinar medios filtrantes Catalan de Tecnologia. Disponible en: http://sites.google.
y diferentes tipos de plantas logran las remociones de DBO5 com/site/humedalesartificiales/7-diseno-hidraulico
MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE, VIVIENDA Y DESA-
y SST en las cantidades exigidas por la norma ambiental
RROLLO TERRITORIAL, ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE
(mínimo un 80 %) siempre y cuando se realicen las prue- PORCICULTORES. Guía ambiental para el subsector porci-
bas piloto. En las condiciones ambientales de La Salada cola. Colombia. 2002, 102p. Disponible en: http://www.
las plantas seleccionadas dieron los resultados esperados minambiente.gov.co/documentos/porc%C3%ADcola.
pdf
para las aguas residuales de la unidad porcina, lo cual
ÑIQUE ÁLVAREZ, M. Humedales construidos para el trata-
es un indicativo de que en cada región se deben ensayar miento de aguas residuales. Perú, Sociedad Peruana de
plantas de la zona, los medios filtrantes y los caudales de Gestión Ambiental [en línea]. Disponible en: http://www.
entrada con el fin de definir el sistema más óptimo. No geocities.com/sociedadpga/publicaciones/anoInro1/
humedales_tratamiento_aguas.htm [Citado 25 Mar 2004]
existen sistemas estándar para todas las aguas residuales
PEÑA, C. Toxicología ambiental: evaluación de riesgos y res-
y para todas las zonas rurales de Colombia, por tanto se tauración ambiental [en línea]. Estados Unidos, 1996-2001.
debe contar con el apoyo de los aprendices e instructores Disponible en: http://superfund.pharmacy.arizona.
del Sena conocedores del tema, o de profesionales de las edu/toxamb/c4-3-1-1.html [Last update: 7 Jun 2001]
22
Estrategias de bioaumentación y
bioestimulación para mejorar la eficacia
de los procesos de biorremediación
Resumen
La biorremediación, que implica bioaumentación y / o bioestimulación,
siendo un enfoque económico y ecológico, se ha convertido en la técnica
de limpieza de suelo y agua más ventajosa para sitios contaminados que
contienen metales pesados y / o contaminantes orgánicos. La adición de
cultivos microbianos pre-cultivados para mejorar la degradación de
compuestos no deseados (bioaumentación) y / o la inyección de
nutrientes y otros componentes suplementarios a la población
microbiana nativa para inducir la propagación a un ritmo acelerado
(bioestimulación), son los enfoques más comunes para en
biorremediación in situ de derrames accidentales y sitios contaminados
crónicamente en todo el mundo. Sin embargo, muchos factores como la
selección de cepas, la ecología microbiana, el tipo de contaminante, las
limitaciones ambientales, así como los procedimientos de introducción
de cultivos, pueden conducir a su fracaso. Estos inconvenientes, junto
con la literatura fragmentada, han abierto una brecha entre los ensayos
de laboratorio y la aplicación en el campo. La presente revisión analiza
la eficacia y las limitaciones de los procesos de bioaumentación y
bioestimulación. Se presenta un resumen de estudios experimentales
tanto en sistemas confinados en condiciones controladas como de
estudios de casos reales en el campo. Se aborda un relato comparativo
entre las dos técnicas y también el escenario actual a nivel mundial para
el biotratamiento in situ mediante bioaumentación y
el biotratamiento in situ mediante bioaumentación y
el biotratamiento in situ mediante bioaumentación y bioestimulación.
Página 1
Introducción a El objetivo principal de esta ciencia es la reducción de la

Biotecnología ambiental contaminación mediante
1 biorremedación / biotratamiento o apoyo como recursos
CAPÍTULO para uso humano
La palabra "medio ambiente" se deriva de la palabra Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
francesa "medio ambiente". La http://ebookcentral.proquest.com
El significado de la palabra francesa está relacionado de Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
alguna manera con "abarcar", "rodear", Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
etc. Se cree que fue introducido en el tema por el biólogo todos los derechos.
Jacob
Van Erkulin a principios del siglo XX y el término "medio Página 2
ambiente" se define como 1.2
nuestro entorno, que incluye el componente abiótico (los no Biotecnología ambiental
vivos) de forma no contaminante. También puede ayudar a una
y el componente biótico (lo vivo) que nos rodea. El ambiente producción más limpia de
abiótico productos. En general, abarca aspectos de los recursos
incluye agua, aire y suelo, mientras que el entorno biótico se naturales.
compone de todos los seres vivos. gestión, tratamiento de residuos y control de la
organismos: plantas, animales y microorganismos. El medio contaminación. Por lo tanto, el mayor
ambiente es muy áreas de conocimiento son la reducción de la contaminación
componente importante necesario para la existencia de ambiental a través de
seres humanos y otros biodegradación, biotransformación, bioacumulación de
organismos bióticos. Contrariamente a su nombre, la toxicidad como orgánicos,
biotecnología no es una tecnología única. metales, aceite e hidrocarburos, tintes, detergentes, etc
Más bien, es un grupo de tecnologías que comparten dos .; Manejo de energía
características (comunes) mediante la producción de energía no convencional no
trabajar con células vivas y sus moléculas y tener una amplia contaminante como el biodiésel
gama de metanol, biogás, biohidrógeno, etc .; Aplicación agrícola de
Usos prácticos que pueden mejorar nuestras vidas. La biofertilizantes,
biotecnología se puede definir ampliamente bioplaguicidas o bioorgánicos de múltiples
como "utilizar organismos o sus productos con fines usuarios. Recuperación de recursos de
comerciales". Producción desechos tóxicos o no tóxicos mediante un enfoque
puede llevarse a cabo utilizando organismos intactos de biotecnológico; Biosensor
bacterias, hongos y otros enfoque de la vigilancia de la contaminación y varias otras
microbios, o mediante el uso de sustancias naturales creadas cuestiones conexas.
por los organismos, como Las biotecnologías ambientales compiten con gran éxito
enzimas. La biotecnología ambiental es “la integración de las contra
ciencias naturales tecnologías tradicionales en los últimos días y están
e ingeniería para lograr la aplicación de organismos, células, brindando soluciones a
partes problemas a través de las llamadas tecnologías de
del mismo y análogos moleculares para la protección y tratamiento de 'final de tubería' y
restauración de la biorremediación. La biotecnología ambiental también puede
calidad de nuestro medio ambiente ”. La Sociedad proporcionar una forma natural
Internacional para el Medio Ambiente de abordar principalmente problemas ambientales que van
La biotecnología define la biotecnología ambiental como el desde la identificación
desarrollo, de los peligros biológicos a las técnicas de biorremediación
uso y regulación de sistemas biológicos para la remediación para aplicaciones industriales, agrícolas y
de contaminantes fines domésticos como efluentes y residuos municipales. Por
entornos (tierra, aire y agua) y para procesos respetuosos lo tanto, el uso ambiental
con el medio ambiente de la biotecnología incluye el desarrollo, uso de bioseguridad
(tecnologías de fabricación ecológicas y desarrollo y regulación de
sostenible). También puede sistemas biológicos para la remediación de ambientes
describirse como '' el uso óptimo de la naturaleza, en forma contaminados como la tierra,
de plantas, animales, agua, aire, así como para su uso en procesos
bacterias, hongos y algas, para producir energía renovable, ambientalmente racionales que conducen a
alimentos y nutrientes en tecnologías limpias y desarrollo sostenible. Prácticamente,
un ciclo integrado sinérgico de procesos lucrativos donde el todos los tipos de humanos
desperdicio de Las actividades generan desechos y esto supone una gran
cada proceso se convierte en materia prima para otro carga para el medio ambiente.
proceso ''.
Hasta ahora, nos hemos basado más en los métodos físicos residuos / recuperación / aprovechamiento / tratamiento de
y químicos de residuos, y sustitución de los
control de polución. Sin embargo, es probable que los base de recursos renovables con recursos renovables.
microorganismos resulten más 1.1 BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEDIO AMBIENTE
herramientas adecuadas para el control de la contaminación El crecimiento industrial, el desarrollo económico y la
por su versatilidad y adaptabilidad. consumación indican una
En el campo de la gestión ambiental, la biotecnología ha el progreso del país y el nivel de vida de sus
ayudado a individuos. Crecimiento industrial en el
monitoreo ambiental, degradación de desechos, sustitución El siglo XX también ha traído consigo nuevos problemas. La
de contaminación del agua,
base de recursos renovables con uno renovable y producción contaminación del aire, contaminación de la tierra,
de eco-amigables contaminación acústica, contaminación radiactiva, sólido
productos y procesos. desechos, agotamiento de recursos, escasez de agua de
La aplicación de biotecnologías está amenazada por riesgos buena calidad, proliferación
que son difíciles peligros para la salud, son todos resultados o consecuencias
definir, mucho menos evaluar. La introducción de de estupendos efectos industriales
genéticamente modificados actividades con menos atención a sus impactos negativos en
Los microbios pueden crear nuevos nichos ecológicos y los seres humanos y el
producir a gran escala ambiente. Los mecanismos incorporados de la naturaleza y
transformaciones en la estructura y función del ecosistema la capacidad de autorregulación han
en su conjunto. ha sido desequilibrado por la cantidad y complejidad de los
Hay muchos riesgos y peligros desconocidos asociados con desechos generados
el accidente o por la sociedad moderna. En términos económicos, solo
liberación deliberada de formas novedosas de consideramos los costos de material
autopropagación, manipuladas genéticamente y los costos de energía involucrados y no prestan atención a
vida en la biosfera. En caso de consecuencias desastrosas, es los costos involucrados en
probable que la forma de pérdida de la calidad ambiental. Urbanización,
Las personas que se beneficiarán poco del uso de la agricultura incorrecta
biotecnología se verán perjudicadas. En prácticas, etc .; son responsables de la contaminación. A
En los últimos años, un desarrollo considerable en términos medida que el progreso tecnológico ha
de I + D y su aplicación. Después de la revolución industrial, la solución del problema
sobre “Biotecnología ambiental” se realiza en todo el medioambiental debe
mundo. Las áreas principales seguir el progreso tecnológico. Procesos industriales y
de aplicación son la biodegradación microbiana de productos derivados,
contaminantes, el desarrollo de ambos deben ser respetuosos con el medio ambiente y
tecnología apropiada para la producción de biofertilizantes y menos dañinos. Contaminación
bioplaguicidas y puede definirse como un cambio indeseable en las
su uso en el campo de la agricultura y la condiciones físicas, químicas o biológicas
horticultura; producción de una sola célula características del aire, el agua y la tierra que pueden dañar
proteína, etc. Se produjo una discusión considerable en la vida humana, la vida de
reconocimiento y apoyo especies deseables, nuestros procesos industriales,
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de condiciones de vida y culturales
http://ebookcentral.proquest.com activos; o desperdiciar nuestros recursos de materia
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. prima. Medios de protección del medio ambiente
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados limitar el deterioro del medio ambiente e incluye la
todos los derechos. conservación de
recursos. La 'protección del medio ambiente' tiene tres
Página 3 objetivos principales:
Introducción a la biotecnología ambiental • Para evitar daños y molestias;
1.3 • Mejorar la productividad y el placer; y
del tremendo potencial que ofrece la biotecnología • Mantener los equilibrios del ecosistema.
ambiental Los esfuerzos de protección del medio ambiente nos
particularmente en el desarrollo de la próxima generación compensarán en términos de dinero,
de prevención de la contaminación, economía, productividad, justicia social, entornos más
reducción de la contaminación y desarrollo sostenible de limpios y buena salud.
tecnologías ecológicas. La Los problemas ambientales difieren solo un poco con
El surgimiento y aceptación del concepto de desarrollo respecto a un país; entonces
sostenible justifica los problemas enfrentados en otros lugares y los controles
que se amplíe el alcance de la biotecnología ambiental para aplicados son igualmente aplicables.
abordar cuestiones Conciencia, participación y acción de manera concertada por
como monitoreo ambiental, restauración de la calidad todos los que están
ambiental, recurso / Será necesario estar conectado para resolver los problemas
de contaminación. 'Ambiental
Biotecnología '' implica aplicaciones específicas de la de tecnologías internacionales (en particular las de Europa,
biotecnología a la Canadá y
gestión del medio ambiente y aspectos socioeconómicos y Japón) para la remediación de los sitios del superfondo. Los
de desarrollo relacionados criterios utilizados por ellos para
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de La evaluación se aplica en general también al evaluar
http://ebookcentral.proquest.com diferentes tecnologías para
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. propósito de la reducción de la contaminación. Los criterios
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados son:
todos los derechos. (i) Función: objeto y aplicabilidad de la tecnología;
(ii) Descripción: detalles de los principios operativos y
Página 4 características de diseño;
1.4 (iii) Desempeño: demostración de efectividad;
Biotecnología ambiental (iv) Limitaciones;
cuestiones, teniendo en cuenta el concepto de desarrollo (v) Economía; y
sostenible. 'Ambiental (vi) Estado de la investigación, el desarrollo y la
la biotecnología engloba cuestiones como: disponibilidad.
• Monitoreo ambiental; Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
• Restauración de la calidad ambiental; http://ebookcentral.proquest.com
• Recurso / residuos / recuperación de desechos / utilización Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
/ tratamiento por aplicación Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
de la tecnología de r- ADN; todos los derechos.
• Sustitución de recursos no renovables por renovables;
• Mejora de la deformación por degradación de Página 5
contaminantes altamente tóxicos con el Introducción a la biotecnología ambiental
producción de productos químicos; 1,5
• Cambios globales; Además de los puntos mencionados anteriormente, la
• Diversidad biológica; y elección de la tecnología es
• Gestión de riesgos. también influenciado por las consideraciones sociales,
La gestión de la contaminación industrial es, por tanto, una políticas y geográficas. La
de las muchas cuestiones Los criterios se aplican a la evaluación de tecnologías en
a los que se dirige la biotecnología ambiental. Durante otras áreas de limpieza ambiental.
mucho tiempo, el punto de trabajo también.
La discusión sobre la contaminación ambiental como un 1.2 BIOTECNOLOGÍA, AGRICULTURA Y MEDIO AMBIENTE
problema ha sido síntomas más bien CONTAMINACIÓN
que las causas de la contaminación. Esto naturalmente La agricultura es el uso de recursos naturales base para la
influyó en nuestro pensamiento y énfasis mejora y
se dio sobre medición y remoción (tecnologías de aumento de la producción de cultivos, ganado, pesca y
tratamiento). Luego lentamente árboles. En Agrícola
se prestó atención a la Evaluación de Impacto Ambiental biotecnología, se acelera la mejora y se incrementa la
(EIA) producción
y esto podría contribuir a una mejor planificación y a la utilizando conocimientos actualizados de los organismos
posibilidad de un mejor control. vivos, incluido el código genético.
Y hoy, hemos comenzado a atacar la raíz de la Estos incluyen técnicas convencionales bien establecidas
contaminación. Tenemos como en plagas biológicas
comenzó a discutir sobre lo que se describe como control, fermentación y producción de vacunas y
'tecnologías limpias' que creen en biofertilizantes así
desarrollo de procesos y modificaciones para minimizar la como técnicas modernas como el cultivo de tejidos, la
contaminación. ingeniería genética (también llamada
Los puntos útiles en la gestión eficaz de la contaminación modificación genética), tecnología de ADN recombinante
son: (ADNr) y cultivos y
(a) Tratamiento en proceso. transformación animal como resultado de la transgénesis. La
(b) Tratamiento al final de la tubería. importancia de estos nuevos
(c) Remediación de sitios contaminados. tecnologías como la biotecnología en seguridad alimentaria,
(d) Modificación de procesos existentes. sostenibilidad ambiental
(e) Introducción de nuevos procesos y productos. y el desarrollo económico fue capturado en el General de las
Aunque muchas tecnologías han estado disponibles para Naciones Unidas
fines de limpieza, Montaje en 2005.
sólo se ha demostrado que algunos de ellos tienen un valor Explosión industrial global que está destinada a satisfacer las
de aplicación de rutina. En necesidades de
1989, la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. Publicó la creciente población mundial siempre está asociada con el
una amplia evaluación medio ambiente
contaminación. La contaminación se produce como otro caso de estudio es el de los microbios aislados de suelos
resultado de una gestión inadecuada de los ricos en plaguicidas.
subproductos, su acumulación en el medio ambiente más Estos microbios tienen el potencial de utilizar los pesticidas
allá de los límites aceptables como fuente de energía.
y por lo tanto, causa peligro y / o molestia al hombre. El y así cuando se mezclan con biofertilizantes, servirían como
industrial by- un buen
los productos que son contaminantes pueden ser seguros contra el aumento de los niveles de toxicidad de los
compuestos orgánicos o inorgánicos. plaguicidas en los procesos agrícolas.
El entorno del hombre está compuesto por componentes Sin embargo, hay argumentos en contra de que el recién
abióticos y bióticos. Desarrollando introducido
Los países se enfrentan al desafío de aumentar rápidamente Los microorganismos utilizados para la limpieza de derrames
la agricultura de hidrocarburos podrían crear un desequilibrio en
productividad para ayudar a alimentar a sus poblaciones en el medio natural afectado. También existe la preocupación
crecimiento sin agotar de que la mutua
la base de recursos naturales. En muchos países, la armonía en la que los organismos que existen en ese entorno
agricultura aún subsiste particular pueden
y primitivo y esto suscita preocupaciones sobre la seguridad ser alterado y se debe tener extrema precaución para no
alimentaria, la deforestación, perturbar el mutuo
rápido crecimiento de la población, protección del medio relaciones que ya están establecidas en ese entorno al que
ambiente, suelos pobres, estrés estos
ambientes, condiciones climáticas desfavorables y cultivos Se introducen microorganismos recién descubiertos y
mejorados y clonados. Esto lleva
ganado. Por ejemplo, un entorno en el que la contaminación a una sugerencia de que las consecuencias ambientales
de un tipo particular positivas y negativas
es máximo. Los efluentes de una industria del almidón se de la biotecnología ambiental y agrícola debe ser
mezclan con un agua local. rápidamente
cuerpo como un lago o estanque. Estos provocan enormes dirigido.
depósitos de almidón que no se 1.3 DESAFÍOS IMPUESTOS AL MEDIO AMBIENTE POR LOS
fácilmente degradado por microorganismos salvo algunas HUMANOS
excepciones. Mediante OCUPACIONES
ingeniería genética, se aislaron algunos microorganismos de Las actividades humanas constituyen uno de los principales
los contaminantes medios de introducción de pesados
sitio y escaneado en busca de cambios significativos en su metales en el medio ambiente. Uno de los principales
genoma como evoluciones o desafíos del desarrollo
mutaciones. Luego se identificaron los genes modificados que afrontar esta década es cómo lograr una solución
porque el aislado rentable y ecológica
se han adaptado para utilizar / degradar el almidón mejor estrategias sólidas para hacer frente a la crisis mundial de
que otros microbios de residuos que enfrentan tanto los países desarrollados
el mismo género. Como resultado, los genes resultantes se y países en desarrollo. La crisis ha amenazado a los
clonan industrialmente asimiladores y
microorganismos importantes, que se utilizan para fines capacidad de carga de la tierra, nuestro sistema de soporte
económicos vital. Aunque el
procesos como la fermentación, y también se puede aplicar El contenido de nutrientes de los desechos los hace
en productos farmacéuticos atractivos como fertilizantes, aplicación a la tierra
Industrias. de muchos desechos industriales y aguas residuales se ve
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de limitado por la presencia de
http://ebookcentral.proquest.com metales, productos químicos orgánicos peligrosos, sales y pH
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. extremo.
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados Contaminación del medio ambiente por metales pesados,
todos los derechos. incluso en niveles bajos, y su
Los efectos acumulativos a largo plazo resultantes en la salud
Página 6 se encuentran entre los principales
1,6 preocupaciones en todo el mundo. Por ejemplo, la
Biotecnología ambiental bioacumulación de plomo (Pb) en
Otro estudio de caso es la incidencia de derrames de El cuerpo humano interfiere con el funcionamiento de las
petróleo en los océanos, que mitocondrias, lo que perjudica
requieren limpieza; microbios aislados de entornos ricos en respiración, y también causa estreñimiento, hinchazón del
aceite como la transferencia de aceite cerebro, parálisis y
oleoductos; Se ha descubierto que los pozos de petróleo, muerte eventual. Este problema es aún más pronunciado en
etc., tienen el potencial de degradar el desarrollo
o utilizarlo como fuente de energía y así servir como remedio países donde los esfuerzos de investigación para monitorear
a los derrames de petróleo. Todavía el medio ambiente han
no ha recibido la atención deseada por las partes 1.4 CONTRIBUCIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA
interesadas. Metales pesados MEJORAR
La concentración en el medio ambiente no puede atribuirse PRODUCTIVIDAD AGRÍCOLA
a factores geológicos. La biotecnología se considera un medio para el rápido
solo, ya que las actividades humanas modifican aumento de la agricultura
considerablemente la composición mineral producción mediante el tratamiento de las limitaciones de
de suelos, cultivos y agua. El reciente crecimiento producción de pequeña escala o
demográfico e industrial ha llevado agricultores de escasos recursos que aportan más del 70%
al aumento de la producción de residuos domésticos, de los alimentos producidos
municipales e industriales, que países en desarrollo. La biotecnología es aplicable a todas las
son arrojados indiscriminadamente a vertederos y cuerpos áreas y campos.
de agua sin tratamiento. de los esfuerzos humanos. La biotecnología agrícola tiene el
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de potencial de
http://ebookcentral.proquest.com abordar algunos de los problemas de los países en desarrollo
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. como la inseguridad alimentaria;
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados condiciones ambientales y climáticas desfavorables, etc. y
todos los derechos. mejorar
productividad agrícola. La biotecnología agrícola ha
Página 7 proporcionado a los animales
Introducción a la biotecnología ambiental agricultura con vacunas más seguras y eficaces contra la
1,7 pseudo rabia, entérico
Los residuos urbanos contienen metales pesados como colibacilosis y fiebre aftosa (FA).
arsénico (As), cadmio (Cd), La detección de enfermedades en cultivos y animales es más
Cobre (Cu), Hierro (Fe), Oro (Av), Manganeso (Mn), Plomo eficiente y rápida.
(Pb), Níquel (Ni) hecho usando sondas de ADN. La biotecnología actúa como
y zinc (Zn) que terminan en el suelo como sumidero cuando una herramienta clave para el avance
se lixivian en investigación médica y veterinaria. Los cultivos ahora son
de los vertederos. El suelo es un recurso vital para sustentar genéticamente
dos necesidades humanas de modificado para resistencia a insectos y plagas, maduración
suministro de alimentos de calidad y medio ambiente de retardada, tolerancia a herbicidas
calidad. Plantas cultivadas en una tierra contaminada y máxima producción en entornos estresados. Mapeo
con residuos municipales, domésticos o industriales puede molecular de
absorber metales pesados en el cultivos y animales de granja ha reducido notablemente el
forma de iones móviles presentes en la solución del suelo a tiempo de reproducción y mejorado
través de sus raíces o a través de comprensión y manipulación de genes por parte del
absorción foliar. Estos metales absorbidos se bioacumulan hombre. La nutrición es una de las más
en las raíces, graves limitaciones a la producción ganadera en los países
tallos, frutos, granos y hojas de plantas. Se sabe que las en desarrollo. Plantas
plantas absorben y generalmente contienen anti-nutrientes adquiridos de
acumulan metales pesados de suelos contaminados. El fertilizantes, pesticidas y
consumo de tales varios productos químicos naturales. Algunos de estos
plantas pueden ser particularmente peligrosas porque los productos químicos se conocen como
metales acumulados en Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
Las plantas comestibles pueden terminar en la cadena http://ebookcentral.proquest.com
alimentaria humana con los efectos adversos Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
concomitantes. Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
efectos sobre la salud humana y animal. Una prometedora y todos los derechos.
rentable basada en plantas
La tecnología para la limpieza de la contaminación por Página 8
metales pesados es la fitorremediación. 1.8
La fitorremediación ha llamado la atención en los últimos Biotecnología ambiental
años debido a la baja metabolitos secundarios y se ha demostrado que son
costo de implementación y es particularmente atractivo en altamente biológicamente
los trópicos, donde activo. Ejemplos de estos metabolitos secundarios de las
las condiciones climáticas normales favorecen el crecimiento plantas son saponinas, taninos,
de las plantas y la actividad microbiana. Plantas flavonoides, alcaloides, oxalatos, fitatos, inhibidores de
que brotan y crecen en suelos cargados de metales son tripsina (proteasa),
tolerantes a la contaminación por metales en glucósidos cianogénicos, etc. Se ha demostrado que algunos
suelo y son 'candidatos' para estrategias de remediación y de estos productos químicos son
manejo de pesados perjudicial para la salud o evidentemente ventajoso para la
suelos contaminados con metales. salud humana y animal
si se consume en cantidades adecuadas. Estos factores la desnutrición debe reducirse drásticamente, la agricultura
antinutricionales afectan la debe adaptarse para satisfacer
valor nutricional global de los alimentos para humanos y las futuras demandas del aumento de la población. El
animales. Algunos de estos aumento de la población humana
Los componentes de la planta tienen el potencial de aumenta la demanda de tierra, espacio y recursos
precipitar efectos adversos en el disponibles y primitivos
productividad de la ganadería. Los métodos convencionales Las prácticas agrícolas causan desertificación,
de fitomejoramiento han sido contaminación ambiental y
utilizado para reducir y, en algunos casos, eliminar dichos produce efectos resultantes sobre el clima, los ecosistemas,
factores antinutritivos (ANF). los ciclos biogeoquímicos y
Un ejemplo es la introducción de cultivares de colza, que son Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
bajos en o http://ebookcentral.proquest.com
libre de ácido erúcico y glucosinolatos. Una combinación de Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
ingeniería genética Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
y los métodos convencionales de fitomejoramiento podrían todos los derechos.
conducir a una reducción sustancial
o eliminación de los principales factores antinutritivos en Página 9
especies vegetales de importancia en Introducción a la biotecnología ambiental
alimentos para animales. 1,9
Los microbios transgénicos del rumen también podrían salud humana. Prácticas agrícolas sostenibles dirigidas a
desempeñar un papel en la desintoxicación de mejorar
venenos vegetales o inactivación de factores productividad agrícola, limpia, segura y respetuosa con el
antinutricionales. Introducción exitosa medio ambiente
de un inóculo de rumen caprino obtenido en Hawai en el condiciones deben ser introducidas en el sistema agrícola
rumen bovino global con el fin de
en Australia desintoxicaron 3 hidroxi 4 (IH) piridina (3,4 Reducir los efectos adversos de la contaminación ambiental
DHP), un desglose en la salud humana y
producto del aminoácido no proteico mimosina que se el clima (calentamiento global). Las nuevas técnicas de la
encuentra en el forraje de Leucaena. biotecnología proporcionan
En la producción animal, las técnicas biotecnológicas innovaciones que complementan las debilidades de la
aplicadas incluyen la clonación de genes, agricultura convencional
transferencia de embriones, inseminación artificial, prácticas y deberían adoptarse para aumentar la producción
modificación de la leche, etc. En animales de alimentos.
salud, se utilizan técnicas biotecnológicas para el diagnóstico Muchos científicos estarían de acuerdo en que la
rápido y preciso biotecnología es un contribuyente importante
y tratamiento de enfermedades. Terapia génica, producción un sistema de agricultura sostenible porque puede producir
de vacunas, producción más alimentos con menos
de productos farmacéuticos recombinantes, etc. son impacto ambiental en comparación con la agricultura
ejemplos. La biotecnología puede ayudar convencional.
promover la agricultura y el medio ambiente sostenibles y 1.4.1 Biotecnología para reducir el uso de plaguicidas
seguros, respectivamente, químicos,
globalmente de dos formas: herbicidas y fertilizantes
1. Al aumentar la producción de alimentos dentro de la Se debate mucho sobre el uso excesivo de herbicidas
superficie de tierra existente bajo arado, químicos, pesticidas y
haciendo innecesario el uso de tierras marginales o fertilizantes. Se convierten en un peligro para el medio
ambientalmente ambiente porque sufren
métodos y áreas sensibles. Esto conduce a la conservación degradación por microorganismos y luz ultravioleta que
de los recursos biológicos. libera tóxicos
evitando así la erosión del suelo. productos químicos en el medio ambiente. Utilizando
2. Uso de cultivos respetuosos con el medio ambiente, como biotecnología, pesticidas bacterianos y
herbicidas resistentes a los insectos Se están desarrollando pesticidas virales que ayudarán a
especies tolerantes, así como cultivos que pueden fijar reducir el uso de
nitrógeno y conducir a plaguicidas químicos. Varias empresas en USA como
depuración del medio ambiente. Monsanto, Mycogen,
En consecuencia, menos productos químicos como Ecogen, Repligen, Zoecon, etc.están involucrados
pesticidas, herbicidas y sintéticos activamente en el desarrollo de
Se utilizan fertilizantes nitrogenados. La biotecnología plaguicidas biológicos. Los ensayos continúan utilizando los
agrícola ha sido durante mucho tiempo un genéticamente modificados.
fuente de innovación en la producción y procesamiento de bacterias vivas del suelo para recubrir las semillas antes de
productos agrícolas plantarlas. Otro método es
y tiene un impacto profundo en el sector ganadero. A nivel intentado es matar las bacterias recombinantes y aplicarlas
mundial, si el hambre y a las hojas de los cultivos
plantas. Ambos enfoques protegen la toxina de la • Las algas verdiazules, se multiplican en las condiciones de
degradación por microbios. anegamiento y arreglan
o rayos ultravioleta una vez aplicados a las plantas de cultivo. el nitrógeno. Acumulan la biomasa que ayuda a mejorar
La empresa Ecogen Inc. participó en el desarrollo de las propiedades físicas del suelo. Esto es útil para la
pesticidas biológicos. recuperación de
contra las dos principales plagas de los cultivos, el gusano de suelos alcalinos además de proporcionar tolerancia parcial a
las yemas y el gusano de bola, transfiriendo los pesticidas. La
un gen de Bacillus thuringiensis (Bt), en un suelo natural las algas verdiazules más comunes
bacteria o en una cepa de Pseudomonas . Los insecticidas Bt son Azobacter sp. y Azospirillum sp.
ya están siendo Azolla , que es un helecho acuático contiene una
comercializados durante los últimos años y en el futuro se cynobacterium endofítica
modificarán utilizando Anabaena azollae en las cavidades foliares proporcionando
ingeniería genética y se utilizará contra una variedad de una relación simbiótica.
insectos. Genéticamente Azolla con Anaebaena es útil como biofertilizante.
Se han producido con éxito plantas modificadas resistentes • Bacterias solubilizadoras de fosfato: algunas bacterias
a insectos que como Thiobacillus, Bacillus
más ayuda para reducir el uso de insecticidas en el son capaces de convertir el fósforo inorgánico no disponible
futuro. Los experimentos presente
continúan desarrollando herbicidas seguros para el medio en el suelo a forma orgánica o inorgánica de fosfato. Estas
ambiente. Para utilizar estos bacterias
herbicidas para programa de protección de cultivos, También puede producir sideróforos, que se quela con el
herbicida modificado genéticamente hierro y lo convierte en
Se han producido plantas resistentes en una variedad de no disponible para bacterias patógenas. Los sideróforos son
plantas de cultivo. Esta voluntad bajos de unión al hierro
Garantizar el uso de herbicidas más seguros para el medio péptidos de peso molecular (400-1.000 Daltons) sintetizados
ambiente. por algunos
1.4.2 Biofertilizantes bacterias del suelo.
También se están utilizando biofertilizantes en lugar de • Fertilizantes orgánicos: Ciertos tipos de desechos
fertilizantes químicos para promover orgánicos se utilizan como fertilizantes.
Reducir los peligros ambientales causados por los por ejemplo, estiércol de animales (estiércol de vaca,
fertilizantes químicos. La estiércol de elefante, etc.), orina, basura urbana,
El término biofertilizantes se utiliza para referirse a los aguas residuales, residuos de cultivos y tortas
aportes de nutrientes de origen biológico a oleaginosas. Todos estos desechos se pueden convertir
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de en abonos orgánicos.
http://ebookcentral.proquest.com Ventajas de usar biofertilizantes
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. • Los biofertilizantes mejoran la tolerancia de las plantas
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados frente a los tóxicos pesados.
todos los derechos. rieles.
• Es posible recuperar la salinidad o alcalinidad del suelo
Página 10 mediante el uso de biofertilizantes.
1,10 • El uso de biofertilizantes ayuda a controlar la
Biotecnología ambiental contaminación ambiental.
Apoyar el crecimiento de las plantas, que generalmente se • La fertilidad del suelo aumenta año tras año.
logra mediante la adición de microbios. • Bajo costo y fácil de producir.
inoculantes como fuente de biofertilizantes. Los • Los biofertilizantes aumentan las propiedades físico-
biofertilizantes incluyen ampliamente el químicas del suelo, suelo
siguientes categorías: textura y capacidad de retención de agua.
• Fijadores simbióticos de nitrógeno: los microorganismos Algunas de las limitaciones encontradas al usar los
diazotróficos son los biofertilizantes son
fijadores de nitrógeno simbióticos que sirven como que por sí solos no pueden satisfacer las necesidades totales
biofertilizantes, por ejemplo, Rhizobium sp., de las plantas para el suministro de nutrientes
Bradyrhizopium sp. Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
• Fijadores de nitrógeno asimbióticos: las bacterias fijadoras http://ebookcentral.proquest.com
de nitrógeno asimbióticas Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
puede convertir directamente el nitrógeno gaseoso en Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
compuestos ricos en nitrógeno. todos los derechos.
Tras la muerte de estos fijadores de nitrógeno, el suelo se
enriquece con Página 11
compuestos nitrogenados que sirven como biofertilizantes, Introducción a la biotecnología ambiental
por ejemplo, Azobacter 1,11
sp., Azospirillum sp. y tampoco producen los resultados espectaculares que se
observan en sintéticos
fertilizantes. Es importante desarrollar un enfoque que Enzimas que les permiten metabolizar numerosas sustancias
pueda maximizar el uso de químicas artificiales.
biofertilizantes y reducir la dependencia de los fertilizantes (es decir, xenobióticos). La biorremediación es el uso de
químicos en las proximidades microorganismos o
futuro sin afectar la productividad de los cultivos. Esto nos Procesos microbianos para desintoxicar y degradar
ayudará a resolver el contaminantes ambientales.
Problemas relacionados con el medio ambiente causados Se han utilizado microorganismos para el tratamiento y la
por el uso excesivo de fertilizantes químicos. transformación de rutina.
1.5 BIOTECNOLOGÍA Y PRODUCCIÓN GANADERA EN EL de productos de desecho durante varias décadas. El lodo de
MEJORA DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES película fija y activado
El ganado recicla los nutrientes en la granja y produce una Los sistemas de tratamiento dependen de las actividades
producción valiosa de la tierra. metabólicas de los microorganismos que
que no es adecuado para la producción agrícola sostenida y degradar los desechos que ingresan a la instalación de
proporciona energía y tratamiento. Tratamiento de residuos especializado
capital para operaciones agrícolas exitosas. El ganado Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
también puede ayudar a mantener http://ebookcentral.proquest.com
fertilidad del suelo en suelos que carecen de un contenido Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
orgánico o de nutrientes adecuados. Añadiendo Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
El estiércol animal en el suelo aumenta la capacidad de todos los derechos.
retención de nutrientes (o cationes
capacidad de intercambio), mejora la condición física del Pagina 12
suelo aumentando su 1.12
capacidad de retención de agua y mejora la estructura del Biotecnología ambiental
suelo. El estiércol animal proporciona plantas que contienen poblaciones microbianas
condiciones favorables para la microflora y la fauna en los seleccionadas y aclimatadas se utilizan a menudo
suelos. Animales de pastoreo para tratar efluentes industriales. Se ha aplicado la
mejorar la cobertura del suelo dispersando semillas, innovación en biorremediación
controlando el crecimiento de arbustos, rompiendo a la remediación de suelos, aguas subterráneas y medios
levanta las costras del suelo y elimina la biomasa que de otro ambientales similares.
modo podría ser combustible para los arbustos Las técnicas de biorremediación dependen de tener los
incendios. Estas actividades estimulan la labranza del césped microorganismos adecuados
y mejoran la germinación de las semillas. en el lugar correcto con las condiciones ambientales
y así mejorar la calidad de la tierra y el crecimiento de la adecuadas para que la degradación
vegetación. La producción ganadera ocurrir. Los microorganismos adecuados son las bacterias y
también permite a los agricultores distribuir los nutrientes hongos que poseen la
de las plantas en el tiempo y el espacio de forma capacidad fisiológica y metabólica para degradar los
de pastoreo para producir estiércol, y en la tierra la tierra contaminantes. Ya,
que no puede sostener la cosecha bacterias con capacidad natural para digerir ciertos
producción. Esto hace que otras tierras sean más productos químicos se utilizan para
productivas. El pastoreo de ganado puede limpiar sitios industriales. Mediante la ingeniería genética, la
también acelerar la transformación de los nutrientes de los biotecnología ha
subproductos de los cultivos en fertilizantes, provocó la rápida producción de bacterias.
acelerando así el proceso de recuperación de tierras entre 1.7 BIOTECNOLOGÍA Y ELIMINACIÓN DE METALES PESADOS
cultivos. Como enfermedad CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE
También se eliminan las limitaciones, las razas grandes de Básicamente, los metales pesados de interés ambiental
ganado se pueden integrar en incluyen el mercurio,
operaciones de cultivo para proporcionar energía agrícola y vanadio, níquel, cobalto, plomo, cadmio, cromo, estaño, etc.
abono. La biotecnología tiene Algunos dañinos
mejorado aumento de la producción animal a través de la compuestos que causan graves contaminaciones
inseminación artificial (IA) ambientales y desastres como
y también mejoró la sanidad animal y el control de El diclorodifeniltricloroetano (DDT) y el plomo (Pb) se
enfermedades a través de la producción pueden
de vacunas de ADN recombinante. eliminado mediante ingeniería genética de bacterias
Los cultivos mejorados mediante biotecnología están fabricadas para
produciendo mayores rendimientos en todo el mundo para ese propósito. La capacidad de los microorganismos para
ayudar a alimentar a un mundo hambriento y en acumular metales y
crecimiento. su uso potencial en la descontaminación de ambientes
1.6 BIOTECNOLOGÍA Y ELIMINACIÓN DE QUÍMICOS impactados por
TÓXICOS Muchos científicos han informado de metales tóxicos. Los
DEL MEDIO AMBIENTE microorganismos eliminan
Los microorganismos han ampliado los entornos en los que metales tóxicos por diversos mecanismos, como la adsorción
viven al evolucionar a las superficies celulares,
complejación de exopolisacáridos, acumulación intracelular, y aceite. Sin embargo, también se ha informado de
biosíntesis eliminación de azufre bajo condiciones anaeróbicas
de metalotioninas y otras proteínas que atrapan metales y acción microbiana.
los transforman en 1.9 BIOTECNOLOGÍA Y MODELADO DE ECOSISTEMAS
compuestos volátiles. Micrococcus luteus y Azotobacte r Un ecosistema está formado por productores,
sp. se ha demostrado que consumidores, descomponedores y
inmovilizar grandes cantidades de plomo de sitios que detritívoros y su entorno físico, todos interactuando a través
contienen altas concentraciones de la energía
de sales de plomo, sin efecto detectable sobre la flujo y reciclaje de materiales. Una red trófica es una red de
viabilidad. Uranio, cobre y cruces, interconectados
el cobalto podría eliminarse mediante células inmovilizadas cadenas alimentarias que involucran a productores
con poliacrilamida de Streptomyces primarios, consumidores y descomponedores.
albus . Los procesos microbianos también pueden mediar en Las perturbaciones en una parte de un ecosistema pueden
la precipitación de metales de tener efectos inesperados en
soluciones acuosas. Ciertos productos extracelulares de otras partes aparentemente no relacionadas. El modelado
bacterias pueden interactuar con de ecosistemas es un enfoque para
cationes metálicos libres o absorbidos que forman predecir efectos imprevistos. Con este método, los
precipitados metálicos insolubles. investigadores identifican bits cruciales
El principal mecanismo involucrado en tal precipitación es a de información sobre diferentes componentes del
través de la ecosistema. Ellos usan computadora
formación de sulfuro de hidrógeno y la inmovilización de programas y modelos para combinar la información y luego
cationes metálicos como usar el resultado
sulfuros metálicos. Ciertos hongos que producen ácido datos para predecir el resultado de la próxima
oxálico (oxalatos) facilitan perturbación. Técnicas biotecnológicas
la inmovilización de metales tales como cristales de oxalato como la bioinformática son útiles en el modelado de
metálico. Los microbios pueden ecosistemas. Ofertas de bioinformática en
también catalizan una variedad de transformaciones de gestión de bases de datos de genes, mapeo de genes,
metales, que son útiles para residuos codificación, alineación de secuencias, etc.
tratamiento. Estas transformaciones incluyen oxidación, 1.10 BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA EN EL SEGUIMIENTO
reducción y alquilación. DE
reacciones. Bacterias, hongos, algas o protozoos, en las CONTAMINACIÓN AMBIENTAL
reacciones de oxidación, Se utilizan varios parámetros microbianos para la detección
Puede depositar iones ferrosos y manganeso. Geobacter y el seguimiento.
metalireducens eliminar de contaminantes, especialmente en cuerpos de
uranio, un residuo radiactivo, de aguas de drenaje en agua. Algunos microorganismos sirven como
operaciones mineras y indicadores de contaminación orgánica, mientras que otros
de aguas subterráneas contaminadas. sirven como indicadores de inorgánica
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de contaminación. Algunos de los parámetros utilizados para el
http://ebookcentral.proquest.com seguimiento de la contaminación orgánica
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. son bacterias heterótrofas, coliformes totales y fecales y
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados estreptococos fecales.
todos los derechos. Los parámetros utilizados para monitorear la contaminación
inorgánica incluyen nitrificación
Página 13 bacterias, bacterias oxidantes de azufre, bacterias
Introducción a la biotecnología ambiental reductoras de sulfato (SRB), hierro
1,13 bacterias, etc. La presencia de coliformes fecales en
1.8 BIOTECNOLOGÍA Y DESULFURIZACIÓN DE FÓSILES números por encima del mundo
COMBUSTIBLES El estándar de la Organización de la Salud (OMS) para agua
La eliminación de azufre inorgánico del carbón está mediada portátil es indicativo de
por oxidación microbiana. contaminación de origen humano.
de azufre. Los microorganismos heterótrofos son organismos que
La oxidación directa de azufre inorgánico obtienen su energía.
por Thiobacillus sp. es una membrana de la oxidación de moléculas orgánicas. Su presencia en gran
reacción unida y requiere el contacto directo del sustrato número
con la bacteria. en los sistemas acuáticos es indicativo de contaminación
Como resultado de esto, la unión del cultivo a la partícula de orgánica. La presencia de
carbón es la absoluta fuentes de carbono biodegradables apoyan la proliferación
requisito. Cultivos mixtos y puros de una variedad de de heterótrofos en
microorganismos. Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
(bacterias heterótrofas) se puede utilizar para eliminar el http://ebookcentral.proquest.com
azufre orgánico del carbón Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
todos los derechos.
control de la contaminación, lixiviación y recuperación de
Página 14 minerales. En la industria del petróleo,
1,14 Los microorganismos también pueden modificarse
Biotecnología ambiental genéticamente para producir productos químicos.
sistemas acuáticos. En el caso de los xenobióticos, las pocas útil para mejorar la recuperación de aceite. La limpieza de
especies que pueden degradar los derrames de petróleo podría, en
ellos pueden producir subproductos durante el metabolismo futuro, dejarse en manos de bacterias modificadas
que pueden ayudar a otros genéticamente. En las industrias mineras,
especies microbianas. Por lo tanto, un recuento microbiano microorganismos con la propiedad de una mayor capacidad
heterotrófico alto sugiere de lixiviación podrían ser
alto nivel de compuestos orgánicos en el sistema acuático, diseñado. Los microorganismos pueden unir metales a sus
mientras que el recuento bajo sugiere superficies y concentrarse
un bajo nivel de contaminación orgánica o la presencia de ellos internamente. Como resultado de esto, se pueden usar
materia orgánica persistente cepas genéticamente mejoradas.
dentro del sistema acuático. para recuperar metales valiosos o eliminar metales
1.11 BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA EN EL BIOENSAYO DE contaminantes de una solución diluida
TOXICIDAD AMBIENTAL como en los residuos industriales. Ya se están realizando
Los residuos industriales tóxicos son una amenaza tanto para investigaciones para mejorar la
el tratamiento de residuos biológicos Bacterias naturales que pueden 'comer aceite', para su uso
sistemas y el entorno de su disposición final. Como después de un derrame de petróleo. Por
resultado, los bioensayos Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
son muy necesarios para generar datos que puedan http://ebookcentral.proquest.com
utilizarse para la predicción de Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
efectos ambientales de los residuos y regulación de Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
vertidos. Aunque los peces todos los derechos.
han sido los organismos de prueba más populares,
organismos estándar para organismos acuáticos Página 15
Los bioensayos también incluyen fitoplancton, zooplancton, Introducción a la biotecnología ambiental
moluscos, insectos y 1,15
crustáceos. El uso de microbios (especialmente bacterias) aplicando bacterias a las playas cubiertas de aceite, las
como organismo de bioensayo es complejas moléculas de aceite serían
ganando amplia aceptación y ofrece una serie de ventajas descompuesto en azúcares inofensivos.
sobre el estándar Muchos microorganismos pueden degradar varios tipos de
organismos. agentes ambientales.
Las bacterias se manipulan fácilmente y requieren un contaminantes en materiales relativamente inofensivos
espacio relativamente pequeño para antes de la muerte del micro-
cultivo y / o análisis, en comparación con otros organismos. Esta propiedad también podría utilizarse para
bioensayos. Además, el corto superar los problemas ambientales.
ciclo de vida significa resultados experimentales rápidos, lo los peligros del DDT, el plomo y otros contaminantes
que permite al laboratorio ambientales como los desechos tóxicos
procesar más muestras. Las sencillas y rápidas técnicas de a nivel mundial. Se han detectado cepas de bacterias que
bioensayo de bacterias pueden degradar los hidrocarburos combustibles.
incluyen el ensayo de Nitrobacter, las pruebas de Microtox, diseñado y el uso de microorganismos genéticamente
el Toxi-chromotest y el modificados para limpiar el aceite
Prueba de Ames / Salmonella. El bioensayo de Nitrobacter se derrames o tratar aguas residuales se ha propuesto y está en
basa en la cuantificación producción /
de la actividad de Nitrobacter determinada midiendo el fabricación.
efecto tóxico en el 1.13 BIOREMEDIACIÓN Y SU IMPORTANCIA EN EL MEDIO
tasa de utilización de nitrito. Photobacterium phosphoreum AMBIENTE
es la base de la PROTECCION
Ensayo Microtox. Toxichromotest se basa en la inhibición de La biorremediación se define como 'el proceso de utilizar
la beta galactosidasa. microorganismos para eliminar
biosíntesis en E. coli o biosíntesis de enzimas, como los contaminantes ambientales donde los microbios sirven
triptófano y como carroñeros ”.
alfa-glucosidasa, bajo el control de operones (distintos del • La eliminación de desechos orgánicos por microbios
operón Lac) conduce a la limpieza ambiental.
por contaminantes ambientales. arriba. Los otros nombres / términos utilizados para la
1.12 BIOTECNOLOGÍA Y CONTROL DE DERRAMES DE biorremediación son biotratamiento,
HIDROCARBUROS biorreclamación y biorrestauración.
Los microorganismos ahora pueden modificarse • El término "Xenobióticos" (xenos significa extranjero) se
genéticamente para su uso en la recuperación de petróleo, refiere a lo antinatural,
productos químicos extraños y sintéticos, como pesticidas, Se suministra una cantidad adecuada de nutrientes
herbicidas, esenciales en el sitio que promueve
refrigerantes, disolventes y otros compuestos orgánicos. el crecimiento microbiano en el sitio
• La degradación microbiana de los xenobióticos también mismo. La biorremediación in situ es generalmente
ayuda a reducir la utilizado para la limpieza de derrames de petróleo, playas,
contaminación ambiental. Pseudomonas, que es un etc. Hay dos tipos de in situ
microorganismo del suelo. biorremediación
degrada eficazmente los xenobióticos. 1. Biorremediación intrínseca
• Diferentes cepas de Pseudomonas que son capaces de 2. Biorremediación diseñada in situ
desintoxicar más de 1.13.2.1 Biorremediación intrínseca
100 compuestos orgánicos (por ejemplo, fenoles, bifenilos, Los microorganismos que se utilizan para la biodegradación
organofosforados, se prueban para la
naftaleno, etc.). capacidad natural para provocar la
• También se sabe que algunas otras cepas microbianas biodegradación. Entonces, el metabolismo inherente
tienen la capacidad de La capacidad de los microorganismos para degradar ciertos
degradan xenobióticos contaminantes es la intrínseca
como Mycobacterium , Alcaligenes , Norcardia, etc. biorremediación. La capacidad de las bacterias de la
1.13.1 Factores que afectan la biodegradación superficie para degradar una mezcla determinada.
Los factores que inciden en la biodegradación son: de contaminantes en las aguas subterráneas depende del
• la naturaleza química de los xenobióticos, tipo y concentración
• la concentración y suministro de nutrientes, de compuestos, aceptor de electrones y la duración de las
• O 2 , temperatura, pH, potencial redox y bacterias expuestas a
• la capacidad del microorganismo individual. contaminación. Por lo tanto, la capacidad de degradación de
La naturaleza química de los xenobióticos es muy importante las bacterias autóctonas
porque fue Los contaminantes pueden determinarse en laboratorio
descubrió que la presencia de halógenos, por ejemplo, en utilizando las técnicas de
compuestos aromáticos, inhibe estudios de microcosmos y recuento de placas. Las
biodegradación. Los compuestos solubles en agua son más condiciones del sitio que favorecen intrínsecamente
fácilmente degradables. biorremediación son el flujo de agua subterránea durante
mientras que la presencia de estructura de anillo cíclico y la todo el año, minerales de carbonato
longitud de cadenas o ramas para amortiguar la acidez producida durante la
Disminuir la eficiencia de la biodegradación. Los compuestos biodegradación, suministro de aceptores de electrones
alifáticos son más y nutrientes para el crecimiento microbiano y ausencia de
fácilmente degradados que los aromáticos. compuestos tóxicos.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de 1.13.2.2 Biorremediación in situ diseñada
http://ebookcentral.proquest.com Cuando el proceso de biorremediación está diseñado para
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. aumentar el metabolismo
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados eficiencia de degradación (de contaminantes), se llama
todos los derechos. ingeniería in situ
biorremediación. Esto se hace suministrando una cantidad
Página 16 suficiente de nutrientes.
1,16 y suministro de oxígeno, agregando aceptores de electrones
Biotecnología ambiental y manteniendo óptimas
Bioestimulación : es un proceso mediante el cual la actividad temperatura y pH. Esto se hace para superar el lento y
microbiana puede ser limitado
mejorado por un mayor suministro de nutrientes o por la capacidad de biorremediación de microorganismos.
adición de ciertos estimulantes Ventajas de la biorremediación in situ
agentes como aceptores de electrones, tensioactivos, etc. • El método asegura una exposición mínima al público o al
Bio-aumento : es posible aumentar la biodegradación a personal del sitio.
través de • Hay una interrupción mínima o limitada en el sitio de la
manipulación de genes, es decir, utilizando microorganismos biorremediación.
modificados genéticamente y Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
mediante el uso de una variedad de microorganismos en la http://ebookcentral.proquest.com
reacción de biodegradación. Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
Dependiendo del método seguido para limpiar el medio Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
ambiente, todos los derechos.
La biorremediación se lleva a cabo de dos formas:
1.13.2 En situ biorremediación Página 17
La biorremediación in situ implica un enfoque directo para la Introducción a la biotecnología ambiental
degradación microbiana 1,17
de xenobióticos en el sitio de contaminación que podría ser • Debido a estos factores, es rentable.
suelo, agua, etc.
• Es posible el tratamiento simultáneo de suelo y agua Página 18
contaminados. 1,18
Desventajas de la biorremediación in situ Biotecnología ambiental
• Los sitios están expuestos directamente a factores • Aquí, el agua sirve como medio de suspensión donde los
ambientales como la temperatura, nutrientes, trazan
suministro de oxígeno, etc. elementos, químicos de ajuste de pH y contaminantes
• Existe la variación estacional de la actividad microbiana. desorbidos son
• Aplicación problemática de aditivos de tratamiento como disuelto.
nutrientes, • El material particulado en suspensión incluye un sustrato
tensioactivos, oxígeno, etc. biológicamente inerte
• Es un proceso muy tedioso y que requiere mucho tiempo. que consiste en contaminantes y biomasa adherida a la
1.13.3 Biorremediación ex situ matriz del suelo o libre
En este, los residuos y el material tóxico se recogen de los en medio de suspensión.
sitios contaminados. • Los materiales sólidos contaminados, los microorganismos
y la gama seleccionada de microorganismos llevan a cabo la y el agua
biorremediación formulados en suspensión se introducen en un biorreactor,
en el lugar designado. Este proceso es un método mejorado es decir, un fermentador.
sobre el in situ • Biológicamente, hay tres tipos de biorreactores en fase de
método de biorremediación. Sobre la base de fases de lechada: aireados
materiales contaminados lagunas, reactor de transporte aéreo de bajo cizallamiento y
bajo tratamiento, la biorremediación ex situ se clasifica en reactor de suelo de lecho fluidizado.
dos: • Los dos primeros tipos están en uso de biorremediación a
• Sistema de fase sólida y gran escala, mientras que
• Sistema de fase de lechada. el tercero está en etapa de desarrollo.
1.13.3.1 Tratamiento en fase sólida Ventajas de la biorremediación ex situ
• Este sistema incluye el tratamiento de la tierra y las pilas • Como el tiempo requerido es corto, es un proceso más
de suelo que comprenden eficiente.
desechos como hojas, abonos animales, desechos agrícolas, • Se puede controlar de una manera mucho mejor.
domésticos y • El proceso se puede mejorar mediante el enriquecimiento
residuos industriales, lodos de depuradora y residuos sólidos con el deseado y más
municipales. microorganismos eficientes.
• La práctica tradicional de limpieza implica el Desventajas de la biorremediación ex situ
procesamiento informal de • Los sitios de contaminación permanecen muy perturbados.
los materiales orgánicos y la producción de compost que se • Una vez que se completa el proceso, la eliminación de
pueden utilizar desechos degradados se convierte en un
como enmienda del suelo. problema importante.
• El compostaje es un microbiano manejado, denso de • Es un proceso costoso.
sustrato que se calienta espontáneamente. Se producen varios tipos de reacciones durante la
sistema que se utiliza para tratar una gran cantidad de biorremediación / microbiana.
sólidos contaminados degradación
material. (a) Biorremediación aeróbica: cuando la biodegradación
• El compostaje se puede hacer en sistema abierto, es decir, requiere oxígeno
en el tratamiento de la tierra y / o en (O 2 ) para la oxidación de compuestos orgánicos, se llama
Sistema de tratamiento cerrado. aeróbico
• Los compuestos peligrosos que se informó que biorremediación. Las enzimas como monooxigenasas y
desaparecen a través del compostaje. dioxigenasas son
incluyen hidrocarburos alifáticos y aromáticos y ciertos intervienen y actúan sobre compuestos alifáticos y
halogenados aromáticos.
compuestos. (b) Biorremediación anaeróbica: no requiere oxígeno. La
• Las posibles rutas que conducen a la desaparición de El proceso de degradación es lento pero más rentable ya que
peligrosos no se requiere suministro de oxígeno.
compuestos incluyen volatilización, asimilación, adsorción, (c) Biorremediación secuencial: Algunas de las
polimerización y lixiviación. degradaciones xenobióticas requieren
1.13.3.2 Tratamiento en fase de lechada procesos tanto aeróbicos como anaeróbicos que de manera
• Este es un sistema de tratamiento trifásico que involucra muy efectiva
tres componentes principales: reducir la toxicidad, por ejemplo, tetraclorometano y
agua, material particulado en suspensión y aire. tetracloroetano
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de sufrir una degradación secuencial.
http://ebookcentral.proquest.com 1.13.4 Uso de ingeniería genética y manipulaciones
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. genéticas para más
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados biorremediación eficiente
todos los derechos. En los últimos años, se han realizado esfuerzos para crear
microorganismos (GEM) para mejorar la en la temperatura atmosférica. Durante los últimos 100-150
biorremediación. Esto se hace para superar años, el nivel de
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de El CO 2 ha aumentado aproximadamente un 25% con un
http://ebookcentral.proquest.com aumento de la temperatura atmosférica.
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. en aproximadamente un 0,5%, lo que es una clara indicación
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados de que el CO 2 está estrechamente relacionado con
todos los derechos. calentamiento. Hay un aumento constante en el contenido
de CO 2 debido a la continua
Página 19 adición de CO 2 de diversas fuentes, particularmente de
Introducción a la biotecnología ambiental procesos industriales.
1,19 Es muy claro que la reducción de
algunas de las limitaciones y problemas de la la concentración atmosférica de CO 2 supone
biorremediación. Estos problemas significado. Se han utilizado métodos biotecnológicos para
están: reducir la
• A veces, el crecimiento de microorganismos se ve inhibido contenido de CO 2 atmosférico en dos niveles:
o reducido por (a) Fotosíntesis: las plantas utilizan CO 2 durante la
los xenobióticos. fotosíntesis, lo que reduce
• Ningún microorganismo natural tiene la capacidad de el contenido de CO 2 en la atmósfera. La ecuación de la
degradando todos los xenobióticos presentes en la fotosíntesis es:
contaminación ambiental. 6CO 2 + 6H 2 O → C 6 H 12 O 6 + 6O 2
• La degradación microbiana es un proceso muy lento. Las plantas de crecimiento rápido utilizan el CO 2
• A veces, ciertos xenobióticos se adsorben en las partículas. más eficientemente para
materia del suelo y, por lo tanto, no están disponibles para fotosíntesis. Las técnicas de micropropagación y sintética
la degradación microbiana. Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
Como la mayoría de genes responsables de la síntesis de http://ebookcentral.proquest.com
enzimas Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
con capacidad de biodegradación se encuentran en los Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
plásmidos, la genética todos los derechos.
Las manipulaciones de plásmidos pueden conducir a la
creación de nuevas cepas de bacterias. Página 20
con diferentes vías degradativas. En la década de 1970, 1,20
Chakrabarty y su equipo de colaboradores Biotecnología ambiental
los trabajadores informaron del desarrollo de una nueva Las semillas deben usarse para aumentar la propagación de
cepa de la bacteria Pseudomonas este tipo de crecimiento rápido.
mediante manipulaciones de la transferencia de plásmidos plantas. Además, la utilización de CO 2 puede aumentarse
que denominaron "superbacterias". mejorando la
Esta superbacteria tenía la capacidad de degradar una serie tasa de fotosíntesis. La enzima ribulosa bifosfato carboxilasa
de hidrocarburos de (Caso RUBP) está estrechamente relacionado con la fijación
petróleo simultáneamente como alcanfor, octano, xileno, de CO 2 . Los intentos estan siendo
naftaleno, etc. hecho para manipular genéticamente esta enzima para que
En 1980, Estados Unidos otorgó la patente a esta la fotosintética
superbacteria convirtiéndola en la primera aumenta la eficiencia.
Microorganismo modificado genéticamente para ser Algunas microalgas como Chlorella pyrenodiosa , Spirulina
patentado. maxima son conocidos
En ciertos casos, se utilizó el proceso de transferencia de Ser más eficiente que las plantas superiores en la utilización
plásmidos. Por ejemplo, el del CO 2 atmosférico .
Se conjugó una bacteria que contenía plásmido CAM (que para la fotosíntesis y generan más O 2 que la cantidad de
degrada el alcanfor). CO 2
con otra bacteria con plásmido OCT (degradante de consumado.
octano). Debido a que no El cultivo de estas microalgas cerca de las industrias y
compatibilidad, estos plásmidos no pueden coexistir en la centrales eléctricas.
misma bacteria. Sin emabargo, (donde la emisión de CO 2 a la atmósfera es muy alta)
debido a la presencia de regiones homólogas de ADN, se ayudará a
produce la recombinación la reducción de los efectos contaminantes del CO 2 . Usando
entre estos dos plásmidos que da como resultado un solo ingeniería genética,
plásmido CAM-OCT Se están haciendo intentos para desarrollar nuevas cepas de
dando a la bacteria la capacidad de degradar tanto el estas microalgas.
alcanfor como el octano. que puede tolerar altas concentraciones de CO 2 . Un éxito
1.13.5 Biotecnología para reducir el dióxido de carbono limitado ha
(CO 2 ) atmosférico ya se ha informado en los mutantes de Anacystis
El dióxido de carbono es el gas que es la principal causa del nidulans y Oocystis
efecto invernadero y aumenta sp.
(b) Calcificación biológica: ciertos organismos de aguas sólidos y compuestos orgánicos solubles, metales pesados,
profundas como los corales, cianuros,
y las algas rojas almacenan CO 2 a través de un proceso de Materiales químicos biodegradables y volátiles como H 2 S y
calcificación biológica. Como SO 2 , etc.
el CaCO 3 se precipita, se puede producir cada vez más CO2 • Los compuestos orgánicos solubles experimentan una
atmosférico lenta descomposición dando como resultado
utilizado para su formación. El proceso de calcificación es el en el agotamiento del oxígeno y la producción de gases
siguiente: nocivos. Los metales pesados
H 2 O + CO 2 → H 2 CO 3 y otros materiales orgánicos tóxicos como compuestos
H 2 CO 3 + Ca 2+ → CaCO 3 + CO 2 + H 2 O clorados en
1.13.6 Tratamiento de aguas residuales mediante Los efluentes de la industria del papel tienen efectos
microorganismos adversos sobre la flora acuática.
Las aguas residuales se definen como las aguas residuales y fauna.
resultantes de las diversas • Los altos niveles de nitrógeno y fósforo provocan
actividades, agricultura e industrias y contiene eutrofización.
principalmente orgánicos e inorgánicos que conduce al crecimiento indeseable de algas y la muerte
compuestos, sustancias tóxicas, metales pesados y de animales debido a
organismos patógenos. La falta de oxígeno.
Las aguas residuales se tratan para deshacerse de estas Se están utilizando técnicas biotecnológicas para abordar
sustancias indeseables sometiendo la algunos de estos
materia orgánica a la biodegradación por problemas. El tratamiento biológico de efluentes se utiliza
microorganismos. La biodegradación desde hace bastante
implica la degradación de la materia orgánica a moléculas en algún momento en muchos países del mundo. Sin
más pequeñas (CO 2 , NH 3 , embargo, algunos
PO 4 , etc.) y requiere un suministro constante de oxígeno. El Los problemas relacionados con el tratamiento convencional
proceso de suministro se resuelven utilizando
el oxígeno es caro, tedioso y requiere mucha experiencia y biotecnología. Entre las sustancias liberadas en los efluentes
mano de obra. se encuentran los calcitrantes que
Estos problemas se superan mediante el cultivo de no se puede degradar utilizando métodos de tratamiento
microalgas en los estanques y convencionales. Biotecnología
tanques donde se realiza el tratamiento de aguas ayuda a superar este problema.
residuales. Las algas liberan el O 2 mientras • En EE. UU., La empresa BioTechnica utiliza la degradación
llevar a cabo la fotosíntesis que asegura un suministro de la lignina para
continuo de oxígeno para tratamiento de sustancias como bifenilos policlorados (PCB)
biodegradación. y
Las algas también son capaces de adsorber ciertos metales dioxina.
pesados tóxicos debido a • En Europa, ICI y Ciba-Geigy están trabajando en la
las cargas negativas en la superficie de las células de las algas desintoxicación enzimática.
que pueden absorber positivamente (descomposición) de sustancias como los cianuros y también
metales cargados. El tratamiento de las aguas residuales con los subproductos
algas también favorece el crecimiento de los peces, ya que productos de la síntesis de herbicidas S-triazina.
Las algas son una buena fuente de alimento para los Transformación microbiana de determinadas sustancias
peces. Las algas utilizadas para el tratamiento de aguas como los dibenzofuranos,
residuales biarilcetonas, bibenzodioxinas halogenadas, etc., se utilizan
son Chlorella, Euglene, Chlamydomnas, Scenedesmus, para minimizar la
Ulothrix, Thribonima, etc. Problema de contaminación por vertidos tóxicos.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de • Por ejemplo, se han aislado ciertas cepas
http://ebookcentral.proquest.com de Pseudomonas que selectivamente
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. desoxigenar las posiciones 1,2 de biaréteres sustituidos y
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados biarilcetonas.
todos los derechos. - Degradación microbiana de cloro-, dicloro- y carbontetra-
También se está intentando solucionar el problema con
Página 21 cloruro, etc.
Introducción a la biotecnología ambiental - Las industrias de papel y celulosa liberan efluentes que
1,21 contienen
1.13.7 Tratamiento de efluentes industriales mediante compuestos cromofóricos y materiales orgánicos clorados
biotecnología como
• Los efluentes industriales deben ser tratados cloroligninas, clorosiringoles, cloroalifáticos, catecoles, etc.
adecuadamente para controlar que
la contaminación ambiental. Puede afectar al sistema acuático por sus propiedades
• El efluente industrial a menudo contiene materiales inhibitorias y mutagénicas.
tóxicos como en suspensión ocupaciones.
- Ciertos hongos que habitan en el suelo, estreptomicetos , nitrógeno, fósforo, etc., mediante el suministro de
bacterias y bacterias blancas cosustratos, por ejemplo, metano
hongos de la pudrición ( Ganoderma lacidum , Coriolus que puede degradar el tricloroetileno, o mediante la adición
(Trametes) versicolor , P. de tensioactivos a
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de dispersar los compuestos hidrofóbicos en agua.
http://ebookcentral.proquest.com • Bioaumentación: Adición de microorganismos específicos
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. al
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados el suelo contaminado constituye bioaumentación. Algunos
todos los derechos. de los contaminantes
como policlorobifenilos (PCB), trinitrotolueno (TNT),
Página 22 poliaromático
1,22 los hidrocarburos (HAP), etc.no se degradan solo por el suelo
Biotecnología ambiental nativo
chrysosporium , Coprinus macrorhizus, microorganismos por lo que una combinación de
Hericiumerinaceus, etc. microorganismos; denominado
han sido estudiados por su capacidad para decolorar “Consorcio” o “cóctel” de microorganismos; se agrega para
sustratos cromofóricos. lograr
Los hongos de pudrición blanca producen una variedad de bioaumentación.
enzimas que degradan la lignina • Bioventing: Bioventing implica la biodegradación aeróbica
(por ejemplo, peroxidasas y lacasas) que degradan de contaminantes.
sustancias fenólicas. haciendo circular el aire a través de las subsuperficies del
1.13.8 Uso de biotecnología para la recuperación de sitios suelo y es uno de los
tóxicos técnica rentable y eficiente utilizada para la biorremediación
Generalmente, incineración (secado y luego quemado a de
cenizas en el horno) o suelos contaminados con petróleo. Se utiliza muy
Se utilizan tratamientos químicos para eliminar las toxinas y eficazmente para la degradación.
los desechos de los desechos. de parafinas solubles e hidrocarburos poliaromáticos.
sitios de disposición. Últimamente, las técnicas • Fitorremediación: La biorremediación mediante el uso de
biotecnológicas que implican la biodegradación plantas se denomina
como un enfoque alternativo que se está fitorremediación. Ciertas especies de plantas que tienen la
utilizando. Empresas como BioTechnica son capacidad de
trabajando en el tratamiento del sitio contaminado in Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
situ . Sin embargo, hay mucho debate http://ebookcentral.proquest.com
sobre la cuestión de la liberación de microbios modificados Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
genéticamente para Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados
el tratamiento de sitios tóxicos y el riesgo que implica todo todos los derechos.
el procedimiento. Como nosotros
saber que, los organismos modificados liberados que tienen Página 23
capacidad para reproducirse, Introducción a la biotecnología ambiental
propagarse a sitios distintos a los sitios de liberación inicial y 1,23
puede sufrir mutaciones. estimular la biodegradación de contaminantes
Todo esto puede conllevar el riesgo de desarrollar lo que se (especialmente cerca del suelo adyacente
describen como “super bugs”. a las raíces-rizosfera) se cultivan cerca de los sitios de suelo
Algunas de las empresas de EE. UU. Están experimentando y contaminado. Esto
realizando su trabajo es un proceso económico y respetuoso con el medio
en los reactores cerrados con el fin de evaluar más a fondo ambiente, pero lleva mucho tiempo
la evaluación de riesgos y el costo para finalizar el proceso de limpieza.
eficacia de este enfoque. • Agricultura de la tierra: la agricultura de la tierra es una
Con el fin de solucionar el problema de la contaminación del técnica para la biorremediación de
suelo provocada por extensas suelos contaminados con hidrocarburos. En esto, el suelo se
uso de herbicidas, pesticidas e insecticidas, biorremediación excava, se mezcla
del suelo utilizando con microorganismos y nutrientes y se extienden sobre un
se están llevando a cabo microorganismos. Los revestimiento solo
contaminantes más comunes son: debajo del suelo contaminado.
hidrocarburos, disolventes clorados, policlorobifenilos y • Uso de biorreactores en fase de lechada: en este proceso,
metales. La el excavado contaminado
La biorremediación del suelo implica: el suelo se somete a biorremediación en condiciones
• Bioestimulación: la bioestimulación implica la óptimas y controladas
estimulación de microorganismos en biorreactores específicamente diseñados.
ya presente en el suelo. Esto se puede hacer agregando Bacterias manipuladas utilizadas para la degradación de
nutrientes, p. Ej. xenobióticos y desechos tóxicos
Bacteria
Sustrato que se puede degradar
Pseudomonas capacia
Ácido 2,4,5-tricloro-fenoxiacético
P. putida y otras spp. (también E. coli )
2,2,5-dicloropropionato; mono y
dicloroaromáticos
Alcaligenes sp.
Ácido diclorofenoxiacético, mezclado
clorofenoles; 1,4-diclorobenceno
Acinetobacter sp.
4-clorobenceno
Pseudomonas capacia
Ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético
1.13.9 Uso de biotecnología en la eliminación de aceite y
grasa
depósitos
• Los derrames de petróleo de los petroleros en la superficie
terrestre, así como en los mares y
Los océanos son un gran peligro para el medio
ambiente. Esto no solo mata al
la flora y fauna acuáticas al destruir el hábitat pero también
crea salud
problemas para los habitantes locales.
• Tradicionalmente, los dispersantes químicos se utilizan
como remediación.
esfuerzos. Sin embargo, estos dispersantes químicos
también son de naturaleza tóxica.
y persisten en el medio ambiente durante mucho tiempo.
• Las técnicas actuales de lavado del aceite de la grava y
limpieza.
el área de los derrames de petróleo, es muy costosa y
requiere mucho tiempo.
• Para superar algunos de estos problemas, los fertilizantes
oleofílicos
se están desarrollando que permiten un rápido crecimiento
y multiplicación de
microbios que además conduce al aumento de la
biodegradación
proceso de remoción de aceite.
• En los últimos años, utilizando ingeniería genética, aceite
utilizando microorganismos
Se han producido que pueden crecer rápidamente en aceite.
• Los microbios modificados genéticamente para limpiar los
derrames de petróleo se mezclan con paja. En el lugar del
derrame de petróleo, la paja mezclada con microbios se
esparcidos sobre el área derramada de petróleo.
CAPÍTULO entornos (tierra, aire y agua) y para
La palabra "medio ambiente" se deriva de la procesos respetuosos con el medio
palabra francesa "medio ambiente". La ambiente
El significado de la palabra francesa está (tecnologías de fabricación ecológicas y
relacionado de alguna manera con desarrollo sostenible). También puede
"abarcar", "rodear", describirse como '' el uso óptimo de la
etc. Se cree que fue introducido en el tema naturaleza, en forma de plantas, animales,
por el biólogo Jacob bacterias, hongos y algas, para producir
Van Erkulin a principios del siglo XX y el energía renovable, alimentos y nutrientes
término "medio ambiente" se define como en
nuestro entorno, que incluye el un ciclo integrado sinérgico de procesos
componente abiótico (los no vivos) lucrativos donde el desperdicio de
y el componente biótico (lo vivo) que nos cada proceso se convierte en materia prima
rodea. El ambiente abiótico para otro proceso ''.
incluye agua, aire y suelo, mientras que el El objetivo principal de esta ciencia es la
entorno biótico se compone de todos los reducción de la contaminación mediante
seres vivos. biorremedación / biotratamiento o apoyo
organismos: plantas, animales y como recursos para uso humano
microorganismos. El medio ambiente es Buddolla, V. (2016). Biotecnología
muy ambiental :. Obtenido de
componente importante necesario para la http://ebookcentral.proquest.com
existencia de seres humanos y otros Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
organismos bióticos. Contrariamente a su Copyright © 2016. Alpha Science
nombre, la biotecnología no es una International. Reservados todos los
tecnología única. derechos.
Más bien, es un grupo de tecnologías que
comparten dos características (comunes) Página 2
trabajar con células vivas y sus moléculas y 1.2
tener una amplia gama de Biotecnología ambiental
Usos prácticos que pueden mejorar de forma no contaminante. También puede
nuestras vidas. La biotecnología se puede ayudar a una producción más limpia de
definir ampliamente productos. En general, abarca aspectos de
como "utilizar organismos o sus productos los recursos naturales.
con fines comerciales". Producción gestión, tratamiento de residuos y control
puede llevarse a cabo utilizando organismos de la contaminación. Por lo tanto, el mayor
intactos de bacterias, hongos y otros áreas de conocimiento son la reducción de
microbios, o mediante el uso de sustancias la contaminación ambiental a través de
naturales creadas por los organismos, como biodegradación, biotransformación,
enzimas. La biotecnología ambiental es “la bioacumulación de toxicidad como
integración de las ciencias naturales orgánicos,
e ingeniería para lograr la aplicación de metales, aceite e hidrocarburos, tintes,
organismos, células, partes detergentes, etc .; Manejo de energía
del mismo y análogos moleculares para la mediante la producción de energía no
protección y restauración de la convencional no contaminante como el
calidad de nuestro medio ambiente ”. La biodiésel
Sociedad Internacional para el Medio metanol, biogás, biohidrógeno, etc
Ambiente .; Aplicación agrícola de biofertilizantes,
La biotecnología define la biotecnología bioplaguicidas o bioorgánicos de múltiples
ambiental como el desarrollo, usuarios. Recuperación de recursos de
uso y regulación de sistemas biológicos para desechos tóxicos o no tóxicos mediante un
la remediación de contaminantes enfoque biotecnológico; Biosensor
enfoque de la vigilancia de la contaminación Los microbios pueden crear nuevos nichos
y varias otras cuestiones conexas. ecológicos y producir a gran escala
Las biotecnologías ambientales compiten transformaciones en la estructura y función
con gran éxito contra del ecosistema en su conjunto.
tecnologías tradicionales en los últimos días Hay muchos riesgos y peligros desconocidos
y están brindando soluciones a asociados con el accidente o
problemas a través de las llamadas liberación deliberada de formas novedosas
tecnologías de tratamiento de 'final de de autopropagación, manipuladas
tubería' y genéticamente
biorremediación. La biotecnología vida en la biosfera. En caso de
ambiental también puede proporcionar una consecuencias desastrosas, es probable que
forma natural Las personas que se beneficiarán poco del
de abordar principalmente problemas uso de la biotecnología se verán
ambientales que van desde la identificación perjudicadas. En
de los peligros biológicos a las técnicas de En los últimos años, un desarrollo
biorremediación para aplicaciones considerable en términos de I + D y su
industriales, agrícolas y aplicación.
fines domésticos como efluentes y residuos sobre “Biotecnología ambiental” se realiza
municipales. Por lo tanto, el uso ambiental en todo el mundo. Las áreas principales
de la biotecnología incluye el desarrollo, uso de aplicación son la biodegradación
de bioseguridad y regulación de microbiana de contaminantes, el desarrollo
sistemas biológicos para la remediación de de
ambientes contaminados como la tierra, tecnología apropiada para la producción de
agua, aire, así como para su uso en procesos biofertilizantes y bioplaguicidas y
ambientalmente racionales que conducen a su uso en el campo de la agricultura y la
tecnologías limpias y desarrollo horticultura; producción de una sola célula
sostenible. Prácticamente, todos los tipos proteína, etc. Se produjo una discusión
de humanos considerable en reconocimiento y apoyo
Las actividades generan desechos y esto Buddolla, V. (2016). Biotecnología
supone una gran carga para el medio ambiental :. Obtenido de
ambiente. http://ebookcentral.proquest.com
Hasta ahora, nos hemos basado más en los Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
métodos físicos y químicos de Copyright © 2016. Alpha Science
control de polución. Sin embargo, es International. Reservados todos los
probable que los microorganismos resulten derechos.
más
herramientas adecuadas para el control de Página 3
la contaminación por su versatilidad y Introducción a la biotecnología ambiental
adaptabilidad. 1.3
En el campo de la gestión ambiental, la del tremendo potencial que ofrece la
biotecnología ha ayudado a biotecnología ambiental
monitoreo ambiental, degradación de particularmente en el desarrollo de la
desechos, sustitución de próxima generación de prevención de la
base de recursos renovables con uno contaminación,
renovable y producción de eco-amigables reducción de la contaminación y desarrollo
productos y procesos. sostenible de tecnologías ecológicas. La
La aplicación de biotecnologías está El surgimiento y aceptación del concepto de
amenazada por riesgos que son difíciles desarrollo sostenible justifica
definir, mucho menos evaluar. La que se amplíe el alcance de la biotecnología
introducción de genéticamente ambiental para abordar cuestiones
modificados
como monitoreo ambiental, restauración puede definirse como un cambio indeseable
de la calidad ambiental, recurso / en las condiciones físicas, químicas o
residuos / recuperación / aprovechamiento biológicas
/ tratamiento de residuos, y sustitución de características del aire, el agua y la tierra
los que pueden dañar la vida humana, la vida
base de recursos renovables con recursos de
renovables. especies deseables, nuestros procesos
1.1 BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEDIO industriales, condiciones de vida y
AMBIENTE culturales
El crecimiento industrial, el desarrollo activos; o desperdiciar nuestros recursos de
económico y la consumación indican una materia prima. Medios de protección del
el progreso del país y el nivel de vida de sus medio ambiente
individuos. Crecimiento industrial en el limitar el deterioro del medio ambiente e
El siglo XX también ha traído consigo nuevos incluye la conservación de
problemas. La contaminación del agua, recursos. La 'protección del medio
contaminación del aire, contaminación de la ambiente' tiene tres objetivos principales:
tierra, contaminación acústica, • Para evitar daños y molestias;
contaminación radiactiva, sólido • Mejorar la productividad y el placer; y
desechos, agotamiento de recursos, escasez • Mantener los equilibrios del ecosistema.
de agua de buena calidad, proliferación Los esfuerzos de protección del medio
peligros para la salud, son todos resultados ambiente nos compensarán en términos de
o consecuencias de estupendos efectos dinero,
industriales economía, productividad, justicia social,
actividades con menos atención a sus entornos más limpios y buena salud.
impactos negativos en los seres humanos y Los problemas ambientales difieren solo un
el poco con respecto a un país; entonces
ambiente. Los mecanismos incorporados de los problemas enfrentados en otros lugares
la naturaleza y la capacidad de y los controles aplicados son igualmente
autorregulación han aplicables.
ha sido desequilibrado por la cantidad y Conciencia, participación y acción de
complejidad de los desechos generados manera concertada por todos los que están
por la sociedad moderna. En términos Será necesario estar conectado para
económicos, solo consideramos los costos resolver los problemas de
de material contaminación. 'Ambiental
y los costos de energía involucrados y no Biotecnología '' implica aplicaciones
prestan atención a los costos involucrados específicas de la biotecnología a la
en gestión del medio ambiente y aspectos
la forma de pérdida de la calidad socioeconómicos y de desarrollo
ambiental. Urbanización, agricultura relacionados
incorrecta Buddolla, V. (2016). Biotecnología
prácticas, etc .; son responsables de la ambiental :. Obtenido de
contaminación. A medida que el progreso http://ebookcentral.proquest.com
tecnológico ha Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
Después de la revolución industrial, la Copyright © 2016. Alpha Science
solución del problema medioambiental International. Reservados todos los
debe derechos.
seguir el progreso tecnológico. Procesos
industriales y productos derivados, Página 4
ambos deben ser respetuosos con el medio 1.4
ambiente y menos dañinos. Contaminación Biotecnología ambiental
cuestiones, teniendo en cuenta el concepto Aunque muchas tecnologías han estado
de desarrollo sostenible. 'Ambiental disponibles para fines de limpieza,
la biotecnología engloba cuestiones como: sólo se ha demostrado que algunos de ellos
• Monitoreo ambiental; tienen un valor de aplicación de rutina. En
• Restauración de la calidad ambiental; 1989, la Agencia de Protección Ambiental
• Recurso / residuos / recuperación de de EE. UU. Publicó una amplia evaluación
desechos / utilización / tratamiento por de tecnologías internacionales (en
aplicación particular las de Europa, Canadá y
de la tecnología de r- ADN; Japón) para la remediación de los sitios del
• Sustitución de recursos no renovables por superfondo. Los criterios utilizados por ellos
renovables; para
• Mejora de la deformación por La evaluación se aplica en general también
degradación de contaminantes altamente al evaluar diferentes tecnologías para
tóxicos con el propósito de la reducción de la
producción de productos químicos; contaminación. Los criterios son:
• Cambios globales; (i) Función: objeto y aplicabilidad de la
• Diversidad biológica; y tecnología;
• Gestión de riesgos. (ii) Descripción: detalles de los principios
La gestión de la contaminación industrial es, operativos y características de diseño;
por tanto, una de las muchas cuestiones (iii) Desempeño: demostración de
a los que se dirige la biotecnología efectividad;
ambiental. Durante mucho tiempo, el punto (iv) Limitaciones;
de (v) Economía; y
La discusión sobre la contaminación (vi) Estado de la investigación, el desarrollo
ambiental como un problema ha sido y la disponibilidad.
síntomas más bien Buddolla, V. (2016). Biotecnología
que las causas de la contaminación. Esto ambiental :. Obtenido de
naturalmente influyó en nuestro http://ebookcentral.proquest.com
pensamiento y énfasis Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
se dio sobre medición y remoción Copyright © 2016. Alpha Science
(tecnologías de tratamiento). Luego International. Reservados todos los
lentamente derechos.
se prestó atención a la Evaluación de
Impacto Ambiental (EIA) Página 5
y esto podría contribuir a una mejor Introducción a la biotecnología ambiental
planificación y a la posibilidad de un mejor 1,5
control. Además de los puntos mencionados
Y hoy, hemos comenzado a atacar la raíz de anteriormente, la elección de la tecnología
la contaminación. Tenemos es
comenzó a discutir sobre lo que se describe también influenciado por las
como 'tecnologías limpias' que creen en consideraciones sociales, políticas y
desarrollo de procesos y modificaciones geográficas. La
para minimizar la contaminación. Los criterios se aplican a la evaluación de
Los puntos útiles en la gestión eficaz de la tecnologías en otras áreas de limpieza
contaminación son: ambiental.
(a) Tratamiento en proceso. trabajo también.
(b) Tratamiento al final de la tubería. 1.2 BIOTECNOLOGÍA, AGRICULTURA Y
(c) Remediación de sitios contaminados. MEDIO AMBIENTE
(d) Modificación de procesos existentes. CONTAMINACIÓN
(e) Introducción de nuevos procesos y La agricultura es el uso de recursos
productos. naturales base para la mejora y
aumento de la producción de cultivos, rápido crecimiento de la población,
ganado, pesca y árboles. En Agrícola protección del medio ambiente, suelos
biotecnología, se acelera la mejora y se pobres, estrés
incrementa la producción ambientes, condiciones climáticas
utilizando conocimientos actualizados de desfavorables y cultivos mejorados y
los organismos vivos, incluido el código ganado. Por ejemplo, un entorno en el que
genético. la contaminación de un tipo particular
Estos incluyen técnicas convencionales bien es máximo. Los efluentes de una industria
establecidas como en plagas biológicas del almidón se mezclan con un agua local.
control, fermentación y producción de cuerpo como un lago o estanque. Estos
vacunas y biofertilizantes así provocan enormes depósitos de almidón
como técnicas modernas como el cultivo de que no se
tejidos, la ingeniería genética (también fácilmente degradado por microorganismos
llamada salvo algunas excepciones. Mediante
modificación genética), tecnología de ADN ingeniería genética, se aislaron algunos
recombinante (ADNr) y cultivos y microorganismos de los contaminantes
transformación animal como resultado de la sitio y escaneado en busca de cambios
transgénesis. La importancia de estos significativos en su genoma como
nuevos evoluciones o
tecnologías como la biotecnología en mutaciones. Luego se identificaron los
seguridad alimentaria, sostenibilidad genes modificados porque el aislado
ambiental se han adaptado para utilizar / degradar el
y el desarrollo económico fue capturado en almidón mejor que otros microbios de
el General de las Naciones Unidas el mismo género. Como resultado, los genes
Montaje en 2005. resultantes se clonan industrialmente
Explosión industrial global que está microorganismos importantes, que se
destinada a satisfacer las necesidades de utilizan para fines económicos
la creciente población mundial siempre está procesos como la fermentación, y también
asociada con el medio ambiente se puede aplicar en productos
contaminación. La contaminación se farmacéuticos
produce como resultado de una gestión Industrias.
inadecuada de los Buddolla, V. (2016). Biotecnología
subproductos, su acumulación en el medio ambiental :. Obtenido de
ambiente más allá de los límites aceptables http://ebookcentral.proquest.com
y por lo tanto, causa peligro y / o molestia al Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
hombre. El industrial by- Copyright © 2016. Alpha Science
los productos que son contaminantes International. Reservados todos los
pueden ser compuestos orgánicos o derechos.
inorgánicos.
El entorno del hombre está compuesto por Página 6
componentes abióticos y 1,6
bióticos. Desarrollando Biotecnología ambiental
Los países se enfrentan al desafío de Otro estudio de caso es la incidencia de
aumentar rápidamente la agricultura derrames de petróleo en los océanos, que
productividad para ayudar a alimentar a sus requieren limpieza; microbios aislados de
poblaciones en crecimiento sin agotar entornos ricos en aceite como la
la base de recursos naturales. En muchos transferencia de aceite
países, la agricultura aún subsiste oleoductos; Se ha descubierto que los pozos
y primitivo y esto suscita preocupaciones de petróleo, etc., tienen el potencial de
sobre la seguridad alimentaria, la degradar
deforestación,
o utilizarlo como fuente de energía y así El contenido de nutrientes de los desechos
servir como remedio a los derrames de los hace atractivos como fertilizantes,
petróleo. Todavía aplicación a la tierra
otro caso de estudio es el de los microbios de muchos desechos industriales y aguas
aislados de suelos ricos en plaguicidas. residuales se ve limitado por la presencia de
Estos microbios tienen el potencial de metales, productos químicos orgánicos
utilizar los pesticidas como fuente de peligrosos, sales y pH extremo.
energía. Contaminación del medio ambiente por
y así cuando se mezclan con biofertilizantes, metales pesados, incluso en niveles bajos, y
servirían como un buen su
seguros contra el aumento de los niveles de Los efectos acumulativos a largo plazo
toxicidad de los plaguicidas en los procesos resultantes en la salud se encuentran entre
agrícolas. los principales
Sin embargo, hay argumentos en contra de preocupaciones en todo el mundo. Por
que el recién introducido ejemplo, la bioacumulación de plomo (Pb)
Los microorganismos utilizados para la en
limpieza de derrames de hidrocarburos El cuerpo humano interfiere con el
podrían crear un desequilibrio en funcionamiento de las mitocondrias, lo que
el medio natural afectado. También existe perjudica
la preocupación de que la mutua respiración, y también causa estreñimiento,
armonía en la que los organismos que hinchazón del cerebro, parálisis y
existen en ese entorno particular pueden muerte eventual. Este problema es aún más
ser alterado y se debe tener extrema pronunciado en el desarrollo
precaución para no perturbar el mutuo países donde los esfuerzos de investigación
relaciones que ya están establecidas en ese para monitorear el medio ambiente han
entorno al que estos no ha recibido la atención deseada por las
Se introducen microorganismos recién partes interesadas. Metales pesados
descubiertos y clonados. Esto lleva La concentración en el medio ambiente no
a una sugerencia de que las consecuencias puede atribuirse a factores geológicos.
ambientales positivas y negativas solo, ya que las actividades humanas
de la biotecnología ambiental y agrícola modifican considerablemente la
debe ser rápidamente composición mineral
dirigido. de suelos, cultivos y agua. El reciente
1.3 DESAFÍOS IMPUESTOS AL MEDIO crecimiento demográfico e industrial ha
AMBIENTE POR LOS HUMANOS llevado
OCUPACIONES al aumento de la producción de residuos
Las actividades humanas constituyen uno domésticos, municipales e industriales, que
de los principales medios de introducción son arrojados indiscriminadamente a
de pesados vertederos y cuerpos de agua sin
metales en el medio ambiente. Uno de los tratamiento.
principales desafíos del desarrollo Buddolla, V. (2016). Biotecnología
que afrontar esta década es cómo lograr ambiental :. Obtenido de
una solución rentable y ecológica http://ebookcentral.proquest.com
estrategias sólidas para hacer frente a la Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
crisis mundial de residuos que enfrentan Copyright © 2016. Alpha Science
tanto los países desarrollados International. Reservados todos los
y países en desarrollo. La crisis ha derechos.
amenazado a los asimiladores y
capacidad de carga de la tierra, nuestro Página 7
sistema de soporte vital. Aunque el Introducción a la biotecnología ambiental
1,7
Los residuos urbanos contienen metales PRODUCTIVIDAD AGRÍCOLA
pesados como arsénico (As), cadmio (Cd), La biotecnología se considera un medio
Cobre (Cu), Hierro (Fe), Oro (Av), para el rápido aumento de la agricultura
Manganeso (Mn), Plomo (Pb), Níquel (Ni) producción mediante el tratamiento de las
y zinc (Zn) que terminan en el suelo como limitaciones de producción de pequeña
sumidero cuando se lixivian escala o
de los vertederos. El suelo es un recurso agricultores de escasos recursos que
vital para sustentar dos necesidades aportan más del 70% de los alimentos
humanas de producidos
suministro de alimentos de calidad y medio países en desarrollo. La biotecnología es
ambiente de calidad. Plantas cultivadas en aplicable a todas las áreas y campos.
una tierra contaminada de los esfuerzos humanos. La biotecnología
con residuos municipales, domésticos o agrícola tiene el potencial de
industriales puede absorber metales abordar algunos de los problemas de los
pesados en el países en desarrollo como la inseguridad
forma de iones móviles presentes en la alimentaria;
solución del suelo a través de sus raíces o a condiciones ambientales y climáticas
través de desfavorables, etc. y mejorar
absorción foliar. Estos metales absorbidos productividad agrícola. La biotecnología
se bioacumulan en las raíces, agrícola ha proporcionado a los animales
tallos, frutos, granos y hojas de plantas. Se agricultura con vacunas más seguras y
sabe que las plantas absorben y eficaces contra la pseudo rabia, entérico
acumulan metales pesados de suelos colibacilosis y fiebre aftosa (FA).
contaminados. El consumo de tales La detección de enfermedades en cultivos y
plantas pueden ser particularmente animales es más eficiente y rápida.
peligrosas porque los metales acumulados hecho usando sondas de ADN. La
en biotecnología actúa como una herramienta
Las plantas comestibles pueden terminar en clave para el avance
la cadena alimentaria humana con los en investigación médica y veterinaria. Los
efectos adversos concomitantes. cultivos ahora son genéticamente
efectos sobre la salud humana y modificado para resistencia a insectos y
animal. Una prometedora y rentable plagas, maduración retardada, tolerancia a
basada en plantas herbicidas
La tecnología para la limpieza de la y máxima producción en entornos
contaminación por metales pesados es la estresados. Mapeo molecular de
fitorremediación. cultivos y animales de granja ha reducido
La fitorremediación ha llamado la atención notablemente el tiempo de reproducción y
en los últimos años debido a la baja mejorado
costo de implementación y es comprensión y manipulación de genes por
particularmente atractivo en los trópicos, parte del hombre. La nutrición es una de las
donde más
las condiciones climáticas normales graves limitaciones a la producción
favorecen el crecimiento de las plantas y la ganadera en los países en
actividad microbiana. Plantas desarrollo. Plantas
que brotan y crecen en suelos cargados de generalmente contienen anti-nutrientes
metales son tolerantes a la contaminación adquiridos de fertilizantes, pesticidas y
por metales en varios productos químicos
suelo y son 'candidatos' para estrategias de naturales. Algunos de estos productos
remediación y manejo de pesados químicos se conocen como
suelos contaminados con metales. Buddolla, V. (2016). Biotecnología
1.4 CONTRIBUCIONES DE LA ambiental :. Obtenido de
BIOTECNOLOGÍA PARA MEJORAR http://ebookcentral.proquest.com
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. venenos vegetales o inactivación de
Copyright © 2016. Alpha Science factores antinutricionales. Introducción
International. Reservados todos los exitosa
derechos. de un inóculo de rumen caprino obtenido
en Hawai en el rumen bovino
Página 8 en Australia desintoxicaron 3 hidroxi 4 (IH)
1.8 piridina (3,4 DHP), un desglose
Biotecnología ambiental producto del aminoácido no proteico
metabolitos secundarios y se ha mimosina que se encuentra en el forraje de
demostrado que son altamente Leucaena.
biológicamente En la producción animal, las técnicas
activo. Ejemplos de estos metabolitos biotecnológicas aplicadas incluyen la
secundarios de las plantas son saponinas, clonación de genes,
taninos, transferencia de embriones, inseminación
flavonoides, alcaloides, oxalatos, fitatos, artificial, modificación de la leche, etc. En
inhibidores de tripsina (proteasa), animales
glucósidos cianogénicos, etc. Se ha salud, se utilizan técnicas biotecnológicas
demostrado que algunos de estos para el diagnóstico rápido y preciso
productos químicos son y tratamiento de enfermedades. Terapia
perjudicial para la salud o evidentemente génica, producción de vacunas, producción
ventajoso para la salud humana y animal de productos farmacéuticos
si se consume en cantidades recombinantes, etc. son ejemplos. La
adecuadas. Estos factores antinutricionales biotecnología puede ayudar
afectan la promover la agricultura y el medio
valor nutricional global de los alimentos ambiente sostenibles y seguros,
para humanos y animales. Algunos de estos respectivamente,
Los componentes de la planta tienen el globalmente de dos formas:
potencial de precipitar efectos adversos en 1. Al aumentar la producción de alimentos
el dentro de la superficie de tierra existente
productividad de la ganadería. Los métodos bajo arado,
convencionales de fitomejoramiento han haciendo innecesario el uso de tierras
sido marginales o ambientalmente
utilizado para reducir y, en algunos casos, métodos y áreas sensibles. Esto conduce a
eliminar dichos factores antinutritivos la conservación de los recursos biológicos.
(ANF). evitando así la erosión del suelo.
Un ejemplo es la introducción de cultivares 2. Uso de cultivos respetuosos con el medio
de colza, que son bajos en o ambiente, como herbicidas resistentes a los
libre de ácido erúcico y glucosinolatos. Una insectos
combinación de ingeniería genética especies tolerantes, así como cultivos que
y los métodos convencionales de pueden fijar nitrógeno y conducir a
fitomejoramiento podrían conducir a una depuración del medio ambiente.
reducción sustancial En consecuencia, menos productos
o eliminación de los principales factores químicos como pesticidas, herbicidas y
antinutritivos en especies vegetales de sintéticos
importancia en Se utilizan fertilizantes nitrogenados. La
alimentos para animales. biotecnología agrícola ha sido durante
Los microbios transgénicos del rumen mucho tiempo un
también podrían desempeñar un papel en la fuente de innovación en la producción y
desintoxicación de procesamiento de productos agrícolas
y tiene un impacto profundo en el sector
ganadero. A nivel mundial, si el hambre y
la desnutrición debe reducirse fertilizantes. Se convierten en un peligro
drásticamente, la agricultura debe para el medio ambiente porque sufren
adaptarse para satisfacer degradación por microorganismos y luz
las futuras demandas del aumento de la ultravioleta que libera tóxicos
población. El aumento de la población productos químicos en el medio
humana ambiente. Utilizando biotecnología,
aumenta la demanda de tierra, espacio y pesticidas bacterianos y
recursos disponibles y primitivos Se están desarrollando pesticidas virales
Las prácticas agrícolas causan que ayudarán a reducir el uso de
desertificación, contaminación ambiental y plaguicidas químicos. Varias empresas en
produce efectos resultantes sobre el clima, USA como Monsanto, Mycogen,
los ecosistemas, los ciclos biogeoquímicos y Ecogen, Repligen, Zoecon, etc.están
Buddolla, V. (2016). Biotecnología involucrados activamente en el desarrollo
ambiental :. Obtenido de de
http://ebookcentral.proquest.com plaguicidas biológicos. Los ensayos
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. continúan utilizando los genéticamente
Copyright © 2016. Alpha Science modificados.
International. Reservados todos los bacterias vivas del suelo para recubrir las
derechos. semillas antes de plantarlas. Otro método
es
Página 9 intentado es matar las bacterias
Introducción a la biotecnología ambiental recombinantes y aplicarlas a las hojas de los
1,9 cultivos
salud humana. Prácticas agrícolas plantas. Ambos enfoques protegen la toxina
sostenibles dirigidas a mejorar de la degradación por microbios.
productividad agrícola, limpia, segura y o rayos ultravioleta una vez aplicados a las
respetuosa con el medio ambiente plantas de cultivo.
condiciones deben ser introducidas en el La empresa Ecogen Inc. participó en el
sistema agrícola global con el fin de desarrollo de pesticidas biológicos.
Reducir los efectos adversos de la contra las dos principales plagas de los
contaminación ambiental en la salud cultivos, el gusano de las yemas y el gusano
humana y de bola, transfiriendo
el clima (calentamiento global). Las nuevas un gen de Bacillus thuringiensis (Bt), en un
técnicas de la biotecnología proporcionan suelo natural
innovaciones que complementan las bacteria o en una cepa
debilidades de la agricultura convencional de Pseudomonas . Los insecticidas Bt ya
prácticas y deberían adoptarse para están siendo
aumentar la producción de alimentos. comercializados durante los últimos años y
Muchos científicos estarían de acuerdo en en el futuro se modificarán utilizando
que la biotecnología es un contribuyente ingeniería genética y se utilizará contra una
importante variedad de insectos. Genéticamente
un sistema de agricultura sostenible porque Se han producido con éxito plantas
puede producir más alimentos con menos modificadas resistentes a insectos que
impacto ambiental en comparación con la más ayuda para reducir el uso de
agricultura convencional. insecticidas en el futuro. Los experimentos
1.4.1 Biotecnología para reducir el uso de continúan desarrollando herbicidas seguros
plaguicidas químicos, para el medio ambiente. Para utilizar estos
herbicidas y fertilizantes herbicidas para programa de protección de
Se debate mucho sobre el uso excesivo de cultivos, herbicida modificado
herbicidas químicos, pesticidas y genéticamente
Se han producido plantas resistentes en una el nitrógeno. Acumulan la biomasa que
variedad de plantas de cultivo. Esta ayuda a mejorar
voluntad las propiedades físicas del suelo. Esto es útil
Garantizar el uso de herbicidas más seguros para la recuperación de
para el medio ambiente. suelos alcalinos además de proporcionar
1.4.2 Biofertilizantes tolerancia parcial a los pesticidas. La
También se están utilizando biofertilizantes las algas verdiazules más comunes
en lugar de fertilizantes químicos para son Azobacter sp. y Azospirillum sp.
promover Azolla , que es un helecho acuático contiene
Reducir los peligros ambientales causados una cynobacterium endofítica
por los fertilizantes químicos. La Anabaena azollae en las cavidades foliares
El término biofertilizantes se utiliza para proporcionando una relación simbiótica.
referirse a los aportes de nutrientes de Azolla con Anaebaena es útil como
origen biológico a biofertilizante.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología • Bacterias solubilizadoras de fosfato:
ambiental :. Obtenido de algunas bacterias como Thiobacillus,
http://ebookcentral.proquest.com Bacillus
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. son capaces de convertir el fósforo
Copyright © 2016. Alpha Science inorgánico no disponible presente
International. Reservados todos los en el suelo a forma orgánica o inorgánica de
derechos. fosfato. Estas bacterias
También puede producir sideróforos, que
Página 10 se quela con el hierro y lo convierte en
1,10 no disponible para bacterias patógenas. Los
Biotecnología ambiental sideróforos son bajos de unión al hierro
Apoyar el crecimiento de las plantas, que péptidos de peso molecular (400-1.000
generalmente se logra mediante la adición Daltons) sintetizados por algunos
de microbios. bacterias del suelo.
inoculantes como fuente de • Fertilizantes orgánicos: Ciertos tipos de
biofertilizantes. Los biofertilizantes desechos orgánicos se utilizan como
incluyen ampliamente el fertilizantes.
siguientes categorías: por ejemplo, estiércol de animales
• Fijadores simbióticos de nitrógeno: los (estiércol de vaca, estiércol de elefante,
microorganismos diazotróficos son los etc.), orina, basura urbana,
fijadores de nitrógeno simbióticos que aguas residuales, residuos de cultivos y
sirven como biofertilizantes, por tortas oleaginosas. Todos estos desechos se
ejemplo, Rhizobium sp., pueden convertir
Bradyrhizopium sp. en abonos orgánicos.
• Fijadores de nitrógeno asimbióticos: las Ventajas de usar biofertilizantes
bacterias fijadoras de nitrógeno • Los biofertilizantes mejoran la tolerancia
asimbióticas de las plantas frente a los tóxicos pesados.
puede convertir directamente el nitrógeno rieles.
gaseoso en compuestos ricos en nitrógeno. • Es posible recuperar la salinidad o
Tras la muerte de estos fijadores de alcalinidad del suelo mediante el uso de
nitrógeno, el suelo se enriquece con biofertilizantes.
compuestos nitrogenados que sirven como • El uso de biofertilizantes ayuda a controlar
biofertilizantes, por ejemplo, Azobacter la contaminación ambiental.
sp., Azospirillum sp. • La fertilidad del suelo aumenta año tras
• Las algas verdiazules, se multiplican en las año.
condiciones de anegamiento y arreglan • Bajo costo y fácil de producir.
• Los biofertilizantes aumentan las
propiedades físico-químicas del suelo, suelo
textura y capacidad de retención de agua. capacidad de retención de agua y mejora la
Algunas de las limitaciones encontradas al estructura del suelo. El estiércol animal
usar los biofertilizantes son proporciona
que por sí solos no pueden satisfacer las condiciones favorables para la microflora y
necesidades totales de las plantas para el la fauna en los suelos. Animales de pastoreo
suministro de nutrientes mejorar la cobertura del suelo dispersando
Buddolla, V. (2016). Biotecnología semillas, controlando el crecimiento de
ambiental :. Obtenido de arbustos, rompiendo
http://ebookcentral.proquest.com levanta las costras del suelo y elimina la
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. biomasa que de otro modo podría ser
Copyright © 2016. Alpha Science combustible para los arbustos
International. Reservados todos los incendios. Estas actividades estimulan la
derechos. labranza del césped y mejoran la
germinación de las semillas.
Página 11 y así mejorar la calidad de la tierra y el
Introducción a la biotecnología ambiental crecimiento de la vegetación. La producción
1,11 ganadera
y tampoco producen los resultados también permite a los agricultores distribuir
espectaculares que se observan en los nutrientes de las plantas en el tiempo y
sintéticos el espacio de forma
fertilizantes. Es importante desarrollar un de pastoreo para producir estiércol, y en la
enfoque que pueda maximizar el uso de tierra la tierra que no puede sostener la
biofertilizantes y reducir la dependencia de cosecha
los fertilizantes químicos en las producción. Esto hace que otras tierras
proximidades sean más productivas. El pastoreo de
futuro sin afectar la productividad de los ganado puede
cultivos. Esto nos ayudará a resolver el también acelerar la transformación de los
Problemas relacionados con el medio nutrientes de los subproductos de los
ambiente causados por el uso excesivo de cultivos en fertilizantes,
fertilizantes químicos. acelerando así el proceso de recuperación
1.5 BIOTECNOLOGÍA Y PRODUCCIÓN de tierras entre cultivos. Como enfermedad
GANADERA EN EL También se eliminan las limitaciones, las
MEJORA DE LAS CONDICIONES razas grandes de ganado se pueden integrar
AMBIENTALES en
El ganado recicla los nutrientes en la granja operaciones de cultivo para proporcionar
y produce una producción valiosa de la energía agrícola y abono. La biotecnología
tierra. tiene
que no es adecuado para la producción mejorado aumento de la producción animal
agrícola sostenida y proporciona energía y a través de la inseminación artificial (IA)
capital para operaciones agrícolas y también mejoró la sanidad animal y el
exitosas. El ganado también puede ayudar a control de enfermedades a través de la
mantener producción
fertilidad del suelo en suelos que carecen de de vacunas de ADN recombinante.
un contenido orgánico o de nutrientes Los cultivos mejorados mediante
adecuados. Añadiendo biotecnología están produciendo mayores
El estiércol animal en el suelo aumenta la rendimientos en todo el mundo para
capacidad de retención de nutrientes (o ayudar a alimentar a un mundo hambriento
cationes y en crecimiento.
capacidad de intercambio), mejora la 1.6 BIOTECNOLOGÍA Y ELIMINACIÓN DE
condición física del suelo aumentando su QUÍMICOS TÓXICOS
DEL MEDIO AMBIENTE
Los microorganismos han ampliado los 1.7 BIOTECNOLOGÍA Y ELIMINACIÓN DE
entornos en los que viven al evolucionar METALES PESADOS
Enzimas que les permiten metabolizar CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE
numerosas sustancias químicas artificiales. Básicamente, los metales pesados de
(es decir, xenobióticos). La biorremediación interés ambiental incluyen el mercurio,
es el uso de microorganismos o vanadio, níquel, cobalto, plomo, cadmio,
Procesos microbianos para desintoxicar y cromo, estaño, etc. Algunos dañinos
degradar contaminantes ambientales. compuestos que causan graves
Se han utilizado microorganismos para el contaminaciones ambientales y desastres
tratamiento y la transformación de rutina. como
de productos de desecho durante varias El diclorodifeniltricloroetano (DDT) y el
décadas. El lodo de película fija y activado plomo (Pb) se pueden
Los sistemas de tratamiento dependen de eliminado mediante ingeniería genética de
las actividades metabólicas de los bacterias fabricadas para
microorganismos que ese propósito. La capacidad de los
degradar los desechos que ingresan a la microorganismos para acumular metales y
instalación de tratamiento. Tratamiento de su uso potencial en la descontaminación de
residuos especializado ambientes impactados por
Buddolla, V. (2016). Biotecnología Muchos científicos han informado de
ambiental :. Obtenido de metales tóxicos. Los microorganismos
http://ebookcentral.proquest.com eliminan
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. metales tóxicos por diversos mecanismos,
Copyright © 2016. Alpha Science como la adsorción a las superficies
International. Reservados todos los celulares,
derechos. complejación de exopolisacáridos,
acumulación intracelular, biosíntesis
Pagina 12 de metalotioninas y otras proteínas que
1.12 atrapan metales y los transforman en
Biotecnología ambiental compuestos volátiles. Micrococcus
plantas que contienen poblaciones luteus y Azotobacte r sp. se ha demostrado
microbianas seleccionadas y aclimatadas se que
utilizan a menudo inmovilizar grandes cantidades de plomo de
para tratar efluentes industriales. Se ha sitios que contienen altas concentraciones
aplicado la innovación en biorremediación de sales de plomo, sin efecto detectable
a la remediación de suelos, aguas sobre la viabilidad. Uranio, cobre y
subterráneas y medios ambientales el cobalto podría eliminarse mediante
similares. células inmovilizadas con poliacrilamida
Las técnicas de biorremediación dependen de Streptomyces
de tener los microorganismos adecuados albus . Los procesos microbianos también
en el lugar correcto con las condiciones pueden mediar en la precipitación de
ambientales adecuadas para que la metales de
degradación soluciones acuosas. Ciertos productos
ocurrir. Los microorganismos adecuados extracelulares de bacterias pueden
son las bacterias y hongos que poseen la interactuar con
capacidad fisiológica y metabólica para cationes metálicos libres o absorbidos que
degradar los contaminantes. Ya, forman precipitados metálicos insolubles.
bacterias con capacidad natural para digerir El principal mecanismo involucrado en tal
ciertos productos químicos se utilizan para precipitación es a través de la
limpiar sitios industriales. Mediante la formación de sulfuro de hidrógeno y la
ingeniería genética, la biotecnología ha inmovilización de cationes metálicos como
provocó la rápida producción de bacterias. sulfuros metálicos. Ciertos hongos que
producen ácido oxálico (oxalatos) facilitan
la inmovilización de metales tales como Un ecosistema está formado por
cristales de oxalato metálico. Los microbios productores, consumidores,
pueden descomponedores y
también catalizan una variedad de detritívoros y su entorno físico, todos
transformaciones de metales, que son útiles interactuando a través de la energía
para residuos flujo y reciclaje de materiales. Una red
tratamiento. Estas transformaciones trófica es una red de cruces,
incluyen oxidación, reducción y alquilación. interconectados
reacciones. Bacterias, hongos, algas o cadenas alimentarias que involucran a
protozoos, en las reacciones de oxidación, productores primarios, consumidores y
Puede depositar iones ferrosos y descomponedores.
manganeso. Geobacter Las perturbaciones en una parte de un
metalireducens eliminar ecosistema pueden tener efectos
uranio, un residuo radiactivo, de aguas de inesperados en
drenaje en operaciones mineras y otras partes aparentemente no
de aguas subterráneas contaminadas. relacionadas. El modelado de ecosistemas
Buddolla, V. (2016). Biotecnología es un enfoque para
ambiental :. Obtenido de predecir efectos imprevistos. Con este
http://ebookcentral.proquest.com método, los investigadores identifican bits
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. cruciales
Copyright © 2016. Alpha Science de información sobre diferentes
International. Reservados todos los componentes del ecosistema. Ellos usan
derechos. computadora
programas y modelos para combinar la
Página 13 información y luego usar el resultado
Introducción a la biotecnología ambiental datos para predecir el resultado de la
1,13 próxima perturbación. Técnicas
1.8 BIOTECNOLOGÍA Y DESULFURIZACIÓN biotecnológicas
DE FÓSILES como la bioinformática son útiles en el
COMBUSTIBLES modelado de ecosistemas. Ofertas de
La eliminación de azufre inorgánico del bioinformática en
carbón está mediada por oxidación gestión de bases de datos de genes, mapeo
microbiana. de genes, codificación, alineación de
de azufre. secuencias, etc.
La oxidación directa de azufre inorgánico 1.10 BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA EN EL
por Thiobacillus sp. es una membrana SEGUIMIENTO DE
reacción unida y requiere el contacto CONTAMINACIÓN AMBIENTAL
directo del sustrato con la bacteria. Se utilizan varios parámetros microbianos
Como resultado de esto, la unión del cultivo para la detección y el seguimiento.
a la partícula de carbón es la absoluta de contaminantes, especialmente en
requisito. Cultivos mixtos y puros de una cuerpos de agua. Algunos microorganismos
variedad de microorganismos. sirven como
(bacterias heterótrofas) se puede utilizar indicadores de contaminación orgánica,
para eliminar el azufre orgánico del carbón mientras que otros sirven como indicadores
y aceite. Sin embargo, también se ha de inorgánica
informado de eliminación de azufre bajo contaminación. Algunos de los parámetros
condiciones anaeróbicas utilizados para el seguimiento de la
acción microbiana. contaminación orgánica
1.9 BIOTECNOLOGÍA Y MODELADO DE son bacterias heterótrofas, coliformes
ECOSISTEMAS totales y fecales y estreptococos fecales.
Los parámetros utilizados para monitorear sistemas y el entorno de su disposición
la contaminación inorgánica incluyen final. Como resultado, los bioensayos
nitrificación son muy necesarios para generar datos que
bacterias, bacterias oxidantes de azufre, puedan utilizarse para la predicción de
bacterias reductoras de sulfato (SRB), hierro efectos ambientales de los residuos y
bacterias, etc. La presencia de coliformes regulación de vertidos. Aunque los peces
fecales en números por encima del mundo han sido los organismos de prueba más
El estándar de la Organización de la Salud populares, organismos estándar para
(OMS) para agua portátil es indicativo de organismos acuáticos
contaminación de origen humano. Los bioensayos también incluyen
Los microorganismos heterótrofos son fitoplancton, zooplancton, moluscos,
organismos que obtienen su energía. insectos y
de la oxidación de moléculas orgánicas. Su crustáceos. El uso de microbios
presencia en gran número (especialmente bacterias) como organismo
en los sistemas acuáticos es indicativo de de bioensayo es
contaminación orgánica. La presencia de ganando amplia aceptación y ofrece una
fuentes de carbono biodegradables apoyan serie de ventajas sobre el estándar
la proliferación de heterótrofos en organismos.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología Las bacterias se manipulan fácilmente y
ambiental :. Obtenido de requieren un espacio relativamente
http://ebookcentral.proquest.com pequeño para
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. cultivo y / o análisis, en comparación con
Copyright © 2016. Alpha Science otros bioensayos. Además, el corto
International. Reservados todos los ciclo de vida significa resultados
derechos. experimentales rápidos, lo que permite al
laboratorio
Página 14 procesar más muestras. Las sencillas y
1,14 rápidas técnicas de bioensayo de bacterias
Biotecnología ambiental incluyen el ensayo de Nitrobacter, las
sistemas acuáticos. En el caso de los pruebas de Microtox, el Toxi-chromotest y
xenobióticos, las pocas especies que el
pueden degradar Prueba de Ames / Salmonella. El bioensayo
ellos pueden producir subproductos de Nitrobacter se basa en la cuantificación
durante el metabolismo que pueden ayudar de la actividad de Nitrobacter determinada
a otros midiendo el efecto tóxico en el
especies microbianas. Por lo tanto, un tasa de utilización de
recuento microbiano heterotrófico alto nitrito. Photobacterium phosphoreum es la
sugiere base de la
alto nivel de compuestos orgánicos en el Ensayo Microtox. Toxichromotest se basa
sistema acuático, mientras que el recuento en la inhibición de la beta galactosidasa.
bajo sugiere biosíntesis en E. coli o biosíntesis de
un bajo nivel de contaminación orgánica o enzimas, como triptófano y
la presencia de materia orgánica alfa-glucosidasa, bajo el control de
persistente operones (distintos del operón Lac)
dentro del sistema acuático. por contaminantes ambientales.
1.11 BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA EN EL 1.12 BIOTECNOLOGÍA Y CONTROL DE
BIOENSAYO DE DERRAMES DE HIDROCARBUROS
TOXICIDAD AMBIENTAL Los microorganismos ahora pueden
Los residuos industriales tóxicos son una modificarse genéticamente para su uso en
amenaza tanto para el tratamiento de la recuperación de petróleo,
residuos biológicos
control de la contaminación, lixiviación y los peligros del DDT, el plomo y otros
recuperación de minerales. En la industria contaminantes ambientales como los
del petróleo, desechos tóxicos
Los microorganismos también pueden a nivel mundial. Se han detectado cepas de
modificarse genéticamente para producir bacterias que pueden degradar los
productos químicos. hidrocarburos combustibles.
útil para mejorar la recuperación de diseñado y el uso de microorganismos
aceite. La limpieza de los derrames de genéticamente modificados para limpiar el
petróleo podría, en aceite
futuro, dejarse en manos de bacterias derrames o tratar aguas residuales se ha
modificadas genéticamente. En las propuesto y está en producción /
industrias mineras, fabricación.
microorganismos con la propiedad de una 1.13 BIOREMEDIACIÓN Y SU
mayor capacidad de lixiviación podrían ser IMPORTANCIA EN EL MEDIO AMBIENTE
diseñado. Los microorganismos pueden PROTECCION
unir metales a sus superficies y La biorremediación se define como 'el
concentrarse proceso de utilizar microorganismos para
ellos internamente. Como resultado de eliminar
esto, se pueden usar cepas genéticamente los contaminantes ambientales donde los
mejoradas. microbios sirven como carroñeros ”.
para recuperar metales valiosos o eliminar • La eliminación de desechos orgánicos por
metales contaminantes de una solución microbios conduce a la limpieza ambiental.
diluida arriba. Los otros nombres / términos
como en los residuos industriales. Ya se utilizados para la biorremediación son
están realizando investigaciones para biotratamiento,
mejorar la biorreclamación y biorrestauración.
Bacterias naturales que pueden 'comer • El término "Xenobióticos" (xenos significa
aceite', para su uso después de un derrame extranjero) se refiere a lo antinatural,
de petróleo. Por productos químicos extraños y sintéticos,
Buddolla, V. (2016). Biotecnología como pesticidas, herbicidas,
ambiental :. Obtenido de refrigerantes, disolventes y otros
http://ebookcentral.proquest.com compuestos orgánicos.
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. • La degradación microbiana de los
Copyright © 2016. Alpha Science xenobióticos también ayuda a reducir la
International. Reservados todos los contaminación
derechos. ambiental. Pseudomonas, que es un
microorganismo del suelo.
Página 15 degrada eficazmente los xenobióticos.
Introducción a la biotecnología ambiental • Diferentes cepas de Pseudomonas que
1,15 son capaces de desintoxicar más de
aplicando bacterias a las playas cubiertas de 100 compuestos orgánicos (por ejemplo,
aceite, las complejas moléculas de aceite fenoles, bifenilos, organofosforados,
serían naftaleno, etc.).
descompuesto en azúcares inofensivos. • También se sabe que algunas otras cepas
Muchos microorganismos pueden degradar microbianas tienen la capacidad de
varios tipos de agentes ambientales. degradan xenobióticos
contaminantes en materiales relativamente como Mycobacterium , Alcaligenes , Norcar
inofensivos antes de la muerte del micro- dia, etc.
organismos. Esta propiedad también podría 1.13.1 Factores que afectan la
utilizarse para superar los problemas biodegradación
ambientales. Los factores que inciden en la
biodegradación son:
• la naturaleza química de los xenobióticos, La biorremediación in situ implica un
• la concentración y suministro de enfoque directo para la degradación
nutrientes, microbiana
• O 2 , temperatura, pH, potencial redox y de xenobióticos en el sitio de
• la capacidad del microorganismo contaminación que podría ser suelo, agua,
individual. etc.
La naturaleza química de los xenobióticos es Se suministra una cantidad adecuada de
muy importante porque fue nutrientes esenciales en el sitio que
descubrió que la presencia de halógenos, promueve
por ejemplo, en compuestos aromáticos, el crecimiento microbiano en el sitio
inhibe mismo. La biorremediación in situ es
biodegradación. Los compuestos solubles generalmente
en agua son más fácilmente degradables. utilizado para la limpieza de derrames de
mientras que la presencia de estructura de petróleo, playas, etc. Hay dos tipos de in situ
anillo cíclico y la longitud de cadenas o biorremediación
ramas 1. Biorremediación intrínseca
Disminuir la eficiencia de la 2. Biorremediación diseñada in situ
biodegradación. Los compuestos alifáticos 1.13.2.1 Biorremediación intrínseca
son más Los microorganismos que se utilizan para la
fácilmente degradados que los aromáticos. biodegradación se prueban para la
Buddolla, V. (2016). Biotecnología capacidad natural para provocar la
ambiental :. Obtenido de biodegradación. Entonces, el metabolismo
http://ebookcentral.proquest.com inherente
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. La capacidad de los microorganismos para
Copyright © 2016. Alpha Science degradar ciertos contaminantes es la
International. Reservados todos los intrínseca
derechos. biorremediación. La capacidad de las
bacterias de la superficie para degradar una
Página 16 mezcla determinada.
1,16 de contaminantes en las aguas
Biotecnología ambiental subterráneas depende del tipo y
Bioestimulación : es un proceso mediante concentración
el cual la actividad microbiana puede ser de compuestos, aceptor de electrones y la
mejorado por un mayor suministro de duración de las bacterias expuestas a
nutrientes o por la adición de ciertos contaminación. Por lo tanto, la capacidad
estimulantes de degradación de las bacterias autóctonas
agentes como aceptores de electrones, Los contaminantes pueden determinarse en
tensioactivos, etc. laboratorio utilizando las técnicas de
Bio-aumento : es posible aumentar la estudios de microcosmos y recuento de
biodegradación a través de placas. Las condiciones del sitio que
manipulación de genes, es decir, utilizando favorecen intrínsecamente
microorganismos modificados biorremediación son el flujo de agua
genéticamente y subterránea durante todo el año, minerales
mediante el uso de una variedad de de carbonato
microorganismos en la reacción de para amortiguar la acidez producida
biodegradación. durante la biodegradación, suministro de
Dependiendo del método seguido para aceptores de electrones
limpiar el medio ambiente, y nutrientes para el crecimiento microbiano
La biorremediación se lleva a cabo de dos y ausencia de compuestos tóxicos.
formas: 1.13.2.2 Biorremediación in situ diseñada
1.13.2 En situ biorremediación Cuando el proceso de biorremediación está
diseñado para aumentar el metabolismo
eficiencia de degradación (de bajo tratamiento, la biorremediación ex
contaminantes), se llama ingeniería in situ situ se clasifica en dos:
biorremediación. Esto se hace • Sistema de fase sólida y
suministrando una cantidad suficiente de • Sistema de fase de lechada.
nutrientes. 1.13.3.1 Tratamiento en fase sólida
y suministro de oxígeno, agregando • Este sistema incluye el tratamiento de la
aceptores de electrones y manteniendo tierra y las pilas de suelo que comprenden
óptimas desechos como hojas, abonos animales,
temperatura y pH. Esto se hace para desechos agrícolas, domésticos y
superar el lento y limitado residuos industriales, lodos de depuradora
capacidad de biorremediación de y residuos sólidos municipales.
microorganismos. • La práctica tradicional de limpieza implica
Ventajas de la biorremediación in situ el procesamiento informal de
• El método asegura una exposición mínima los materiales orgánicos y la producción de
al público o al personal del sitio. compost que se pueden utilizar
• Hay una interrupción mínima o limitada como enmienda del suelo.
en el sitio de la biorremediación. • El compostaje es un microbiano
Buddolla, V. (2016). Biotecnología manejado, denso de sustrato que se
ambiental :. Obtenido de calienta espontáneamente.
http://ebookcentral.proquest.com sistema que se utiliza para tratar una gran
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29. cantidad de sólidos contaminados
Copyright © 2016. Alpha Science material.
International. Reservados todos los • El compostaje se puede hacer en sistema
derechos. abierto, es decir, en el tratamiento de la
tierra y / o en
Página 17 Sistema de tratamiento cerrado.
Introducción a la biotecnología ambiental • Los compuestos peligrosos que se informó
1,17 que desaparecen a través del compostaje.
• Debido a estos factores, es rentable. incluyen hidrocarburos alifáticos y
• Es posible el tratamiento simultáneo de aromáticos y ciertos halogenados
suelo y agua contaminados. compuestos.
Desventajas de la biorremediación in situ • Las posibles rutas que conducen a la
• Los sitios están expuestos directamente a desaparición de peligrosos
factores ambientales como la temperatura, compuestos incluyen volatilización,
suministro de oxígeno, etc. asimilación, adsorción,
• Existe la variación estacional de la polimerización y lixiviación.
actividad microbiana. 1.13.3.2 Tratamiento en fase de lechada
• Aplicación problemática de aditivos de • Este es un sistema de tratamiento trifásico
tratamiento como nutrientes, que involucra tres componentes
tensioactivos, oxígeno, etc. principales:
• Es un proceso muy tedioso y que requiere agua, material particulado en suspensión y
mucho tiempo. aire.
1.13.3 Biorremediación ex situ Buddolla, V. (2016). Biotecnología
En este, los residuos y el material tóxico se ambiental :. Obtenido de
recogen de los sitios contaminados. http://ebookcentral.proquest.com
y la gama seleccionada de microorganismos Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
llevan a cabo la biorremediación Copyright © 2016. Alpha Science
en el lugar designado. Este proceso es un International. Reservados todos los
método mejorado sobre el in situ derechos.
método de biorremediación. Sobre la base
de fases de materiales contaminados Página 18
1,18 (b) Biorremediación anaeróbica: no
Biotecnología ambiental requiere oxígeno. La
• Aquí, el agua sirve como medio de El proceso de degradación es lento pero
suspensión donde los nutrientes, trazan más rentable ya que
elementos, químicos de ajuste de pH y no se requiere suministro de oxígeno.
contaminantes desorbidos son (c) Biorremediación secuencial: Algunas de
disuelto. las degradaciones xenobióticas requieren
• El material particulado en suspensión procesos tanto aeróbicos como anaeróbicos
incluye un sustrato biológicamente inerte que de manera muy efectiva
que consiste en contaminantes y biomasa reducir la toxicidad, por ejemplo,
adherida a la matriz del suelo o libre tetraclorometano y tetracloroetano
en medio de suspensión. sufrir una degradación secuencial.
• Los materiales sólidos contaminados, los 1.13.4 Uso de ingeniería genética y
microorganismos y el agua manipulaciones genéticas para más
formulados en suspensión se introducen en biorremediación eficiente
un biorreactor, es decir, un fermentador. En los últimos años, se han realizado
• Biológicamente, hay tres tipos de esfuerzos para crear
biorreactores en fase de lechada: aireados microorganismos (GEM) para mejorar la
lagunas, reactor de transporte aéreo de biorremediación. Esto se hace para superar
bajo cizallamiento y reactor de suelo de Buddolla, V. (2016). Biotecnología
lecho fluidizado. ambiental :. Obtenido de
• Los dos primeros tipos están en uso de http://ebookcentral.proquest.com
biorremediación a gran escala, mientras Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
que Copyright © 2016. Alpha Science
el tercero está en etapa de desarrollo. International. Reservados todos los
Ventajas de la biorremediación ex situ derechos.
• Como el tiempo requerido es corto, es un
proceso más eficiente. Página 19
• Se puede controlar de una manera mucho Introducción a la biotecnología ambiental
mejor. 1,19
• El proceso se puede mejorar mediante el algunas de las limitaciones y problemas de
enriquecimiento con el deseado y más la biorremediación. Estos problemas
microorganismos eficientes. están:
Desventajas de la biorremediación ex situ • A veces, el crecimiento de
• Los sitios de contaminación permanecen microorganismos se ve inhibido o reducido
muy perturbados. por
• Una vez que se completa el proceso, la los xenobióticos.
eliminación de desechos degradados se • Ningún microorganismo natural tiene la
convierte en un capacidad de
problema importante. degradando todos los xenobióticos
• Es un proceso costoso. presentes en la contaminación ambiental.
Se producen varios tipos de reacciones • La degradación microbiana es un proceso
durante la biorremediación / microbiana. muy lento.
degradación • A veces, ciertos xenobióticos se adsorben
(a) Biorremediación aeróbica: cuando la en las partículas.
biodegradación requiere oxígeno materia del suelo y, por lo tanto, no están
(O 2 ) para la oxidación de compuestos disponibles para la degradación microbiana.
orgánicos, se llama aeróbico Como la mayoría de genes responsables de
biorremediación. Las enzimas como la síntesis de enzimas
monooxigenasas y dioxigenasas son con capacidad de biodegradación se
intervienen y actúan sobre compuestos encuentran en los plásmidos, la genética
alifáticos y aromáticos.
Las manipulaciones de plásmidos pueden calentamiento. Hay un aumento constante
conducir a la creación de nuevas cepas de en el contenido de CO 2 debido a la
bacterias. continua
con diferentes vías degradativas. En la adición de CO 2 de diversas fuentes,
década de 1970, Chakrabarty y su equipo de particularmente de procesos industriales.
colaboradores Es muy claro que la reducción de
los trabajadores informaron del desarrollo la concentración atmosférica de
de una nueva cepa de la CO 2 supone
bacteria Pseudomonas significado. Se han utilizado métodos
mediante manipulaciones de la biotecnológicos para reducir la
transferencia de plásmidos que contenido de CO 2 atmosférico en dos
denominaron "superbacterias". niveles:
Esta superbacteria tenía la capacidad de (a) Fotosíntesis: las plantas utilizan
degradar una serie de hidrocarburos de CO 2 durante la fotosíntesis, lo que reduce
petróleo simultáneamente como alcanfor, el contenido de CO 2 en la atmósfera. La
octano, xileno, naftaleno, etc. ecuación de la fotosíntesis es:
En 1980, Estados Unidos otorgó la patente a 6CO 2 + 6H 2 O → C 6 H 12 O 6 + 6O 2
esta superbacteria convirtiéndola en la Las plantas de crecimiento rápido utilizan el
primera CO 2
Microorganismo modificado genéticamente más eficientemente para
para ser patentado. fotosíntesis. Las técnicas de
En ciertos casos, se utilizó el proceso de micropropagación y sintética
transferencia de plásmidos. Por ejemplo, el Buddolla, V. (2016). Biotecnología
Se conjugó una bacteria que contenía ambiental :. Obtenido de
plásmido CAM (que degrada el alcanfor). http://ebookcentral.proquest.com
con otra bacteria con plásmido OCT Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
(degradante de octano). Debido a que no Copyright © 2016. Alpha Science
compatibilidad, estos plásmidos no pueden International. Reservados todos los
coexistir en la misma bacteria. Sin derechos.
emabargo,
debido a la presencia de regiones Página 20
homólogas de ADN, se produce la 1,20
recombinación Biotecnología ambiental
entre estos dos plásmidos que da como Las semillas deben usarse para aumentar la
resultado un solo plásmido CAM-OCT propagación de este tipo de crecimiento
dando a la bacteria la capacidad de rápido.
degradar tanto el alcanfor como el octano. plantas. Además, la utilización
1.13.5 Biotecnología para reducir el de CO 2 puede aumentarse mejorando la
dióxido de carbono (CO 2 ) atmosférico tasa de fotosíntesis. La enzima ribulosa
El dióxido de carbono es el gas que es la bifosfato carboxilasa
principal causa del efecto invernadero y (Caso RUBP) está estrechamente
aumenta relacionado con la fijación de CO 2 . Los
en la temperatura atmosférica. Durante los intentos estan siendo
últimos 100-150 años, el nivel de hecho para manipular genéticamente esta
El CO 2 ha aumentado aproximadamente enzima para que la fotosintética
un 25% con un aumento de la temperatura aumenta la eficiencia.
atmosférica. Algunas microalgas como Chlorella
en aproximadamente un 0,5%, lo que es una pyrenodiosa , Spirulina maxima son
clara indicación de que el CO 2 está conocidos
estrechamente relacionado con Ser más eficiente que las plantas superiores
en la utilización del CO 2 atmosférico .
para la fotosíntesis y generan más O 2 que tanques donde se realiza el tratamiento de
la cantidad de CO 2 aguas residuales. Las algas liberan el
consumado. O 2 mientras
El cultivo de estas microalgas cerca de las llevar a cabo la fotosíntesis que asegura un
industrias y centrales eléctricas. suministro continuo de oxígeno para
(donde la emisión de CO 2 a la atmósfera es biodegradación.
muy alta) ayudará a Las algas también son capaces de adsorber
la reducción de los efectos contaminantes ciertos metales pesados tóxicos debido a
del CO 2 . Usando ingeniería genética, las cargas negativas en la superficie de las
Se están haciendo intentos para desarrollar células de las algas que pueden absorber
nuevas cepas de estas microalgas. positivamente
que puede tolerar altas concentraciones de metales cargados. El tratamiento de las
CO 2 . Un éxito limitado ha aguas residuales con algas también
ya se ha informado en los mutantes favorece el crecimiento de los peces, ya que
de Anacystis nidulans y Oocystis Las algas son una buena fuente de alimento
sp. para los peces. Las algas utilizadas para el
(b) Calcificación biológica: ciertos tratamiento de aguas residuales
organismos de aguas profundas como los son Chlorella, Euglene, Chlamydomnas,
corales, Scenedesmus, Ulothrix, Thribonima, etc.
y las algas rojas almacenan CO 2 a través de Buddolla, V. (2016). Biotecnología
un proceso de calcificación biológica. Como ambiental :. Obtenido de
el CaCO 3 se precipita, se puede producir http://ebookcentral.proquest.com
cada vez más CO2 atmosférico Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
utilizado para su formación. El proceso de Copyright © 2016. Alpha Science
calcificación es el siguiente: International. Reservados todos los
H 2 O + CO 2 → H 2 CO 3 derechos.
H 2 CO 3 + Ca 2+ → CaCO 3 + CO 2 + H 2 O
1.13.6 Tratamiento de aguas residuales Página 21
mediante microorganismos Introducción a la biotecnología ambiental
Las aguas residuales se definen como las 1,21
aguas residuales resultantes de las diversas 1.13.7 Tratamiento de efluentes
actividades, agricultura e industrias y industriales mediante biotecnología
contiene principalmente orgánicos e • Los efluentes industriales deben ser
inorgánicos tratados adecuadamente para controlar
compuestos, sustancias tóxicas, metales la contaminación ambiental.
pesados y organismos patógenos. La • El efluente industrial a menudo contiene
Las aguas residuales se tratan para materiales tóxicos como en suspensión
deshacerse de estas sustancias indeseables sólidos y compuestos orgánicos solubles,
sometiendo la metales pesados, cianuros,
materia orgánica a la biodegradación por Materiales químicos biodegradables y
microorganismos. La biodegradación volátiles como H 2 S y SO 2 , etc.
implica la degradación de la materia • Los compuestos orgánicos solubles
orgánica a moléculas más pequeñas (CO 2 , experimentan una lenta descomposición
NH 3 , dando como resultado
PO 4 , etc.) y requiere un suministro en el agotamiento del oxígeno y la
constante de oxígeno. El proceso de producción de gases nocivos. Los metales
suministro pesados
el oxígeno es caro, tedioso y requiere y otros materiales orgánicos tóxicos como
mucha experiencia y mano de obra. compuestos clorados en
Estos problemas se superan mediante el
cultivo de microalgas en los estanques y
Los efluentes de la industria del papel También se está intentando solucionar el
tienen efectos adversos sobre la flora problema con cloruro, etc.
acuática. - Las industrias de papel y celulosa liberan
y fauna. efluentes que contienen
• Los altos niveles de nitrógeno y fósforo compuestos cromofóricos y materiales
provocan eutrofización. orgánicos clorados como
que conduce al crecimiento indeseable de cloroligninas, clorosiringoles,
algas y la muerte de animales debido a cloroalifáticos, catecoles, etc. que
falta de oxígeno. Puede afectar al sistema acuático por sus
Se están utilizando técnicas biotecnológicas propiedades inhibitorias y mutagénicas.
para abordar algunos de estos ocupaciones.
problemas. El tratamiento biológico de - Ciertos hongos que habitan en el
efluentes se utiliza desde hace bastante suelo, estreptomicetos , bacterias y
en algún momento en muchos países del bacterias blancas
mundo. Sin embargo, algunos hongos de la pudrición ( Ganoderma
Los problemas relacionados con el lacidum , Coriolus (Trametes) versicolor , P.
tratamiento convencional se resuelven Buddolla, V. (2016). Biotecnología
utilizando ambiental :. Obtenido de
biotecnología. Entre las sustancias liberadas http://ebookcentral.proquest.com
en los efluentes se encuentran los Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
calcitrantes que Copyright © 2016. Alpha Science
no se puede degradar utilizando métodos International. Reservados todos los
de tratamiento derechos.
convencionales. Biotecnología
ayuda a superar este problema. Página 22
• En EE. UU., La empresa BioTechnica utiliza 1,22
la degradación de la lignina para Biotecnología ambiental
tratamiento de sustancias como bifenilos chrysosporium , Coprinus macrorhizus,
policlorados (PCB) y Hericiumerinaceus, etc.
dioxina. han sido estudiados por su capacidad para
• En Europa, ICI y Ciba-Geigy están decolorar sustratos cromofóricos.
trabajando en la desintoxicación Los hongos de pudrición blanca producen
enzimática. una variedad de enzimas que degradan la
(descomposición) de sustancias como los lignina
cianuros y también los subproductos (por ejemplo, peroxidasas y lacasas) que
productos de la síntesis de herbicidas S- degradan sustancias fenólicas.
triazina. 1.13.8 Uso de biotecnología para la
Transformación microbiana de recuperación de sitios tóxicos
determinadas sustancias como los Generalmente, incineración (secado y luego
dibenzofuranos, quemado a cenizas en el horno) o
biarilcetonas, bibenzodioxinas Se utilizan tratamientos químicos para
halogenadas, etc., se utilizan para minimizar eliminar las toxinas y los desechos de los
la desechos.
Problema de contaminación por vertidos sitios de disposición. Últimamente, las
tóxicos. técnicas biotecnológicas que implican la
• Por ejemplo, se han aislado ciertas cepas biodegradación
de Pseudomonas que selectivamente como un enfoque alternativo que se está
desoxigenar las posiciones 1,2 de biaréteres utilizando. Empresas como BioTechnica son
sustituidos y trabajando en el tratamiento del sitio
biarilcetonas. contaminado in situ . Sin embargo, hay
- Degradación microbiana de cloro-, dicloro- mucho debate
y carbontetra-
sobre la cuestión de la liberación de microorganismos por lo que una
microbios modificados genéticamente para combinación de
el tratamiento de sitios tóxicos y el riesgo microorganismos; denominado
que implica todo el procedimiento. Como “Consorcio” o “cóctel” de
nosotros microorganismos; se agrega para lograr
saber que, los organismos modificados bioaumentación.
liberados que tienen capacidad para • Bioventing: Bioventing implica la
reproducirse, biodegradación aeróbica de contaminantes.
propagarse a sitios distintos a los sitios de haciendo circular el aire a través de las
liberación inicial y puede sufrir mutaciones. subsuperficies del suelo y es uno de los
Todo esto puede conllevar el riesgo de técnica rentable y eficiente utilizada para la
desarrollar lo que se describen como “super biorremediación de
bugs”. suelos contaminados con petróleo. Se
Algunas de las empresas de EE. UU. Están utiliza muy eficazmente para la
experimentando y realizando su trabajo degradación.
en los reactores cerrados con el fin de de parafinas solubles e hidrocarburos
evaluar más a fondo la evaluación de riesgos poliaromáticos.
y el costo • Fitorremediación: La biorremediación
eficacia de este enfoque. mediante el uso de plantas se denomina
Con el fin de solucionar el problema de la fitorremediación. Ciertas especies de
contaminación del suelo provocada por plantas que tienen la capacidad de
extensas Buddolla, V. (2016). Biotecnología
uso de herbicidas, pesticidas e insecticidas, ambiental :. Obtenido de
biorremediación del suelo utilizando http://ebookcentral.proquest.com
se están llevando a cabo Creado desde upsal el 2020-05-27 15:45:29.
microorganismos. Los contaminantes más Copyright © 2016. Alpha Science
comunes son: International. Reservados todos los
hidrocarburos, disolventes clorados, derechos.
policlorobifenilos y metales. La
La biorremediación del suelo implica: Página 23
• Bioestimulación: la bioestimulación Introducción a la biotecnología ambiental
implica la estimulación de microorganismos 1,23
ya presente en el suelo. Esto se puede hacer estimular la biodegradación de
agregando nutrientes, p. Ej. contaminantes (especialmente cerca del
nitrógeno, fósforo, etc., mediante el suelo adyacente
suministro de cosustratos, por ejemplo, a las raíces-rizosfera) se cultivan cerca de los
metano sitios de suelo contaminado. Esto
que puede degradar el tricloroetileno, o es un proceso económico y respetuoso con
mediante la adición de tensioactivos a el medio ambiente, pero lleva mucho
dispersar los compuestos hidrofóbicos en tiempo
agua. para finalizar el proceso de limpieza.
• Bioaumentación: Adición de • Agricultura de la tierra: la agricultura de
microorganismos específicos al la tierra es una técnica para la
el suelo contaminado constituye biorremediación de
bioaumentación. Algunos de los suelos contaminados con hidrocarburos. En
contaminantes esto, el suelo se excava, se mezcla
como policlorobifenilos (PCB), con microorganismos y nutrientes y se
trinitrotolueno (TNT), poliaromático extienden sobre un revestimiento solo
los hidrocarburos (HAP), etc.no se degradan debajo del suelo contaminado.
solo por el suelo nativo
• Uso de biorreactores en fase de • En los últimos años, utilizando ingeniería
lechada: en este proceso, el excavado genética, aceite utilizando microorganismos
contaminado Se han producido que pueden crecer
el suelo se somete a biorremediación en rápidamente en aceite.
condiciones óptimas y controladas • Los microbios modificados genéticamente
en biorreactores específicamente para limpiar los derrames de petróleo se
diseñados. mezclan
Bacterias manipuladas utilizadas para la con paja. En el lugar del derrame de
degradación de petróleo, la paja mezclada con microbios se
xenobióticos y desechos tóxicos esparcidos sobre el área derramada de
Bacteria petróleo.
Sustrato que se puede degradar
Pseudomonas capacia
Ácido 2,4,5-tricloro-fenoxiacético
P. putida y otras spp. (también E. coli )
2,2,5-dicloropropionato; mono y
dicloroaromáticos
Alcaligenes sp.
Ácido diclorofenoxiacético, mezclado
clorofenoles; 1,4-diclorobenceno
Acinetobacter sp.
4-clorobenceno
Pseudomonas capacia
Ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético
1.13.9 Uso de biotecnología en la
eliminación de aceite y grasa
depósitos
• Los derrames de petróleo de los
petroleros en la superficie terrestre, así
como en los mares y
Los océanos son un gran peligro para el
medio ambiente. Esto no solo mata al
la flora y fauna acuáticas al destruir el
hábitat pero también crea salud
problemas para los habitantes locales.
• Tradicionalmente, los dispersantes
químicos se utilizan como remediación.
esfuerzos. Sin embargo, estos dispersantes
químicos también son de naturaleza tóxica.
y persisten en el medio ambiente durante
mucho tiempo.
• Las técnicas actuales de lavado del aceite
de la grava y limpieza.
el área de los derrames de petróleo, es muy
costosa y requiere mucho tiempo.
• Para superar algunos de estos problemas,
los fertilizantes oleofílicos
se están desarrollando que permiten un
rápido crecimiento y multiplicación de
microbios que además conduce al aumento
de la biodegradación
proceso de remoción de aceite.
Página 1 predecir que los microbios deberían haber
evolucionado para utilizar cualquier nicho que
Microbiología ambiental: suelo satisfaga las
requisitos físicos y químicos
2
CAPÍTULO
mínimos. Recientemente, las bacterias que viven
~ 3,5 km por debajo de la superficie de la tierra
en rocas a altas temperaturas se han
descubierto. Dado que estas condiciones cubren
Los microbios están en todas partes de la biosfera toda la tierra, incluso esa parte
y su presencia afecta invariablemente bajo los océanos: estas formas bacterianas
el entorno en el que están creciendo. Los muchos pueden constituir la masa individual más grande
y variados elementos metabólicos de la vida en (o en) la tierra.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
Las actividades de los microorganismos aseguran http://ebookcentral.proquest.com
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
que participan en reacciones químicas. Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos.
en casi todos los entornos de la tierra. Los

microorganismos requieren una energía
sistema de producción (incluido un aceptor de Página 2
electrones) para mantener la vida y los nutrientes, 2.2
incluyendo agua líquida, para crecer y Biotecnología ambiental
reproducirse. Dado que los microorganismos A continuación se muestra una lista abreviada de
han estado presentes en la tierra por más tiempo los roles que juegan los microbios en nuestras
que otros organismos, han desarrollado la vidas:
capacidad para prosperar en casi cualquier • Mantienen la fertilidad y la labranza del suelo.
entorno que cumpla con estos criterios mínimos. • Limpian toda la materia orgánica muerta; sin
La energía proviene de una de dos fuentes, la luz ellos, lo haríamos
(fotosíntesis) o la oxidación. estar hasta nuestros oídos en cosas muertas,
de moléculas reducidas. Las moléculas oxidables como nuestros antepasados.
pueden ser orgánicas (por ejemplo, azúcar, • Fijan nitrógeno gaseoso en formas que las
proteínas o cualquiera de los otros alimentos que plantas pueden utilizar para
los humanos disfrutamos) o una variedad de mantener la fertilidad de los suelos.
inorgánicos • Se pueden utilizar para extraer minerales de
moléculas como azufre, hierro, hidrógeno, minerales.
monóxido de carbono o amoníaco o • Son el alimento principal para toda la vida
incluso una combinación de moléculas orgánicas marina y de agua dulce; incluso
/ inorgánicas. Existen microorganismos que las ballenas dependen de ellas directa o
prosperar dentro de las células eucariotas, a indirectamente para su nutrición.
temperaturas> 100 o C, en presencia de 2.1 MICROORGANISMOS DEL SUELO
metales tóxicos como el cobre o el mercurio, a Y DEL SUELO
pH ~ 2,0 y ~ 11,0, hasta 3,5 km El suelo es el material exterior suelto de la
debajo de la superficie de la tierra y en soluciones superficie de la tierra que es claramente
salinas saturadas a 0 ° C. diferente del lecho rocoso subyacente y la región
Los microorganismos han ampliado los entornos que soporta
en los que pueden vivir gracias a vida vegetal. Agrícolamente, el suelo es la región
enzimas en desarrollo que les permiten utilizar la que sustenta la vida vegetal por
luz solar para obtener energía, así como un proporcionando el soporte mecánico y los
diversidad de pares de donantes / aceptores de nutrientes necesarios para el crecimiento. Desde
electrones; para que puedan rendir energía el
reacciones oxidativas sobre las fuentes de Desde el punto de vista del microbiólogo, el
energía disponibles. Que esta evolución está en suelo es uno de los sitios más dinámicos de
curso interacciones en la naturaleza. Es la región donde
se demuestra por el aislamiento de la mayoría de los factores físicos, biológicos
microorganismos que pueden metabolizar y reacciones bioquímicas relacionadas con la
numerosos descomposición de la meteorización orgánica de
productos químicos artificiales (los que no se tener lugar la roca madre. Los organismos vivos,
encuentran en la naturaleza). El rango de tanto plantas como animales, constituyen
electrones un componente importante del suelo. Las
aceptores incluyen oxígeno gaseoso, sulfato, investigaciones pioneras de una serie de
nitrato, nitrito, dióxido de carbono, Los primeros microbiólogos demostraron por
monóxido de carbono, hierro y magnesio. De primera vez que el suelo no era inerte.
hecho, los principios evolutivos
material estático pero un medio vibrante de heterótrofos (hongos, bacterias). Los autótrofos
vida. Ahora se cree que el suelo utilizan carbono inorgánico de CO 2 y
ser un sistema dinámico o más bien vivo, que son "productores primarios" de materia orgánica,
contiene una población dinámica de mientras que los heterótrofos utilizan
organismos / microorganismos. El suelo carbono y son descomponedores / consumidores.
cultivado tiene relativamente más población 2.1.1.1 Virus
de microorganismos que el barbecho, y los suelos • Los virus llevan una existencia estrictamente
ricos en materia orgánica parasitaria: se reproducen en
contienen mucha más población que los suelos bacterias, plantas, animales y células humanas.
arenosos y erosionados. Microbios en el • El tipo de virus más importante en el medio
el suelo son importantes para nosotros para ambiente del suelo son los
mantener la fertilidad / productividad del suelo, virus que viven en células bacterianas, llamados
el ciclo de bacteriófagos (fagos).
elementos nutritivos en la biosfera y fuentes de • El papel de los fagos en el medio ambiente del
productos industriales, tales como suelo depende de su capacidad
enzimas, antibióticos, vitaminas, hormonas, para eliminar algunas poblaciones de bacterias y
ácidos orgánicos, etc. Al mismo tiempo, al seleccionar el
ciertos microbios del suelo son los agentes microorganismos tanto de forma negativa como
causantes de enfermedades humanas y vegetales. positiva. El ejemplo
2.1.1 Las características de los de su influencia negativa son los fagos que atacan
microorganismos del suelo el nódulo de la raíz
El suelo habita en diversos grupos de organismos bacterias ( Rhizobium ) que son la causa de la
vivos, tanto microflora como micro- disminución de papilionáceas
fauna cultivos de plantas.
• Microflora: 2.1.1.2 Bacterias
- bacterias • Las bacterias constituyen la masa básica de
- Hongos, mohos, levadura, hongos todos los microorganismos del suelo. Ellos son
- Actinomicetos, Streptomyces caracterizado por una alta actividad metabólica.
- Algas, p. Ej., BGA, algas verdes amarillas, • La mayoría de las bacterias del suelo se
algas pardas doradas caracterizan por la capacidad de adherirse a las
Las bacterias se clasifican nuevamente en: ( I) superficies.
Heterótrofas, por ejemplo, simbióticas y no de las moléculas minerales y de los coloides del
- fijadores simbióticos de N 2 , amonificantes, suelo.
descomponedores de celulosa, desnitrificantes • Un número especialmente elevado de bacterias
( II) Autrótrofos, por ejemplo, Nitrosomonas, se acumula alrededor de los residuos de
Nitrobacter, oxidantes de azufre, etc. tejidos de plantas y animales, así como en los
Buddolla, V. (2016). Biotecnología
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ambiental :. Obtenido de
excrementos de animales que se encuentran
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su camino hacia el suelo. El entorno que es
especialmente adecuado para
el desarrollo de las bacterias son las raíces de las
Página 3 plantas y sus otras
Microbiología ambiental: suelo partes subterráneas.
2.3 • Las bacterias del suelo se pueden subdividir en
• Microfauna: protozoos, nematodos dos grupos: las que siempre
La densidad de organismos vivos en el suelo es ocurren en cada uno de los tipos de suelos
muy alta, es decir, tanto como (autóctonos) y los que
miles de millones / g de suelo por lo general la crecer sólo después de una gran cantidad de la
densidad de organismos es menor en el suelo descarga de materia orgánica en el
cultivado que suelo (zimógeno).
tierra virgen / sin cultivar y la población • El grupo más grande de bacterias del suelo está
disminuye con la acidez del suelo. Cima representado por los actinomicetos.
suelo, la capa superficial contiene mayor número y bacterias rod-coccus que pertenecen
de microorganismos porque al género Arthrobacter .
está bien provisto de oxígeno y nutrientes. La Bacterias Rod-coccus : Bacterias en forma de
capa inferior / subsuelo se agota palo que pertenecen a Arthrobacter
con oxígeno y nutrientes, por lo tanto, contiene géneros son dominantes en números
menos organismos. Ecosistema del suelo representativos del suelo autóctono
se compone de organismos que son autótrofos http://ebookcentral.proquest.com
(algas, BOA) y Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos.
Página 4 dependen del nitrógeno para su salud y
crecimiento y no pueden inhalar
2.4 directamente del medio ambiente. Dependen del
Biotecnología ambiental
suelo para la
microflora. Constituyen del 2 al 60% de la
suministro de nitrógeno. A través del proceso de
población total de la microflora del suelo.
fijación de nitrógeno, nitrógeno
y se caracterizan por la tendencia a formar formas
de la atmósfera pasa a estar disponible para las
ramificadas y cocos.
plantas. Este proceso
Las bacterias son polimórficas. En nuevos
tiene lugar a través de bacterias, por
cultivos bacterianos, las bacterias crecen en un
ejemplo, Rhizobium y Cyanobacteria .
forma de varillas largas e irregulares, mientras
Estas especies de bacterias convierten el
que en las culturas antiguas crean formas de
nitrógeno atmosférico en nitratos.
coco.
y nitritos que forman parte de su metabolismo y
Se caracterizan por una alta resistencia a los
lo hacen disponible
factores ambientales.
a las plantas. Algunas plantas se han modificado
durante la etapa vegetativa. Además, son capaces
a sí mismas tan bien que
de sobrevivir en suelo seco.
ahora pueden almacenar las bacterias en sus
durante unos meses, mientras que la mayoría de
tejidos.
las otras bacterias, que no producen
• El uso de suelo rico en bacterias
las esporas en reposo, mueren. Las bacterias
benéficas puede aumentar la productividad,
tienen la capacidad de utilizar un amplio
crecimiento y salud de las plantas. Así como el
espectro.
dióxido de carbono es útil
de compuestos orgánicos como sustrato
componente de las plantas, de manera similar, el
alimentario. Conducen la biodegradación de
oxígeno también es necesario para ellas
compuestos no fácilmente accesibles y pueden
porque las plantas necesitan oxígeno en el
utilizar muchos metabolitos de otros
proceso de respiración. Toman
microorganismos que incluyen varios polímeros,
oxígeno al digerir los azúcares presentes en ellos
factores de crecimiento y el amino
y usarlo para su
ácidos producidos por microorganismos. Las
crecimiento. Absorben oxígeno de las raíces y si
bacterias que utilizan la celulosa.
las raíces pueden
( Cellulomonas) también pertenecen a las formas Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
en forma de palo. http://ebookcentral.proquest.com
• Las bacterias juegan un papel importante en el Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos.
medio ambiente. Muchos materiales muertos

son descompuestos por bacterias. Si no hubiera
Página 5
bacterias, el medio ambiente
Microbiología ambiental: suelo
habría estado contaminado y lleno de
2.5
microorganismos dañinos. Ellos
absorber nutrientes y energía del suelo solo
degradar la materia orgánica muerta y convertirla
entonces podrán
en energía y
para proporcionar gran cantidad de oxígeno a las
nutrientes. Por ejemplo, descomponen árboles y
plantas. Esos suelos no son
obtienen su alimento de
fértiles que no tienen la estructura y materia
ellos en forma de nutrición.
orgánica adecuadas. Si estos
• Carbono orgánico presente en el medio
componentes estarán presentes en el suelo,
ambiente en forma de organismo muerto
entonces las plantas obtendrán una gran cantidad
es capaz de consumir todo el dióxido de carbono
de
de la atmósfera si hay
oxígeno para la respiración.
no había descomponedores en la tierra. Se puede
2.1.1.3 Actinomicetos
imaginar que si
Los actinomicetos son bacterias organotróficas
el dióxido de carbono se reduce de la atmósfera,
(quimio). Se forman alargados,
habría
hilos ramificados similares al micelio que
no ha habido fotosíntesis en las plantas y, como
contienen una gran cantidad de procariotas
resultado, ningún alimento habría
células. El ancho de los hilos es de 1-5 ìm. Viven
producido por plantas. Los descomponedores o
principalmente en el suelo o sobre
bacterias ayudan en el ciclo de
plantas en descomposición. La mayoría de ellos
minerales como carbono y azufre. También son
llevan un tipo de vida saprofita, y algunos
útiles para fabricar drogas,
son patógenos para plantas y animales (por
anticuerpos y hormonas.
ejemplo: Streptomyces somaliensis ,
• El nitrógeno es el componente más importante
Actinomyces israelii y Nocardia
de las plantas. Plantas totalmente
asteroides causan infecciones subcutáneas de
pies llamados micetoma). Sus capacidades de ramificado y generalmente multicelular. Sus
crecimiento a temperaturas de 40-50 ° C dan gruesos tejidos forman
ellos una amplia gama de potencial de micelio o talo . Las celdas individuales tienen un
descomposición de diversas sustancias. tamaño de aproximadamente 10 µm.
• Los actinomicetos degradan esteroides, lignina, Los hongos del suelo más comunes son los
quitina, hidrocarburos, grasas géneros de Penicillium, Aspergillus,
y ácidos húmicos, que no son fácilmente Trichoderma, Verticillium, Fusarium, Rhizopus,
descompuestos por otras bacterias. Mucor, Zygorhynchus,
• Durante la descomposición de los anteriores, Chaetomium. Los hongos crecen fuertemente en
producen aromáticos suelos ácidos y tienen
compuestos. influencia sobre el cambio de la reacción del pH.
• El olor característico de la tierra recién arada, Papel de los hongos en el medio ambiente:
especialmente en primavera, • Los hongos juegan un papel importante en los
proviene de la bacteria actinomicetos. El olor es suelos y la nutrición de las plantas.
causado por el • Desempeñan un papel importante en la
sustancia llamada geosmina ( 1,10-dimetylo-9- degradación / descomposición de
dekalol) , que se produce celulosa, hemicelulosa, almidón, pectina, lignina
por Streptomyces griseus. Son las bacterias en la materia orgánica
aeróbicas, mientras que una pequeña añadido al suelo.
grupo tiene la capacidad de conducir los procesos • La lignina que es resistente a la descomposición
metabólicos en anaeróbicos por bacterias es principalmente
condiciones (por ejemplo , Actinomyces, descompuesto por hongos.
Micromonospora). • También sirven como alimento para las
• Muchos tipos de actinomicetos producen bacterias.
antibióticos como eritromicina, • Ciertos hongos pertenecientes a la subdivisión
neomicina, estreptomicina, tetraciclina y otros, Zygomycotina y
como subproducto Deuteromycotina son depredadores por
del metabolismo. Aproximadamente el 90% de naturaleza y atacan a los protozoos y
todos los actinomicetos aislados del suelo son nematodos en el suelo y, por lo tanto, mantener
Streptomyces. el equilibrio biológico en el suelo.
2.1.1.4 Hongos • También juegan un papel importante en la
• Los hongos pertenecen a un grupo de agregación del suelo y en la formación
organismos eucarióticos que son los de humus.
heterótrofos La mayoría de ellos pertenecen al • Algunos hongos del suelo son parásitos y
grupo de aerobios o fermentadores causan varias enfermedades de las plantas.
hongos Toman el carbono y la energía para tales como marchites, pudriciones de raíces,
construir sus propias células a partir de marchitez y plagas de plántulas, por
la descomposición de los compuestos ejemplo. Pythium,
orgánicos. Los hongos no tienen Phyiophlhora, Fusarium, Verticillium, etc.
clorofila. A diferencia de las bacterias, la pared • Número de hongos del suelo que forman una
celular de los hongos contiene quitina, asociación micorrízica con las raíces de
glucanos y otros polisacáridos. plantas superiores (asociación simbiótica de un
• Ocurren principalmente en las capas superiores hongo con las raíces de un
del suelo, sin embargo, pueden ser planta superior) y ayuda en la movilización de
encontrado tan profundo como 1 m. fósforo y nitrógeno del suelo
• Entran en relaciones simbióticas con algas, p.ej. Glomus , Gigaspora,
insectos y más. Aculospora ( Endomycorrhiza ) y Amanita,
plantas. Muchas especies de hongos son Boletus, Entoloma, Lactarius (Ectomycorrhiza).
patógenos para los seres humanos, las plantas y 2.1.1.5 Fitoedafón del suelo
animales. El fitoedafón se compone principalmente de
http://ebookcentral.proquest.com algas y, en menor medida, la mayor
plantas. Las algas son el componente principal
del fitoedafón. Son la mayoría
numerosos sobre la superficie del suelo que
Página 6 llegan más profundamente a través del arado,
2.6 agua que se filtra, actividades de los animales y
Biotecnología ambiental la capacidad de migrar. Dos grupos son
• Sus formas vegetativas crean fragmentos distinguibles: colonias de algas que viven en la
parecidos a hilos que son más o menos superficie-epiphytoedaphon
y los que viven en capas más profundas: La mayoría de las algas del suelo (especialmente
endofitoedafón. BGA) actúan como agente cementante en la
• Las algas del suelo son fotoautótrofas unión
obligatorias, sin embargo, las que viven en partículas del suelo y por lo tanto reducir /
las capas más profundas probablemente se prevenir la erosión del suelo.
alimentan heterotróficamente. El mucílago secretado por el BGA es de
• Desempeñan un papel importante en el naturaleza higroscópica y, por lo tanto, ayuda
ecosistema del suelo e influyen en sus en el aumento de la capacidad de retención de
cualidades. agua del suelo durante más tiempo / período.
y estabilidad. A través de la secreción Las algas del suelo, a través del proceso de
extracelular, fertilizan el suelo y fotosíntesis, liberan gran cantidad
participar en la descarga de nutrientes al medio de oxígeno en el medio ambiente del suelo y así
ambiente. facilitar la aireación en
http://ebookcentral.proquest.com suelos sumergidos o oxigenar el medio ambiente
del suelo.
Ayudan a controlar la pérdida de nitratos por
lixiviación y drenaje.
Página 7 especialmente en suelos sin cultivar.
Microbiología ambiental: suelo Ayudan a la erosión de las rocas y a la
2,7 construcción de la estructura del suelo.
• Algunas algas verdiazules (cianobacterias) son 2.1.1.6 Fauna del suelo
capaces de fijar el La microfauna del suelo está representada por
nitrógeno atmosférico ( Nostoc, Anabaena, los protozoos, que se alimentan principalmente
Scytonema, Tylypothrix). de
El suelo habitado por estos microorganismos bacterias. Su función es realizar la selección y
contiene de 26 a 400 veces más rejuvenecer a la población de
nitrógeno. Debido a la capacidad del nitrógeno bacterias del suelo. Entre ellos predominan las
(N 2 ) y el dióxido de carbono (CO 2 ) amebas y los flagelados. La mesofauna es
asimilación, pueden ser los primeros en colonizar representado por los nematodos (anguilas),
el nitrógeno y caracoles, insectos, miriápodos, ácaros
suelo libre de carbono orgánico. http://ebookcentral.proquest.com
• Cerca de dos mil especies de algas se Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
encuentran en el suelo. Son principalmente:
- Algas verdiazules: Nostoc, Anabaena,
Scytonema, Tolypothrix, Página 8
Microcoleus, Schizothrix 2.8
- Algas verdes: Ankistrodesmus, Chlorella, Biotecnología ambiental
Chlorococcum, Chlamydomonas, y otros. Se alimentan de materia orgánica muerta
Characium, Klebsormidium que contribuye a la formación.
- Diatomeas: Achnanthes, Cymbella, Eunotia, de humus.
Fragilaria, Hantzschia, Protozoos : son unicelulares, eucariotas,
Navicula, Nitzschia, Pinnularia incoloros y similares a animales.
- Algas verde amarillentas : Botrydiopsis, organismos (reino animal). Son más grandes que
Heterothrix, Heterococcus, las bacterias y el tamaño varía.
Pleurocloris desde unas pocas micras hasta unos pocos
- Euglenoides: Euglena, Peranema centímetros. Su población en rangos de suelo
- Algas rojas: Porfiridio cultivable.
• Entre los organismos vegetales macrobióticos de 10 000 a 1 00 000 por gramo de suelo y son
que habitan el suelo abundantes en la superficie del suelo. Ellos
medio ambiente, las plantas superiores dominan puede soportar condiciones adversas del suelo,
y constituyen el elemento básico de ya que se caracterizan por una "etapa de quiste"
biocenosis de todos los ecosistemas terrestres. en su ciclo de vida. Excepto unos pocos géneros
Las algas juegan un papel importante en el que se reproducen sexualmente por fusión de
mantenimiento de la fertilidad del suelo, células, el resto de ellas se reproducen
especialmente asexualmente por fisión / fisión binaria. La
en suelos tropicales. mayoría de
Añaden materia orgánica al suelo cuando mueren Los protozoos del suelo son móviles por flagelos
y así aumentan la cantidad o cilios o pseudópodos como locomotoras.
de carbono orgánico en el suelo. órganos. Dependiendo del tipo de apéndices
previstos para la locomoción,
los protozoos son: Página 9
• Rhizopoda (Sarcondia)
• Mastigofora
2.9
• Ciliophora (Ciliata)
• Varios protozoos del suelo causan
• Sporophora (habitantes no comunes del suelo)
enfermedades en los seres humanos que se
• Clase - Rhizopoda: Consiste en protozoos sin
transmiten
apéndices; por lo general
a través del agua y otros vectores, p. ej. La
tienen protoplasma desnudo sin células; pared,
disentería amebiana es causada por
pseudópodos como temporal
Entomobea histolytica.
Los órganos locomotores están presentes algunas
La macrofauna está representada por lombrices
veces. Los géneros importantes son
de tierra, topos, roedores. La
Ameba, Biomyxa, Euglypha, etc.
los organismos rompen el material del suelo y lo
• Clase - Mastigophora: Comprende protozoos
llevan a una profundidad significativa. La
flagelados, que son
Las lombrices de tierra juegan el papel más
predominante en el suelo. Los géneros
importante entre los invertebrados, al alimentar
importantes son: Allention, Bodo, Cercobodo,
sobre la materia orgánica muerta y absorbiéndola
Cercomonas, Entosiphon Spiromonas,
junto con la parte mineral del
Spongomions y Testramitus. Muchos
tierra; residuo no digerido mezclado con suelo
miembros son saprofitos y algunos poseen
mineral y los metabolitos son
clorofila y son
excretado en forma de grumos (coprolitos) que
autótrofo por naturaleza. En este sentido, se
contribuye a la formación
asemejan a las algas unicelulares,
de textura de miga del suelo y su
y por lo tanto, se conocen como "Fitoflagelados".
desprendimiento. Durante el período de un año,
• Los protozoos del suelo pertenecientes a la
las lombrices de tierra, en el área de una hectárea,
clase ciliados / ciliophora son
pueden pasar 7 mil kg de suelo
caracterizado por la presencia de cilios
a través de sus tractos digestivos.
(apéndices en forma de pelos cortos)
2.1.2 El número de microorganismos del
alrededor de su cuerpo, lo que ayuda a la
suelo
locomoción. El suelo importante
El número y la composición de los
habitantes de esta clase son Colpidium, Colpoda,
microorganismos del suelo depende del tipo de
Balantiophorus,
suelo, su estructura, humedad y sobre el
Gastrostyla, Halteria, Uroleptus, Vortiicella,
contenido de materia orgánica.
Pleurotricha, etc.
2.1.2.1 Virus
Los protozoos abundan en la capa superior (15
Se desconoce el número exacto de virus en el
cm) del suelo. La humedad del suelo,
suelo. Su masa se estima
la aireación, la temperatura y el pH son los
a menos de 0,01 toneladas / ha.
factores importantes que afectan a los protozoos
2.1.2.2 Bacterias
del suelo.
• La cantidad de bacterias varía de un par de
• La mayoría de los protozoos obtienen su
millones a un par de
nutrición alimentándose o ingiriendo
mil millones de células por cada 1g de suelo. Se
bacterias del suelo pertenecientes a los
produce el mayor número de bacterias
géneros Enterobacter, Agrobacterium,
en una capa de suelo cultivable a una
Bacillus, Escherichia,
profundidad de hasta unos 30 cm. En mas
Micrococcus y Pseudomonas y, por lo tanto,
profundo
juegan
capas, sus números bajan rápidamente. En la
papel importante en el mantenimiento del
capa cultivable de suelo de
equilibrio microbiano / bacteriano en el
unos 30 cm de grosor, puede haber desde varios
tierra.
cientos de kg hasta
• Algunos protozoos se han utilizado
a unas pocas toneladas de masa bacteriana por
recientemente como agentes de control
cada 1 hectárea.
biológico.
• En las proximidades de las raíces y en su
contra fitopatógenos.
superficie, las bacterias encuentran un aumento
• Especies del género bacteriano a
cantidades de compuestos orgánicos, como
saber. Enterobacter y Aerobacter son
ácidos orgánicos, aminoácidos y
comúnmente utilizado como base alimentaria
vitaminas que son excretadas por las plantas. Por
para el aislamiento y enumeración de suelos
lo tanto, en la capa alrededor
protozoos.
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de raíces, llamada rizosfera, el número de bacterias
Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13. es varias veces mayor
que en el suelo lejos de las raíces.
• En suelos ricos en compuestos orgánicos, viven Los microorganismos se reproducen y
más bacterias; generalmente en transforman la materia orgánica creando
1 g de suelo cultivable puede haber entre 0.5-5.0 biomasa de sus propias células y recolectar
mil millones de bacterias (1.5- sustratos esenciales para reponer la
15 toneladas / ha). suministros de humus. Además, descomponen y
• Los suelos ácidos contienen un número mineralizan los componentes orgánicos.
relativamente bajo de bacterias y una gran compuestos, recirculando consecuentemente los
número de hongos. elementos indispensables en la planta
2.1.2.3 Hongos producción basada en la asimilación de CO 2 de
• Los hongos, excepto las levaduras, se presentan la atmósfera.
en forma de micelios o esporas. La • El carbono constituye el 50% de la masa de la
número de tales unidades por 1 gramo de suelo materia orgánica que ingresa
puede alcanzar varias decenas de suelo en forma de residuos vegetales y animales
http://ebookcentral.proquest.com (hojas que caen, varios
restos en prados y bosques, cadáveres de
animales, raíces y brotes de
plantas muertas).
Página 10 • La materia orgánica fresca está compuesta por
2.10 monosacáridos (hexosa,
Biotecnología ambiental pentosa), polisacáridos (almidón, celulosa,
mil; entre las que las esporas constituyen desde hemicelulosa, quitina),
varias hasta una ácidos orgánicos, compuestos aromáticos
unas pocas docenas por ciento dependiendo de la (lignina, fenoles, taninos),
humedad del suelo y la orgánica compuestos hidrofóbicos (cera, cutina, grasa y
sustancias disponibles. otros).
• Los hongos están más ampliamente • El carbono se recupera durante la
representados en turba ácida y suelos descomposición de los compuestos orgánicos.
forestales. Allí, y procesos de mineralización.
pueden ser más numerosos que las bacterias. • Dependiendo de su naturaleza química,
• La masa principal de hongos se encuentra en la componentes particulares de las plantas
capa superior de 20-30 cm. La La masa se descompone y mineraliza a varias
La masa combinada de hongos en las capas velocidades.
superiores es casi idéntica a la http://ebookcentral.proquest.com
de bacterias, y en suelos forestales, incluso puede Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
ser mayor. En promedio,
está entre 0.001-1.0 mil millones de hongos
(alrededor de 1.5 toneladas / ha). Página 11
2.1.2.4 Algas Microbiología ambiental: suelo
Las algas viven principalmente en las capas 2.11
superiores del suelo en cualquier lugar entre 0-10 • Las sustancias solubles como azúcares,
cm donde aminoácidos, ácidos orgánicos se eliminan
la luz del sol penetra (raramente por debajo de los fácilmente
50 cm). Su número puede variar entre Lavados con agua de residuos vegetales y
100 mil a 3 millones por 1 g de suelo (0,2 animales y luego son
toneladas / ha). En condiciones favorables, metabolizado rápidamente por microorganismos
por ejemplo, en suelos tropicales muy irrigados, del suelo; ellos regulan especialmente
el número puede aumentar. las actividades microbiológicas en la rizosfera .
2.1.2.5 Fauna del suelo • Las ceras, grasas, cauchos y taninos se
Los protozoos pueden desarrollarse ampliamente descomponen con gran dificultad
en suelos adecuadamente húmedos. Sus números debido a sus elevadas propiedades
alcanzan hidrofóbicas. La lignina es la más resistente
en cualquier lugar desde unos pocos cientos hasta sustancia que se descomponga entre los
varios millones por 1 g de suelo seco. La masa materiales vegetales.
de protozoos en el suelo está entre 0.1-0.5 ton / 2.1.3.1 Descomposición de celulosa
ha, mientras que la masa de nematodos • La celulosa se encuentra comúnmente en las
está entre 0-0,2 toneladas / ha, lombrices de tierra paredes de las células vegetales y está asociada
0-2,5 toneladas / ha y otros animales del suelo con hemicelulosa y lignina. En la masa seca de
0-0,5 toneladas / ha. plantas verdes, el
2.1.3 Actividad de los microorganismos en El contenido de celulosa es del 15-30%, mientras
el suelo que en partes lignificadas y paja,
puede llegar al 50%. hongo Pleurotus ostreatus— hongo comestible
• La celulosa es un polisacárido que consta de y Lintunula edodes.
una cadena larga no ramificada de Entre los Ascomycetes, los involucrados
unidades de glucosa. son: Xylaria, Libertella y
• Las bacterias celulolíticas pertenecen Hypoxylon. Entre los hongos del
principalmente a los moho, Trichoderma lignorum demuestra
géneros: Cytophaga , Cellfalcicula, la capacidad de descomponer la lignina.
Cellulomonas y Cellvibro. • La composición del complejo enzimático que
• El sistema celulolítico más conocido se descompone la lignina es,
encuentra en los hongos. El Trichoderma entre otros, representados por oxidorreductasas
libera las enzimas celulasa más activas en el que requieren oxígeno
medio ambiente, o peróxido de hidrógeno H 2 O 2 para la ruptura
luego, el ataque enzimático se produce fuera de oxidativa de enlaces que
las células. Otros hongos como conectan las subunidades de fenilpropano de
Chaetomium, Fusarium y otros también lignina entre sí. En directo
participan activamente en lo anterior. descomposición de la lignina, interviene: lacasa
proceso. (puede oxidar
• La descomposición también puede ocurrir en monofenoles), lignina peroxidasa y otras
condiciones libres de oxígeno; se lleva a cabo enzimas que no
por los géneros: Acetovibrio, Bacteroides, ha sido dilucidado.
Clostridium, Ruminococcus. • La actividad de los microorganismos que
En consecuencia, una gran cantidad de sustancias descomponen la lignina en el suelo estimula
gaseosas, como CO 2 , H 2 , la producción de humus.
Se crean CH 4 . 2.1.3.3 Síntesis y descomposición del humus
• La descomposición de la celulosa ocurre más El humus es una sustancia orgánica amorfa,
rápidamente en suelos neutrales o ligeramente generalmente oscura, que forma el
pH ácido y se ralentiza en suelos muy ácidos. Sistema coloidal de gran superficie capaz de
• Los microorganismos que descomponen la adsorber iones de agua y
celulosa la convierten en más simple. gases.
compuestos y de esta manera crean una base de • Contiene fracciones de sustancias orgánicas que
nutrientes para todo el suelo tienen una baja proporción de
heterótrofos. C: N (de 10 a 15), mientras que la proporción de
2.1.3.2 Descomposición de la lignina estos elementos en plantas muertas '
La lignina pertenece a un gran grupo de el residuo está aproximadamente a C: N = 40: 1.
compuestos aromáticos y, además de • Los ácidos fúlvicos, húmicos y huminos
la celulosa, es un componente principal de los componen la composición del humus.
tejidos de la madera (hasta un 30% de la biomasa Estos son los conglomerados de compuestos más
vegetal). o menos carbonizados,
• La lignina es un polímero construido con que se caracterizan por la presencia de
unidades de fenilopropano que contienen un carboxilo , fenilo y
anillo aromático y los grupos metoxilo - OCH 3 . grupos metoxilo que contienen C, O, N, P y S, así
• Los organismos que degradan la lignina más como los aromáticos
activos son los hongos que causan, por lo que esqueleto con numerosas cadenas laterales.
llamado podredumbre blanca de la • El principal sistema de formación de humus es
madera. Descomponen la madera en CO 2 y la actividad de los microorganismos del suelo:
H 2 O. Ellos bacterias (incluidos actinomicetos) y hongos.
pertenecen a los grupos basidiomicetos y 2.1.3.3.1 La síntesis de humus (humificación)
ascomicitos y están representados • El proceso de formación de humus se llama
por varios cientos de especies. Entre humificación.
los basidiomicetos , los mejores • Los principales sustratos a partir de los cuales
http://ebookcentral.proquest.com se forman los compuestos de humus son
lignina, hidrocarburos y compuestos
nitrogenados. Sin embargo, el tipo de suelo
y las condiciones climáticas determinan el tipo de
Pagina 12 humus.
2.12 • Los microorganismos llevan a cabo los
Biotecnología ambiental siguientes procesos relacionados con la
los conocidos son: Trametes versicolor, formación de humus:
Phanerochaete chrysosporium , ostra - descomponen materia orgánica fresca
produciendo metabolitos - el
precursores de compuestos de humus. demostrado por los actinomicetos y algunas otras
- crean biomasa, que después de la atrofia y bacterias como
autólisis constituyen la como Micrococcus, Corynebacterium y algunos
sustratos iniciales adicionales necesarios para la hongos de pudrición blanca como
formación de humus. Polysticus .
- Catalizan los procesos de síntesis de humus. • Se puede suponer que tanto en la formación de
http://ebookcentral.proquest.com humus como durante su
descomposición, todo el sistema de microflora y
microfauna del suelo
desempeñar un papel colectivo.
Página 13 • Debido a los procesos microbiológicos, el
Microbiología ambiental: suelo nitrógeno de la atmósfera es
2.13 incorporarse a los compuestos de las células
La forma básica de formación de los compuestos orgánicas (los llamados
de humus es a través de su síntesis. fijación de nitrogeno)
de los fragmentos como polifenoles con la • Los compuestos orgánicos contenidos en los
participación de nitrógeno residuos animales y vegetales son
componentes de origen proteico. La fuente de mineralizados por microorganismos y luego se
polifenoles puede ser la incorporan a la
procesos de descomposición de lignina, ciclo del nitrógeno. De esta forma, el nivel de
transformación de hidrocarburos y diversos nitrógeno libre en la atmósfera
Procesos de síntesis microbiológica. Muchos permanece estable (78%).
polifenoles se forman como metabolitos. • El ciclo del nitrógeno en el medio ambiente se
de diferentes microorganismos. La siguiente compone de varios vínculos
etapa de humificación es la oxidación. como:
de polifenoles que conduce a la formación de - fijación simbiótica y no simbiótica del
compuestos chinoides. Estas N 2 atmosférico mediante
Las transformaciones son catalizadas por las microorganismos.
fenol oxidasas producidas por diferentes - descomposición microbiana de los compuestos
microorganismos como el hongo Serpula orgánicos nitrogenados,
lacrymans . La fase final de amonificación - la liberación de NH 3 y de NH 4
el proceso es la polimerización de fenoles + iones la, utilización
oxidados. Transformación del de NH 4
materia orgánica en condiciones en las que el + iones para la resíntesis de proteínas por
oxígeno está disponible conduce a la formación microorganismos el
de humus y en condiciones libres de oxígeno a la utilización de NH 4
formación de depósitos de turba. + iones como sales de amonio por plantas.
2.1.3.3.2 Descomposición del humus - la nitrificación del NH 4
• La degradación del humus ocurre en + iones, los nitratos se crean a través de los
condiciones en las que hay escasez nitritos.
de materia orgánica fresca y cuando no exista un - la utilización de nitratos por plantas superiores,
suministro adecuado de así como por algunas de las
nitrógeno en el suelo. microorganismos (transformación de nitrógeno
• Se cree que la descomposición es provocada por en proteína).
el autóctono - desnitrificación.
bacterias, que se adaptan a la escasez de los 2.1.3.4 Fijación de nitrógeno atmosférico
orgánicos disponibles Los asimiladores son capaces de fijar nitrógeno
sustancias y, en consecuencia, utilizan solo en simbiosis con las plantas.
componentes contenidos • Bacterias Rhizobium , que viven en simbiosis
en complejos de humus. Particularmente alta con plantas papilionáceas,
actividad de degradación es Suministrar al suelo la mayor cantidad de
El papel de los microorganismos en los procesos del nitrógeno. Entran en el sistema raíz de
nitrógeno en el suelo: el ciclo del nitrógeno la planta donde se multiplican formando los
largos hilos de bacterias que
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos. penetrar en el tejido vegetal. El crecimiento
excesivo del tejido vegetal estimulado por
Las bacterias provocan el crecimiento de nódulos
Página 14 que forman unidades específicas en el
2.14 raíces. Dentro de los nódulos, una parte de las
Biotecnología ambiental bacterias que infectan las plantas se transforma
en bacteroides, que no se reproducen pero están participación de las enzimas exocelulares. Los
continuamente activos. aminoácidos formados se transportan
• Se cree que los bacteroides participan a las células de los microorganismos donde tiene
activamente en el proceso de lugar el proceso de desaminación.
Fijación de nitrógeno atmosférico. Los El amoníaco, al ser un gas, se esparce
bacteroides contienen un tinte rojo llamado rápidamente en suelos secos, mientras que en los
leghemoglobina. Se llama así debido a las húmedos,
similitudes con el se disuelve en agua formando NH 4
hemoglobina. El hierro Fe 3+ contenido en el tinte + . Los iones de amonio formados son utilizados
se reduce a Fe 2+ , por lo que por
Se cree que la leghemoglobina media la bacterias y plantas para la síntesis de
transferencia de electrones. aminoácidos o se someten al proceso de
para liberar nitrógeno, provocando así su nitrificación.
reducción. 2.1.3.7 Nitrificación
http://ebookcentral.proquest.com La nitrificación es un proceso biológico de
oxidación del amoníaco a nitrato.
logrado por bacterias nitrificantes
(quimiolitotrofos). La energía
Página 15 liberado durante este proceso es utilizado por las
Microbiología ambiental: suelo bacterias en la síntesis de orgánicos
2.15 compuestos. La nitrificación procede en dos
• Dentro de las raíces de las plantas; por ejemplo, etapas:
de raíz de aliso negro, los nódulos contienen 1. Primero, el amonio se oxida a nitrito. Bacterias
actinomicetos que interactúan ( Streptomyces oxidantes NH 4
alnii). al NO 2 se describen como los
• La fijación de nitrógeno por las bacterias de "nitroso": Nitrosomonas, Nitrosospira,
vida libre es similar. La reducción de Nitrosocyjastis, Nitrosoglea
N 2 a NH 3 se realiza mediante piruvato 2. En segundo lugar, el nitrito formado se oxida
deshidrogenasa y nitrogenasa para formar nitrato. Los nitritos son
enzimas. oxidada en nitratos por el grupo de bacterias
2.1.3.5 Asimiladores de N2 de vida llamado "nitro", como
libre (fijación de nitrógeno no simbiótico) géneros Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus
Las siguientes bacterias heterótrofas poseen la http://ebookcentral.proquest.com
capacidad de fijar nitrógeno libre Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
del aire y para enriquecer el suelo con nitrógeno:
• aerobios: Azotobacter, Azotomonas, Derxia,
Achromobacter, Beijerinckia . Página 16
• microaerófilos: Pseudomonas, 2.16
Flavobacterium, Mycobacterium, Biotecnología ambiental
Arthrobacter y Aerobacter. Las bacterias nitrificantes son sensibles a la
• anaerobios: algunas especies acidificación del medio ambiente;
de Clostridium como: Cl. butyricum, Cl. la ralentización de su crecimiento se produce a
pectinovorum. pH 5,0. El proceso de nitrificación
Dentro del grupo de autótrofos, se demuestran las también puede ser conducida por los
capacidades anteriores microorganismos heterótrofos. El mas grande
por las bacterias fotosintetizadoras: Clorobio, grupo que realiza la nitrificación heterotrófica
Cromatio y cianobacterias son los hongos: Aspergillus
por ejemplo , Anabaena, Nostoc. flavus, Penicillium, Cephalosporium. La
2.1.3.6 Amonificación nitrificación que realizan los hongos es menor
La amonificación es un proceso del ion amonio sensible a la acidificación y más resistente a la
NH 4 sequía. Nitratos formados en el suelo
+ o de la libre puede ser asimilado por las plantas, eliminado
formación de amoniaco. Durante las primeras por el agua o descompuesto en el
etapas de este proceso, un desglose de proceso de desnitrificación.
proteína y se produce una liberación de los 2.1.3.8 Desnitrificación
aminoácidos. A continuación, la desaminación La desnitrificación es el proceso de reducción de
del nitratos para formar nitrógeno molecular.
tiene lugar los aminoácidos. La degradación El proceso anterior se realiza principalmente en
proteolítica de las proteínas se produce con un condiciones libres de oxígeno, y
es cuando los nitratos se utilizan para la Página 17
respiración como el electrón terminal
aceptadores. Varios tipos de bacterias
2.17
heterótrofas pertenecientes a Pseudomonas,
2.1.4.1 Asociaciones / interacciones
Los géneros Achromobacter, Bacillus,
beneficiosas
Micrococcus están involucrados en el proceso de
2.1.4.1.1 Mutualismo (simbiosis)
desnitrificación. La reducción de nitratos se
Es una relación o un tipo de simbiosis en la que
produce en unas pocas etapas. Durante el
tanto la interacción
primera etapa los nitratos se reducen a nitritos
los organismos / socios se benefician unos de
(NO 2
otros. La forma / manera en que
- ), entonces los nitritos son
el beneficio que se deriva depende del tipo de
reducido a óxidos nítricos (NO, N 2 O) y hasta
interacciones. Cuando el beneficio es
nitrógeno molecular. La
en el término de intercambio de nutrientes,
El proceso de desnitrificación también es
entonces la relación se denomina como
realizado por algunos quimioautotróficos.
"Sintrofismo" (significado griego: Syn-mutuo y
bacterias como Thiobacillus denitrificans. Las
trophe = alimento), para
bacterias anteriores obtienen la energía
ejemplo, liquen (asociación de algas o BGA con
de la oxidación de compuestos de azufre para
hongos) en el que las algas
reducir simultáneamente los nitratos.
beneficios por la protección que le brindan las
Se cree que la desnitrificación es un proceso
hifas fúngicas del medio ambiente.
desventajoso ya que conduce a
estrés, mientras que los hongos obtienen y
la privación de compuestos nitrogenados vitales
utilizan el CO2 liberado por las algas durante
de las plantas. La pérdida de nitrógeno
fotosíntesis. Donde las algas verdiazules son las
del suelo debido a que la desnitrificación
compañeras del liquen
aumenta con el exceso de humectación del suelo,
asociación, los heterótrofos (hongos), se
condiciones libres de oxígeno, acumulación de
benefician del nitrógeno fijado por el
nitratos y aumento de temperatura.
alga verde azul.
2.1.4 INTERACCIONES ENTRE Los microorganismos también pueden formar
MICROORGANISMOS DEL SUELO relaciones mutualistas con plantas,
El suelo es el ecosistema terrestre más grande por ejemplo, bacterias fijadoras de nitrógeno, es
donde una amplia variedad de relaciones decir, Rhizobium que crece en las raíces de
existe entre diferentes tipos de organismos del legumbres. En esta asociación Rhizobium-
suelo. Las asociaciones existentes leguminosa, las bacterias Rhizobium son
entre diferentes microorganismos del suelo, ya beneficiada por la protección de las tensiones
sea de forma simbiótica o antagonista ambientales mientras, a su vez, la planta es
naturaleza, influyen en las actividades de los beneficiado al obtener nitrógeno de nitrato
microorganismos en el suelo. Microflora fácilmente disponible liberado por las bacterias
La composición de cualquier hábitat está pareja.
gobernada por el equilibrio biológico creado. La Anabaena-Azolla es una asociación entre el
por las asociaciones e interacciones de todos los helecho acuático Azolla y
individuos que se encuentran en la comunidad. la cianobacteria Anabaena. Esta asociación es de
En el suelo, muchos microorganismos viven en gran importancia en
estrecha proximidad e interactúan entre arrozales, donde el nitrógeno es con frecuencia
ellos mismos de diferentes maneras. Algunas de un nutriente limitante.
las interacciones o asociaciones son Una simbiosis actinorrhizal de
mutuamente beneficiosos, mutuamente actinomycetes, Frankia, con las raíces de
perjudiciales o neutrales. Los diversos tipos de Alnus y Casurina (no leguminosas) es común en
posibles interacciones / asociaciones que ocurren el ecosistema de bosque templado
entre los microorganismos en el suelo para la economía del nitrógeno del suelo. Otro
puede ser: tipo de asociación simbiótica que existe
(a) beneficioso: (i) mutualismo, (ii) entre las raíces de las plantas superiores y los
comensalismo y (iii) protocooperación hongos se encuentra la micorriza. En esta
o asociación
(b) perjudicial / dañino: (i) armensalismo, (ii) el hongo obtiene nutrientes orgánicos esenciales
antagonismo, (iii) competencia y protección de las raíces de las plantas
(iv) parasitismo y (v) depredación y les permite multiplicarse y, a su vez, las plantas
absorben fósforo, nitrógeno
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos. y otros nutrientes inorgánicos puestos a
disposición por el hongo.
2.1.4.1.2 Comensalismos
En esta asociación, un organismo / socio de la afectado negativamente por otra especie en el
asociación se beneficia de otros mismo entorno. De tal
socio sin afectarlo. Por ejemplo, muchos hongos antagonismo, un organismo puede inhibir directa
pueden degradar la celulosa. o indirectamente las actividades
a la glucosa, que es utilizada por muchas del otro. Las relaciones antagónicas son las más
bacterias. La lignina es un componente principal comunes en la naturaleza y también son
de plantas leñosas y suele ser resistente a la importante para la producción de antibióticos. El
degradación por la mayoría de las fenómeno del antagonismo
microorganismos, pero en los suelos forestales, se puede clasificar en tres, es decir, antibiosis,
la lignina se degrada fácilmente por un grupo de competencia y explotación.
Los hongos basidiomicetosos y los productos En el proceso de antibiosis, los antibióticos o
degradados son utilizados por varios otros metabolitos producidos por uno
hongos y bacterias que no pueden utilizar la organismo inhibe a otro organismo. Un
lignina directamente. Este tipo de asociación antibiótico es un inhibidor microbiano de
También se encuentra en el proceso de origen biológico. En el suelo se encuentran
descomposición de la materia orgánica. innumerables ejemplos de antibiosis. Para
2.1.4.1.3 Protocooperación Por ejemplo, las especies de Bacillus del suelo
Es una asociación mutuamente beneficiosa entre producen un agente antifúngico que inhibe
dos especies / socios. a diferencia de crecimiento de varios hongos del suelo. Varias
simbiosis, la protocooperación no es obligatoria especies de Streptomyces de productos del suelo
para su existencia o antibióticos antibacterianos y antifúngicos. La
realización de una actividad en particular. En mayoría de los antibióticos comerciales
este tipo de asociación, un organismo como estreptomicina, cloranfenicol, terramicina
http://ebookcentral.proquest.com y ciclohexamida
se han producido a partir del cultivo masivo
de Streptomyces. Así, especies de
Los Streptomyces son el grupo más grande de
Página 18 productores de antibióticos en el suelo. Otro
2.18 ejemplo de antibiosis es la inhibición
Biotecnología ambiental de Verticillium por Trichoderma, inhibición de
favorece a su asociado mediante la eliminación Rhizoctonia por una bacteria Bacillus
de sustancias tóxicas del hábitat y subtilis, inhibición del hongo Aspergillus del
obtener simultáneamente productos de carbono suelo
elaborados por el otro asociado / terreus por una bacteria Staphylococcus aureus.
pareja. La protocooperación nutricional entre 2.1.4.2.2 Ammensalismo
bacterias y hongos ha sido En esta interacción / asociación, un socio
reportado para varias vitaminas, amino y purinas suprime el crecimiento de otro
en el ecosistema terrestre y asociarse produciendo toxinas como antibióticos
son muy útiles en agricultura. Las asociaciones y gases nocivos como el etileno,
protocooperativas resultan beneficiosas HCN, nitrito, etc.
en agricultura son: i) sinergismo entre plantas 2.1.4.2.3 Competencia de ammensalismo
leguminosas y hongos VAM y Como el suelo está habitado por muchas especies
Rhizobium en el que la fijación de nitrógeno y la diferentes de microorganismos, existe una
disponibilidad / absorción de fósforo es competencia activa entre ellos por los nutrientes
mucho más alto, lo que da como resultado un disponibles y el espacio. La limitante
mayor rendimiento de los cultivos y una mejor el sustrato puede resultar en favorecer una
fertilidad del suelo, ii) especie sobre otra. Por lo tanto, la competencia
sinergismo entre plantas leguminosas PSM http://ebookcentral.proquest.com
y Rhizobium y iii) sinergismo Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
entre las raíces de las plantas y PGPR en la
rizosfera, donde las rizobacterias restringen
el crecimiento de fitopatógenos en las raíces de Página 19
las plantas y secreta la promoción del Microbiología ambiental: suelo
crecimiento 2.19
sustancias. puede definirse como "el efecto nocivo de un
2.1.4.2 Asociaciones / interacciones organismo sobre otro porque
perjudiciales (nocivas) de la remoción de algún recurso del medio
2.1.4.2.1 Antagonismo ambiente ”. Este fenómeno puede
Es la relación en la que se inhibe o inhibe una dar lugar a grandes fluctuaciones en la
especie de un organismo. composición de la población microbiana en
la tierra. • bacterrhiza: la simbiosis de plantas y bacterias.
Por ejemplo, clamidosporas de Fusarium, • micorriza: la simbiosis de plantas y hongos.
oosporas de Aphanomyces y 2.1.5.1 La simbiosis de microbios y plantas -
los conidios de Verticillium dahlae requieren bacterrhiza
nutrientes exógenos para germinar en el suelo. • Los acuerdos simbióticos están claramente
Pero otros hongos y bacterias del suelo agotan ejemplificados en la rizosfera,
estos nutrientes críticos necesarios para que es el área que incorpora la superficie exterior
germinación de esporas y por lo tanto de las raíces de las plantas y
obstaculizar la germinación de esporas el suelo adyacente.
resultando en http://ebookcentral.proquest.com
la disminución de la población. Se ha informado Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
que la competencia por el espacio libre
suprimir la población de hongos por bacterias del
suelo. Por tanto, los organismos con Página 20
La capacidad inherente de crecer rápidamente 2,20
son mejores competidores. Biotecnología ambiental
2.1.4.2.4 Parasitismo • La simbiosis ocurre cuando los
Es una asociación en la que un organismo vive microorganismos se asientan en la raíz de las
dentro o sobre el cuerpo de otro. plantas.
El parásito depende del anfitrión y vive en íntimo sistemas. Tanto las plantas como los
contacto físico. microorganismos pueden beneficiarse
y forma una asociación metabólica con el enormemente de
huésped. Entonces, esto es un parásito huésped tal interacción.
relación en la que uno (parásito) se beneficia • El mejor ejemplo de tal interacción es la
mientras que el otro (huésped) es simbiosis de bacterias nódulos
afectados negativamente, aunque no Rhizobium con las plantas papilionáceas.
necesariamente muertos. El parasitismo es • Las bacterias simbióticas Rhizobium
ampliamente se encuentran entre las más conocidas
propagación en las comunidades del suelo, por organismos fijadores. Rhizobium pertenece a los
ejemplo, bacteriófagos (virus que atacan heterótrofos y aeróbicos.
bacterias) son parásitos intracelulares estrictos, bacterias. Mientras se desarrollan dentro de los
hongos quítridos, que parasitan tejidos vegetales, obtienen la
algas, así como otros hongos y plantas. Hay energía y carbono necesarios de su anfitrión. Por
muchas cepas de hongos. otro lado, el nitrógeno
que son parásitos de algas, plantas, animales asimilado del aire por las bacterias es utilizado
parasitados por diferentes organismos por la planta.
Las lombrices de tierra están parasitadas por • La bacteria Rhizobium puede vivir en el suelo
hongos, bacterias, virus, etc. durante años sin tener ningún
2.1.4.2.5 Depredación contacto con una planta, utilizando
La depredación es una asociación / explotación monosacáridos y manitol como el
en la que el organismo depredador fuente de C y energía. En tales condiciones, no
se alimenta directamente y mata al organismo de exhiben ninguna
presa. Es uno de los mas capacidad para reducir y fijar nitrógeno, pero lo
interrelación dramática entre microorganismos obtienen del sustrato
en la naturaleza, por ejemplo, la en forma de nitrógeno amónico. Sin embargo,
Los hongos nematófagos son los mejores una vez en las proximidades de
ejemplos de hongos depredadores del una planta papilionácea, con la que pueden
suelo. Especies interactuar, penetran su
de Arthrobotrytis y Dactylella se conocen como sistema de raíces y forman nódulos que
hongos atrapadores de nematodos. Otro participan en el nitrógeno atmosférico
ejemplos de depredadores microbianos son los fijación.
protozoos y los hongos del moho del limo que • El sistema simbiótico se forma solo con tipos
se alimentan de bacterias y reducen su particulares de
población. Los bacteriófagos también pueden ser plantas papilionáceas y las especies adecuadas
considerados depredadores de bacterias. del género Rhizobium .
2.1.5 Interacción mutua de plantas y 2.1.5.1.1 Rizosfera
microorganismos La rizosfera es la capa de suelo alrededor de las
El ejemplo más típico de interacción directa de raíces donde, entre otros,
bacterias con plantas son las en grandes concentraciones, bacterias vivas,
siguiente simbiosis: hongos, protozoos, nematodos, ácaros,
colémbolos, que suelen formar grupos de a los nutrientes que son degradados y absorbidos
especies características de un determinado por hongos. Las plantas suministran hongos
planta. con sustancias orgánicas en forma de productos
• La rizosfera está ocupada por una gran variedad de asimilación transportados desde
de formas, sin embargo hojas a raíces. La micorriza es un fenómeno
las Pseudomonas y Achromobacter , así como generalizado; no solo concierne
los desnitrificantes son los raíces de árboles, arbustos, especies de flores,
Los más numerosos y menos numerosos pero también plantas cultivadas como
son Arthrobacter y Bacillus. cereales y patatas. Hay dos tipos de micorrizas:
formas. Los organismos anteriores utilizan los • Ectotrófico,
nutrientes liberados por las raíces. • Endotrófico.
El mayor número de microorganismos va 2.1.5.2.1 Micorrizas ectotróficas
acompañado de una mayor El hongo se desarrolla en la superficie de las
actividad de la fauna del suelo, especialmente de raíces de las plantas, creando una especie de
aquellos organismos que se alimentan de manguito
raíces y microorganismos. compuesto por hilos entrelazados de micelio. Las
• El número de bacterias en la rizosfera puede hifas externas de este
incluso ser 1000 veces el micelio penetra en el suelo, mientras que los
más alto que fuera de la rizosfera. La proporción internos penetran en las capas superficiales
de bacterias desde adentro de tejidos radiculares.
la rizosfera al número de bacterias del exterior se • Como resultado de la micorriza, las raíces
llama el pierden sus pelos radiculares y se vuelven
efecto rizosfera y está marcado con el símbolo R más corto ya que las funciones de las raíces son
/ S (R - rizosfera, asumidas por los hongos. Porque
S - suelo). La fuerza de succión del micelio es mucho más
• Los microorganismos de la rizosfera también fuerte que la de las raíces.
tienen un gran efecto en las plantas. Ellos la planta se abastece mejor de agua y sales
conducir a una degradación continua de minerales que en los casos
compuestos orgánicos y minerales, cuando no hay micorrizas.
que se ponen a disposición de las • Para las plantas que interactúan con hongos
plantas. Además, producen orgánicos micorrízicos, la absorción de
y ácidos no orgánicos, influyen en la disolución el nitrógeno puede aumentar en un 90%, el
de sales minerales y fósforo en un 20% y el potasio en
proteger las plantas contra los fitopatógenos. 75%.
http://ebookcentral.proquest.com • Los hongos también producen sustancias que
estimulan el crecimiento de las raíces y algunas
son capaces de fijar nitrógeno. Ese tipo de
hongos simbióticos pertenecen principalmente a
Página 21 los basidiomicetos.
Microbiología ambiental: suelo 2.1.5.2.2 Micorrizas endotróficas
2.21 La micorriza endotrófica ocurre generalmente
• Un efecto desfavorable se debe a la actividad entre las plantas verdes y algunas
metabólica de la microflora. árboles de hoja caduca.
que provocan el agotamiento del oxígeno • En este tipo de interacción, las raíces de las
necesario para el desarrollo de plantas no difieren externamente de
desnitrificadores. Como consecuencia, algunas los que no tienen micorrizas.
sustancias fitotóxicas pueden ser • El interior de las células de la raíz está lleno de
producidos, como alcoholes, antibióticos o una gruesa red de entrelazados
compuestos fenólicos. hifas que son parcialmente digeridas por la
2.1.5.2 La simbiosis de hongos y plantas planta.
La micorriza es la interacción de los hongos con • La micorriza endotrófica está formada por
las plantas vasculares. En este tipo los hongos imperfectos.
de interacción, ambos organismos se http://ebookcentral.proquest.com
benefician. Los hongos se convierten en raíces de Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
plantas. Ellos
penetran en sus células y estimulan su
crecimiento mediante la producción de la Página 22
hormona auxina. 2.22
Debido a las micorrizas, las plantas obtienen una Biotecnología ambiental
mayor superficie absorbente y un mejor acceso 2.1.6 Biorremediación del suelo
La biorremediación es un grupo de métodos o Microorganismos, que habitan naturalmente el
procesos de tratamiento diseñados para medio ambiente suelo / agua.
Mejorar la degradación microbiana natural de sometidos a purificación, o por otros
contaminantes orgánicos. La microorganismos, que se derivan de
Los microorganismos llevan a cabo la diferentes ambientes. Sin embargo, en ambos
degradación de sustancias nocivas a un nivel casos, se caracterizan por
menos tóxico. una alta actividad de degradación de los
o estado no tóxico. Los microorganismos utilizan 'xenobióticos'. La elección de cepas capaces de
la materia orgánica que contamina el medio ser
ambiente. utilizado para la inoculación de los suelos
compuestos como sustratos contaminados crea muchos problemas.
alimentarios. Después de la degradación de • Aparte de la alta eficiencia en la
compuestos contaminantes, descomposición de 'xenobióticos', el
la población de microorganismos se Las cepas elegidas también deben poseer muchas
reduce. Microorganismos muertos o bajos características adicionales que permitan
cantidad de microorganismos que una vez su adaptación y desarrollo en un nuevo entorno.
carecen de sustratos alimentarios, ya no • Una de las condiciones para la adaptación de los
representan inoculantes en el suelo es
peligro para el medio ambiente. la falta de interacción antagónica con el agua
El objetivo de la biorremediación es la natural y el suelo
neutralización de la contaminación orgánica. microflora.
para lograr concentraciones indetectables o http://ebookcentral.proquest.com
concentraciones permitidas por el Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
regulaciones nacionales de países
particulares. La biorremediación se utiliza para
limpieza de suelos y aguas subterráneas, así Página 23
como de aguas residuales y lodos. Durante Microbiología ambiental: suelo
la utilización de la biorremediación con el fin de 2.23
neutralizar la contaminación, • Además, no pueden ser microorganismos
Deben cumplirse las siguientes condiciones: patógenos ni patógenos que,
(a) el medio ambiente sometido a durante el crecimiento en hidrocarburos,
biorremediación debe contener producen sustancias con citotóxicos,
microorganismos caracterizados por procesos propiedades mutagénicas o cancerígenas.
catabólicos específicos, La selección de microorganismos especializados
(b) los microorganismos utilizados en el proceso en la degradación de determinados
de biorremediación deberían compuestos se basa en los procesos de su
capaz de convertir eficientemente compuestos adaptación u operación genética.
químicos y reducir Las sustancias que constituyen la contaminación
su concentración hasta el nivel permitido por la del medio ambiente, por regla general, son
normativa, compuesto por muchos compuestos. Por lo tanto,
(c) los metabolitos producidos durante la una limpieza completa del suelo requiere
biodegradación no deben tener mezcla especial, cuidadosamente seleccionada,
propiedades tóxicas, mutagénicas o de microorganismos. Utilización de mutado
cancerígenas, y microorganismos es útil sólo en métodos ex
(d) las condiciones en el área inmediata, donde se situ donde condiciones precisas
está llevando a cabo el proceso. del control del proceso y la prevención de la
realizado, debe ser favorable para el crecimiento contaminación por peligrosos
y la actividad de la existen mutantes. Para evitar problemas
microorganismos (nutrientes adecuados, pH relacionados con la introducción de
aceptable, oxígeno u otros organismos extraños en el medio ambiente, las
aceptor de electrones, nivel redox aceptable, mezclas de microorganismos deben
humedad favorable). ser creado para degradar la
La tasa de biodegradación puede estar limitada contaminación. Además, las técnicas utilizadas
por: la temperatura, la toxicidad de para permitir que los microorganismos se
contaminantes concentrados o limitaciones de adapten a las nuevas condiciones deben ser
transferencia de masa. mejorado. Se puede obtener el alto número
2.1.6.1 Microorganismos utilizados en inicial de microorganismos en el suelo.
tecnologías de remediación al inicio del proceso de depuración mediante la
Los procesos de biorremediación pueden ser inoculación del suelo
realizados por autóctonos
con microorganismos. Esto permite una Página 24
biorremediación más rápida y eficaz.
proceso. La inoculación del suelo se realiza 2,24
después de cultivar los microorganismos.
• campo electromagnético para acelerar la
en un biorreactor.
migración bacteriana en el suelo.
Los microorganismos autóctonos naturales
Debido al hecho de que los biopreparados están
cultivados o especialmente preparados
compuestos por organismos vivos,
cepas derivadas de una colección de cultivos y /
su aplicación requiere un conocimiento profundo
o las preparaciones comerciales
del tema, así como una
se utilizan en el proceso de inoculación. Las
Supervisión cuidadosa del proceso de limpieza.
cepas se almacenan en el liofilizado
2.1.6.2 Estimulación de la biorremediación
forma, congelada o colocada en una suspensión
Los procesos de biorremediación están diseñados
especial. Los microorganismos pueden ser
para optimizar las condiciones para microbios.
incorporado tanto en el suelo como en el medio
crecimiento y degradación de
acuático en forma de un
contaminantes. Crecimiento y metabolismo
suspensión o colocado sobre un soporte sólido
microbiano
(inmovilizado).
de contaminantes requieren macronutrientes
Los cultivos microbianos suelen contener una
(fósforo y nitrógeno) y
mezcla de bacterias, nutrientes, un
micronutrientes. La demanda de nutrientes es
soporte sólido y posiblemente
específica para cada caso. Ha sido
enzimas. Dependiendo de la composición de
determinó que la proporción de carbono a
estos
nitrógeno y fósforo dentro del
biopreparados utilizados para la
el suelo debe oscilar entre 100: 10: 1 (por
biorremediación, los anteriores se pueden
peso). Por tanto, la condición básica
subdividir en
para una correcta bioestimulación es el control de
microbiológico (bacteriano), enzimático y
nitrógeno y fósforo
bacteriano-enzimático. La ventaja
concentraciones en el suelo por aplicación de
de preparaciones microbiológicas en relación con
fertilizantes minerales. Lo mas
preparaciones enzimáticas es el
los adecuados, para el propósito anterior, son
hecho de que los microorganismos se multiplican
sulfato de amonio y sodio
en un ambiente previamente limpio
fosfato (fuentes de nitrógeno y fósforo). Además,
mientras que las preparaciones enzimáticas se
el magnesio
añaden, en dosis específicas, sin
sulfato, carbonato de sodio, cloruro de calcio,
la posibilidad de multiplicación. Una de las
sulfato de hierro también se utilizan para
condiciones que deben cumplirse
el propósito. La elección de las dosis adecuadas
Para obtener una biodegradación efectiva es la
de las sustancias biogénicas.
accesibilidad de las bacterias a los
debe ser muy preciso y reajustado a las
Capas de suelo contaminadas. La migración
condiciones del suelo, ya que ha sido
dentro del suelo depende del número de
demostrado que, por ejemplo, los compuestos de
microorganismos así como en el tipo de
nitrógeno en cantidades excesivas pueden
suelo. Los efectos de la biodegradación.
ralentizar
proceso de xenobióticos en el suelo dependen del
por el proceso de biodegradación. La selección
método utilizado para inocular
de nutrientes con un óptimo
el suelo con microorganismos. Incluso la
la composición se lleva a cabo en laboratorios. El
distribución de microorganismos dentro del
tipo de nutrientes que faltan es
debe proporcionarse el suelo y su contacto con
establecido por el crecimiento de bacterias en
los nutrientes contenidos en el suelo.
presencia de diversas fuentes de biogenia
La introducción superficial de los inoculantes no
elementos y mediante una cuidadosa supervisión
es muy eficaz debido a la lentitud
de su crecimiento. Además, la contaminación
migración de microorganismos, especialmente
Se miden la reducción, el consumo de oxígeno y
en suelos, que contienen arcilla y limo.
la liberación de dióxido.
Para agilizar el proceso de migración se aplica lo
2.1.6.3 Clasificación de los métodos de
siguiente:
biorremediación
• inyecciones con el uso de equipos de alta
La división de los métodos de biorremediación
presión,
puede realizarse de acuerdo con
• inmovilización de microorganismos sobre
el nivel de oxigenación del ambiente, así como la
soportes sólidos,
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de ubicación de la limpieza
proceso. Dependiendo del nivel de oxigenación
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos. ambiental, los tipos
de purificación biológica se puede dividir en Las técnicas son más lentas que las ex situ ,
aeróbicos, anaeróbicos / aeróbicos, pueden ser difíciles de manejar y son más
y anaeróbico. Los microorganismos aeróbicos eficaz en sitios con suelo
utilizan oxígeno como aceptor de electrones. permeable. Los métodos ex situ se utilizan donde
Los microorganismos anaeróbicos utilizan otros hay
aceptores de electrones como el nitrato, es peligro de migración de contaminantes tóxicos
sulfato, hierro, manganeso o ciertos compuestos a las aguas subterráneas y cuando el
orgánicos. Facultativo El proceso de desintoxicación debe realizarse en
los organismos pueden usar oxígeno, si está un corto período de tiempo.
presente, u otros aceptores de electrones, si no lo 2.1.6.3.1 Métodos in situ
está. Los métodos in situ se basan principalmente en
La mayoría de los procesos de biorremediación la bioestimulación del contaminante orgánico
del suelo son aeróbicos. En condiciones procesos de degradación enriqueciendo aguas o
anaeróbicas el suelos en elementos biogénicos, por
La descomposición microbiológica de los corrección de la acidez así como por su
contaminantes es más lenta y los productos aireación. Los siguientes métodos in situ
finales puede ser usado:
puede tener un carácter tóxico. La fuente de Métodos agrícolas: estos son los métodos de
oxígeno utilizada por los microorganismos. descontaminación del suelo. Son eficaces con
en los procesos respiratorios puede ser el aire casi todos los componentes de los combustibles.
atmosférico que ingresa al suelo Los productos más ligeros, como la gasolina, se
pasivamente o por la fuerza. La ruta pasiva eliminan por vaporización o, en menor medida
depende de la penetración natural del suelo. extensión, por biodegradación. Cuando se trata
por el aire atmosférico. Se puede realizar un de productos pesados, como combustibles diesel
aumento activo del oxígeno suministrado. y queroseno, la contaminación se elimina
mediante la mezcla mecánica de las capas principalmente por biodegradación. Allí
superficiales del suelo (rastrillado, arado, etc.), Hay muchas variaciones de métodos agrícolas
la introducción de lanzas pulverizadoras dependiendo de la técnica
perforadas especiales que se introducen soluciones. La variación más simple depende de
directamente en el esparcir el suelo contaminado
http://ebookcentral.proquest.com en una fina capa de no más de 0,5 m de espesor
seguido de un período de arado
o rastrillado profundo para airear el suelo. Esto
activa la microflora
Página 25 aportando nutrientes esenciales, oxigenando el
Microbiología ambiental: suelo suelo y desacidificando
2,25 cuando sea necesario. Los nutrientes se reponen
suelo o aireación con compresores y mediante la aplicación de nitrógeno,
ventiladores. Además, el medio ambiente fertilizantes de fosfato o potasio, cuando sea
El enriquecimiento en oxígeno puede tener lugar necesario. La desacidificación del suelo puede
debido a la utilización de hidrógeno. se logra mediante el encalado. Plantar pastos o
peróxido, que se descompone en el suelo en agua plantas papilionáceas en
y oxígeno. Dependiendo de los suelos contaminados también pueden ayudar
nivel de contaminación, así como el carácter del a los procesos de limpieza. Detallado
medio ambiente recultivado, Los programas de fertilización, tratamientos
La biorremediación puede tener lugar mecánicos y otros están diseñados para
mediante métodos tanto in situ como ex situ . En cada caso individual.
el primero, in situ , el punto es que la Bioextracción: La situación es
contaminación se elimina directamente en significativamente más complicada cuando el
el lugar donde ocurre. Sin embargo, en el surge la necesidad de eliminar los contaminantes
segundo método, el contaminado de las capas más profundas del suelo.
el suelo o las aguas se excavan antes de los La estimulación del crecimiento de
procedimientos de regeneración reales. En microorganismos en descomposición, por
las técnicas in situ no requieren la excavación de ejemplo,
los suelos contaminados; entonces se puede productos del petróleo, es más difícil; sin
ser menos costoso, generar menos polvo y es embargo, los métodos son similares.
posible tratar un gran volumen de También es esencial en este caso entregar los
suelo y provocan una menor liberación de nutrientes faltantes, suministrar oxígeno
contaminantes que los métodos ex situ . Pero in y, si es necesario, inocular el suelo con
situ microorganismos capaces de
descomponer los contaminantes. Los procesos de Página 27
ventilación y enjuague del suelo con
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de Microbiología ambiental: suelo
2,27
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos. El método anterior es una combinación
de métodos in situ y ex situ que son
complementarios entre sí, lo que a su vez,
Página 26 permite la optimización de la
2,26 proceso. La biorremediación estimulada por
agua puede ser asistida por tensioactivos. Eso
también se utilizan soluciones que contienen
Se ha demostrado que los tensioactivos sintéticos
nutrientes o cultivos bacterianos activos.
y los biotensioactivos aceleran la
Para lo anterior es necesario el siguiente
procesos de biodegradación de contaminantes
equipamiento técnico: aspiración y
hidrófobos, particularmente de
bombas de desplazamiento positivo, sumideros y
fracciones de productos petrolíferos. Mayor
pantallas que evitan la propagación
solubilidad y formación de emulsión.
de contaminante dentro de los suelos. La
dar como resultado una mejor movilidad de los
condición de un proceso de limpieza eficaz es
productos del petróleo en el suelo y en mayor
también una adecuada configuración geológica
especificidad
del terreno, lo que permite un control
Superficies accesibles a los
flujo del medio (aire, vapor de agua,
microorganismos. Los tensioactivos también
soluciones). La descomposición natural
pueden aumentar la
puede acelerarse utilizando la denominada
permeabilidad de los suelos.
bioextracción. Optimización de
Bioventilación: La aceleración de los procesos
El proceso se puede lograr enjuagando el suelo y
naturales de biodegradación.
los entornos acuáticos.
puede ser asistido por la ventilación del suelo. La
a través de la infiltración forzada de aguas
ventilación es un método físico, que
subterráneas (biorremediación estimulada por
puede utilizarse como una técnica de
agua
descontaminación independiente utilizada para el
in situ ) y aireación (bioventilación del
maximización de la volatilización de
suelo). Microorganismos y nutrientes
hidrocarburos de baja masa molecular (por
entregados con agua estimulan la biodegradación
ejemplo, productos a base de gasolina o
de los productos del petróleo mientras
disolventes). Sin embargo, durante este
el aire enriquece el suelo en oxígeno,
proceso, se produce muy poca biodegradación.
contribuyendo así a la biodegradación. Bioventilación
Biorremediación estimulada por agua El proceso de ventilación permite la eliminación
El objetivo del proceso anterior es forzar un flujo de productos volátiles del petróleo.
vertical y luego horizontal de de las zonas de aireación y saturación, mientras
agua junto con los contaminantes orgánicos en el que al mismo tiempo enriquece
agua y el suelo. suelo con aire y aumentando el nivel de
Biorremediación del suelo estimulada por agua oxigenación. El proceso de aireación
Este método se utiliza para limpiar el medio puede ser tanto activo como pasivo. En el caso de
ambiente del petróleo. la ventilación pasiva, la aireación
sustancias no solubles relacionadas reunidas en se realiza mediante la utilización de redes de
la superficie de las aguas subterráneas. tuberías perforadas. Ventilación activa
Durante el proceso, el agua subterránea se Sin embargo, depende de la creación de presión
bombea hacia la superficie, se purifica, negativa (extracción del
oxigenado y devuelto a la fuente después del aire de tierra) o presión positiva (inyección de
enriquecimiento de nutrientes. En otra aire). La efectividad del suelo.
En casos, se puede utilizar el flujo de las aguas y la bioventilación del medio acuático depende
subterráneas. Las aguas son del nivel de oxígeno en el
obtenido de pozos, que se sitúan en los puntos aire contenido en el suelo, nivel de biogenes,
más bajos. Estas aguas son condiciones de reducción-oxidación,
luego enviado a biorreactores, en los que el presencia de agentes tensioactivos, nivel de
proceso de biodegradación del petróleo- saturación (humedad), pH y
se producen productos relacionados. Luego, la temperatura.
misma agua se devuelve a su fuente. Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de
Buddolla, V. (2016). Biotecnología ambiental :. Obtenido de http://ebookcentral.proquest.com
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Página 28
2,28
La forma más eficaz de suministrar oxígeno al Página 29
suelo contaminado Microbiología ambiental: suelo
es introduciéndolo con aire comprimido. El 2,29
ozono (O 3 ) también se utiliza como Los biorreactores también se pueden utilizar para
fuente alternativa de oxígeno. Sin embargo, la descontaminación de aguas subterráneas.
existe cierto peligro en el uso de ozono como Son fijos o portátiles, lo que facilita el proceso y
la fuente de oxígeno ya que posee algunas menos costoso. Los biorreactores portátiles se
propiedades tóxicas. utilizan para la descontaminación del suelo
2.1.6.3.2 Métodos ex situ aguas después de bombear el material del lecho
Los métodos ex situ se pueden implementar portador de agua o para
cuando el peligro de un contaminante tóxico descontaminación de aguas derivadas del
se produce la migración a las aguas subterráneas proceso de suelo contaminado
y cuando el proceso de desintoxicación enjuague. Hay dos tipos diferentes de
debe completarse en un corto período de tiempo. biorreactores, fluidizados e inmovilizados.
Método del biorreactor: el proceso de camas. La elección del lecho depende
descontaminación es más eficaz cuando principalmente del tipo de contaminantes y
funcionar en biorreactores especialmente su concentración en el agua que se va a
diseñados. Proporcionan un control efectivo de procesar. El inmovilizado
todos La biomasa es una mezcla de microorganismos
parámetros, entrega de los ingredientes seleccionados capaces de biodegradarse
requeridos, oxigenación e inoculación de contaminantes particulares. Los
la tierra. Sin embargo, el costo de este método es microorganismos pueden quedar atrapados
bastante alto debido a la tecnología dentro del portador.
requisitos, así como la necesidad de transporte de estructura (polímeros naturales como agar,
masas pesadas. Por lo tanto, alginato, colágeno o sintético
El método anterior no se usa con frecuencia y polímeros como geles de poliacrilamida,
generalmente se emplea para poliuretanos y otros) que es
cantidades de suelo. llamada inmovilización activa.
Representación esquemática del método del En la inmovilización pasiva, los
biorreactor microorganismos se unen a la superficie.
Entre las tecnologías basadas en métodos ex de un material poroso (carbón activado, por
situ , se encuentran biorreactores ejemplo) o puede crear una gelatina
y lagunas utilizadas para la descontaminación de película sobre la superficie de elementos
aguas residuales oleosas y reactores para estacionarios (anillos de cerámica, baldosas de
tratamiento de masas semilíquidas de suelos, plástico,
lodos y depósitos contaminados. espuma de poliuretano). En tales biorreactores, el
Los materiales sólidos se mezclan con líquidos agua contaminada fluye
seguido de aireación. En ambos contracorriente al aire a través del lecho sólido
tipos de biorreactores, el nivel de oxígeno que contiene el inmovilizado
disuelto puede controlarse simplemente microorganismos.
como el pH y la concentración de nutrientes Método de biopila: el método consiste en
inorgánicos. Esta técnica es trasladar el material contaminado
similar al que trata los residuos municipales tierra o tierra en un lugar especialmente
utilizando el lodo activado preparado.
método. Además, la técnica puede ser ayudada Representación esquemática del método de biopila
por tensioactivos o dispersantes. El suelo excavado está dispuesto en forma de un
para desorber los hidrocarburos de las partículas montón alargado dentro de un
sólidas y aumentar zanja revestida de papel de aluminio que está
el grado de dispersión de contaminantes de aceite equipada con sistemas de drenaje y
insolubles en agua. Activo en superficie ventilación. La
los agentes usados en estos métodos pueden ser El proceso también se ve favorecido por la
sintéticos o naturales. Los biotensioactivos aireación y la adición de agua y nutrientes. La
tienen Buddolla, V. (2016). Biotecnología
ambiental :. Obtenido de
encontrado un uso cada vez mayor debido al Creado desde upsal el 2020-05-27 15:47:13.
hecho de que son más ecológicos
amigables y biodegradables.
http://ebookcentral.proquest.com Página 30
Copyright © 2016. Alpha Science International. Reservados todos los derechos. 2.30
El aire se bombea a través del sistema de tubos Los efectos más importantes provocados por los
perforados equipados con un plaguicidas son:
soplador que crea una presión negativa en la • alteraciones en el equilibrio ecológico de la
parte inferior del montón. En mas simple microflora del suelo,
tecnologías, la aireación real está asegurada por • La aplicación continuada de grandes cantidades
el desplazamiento mecánico del suelo. de pesticidas puede causar alguna
El montón generalmente se cubre con un túnel de cambios duraderos en la microflora del suelo,
aluminio equipado con un sistema de • efecto adverso sobre la fertilidad del suelo y la
aspersores a través de los cuales se entregan agua productividad de los cultivos,
y nutrientes. En muchos recientemente • inhibición de microorganismos del suelo que
tecnologías usadas, el agua circula en un sistema fijan N 2 como Rhizobium,
cerrado. Reflujo desde dentro del Azotobacter, Azospirillum, etc. y celulolíticos y
el suelo se filtra en biorreactores y luego se fosfato-
bombea al depósito desde microorganismos solubilizantes,
que, después del enriquecimiento en nutrientes y • supresión de bacterias
el crecimiento de los microorganismos, es nitrificantes, Nitrosomonas y Nitrobacter, medi
devuelto por el sistema de rociadores al montón. ante
2.1.7 Papel de los microorganismos del suelo También se han utilizado fumigantes de suelo,
en la biodegradación de plaguicidas bromuro de etileno, telona y vapam.
y herbicidas informó
Los pesticidas son las sustancias químicas que
matan las plagas y los herbicidas son los
productos químicos que matan las malas
hierbas. En el contexto del suelo, las plagas son
hongos, bacterias, insectos,
gusanos y nematodos, etc. que causan daños a los
cultivos de campo. Por lo tanto, en general
sentido, los pesticidas son insecticidas,
fungicidas, bactericidas, herbicidas y
nematicidas que se utilizan para controlar o
inhibir enfermedades de las plantas y plagas de
insectos.
Aunque la aplicación a gran escala de pesticidas
y herbicidas es un
parte del aumento de los rendimientos de los
cultivos, el uso excesivo de estos productos
químicos conduce a la
desequilibrio microbiano, contaminación
ambiental y peligros para la salud. Un ideal
El plaguicida debe tener la capacidad de destruir
rápidamente la plaga objetivo y debe
capaz de degradar sustancias no tóxicas lo más
rápido posible.
El "sumidero" definitivo de los plaguicidas
aplicados en la agricultura y el público
el cuidado de la salud es suelo. Siendo el suelo el
almacén de multitud de microbios, en
cantidad y calidad, recibe los productos químicos
en diversas formas y actúa como un
carroñero de sustancias nocivas. La eficiencia y
la competencia para manejar
Los productos químicos varían con el suelo y sus
características físicas, químicas y biológicas.
caracteristicas.
2.1.7.1 Efectos de los plaguicidas
Los plaguicidas que llegan al suelo en cantidades
significativas tienen un efecto directo sobre el
suelo
aspectos microbiológicos, que a su vez influyen
en el crecimiento de las plantas. Algunos de los
-·-
Capítulo 10
Tratamiento anaeróbico
Generalidades
El tratamiento anaeróbico es uno de los sistemas más complejos para aguas re-
Copyright © 2016. Ecoe Ediciones. All rights reserved
siduales; sin embargo, las lagunas anaeróbicas que se encuentran en este grupo
de reactores, tienen un dimensionamiento bastante sencillo y, corno se mencionó
anteriormente, estas lagunas se construyen para disminuir la carga orgánica corno
tratamiento preliminar de aguas residuales crudas antes de ingresarlas a otros
sistemas, como lagunas facultativas, lodos activados, etc.
Las características bioquímicas en los sistemas anaeróbicos se expusieron en un

capítulo anterior; por lo tanto, aquí nos ocuparemos de la biología de los sistemas
anaeróbicos en conjunto, y algunas características de los sistemas en lorma indi-
vidual de acuerdo con el tipo de reactor.
En Perú aún no se ha difundido este tipo de tratamiento a pesar de ser de bajo

costo, y los sistemas ocupan espacios bastante reducidos en comparación con el
sistema de lagunaje. Otros países, como Brasil y Colombia ya han difundido en
mayor escala los modelos anaeróbicos, principalmente para las industrias, que
resultan completamente eficientes.
El tratamiento anaeróbico se realiza por meianogénesis, que es un proceso en el que

los equivalentes de electrón de la materia orgánica (DBO) se utilizan para reducir el
Lazcano Carreño, C. A. (2016). Biotecnología ambiental de aguas y aguas residuales (2a. ed.). Ecoe E
diciones. https://bibliotecas.ups.edu.ec:3488/es/ereader/bibliotecaups/122526?page=408
3 70 ��-
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL DE AGUAS Y AGUAS �ESIDUALES
carbono a su estado mínimo, -4, en CH, o metano. Cada mol de metano contiene 8
equivalentes de electrón o 64 g de 080 o DQO (Castillo, 2005).
El proceso se lleva a cabo en reactores completamente cerrados, en ausencia

completa de oxígeno y donde los microorganismos presentes tanto facultativos
como anaeróbicos estrictos, van a realizar la digestión anaeróbica tal como se
describió anteriormente, hasta transformar la materia orgánica en CO, y CH4;
(Morales, 2005) algunas ventajas de la digestión anaerobia son la alta capacidad
de depuración cuando se aplican cargas elevadas y la baja producción de lodos
(cinco a diez veces menos que los procesos aeróbicos) (Steyer, 2006), bajo
requerimiento de nutrientes y recuperación de energía como gas metano. Una
desventaja de este proceso es que las reacciones son bastante lentas para la
estabilización de la MO y la presencia de sustancias tóxicas inhibe el proceso en
cualquiera de sus etapas (Malina, 2007).
Microbiología del proceso anaeróbico

Como se mencionó anteriormente, el proceso de digestión anaeróbica es llevado
a cabo por un consorcio de microorganismos, entre los que se encuentran bac-
terias heterotróficas facultativas, bacterias acetogénicas y arqueas rnetanogénícas;
el proceso anaeróbico consiste en una serie de reacciones bioquímicas originadas
por microorganismos que transforman la materia contaminante (desagüe, lodos,
etc.), en gas metano y C02 (biogás). Esta conversión se realiza en forma natural en
diferentes ambientes, como en el estómago de los rumiantes (rumen), sedimentos
marinos, de ríos y lagos, fuentes termales, volcanes y en sistemas controlados

como los digestores anaerobios (Porrier, 2005).
Estas transformaciones las realiza una serie de bacterias y otros microorganismos

que actüan sinérgicamente, distinguiéndose principalmente cuatro etapas en el
proceso.
Los procesos importantes que ocurren en un sistema anaeróbico son: hidrólisis,
acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis (figura 197).
El proceso de hidrólisis
Consiste en la degradación de las macromolécu\as presentes en las aguas residua-

les (carbohidratos, proteínas, lípidos, eic.), por medio de enzimas producidas por
los microorganismos denominadas enzimas hidrolíticas, que son vertidas al medio
o asociadas a la envoltura externa celular en moléculas de menor tamaño(< 1 000
amµ o daltons) para ser directamente asimiladas por las células (Confery Logan,
1997) y lo efectúan bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriacea, ade-
más de los géneros Bacilllls, Peploslreplococclls, Pmpionobaclerium, Bacleroides,
��-
CAPÍTULO 10: TRATAMIENTO ANAl:RÓBICO 3 71
Micrococcus y Clostridium. Las bacterias con actividad proteolítica segregan enzi-

mas denominadas proteasas y peptidasas y pertenecen a los géneros Clostridium,
Peptococcus, Biphidobactelium y Streptococcus y entre las bacterias con activi-
dad lipolítica se ha aislado Butyrovibrio fibrosolvens, que hidroliza fosfolípidos
(Rodríguez, 2009). Los productos generados de la hidrólisis deben ingresar a
las células mediante diferentes mecanismos de transporte: 1) difusión facilitada,
en el cual interviene una proteína transportadora, 2) sistema sensible a shocl1 o
transporte activo, 3) simporte de protones en el que intervienen dos o más iones
en paralelo o cotransporte (por ejemplo, el sistema lactosa permeasa), 4) sistema
fosfoenolpiruvato fosfotransferasa, que involucra mecanismos de fosforilación
durante el transporte (Martín, 1994).
El proceso de acidogénesis
Aquí, los sustratos solubles que se producen después de la hidrólisis son seguida-
mente acidificados, produciéndose ácidos orgánicos como el acético, propiónico,
butírico, láctico, eic.; alcoholes como el etanol propano\ y butanol, producción
de amoniaco, C02 e H2. De acuerdo con los compuestos que se encuentren en
los desagües, si estos proceden de la industria farmacéutica u otra industria de
derivados químicos, podrían serdiftcilrnente hidrolizables; mientras que en los
desagües de las industrias alimentarias o lácteas podría ocurrir lo contrario, que
estas sean fácilmente hidrolizables, produciéndose una rápida descomposición
con una acidificación muy intensa, que podría llevar a un descenso del pH del
sistema con valores que inhiban los procesos posteriores de la metanogénesis;
igualmente, otro factor que podría inhibir la flora metanogénica es la fermenta-

ción de aminoácidos que genera una elevada concentración de amonio (Lokshina
et al., 2003). Los aminoácidos que se derivan de la hidrólisis de proteínas se
fermentan por oxidación anaeróbica unida a la producción de hidrógeno, lo que
requiere la presencia de microorganismos que consuman hidrógeno (Ramsay,
2001), o los aa pueden ser degradados por la reacción de Stikcland, tal como
ocurre con Clostridium en anaerobiosis: una desaminación oxidativa de Ala, Val
o Leu que actúan como donadores de H2 y una desarninación oxidativa de Gly,
Pro e Hidroxipro, con producción final de ácidos, C02 y amoniaco (Bello, 2000).
Los lípidos cuyos productos de la hidrólisis son el glicerol, la colina y ácidos gra-
sos de cadena larga, son oxidados anaeróbicamente a ácidos grasos volátiles ce, a
C,), por �-oxidación, produciendo ácido acético. La �-oxidación es inhibida por
niveles elevados de H2.
El proceso de acelogénesis
Donde las bacterias acetogenicas por fermentación transforman los azúcares en
propionato y butirato y son llamadas bacterias acetogenas productoras obligadas
de hidrógeno, que mantienen una asociación sinirofica con los metanógenos
372 BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL DE AGUAS Y AGUAS �ESIDUALES
hidrogenofílicos; se encuentran en número limitado de especies. Las especies

aisladas son: Syntrophomonas sapovorans, Syntrophobacter wolinii, Syntrophomonas
wolfei, Syntrophospara b,yantii y Syntrophus buswellii. Existe además un grupo
de bacterias acetogénicas conocidas como bacterias homoacetogénicas, que
son anaerobias estrictas y usan el (02 como aceptar final de electrones, con
producción de acetato, entre las que se encuentran las siguientes especies:
Clostridium aceticum, C. fonnicoaceticwn y Acetobacterium woody.
Las bacterias homoacetogénicas producen acetato, bien a partir de sustratos

carbonados, o de la reducción de (02• Las bacterias acetógenas obligadas
productoras de hidrógeno oxidan los productos de la primera fase (propiónico y
butírico) en acetato, (02 e H2. La mayoría de ellas son anaerobias estrictas y para
su crecimiento dependen de la eliminación de H2 del medio debido a que inhibe
la acetogénesis (Arnaiz et al., 2000).
El proceso de metanogénesis
Los arquea metanogénícos son los responsables del proceso y se les puede agru-
par como sigue:
Aquellas que usan el H2 como fuente de energía, además del formato y ciertos
alcoholes, siendo el (02 el aceptar final de electrones que es reducido a metano;
por ejemplo: Methanobacterium.
Aquellas que usan compuestos que tienen el grupo metilo. Algunas moléculas son
oxidadas a (02 que actúa como aceptar de electrones con reducción a metano.
Por utilización del acetato, que constituye la mayor parte de metano formado, y
aquí encontramos los siguientes géneros: Methanosarcina y Methanotrix.
Las bacterias sulfatorreductoras, que reducen el sulfato a H2S (sulfurogénesis) en

completa anaerobiosis, pueden interferir con el proceso de meranogénesis gene-
rando problemas como: 1) competencia entre las bacterias reductoras de sulfato
con las arquea metanogénicas por sustratos comunes con disminución de la pro-
ducción de metano; así, se ha demostrado que la presencia ele sulfato en las aguas
residuales no es necesaria para el crecimiento de bacterias sulfatorreductoras, por
lo que pueden competir por el acetato (Stefane, 1998); 2) inhibición de varios
grupos bacterianos por la producción de H2S y 3) toxicidad generada por H2S,
malos olores y biocorrosión.
Los productos finales en la digestión anaeróbica lo constituyen el bíogas, for-

mado principalmente por una mezcla de metano y (02 y cantidades pequeñas
de H2S, H2, NH3, entre otros. En la tabla 30 se muestra la composición del bíogas
tomando en cuenta el sustrato utilizado (Coombs, 1990).
��-
CAPÍTULO 10: TRATAMIENTO ANAl:RÓBICO 3 73
1) Metanogénesis acetotrófica
Realizada por organismos del grupo de los arquea de los géneros
Methanosarcina y Methanosaeta, generando metano y (02 a partir del
ácido acético (70% de la producción de metano).
2) Metanogénesis hidrogenotrófica
Realizada por arqueas de los géneros Methanobacterium y Methanobrevi-
bacteriwn, que fijan el H2 y el (02 generando metano y agua (30% de la
producción de metano).
En general, para garantizar el proceso de metanogénesis se debe garantizar un
equilibrio entre las comunidades de microorganismos que intervienen, tornando
en consideración lo siguiente:
La tasa de crecimiento de las arquea metanogénicas es mucho menor que
la de las bacterias acidogénicas.
La velocidad de la metanogénesis, igualmente, es mucho menor que la
acidogénesis.
Si disminuye la tasa de reproducción de las arquea metanogénicas, se
producirá una acumulación de ácidos, lo que provocará la disminución
de la metanogénesis y por consiguiente la mterrupción de la remoción
de la DQO, generando malos olores en el sistema.
Figura 197, Proceso biológico en anaerobiosis
POL1MEROSY
MACROMOLtCULAS
IIIORÓLISIS Bacterias heterolróíic.1,

facultativas
MONÓMEROS,
AMINOÁCIDOS,
ÁCIDOS GRASOS, ETC.
Bacterias heterotr6íic.1s
ACIOOC tNF.515 •
• facultalivas
ETANOL, METANOL, ÁCIDO ACtrlCO,
PROPQÓNICO, BUT1RICO, ETC
• Clostrldi11111, Peptoco«11s, D N11lfovíbrio,

OCtNESIS '• 8ifi1/obactrri1Jm, Lactobacilus, ele .
j • j
--.
•
1
H20+ C02
•
1 ACETATO I
�IIITANOC tNESIS ,\ftt1111osarci11a

,\fel1111os11el11
Afeta11obaclf!ri11111
Afrt1111obrrvibactniu111 \__ co,
1 METANO 1
Modificodo de Rodrguez 1, 2009, Porrier G P., 2005
21 4 .::;B.:.:0;. E
1 . ;T.::;C::;.N.:.:Oc::L ;: .G.:c(�.A :..AM;;.;. ;.; ;.B..;c
O G �AS�R�ES�D
l . :.A.:.:.L.:::Dc::.E :..A:.:::G:.:::U,..:AS�Y.!....::!A�U
EN""T: E
I �U!,! A� S'...__
L�
6) Son longevos, acumulando los efectos de la contamina -
del tiempo. ci6 n a lo largo
--------
7) Son sensibles a perturbaciones,
8) Tienen largos ciclos de vida.
9) Se pueden cultivar en laboratorio y poseen baja variabilidad .
genét1ca.
10) Presentan una alta diversidad de especies.
11) En algunos países se cuenta con muestreos y análisis bien desarn 11 d
.
1 a taxonomia de muehos es biten conocida rro a os
y las respuestas de va · '
pecies .
. a diisnntos .
contaminantes están b ien documentadas. nas es.
Uso de bioindicadores y biomarcadores en problemas de salud

de los ecosistemas
La mayoria de los contaminantes tiene un efecto directo sobre diferentes procesos

fisiológicos en los seres vivos, que se pueden manifestar como efectos tóxicos, por
ejemplo, reducción del crecimiento, inhibición de la fotosíntesis, inhibición de la
actividad enzimática, etc.
Generalmente, las contaminaciones en los ecosistemas acuáticos vienen dadas
por los efluentes industriales que son arrojados a los cuerpos de agua y que, en
contacto con otras sustancias, pueden incrementar la capacidad tóxica por siner-
gia. Las algas son organismos ideales para ser usados como modelos de toxicidad
en bioensayos de respuesta rápida y en evaluación directa de la toxicidad.
Los efectos de los contaminantes pueden ser observados en los diferentes níve-
les de organización biológica. Las alteraciones moleculares son las primeras_ res-
puestas detectables y cuantificables, destacándose por su capacidad para se�alar
la presencia de contaminantes aun a niveles subletales. Tal conjunto de sena¡es
recibe la denominación de biomarcadores, por lo que se les considera comOif �
. . . . e se maru esta
respuestas biológicas a sustancias contaminantes ambítenta1 es qu d'da
a nivel molecular, bioquímico, celular o fisiológico y proporcionan una me �re
de la exposición al contaminante o de la magnitud del efecto que este causa so
el organismo.
. . tes naturales,
Para el establecimiento de condiciones de equilibrio de los ambíien ac-
íbílí
1 la toma de
es necesario realizar el monitoreo de estas áreas, lo que post ita íli . uírnicos
dones correctivas. Estos monitoreos no deben basarse solo enana r!d en la
151
1
de las muestras ambientales pues no predicen la afectación de la ca de estos
biota; para ello es necesario' medir los efectos en los organismos vivos medir el
ecosistemas. En este contexto, los biornarcadores son imponantes ;3r:o anterior
impacto de la salud del ecosistema, tal corno se mencionó en el cap tu
(Reece, 2000).
Escaneado con CamScanner

Entre estos biomarcadores se encuentran aquellos medidos celular o
molecularmente, cuya aplicación anticipa cambios en los diferentes niveles de
la comunidad biótica, especialmente en los elevados, por lo que pueden usarse
; . de forma predictiva a fin de poder tomar medidas de biorremediación antes de
que ocurran cambios ambientales irreversibles con consecuencias ecológicas
severas. Estos biomarcadores son de gran importancía en la evaluación de la
exposición y sus efectos de diferentes contaminantes, tales como metales pesados,
xenobióticos, orgánicos o compuestos organometalícos, pudiendo medirse a
través de diferentes modelos moleculares. Otra característica importante de
los biomarcadores es que pueden detectar la exposición a los efectos tóxicos
de los compuestos y sus metabolitos, que en algunos casos son metabolizados
rápidamente y eliminados del organismo, como los hidrocarburos polícíclícos
aromáticos y los organofosforados.
Una de las ventajas de los marcadores bioquímicos es la de proveer información

del estado de contaminación de un cuerpo de agua y sus efectos sinérgicos y
antagónicos. El metabolismo de los componentes recalcitrantes o xenobióticos
incluye reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis y en una segunda etapa,
los metabolitos formados pueden conjugarse con productos del metabolismo
endógeno (glucoronato, glutationa, etc.) y que pueden ser eliminados por el
organismo (Siroka, 2003).
Clasificación de los biomarcadores

Los biomarcadores se clasifican en:
Biomarcadores de la condición fisiológica
Razón O¡N2 que mide la utilización de reservas energéticas en dif�r:ntes
condiciones ambientales, especialmente utilizada para evaluar la exposición a
situaciones de baja calidad ambiental.
Biomarcadores de la condición celular
Los contaminantes ambientales afectan el metabolismo lisosomal intracelular
produciendo desechos que se acumulan en los lisosomas (gránulos de lipofucsina),
o afectando Ja permeabilidad de las membranas (estabilidad l_isosomal), que puede
llevar al rompimiento de estos y a la liberación de sus enzimas para finalmente
producir un proceso de autodigestión celular (Gómez, 2004).
Biomarcadores específicos para metales

detecta la utilización de metalotioleínas (MT) como índice de respuesta bioló-
gica en los O rgamsmos
· • .
acuaticos y terrestres , las cuales son proteínas especificas
h,

21 6 __!8�0
1 �T�CE �N�O�L��
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metales presentes en los organismos vivos; son utilizadas co

Para fijar · '6 n de concentraciones
· tnounrne.
canismo de defensa frente a l a exposict elevadas d
e tneta\es
Las algas como bioindicadores de la calidad de los ecosistemas a cuat1co1
,. ·
Algunos ensayos ecotoxicológicos han señalado el impacto del aceite y lo h'd
carburos en algas. Los híidrocarb uros petrog mcos en e l agua pueden afee s l to. é •
abundancia relativa de especies· de al gas, m · hil»

1 ien d o e l crecimiento
· de al lar b
especies sensibles y promovieniendoo eel crecumento
·· gunas
d e otras que sean toleran
·
por lo que muchas de estas se han consiiderad o como biiomdítead ores (Lujántes,de
Fabricius, 2000).
Variados experimentos han dado a conocer algunas microalgas como bioindica.

dores de contaminación. Selenastrum caprocomutum es una de las especies más
sensibles como organismo de ensayo a la exposición de hidrocarburos; también se
han usado especies como Scenedesmus quadricauda, Dunaliella sp., Monochrisis
sp. y Dunaliella tertiolecta, entre otras.
Otro uso importante de las microalgas como bioindicadores de contaminación
consiste en la búsqueda de una prueba sencilla para evaluar los efectos tóxicos
o deletéreos de metabolitos de cianobacterias; se han obtenido resultados satis·
factorios con Microcystis aeruginosa, alga potencialmente tóxica (Mateo, 2006).
Además, las microalgas se usan 'como indicadores de sustancias químicas po·
tencialmente tóxicas, como la morfolina, con la cual se ha experimentado para
conocer su toxicidad. Esta sustancia se comporta químicamente como una amina
secundaria; como resultado de las soluciones de nitrito u óxido de nitrógeno
gaseoso se forma N-nitrosomorfolina (NMOR), carcinógeno para los animales.
De modo general, muchas especies de microalgas han permitido el estudio del
impacto que puede tener determinada sustancia en el ambiente, así como la eva· ,
luación de la toxicidad de sustancias que se incorporan al mercado.
·
Existen · como
algunos trabajos en los cuales se usan las macroalgas bentónicas d
bioindicadores, destacando el trabajo de Calva (2008) realizado en la laguna e
cuenta
on ecomapan, Vieracruz (México), localizada en el golfo de México, que 31
S t . ' .
1
con una importante población pesquera y se conecta al mar por un canal de
metros de ancho y es de tipo mixohalino.
L . . . acroal·
as estaciones de muestreo se establecieron con base en la presencia de rn t'nit·
gas o past0 manno,
· - recolectadas analizadas fueron: Ulv a inte.s 1
l as especies
. y
lts, Bostrichia pinnata y Ruppia maritima (hidrofita).
rocas,
U. intestinalis habítI a tanto en agua marina como salobre, crece sobre tas
d aguas
qu�dando expuesta al sol durante la bajamar. Su presencia indica aporteS eoeiada
residuales B pinn t
l
. · ·
a as ratees de Rizh h
ªª
se 1 oca1iza
.
. en aguas salobres y en ocasiones está as
estua
¡inas,
op ora mangle. Ruppia marítima habita en agua5

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L �Sc!A�G�A 21 7
A
Los resultados de los a�álisis indican que en las algas rojas (B. pinnata) se encon-
traron altas concentraciones de Benzo(a) antraceno, fluoranteno, Pireno y Benzo
(k) fluoranteno.
En las algas verdes (U. intestinalis) los compuestos más abundantes fueron:
Antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(k)fluoranteno y benzo(b)fluoranteno. De
estos, la mayor concentración de hidrocarburos aromáticos polícíclícos (HAP)
totales fue para el acenafteno y el fluoreno. Las rodófitas presentaron menores
concentraciones de HAP que las clorófitas.
En el pasto marino, las concentraciones totales mayores fueron para el lindeno
{1,2,3-c,d) pireno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)antraceno y el pireno. Se sabe
que el indeno(l,2,3-c,d)pireno y el benzo(ghi)perileno son generados a partir del
petróleo.
Con respecto al naftaleno, fluorentano y antraceno, no están asociados al petróleo
y están relacionados con la fabricación de químicos y pinturas; el antraceno, ade-
más, está asociado a la quema de bosques.
Un aspecto importante es la transformación del benzo(a)pireno en las algas, que
en el caso de U. intestinalis es del 42-49% y depende de la actividad de enzimas
para la detoxificación, que son las o-difenol oxidasas, el citocromo P450 y la
peroxidasa. Sus resultados indican el papel importante de las algas marinas en el
transpone de HAP carcinogénicos en el ambiente.
Dado que las concentraciones detectadas en las macroalgas y en el pasto marino
fueron altas, cabe mencionar que algunos de los efectos que ocasionan los HAP
son: en peces y crustáceos, el fluoreno es tóxico a 0,035 ng/g, mientras que el
�uorentano lo es con 0,6 nglg; para HAP totales, la toxicidad para la biota acuá-
tica al 50% se presenta a 35 ng/g, En la laguna Sontecomapán (México), los valo-
res promedio de HAP están en un intervalo de 0,5 a 58,80 ng/g en U. intestinalis.
Uno de los más potentes carcinógenos es el benzo(a)pireno, el cual fue detectado
en am�as macroalgas y en el pasto marino. Los resultados obtenidos indican el
papel importante que desempeñan las macroalgas en la distribución de los HAP
en el ambiente acuático y su posible transferencia en las cadenas alimenticias.
Uso de macroinvertebrados bentónicos como indicadores
en cuerpos de agua
�n la fauna bentónica se incluyen diversos grupos de invertebrados como rno-
Usco�, lombrices, sanguijuelas, platelmintos, crustáceos, ácaros y los estadios
j\luverules
de algunos órdenes de insectos (Segnini, 2003). Se denomina macroin-
O 7;brados a los que alcanzan durante su ciclo de vida un tamaño superior a
y'1 O mm, lo que les puede hacer visibles fácilmente(Rosenberg y Resh, 1993)
repª preferencia se debe a
que: 1) son relativamente sedentarios y por lo tanto
resentativos del área donde son recolectados; 2) tienen ciclos de vida relati-
....
218 E O:
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I . :T:. :.A:.::.-L =D:..::.E .:..A:.::G:.::U:..:A5:..Y.:_.:..::A ::.U: D �A�L�SE�--
varnente cortos comparado con los peces y reflejan con mayor rapidez
I
raciones del medio ambiente con cambios en la estructura de sus pob] �s alte.
. . . . ac1ones
comunidades; 3) Viven y se alimentan en o so b re los sedimentos donde t" Y
a acumularse las toxinas, las cuales se incorporan a la cadena trófica a tr ie�den
aves d
ellos; 4) son sensibles a los factores de perturbación y responden a las sust . e
. . anc1as
contarnmantes presentes tanto en el agua corno en los sedimentos, y 5) son fue
primaria de alimento de muchos peces y participan de manera importante enn;e
degradación de la materia orgánica y el ciclo de nutrientes (Reece y Richardsonª
2000). El incremento de materia orgánica en el agua produce una proliferació�
de los microorganismos encargados de su descomposición, lo que genera entre
otros efectos una reducción de la concentración de OD en el agua y un aumento
de la concentración de nutrientes inorgánicos, corno el amonio y el fosfato. U!
mayoría de invertebrados son sensibles a esta reducción de oxígeno disuelto, de
tal forma que reducen su abundancia o incluso desaparecen. Por el contrario,
otros grupos toleran bien las bajas concentraciones de oxígeno disuelto, como es
el caso de algunas larvas de dípteros de la familia Chironornidae o algunas espe-
cies de oligoquetos, de tal manera que una elevada abundancia de estos grupos
con respecto a las condiciones naturales o de referencia es indicadora de este tipo
de contaminación (Alonso, 2005 y Davis, 2003) (tabla 14).
Tabla 14. Principales grupos de macroinvertebrados bentónicos

que se usan como bioindicadores de la calidad del agua
�
PHYLUM ORDEN- CLASE GÉNERO/ESPECIE CICLO
PLATELMINTOS O. Turbeluidos Duxtsia A
ANÉLIDOS a. Oligo<haeta Tubifa: A

O.Hirudinu Glossiphonia A
Erpobd<lla
MOLUSCOS O. Gutropoda PotAnwpyrg,is A

Unnuzea
a. Bivalvia Pisidüan casnta1mm A

AlwdontR cygnta
ARTRÓPODOS CI. Crustácea/ Eulñmrogammarus A

Amphipoda to In....,.
Ettlimnoga,nmarus
1tutcroc11rpus
Edtinoga,nmalllS
ttltino�tosus
CammaTUS pula
Decápoda A
Austropotamobi1i,
Proc•mbarus A
Insecta Anphineinoum L
L
Hydropsycl1<
Llmnlz,s A
A
Hydr•ma
Clrironom us L
Noto,�cta A �

U 0'--
....:C::A.::.Pl"-'T..c.� 4 A_
L :_E_\_ L
' U_A_C_ I
Ó_N_D_E_LA---'C;;;.A;.:;L :...:;D::...::.
l.::.D B Ó,
A l:.:::0:.::: L :.:G: !C D
I �A�E:....LA �� G :!.' AS�----
S U!
21 9
A�
___
Nota: La letra A muestra �n �iclo de vida que se desarrolla en su integridad en

el agua, mientras que la L indica que en el río se desarrolla parte de su ciclo vital
(larva o pupa)·
La eutroficación de los ecosistemas acuáticos consiste principalmente en un in-
cremento excesivo en las concentraciones de nutrientes como el fósforo y ni-
trógeno, siendo uno de los principales causantes de la degradación ecológica
(Vitousek, 1997; Carpenter, 1998). En condiciones naturales, los nutrientes son
limitantes para los productores primarios, de tal forma que su aumento genera un
incremento de los organismos fotosintéticos. Cuando el aumento de nutrientes es
causado por el hombre se le denomina eutroficación cultural. El origen de estos
nutrientes puede ser diverso: los vertidos de aguas residuales que carecen de trata-
miento adecuado, algunos procesos industriales, las escorrentías agrícolas donde
se emplea gran cantidad de fertilizantes, la deposición atmosférica de determi-
nados contaminantes o la descomposición de la materia orgánica procedente de
núcleos urbanos o industriales. El incremento de productores primarios genera
cambios en la estructura trófica de la comunidad de macroinvertebrados bentó-
nicos, ya que las plantas acuáticas y el perifitón son un recurso alimenticio para
muchos invertebrados. Además, en muchas ocasiones gran parte de la biomasa
de productores primarios se descompone al terminar sus ciclos vitales, generando
un efecto parecido al de la contaminación por materia orgánica antes descrito.
Finalmente, las minas abandonadas de donde se extraían metales a partir de sul-

furos polimetálicos son una importante fuente de contaminación para los ríos
cercanos (Marqués, 2001). Los sulfuros polimetálicos no extraídos de las minas se
oxidan al quedar expuestos a la intemperie generando sulfatos y ácido sulfúrico.
�te último hace disminuir el pH de las aguas receptoras y facilita la bíodisponíbi-
Iídad de los metales (cobre, hierro, mercurio, zinc, etc.). Esta contaminación por
metales genera graves efectos sobre los seres vivos, especialmente en los grupos
más sensibles a estos compuestos, como son los crustáceos y los gasterópodos
!ºsenberg y Resh, 1993), lo. cual se manifiesta por me io de cam ios en la
� �
d ructura de la comunidad de macroinvertebrados bentónicos de los nos afecta-
os, tal como ha ocurrido en muchos ríos de Perú y América Latina.
�rincipales biomarcadores usados en los monitoreos

e ecosistemas acuáticos
a) Membrana lisosomal
Se Viene utilizando la evaluación de la estabilidad de la membrana liso-
somal como un biomarcador celular generalizado de estrés a la contami-
nación. Los lisosomas son organelos subcelulares circundados por una
membrana semipermeable con muchas enzimas hidrolíticas, involucra-
das en procesos celulares como la digestión, defensa y reproducción;
....

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VI. Conclusiones .................................................................... 64

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Sistema de cultivo de los Mejor en oviductos ligados que in vitro.

Número de demi-embriones Relación directa entre el número de demi-

Preservación Menor probabilidad de supervivencia de

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En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados

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de embriones libres de zona pelúcida en fases previas a la

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debido a que la poca cantidad de células de la MCI reduce la

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1938 Hans Spemann divide un cigoto de salamandra con un cabello; mantiene

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22% de ratones nacidos vivos, y los de ocho células daban 46% y