Inmunocromatrografia

UNIVERSIDAD DE GRANADA
Instituto de Biotecnología
VIRCELL, S.L.
Departamento de Rapid Test
INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE UN TEST

INMUNOCROMATOGRÁFICO PARA LA DETECCIÓN
SIMULTÁNEA DE GÉNERO Legionella, SEROGRUPO 1 Y
ESPECIE DE Legionella pneumophila EN MUESTRAS DE
CULTIVO.
María Teresa Pardo García

Granada, 2013
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: María Teresa Pardo García
D.L.: GR 615-2014
ISBN: 978-84-9028-841-2
INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE UN TEST
INMUNOCROMATOGRÁFICO PARA LA DETECCIÓN
SIMULTÁNEA DE GÉNERO Legionella, SEROGRUPO 1 Y
ESPECIE DE Legionella pneumophila EN MUESTRAS DE
CULTIVO.
Memoria para la obtención del Grado de Doctor

(Programa de Doctorado: Biotecnología (101.99.1))
María Teresa Pardo García

Granada, 2013
Dirigida por el Doctor José Manuel Delgado Calvo-Flores (Vircell, S.L.),

y tutorizada por el Doctor Antonio Osuna Carrillo de Albornoz (Universidad de Granada)
El doctorando, María Teresa Pardo García, y el director de la tesis, José Manuel Delgado
Calvo-Flores, garantizamos, al firmar esta tesis doctoral, que el trabajo ha sido realizado por el
doctorando bajo la dirección del director de la tesis y hasta donde nuestro conocimiento alcanza,
en la realización del trabajo, se han respetado los derechos de otros autores a ser citados, cuando
se han utilizado sus resultados o publicaciones.
Granada, Julio de 2013
Director/es de la Tesis Doctorando
Fdo.: José Manuel Delgado Calvo-Flores Fdo.: María Teresa Pardo García
D. José Manuel Delgado Calvo-Flores, Dr. en Ciencias Físicas y Director del Departamento
de Rapid Test de la empresa VIRCELL, S.L. (Granada):
CERTIFICA QUE:
El trabajo presentado por la Lda. María Teresa Pardo García, titulado “Investigación y
Desarrollo de un Test Inmunocromatográfico para la Detección Simultánea de Género
Legionella, Serogrupo 1 y Especie de Legionella pneumophila en Muestras de Cultivo”, ha
sido realizado en el Departamento de Rapid Test de la empresa VIRCELL, S.L., bajo mi
dirección y asesoramiento.
Concluido el trabajo experimental y bibliográfico, considero que la doctorando reúne las

condiciones necesarias para su lectura y autorizo la presentación de esta Tesis Doctoral para
que sea juzgada por el tribunal correspondiente.
Granada, Julio de 2013
Fdo.: José Manuel Delgado Calvo-Flores

Parte de los contenidos de esta Tesis Doctoral han sido presentados en:
- The 7th International Conference on Legionella, Instituto Pasteur, Paris Francia, 2009.
Presentación del poster científico titulado “Evaluation of a new
immunochromatographic rapid test for the identification of Legionella from cultures”.
Así mismo, parte de los resultados han sido publicados como:
- Pardo-García, MT., Delgado-Calvo-Flores, J. M., Rojas-González, J., Fuertes-Ortiz, A.

2013. Evaluation of an immunochromatographic test for the identification of
Legionella genus and Legionella pneumophila serogroups 1-15 from cultures. Enferm
Infecc Microbiol Clin 2013 Jun 21. pii: S0213-005X(13)00123-7. doi:
10.1016/j.eimc.2013.03.020. [Epub ahead of print]
AGRADECIMIENTOS:
Quisiera aprovechar estas páginas para agradecer sinceramente a todas aquellas personas
que me han ayudado durante este tiempo y que han hecho posible este trabajo:
En primer lugar agradezco al Dr. Joaquín Mendoza Montero, Director General de la

empresa Vircell, S.L., y al Dr. José Manuel Delgado Calvo-Flores, director del Departamento
de Rapid Test de la empresa Vircell, S.L., por la confianza depositada en mí para llevar a cabo
este proyecto, por su dedicación, supervisión y apoyo. También a la Dra. Almudena Rojas y
al Dr. José Rojas por su colaboración y aportaciones científicas en este trabajo.
A todos los departamentos de la empresa Vircell, S.L. y sus trabajadores, que me han
ayudado con el material para esta tesis doctoral. En especial al Departamento de Seguridad
Biológica, por su especial atención y ayuda en el cultivo de muestras, así como su
colaboración y asesoramiento. A los Departamentos de Inmunología, Inmunofluorescencia,
ELISA y Biología Molecular-I, y en especial a mis compañeros de departamento, por su
ayuda y colaboración durante todos estos años.
También quisiera agradecer al Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz, por su

tutorización, ayuda y soporte en esta tesis doctoral. A toda la gente del Instituto de
Biotecnología de la Universidad de Granada por su colaboración.
A mis amigos. A todos aquellos que me han escuchado y animado cuando la cuesta se
hacía muy pendiente. A mis compañeras de mesa.
Por último, a la gente más importante en mi vida, mi familia. Mis padres, mi hermana y
mi marido. Sin ellos no estaría aquí.
ÍNDICE Página
Resumen 1
1. Introducción 5
1.1. Características generales de Legionella pneumophila 6
1.1.1. Taxonomía y Descripción de Legionella pneumophila 6
1.1.2. Características biológicas de Legionella pneumophila 7
1.1.3. Morfología de la membrana de Legionella pneumophila. Antígenos 8
1.1.3.1. Lipoproteína asociada al peptidoglicano (PAL) 9
1.1.3.2. Lipopolisacárido (LPS) 10
1.1.3.3. Proteína Mayoritaria de la membrana Externa (MOMP) 12
1.2. Epidemiología y Patogénesis de la infección por Legionella pneumophila 13
1.3. Métodos de Detección de Legionella 15
1.3.1. Cultivo 16
1.3.2. Métodos Directos 19
1.3.3. Métodos Serológicos 20
1.3.4. Antigenuria 21
1.3.5. Análisis Bioquímicos 22
1.3.6. Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos 23
1.4. Legislación Sobre Legionella 24
2. Objetivos 29
3. Inmunocromatografía y Oro Coloidal 33
3.1. Inmunocromatografía 33
3.1.1. Componentes de la Inmunocromatografía 35
3.2. Oro Coloidal 39
3.2.1. Preparación, Tipos y Tamaños 40
3.2.2. Determinación de Parámetros de Validez 42
3.2.3. Conjugación con Proteínas 43
4. Materiales y Métodos 47
4.1. Materiales 47
4.1.1. Muestras Analizadas 47
4.1.2. Reactivos Usados 49
4.1.3. Inoculación de Placas 50
i
4.1.4. Materiales para Inmunocromatografía 51
4.1.5. Maquinaria e Instrumentación 51
4.1.6. Software 56
4.2. Métodos 57
4.2.1. Inoculación de Placas 57
4.2.2. Recogida de las Colonias de las Placas y Preparación a McFarland 1 57
4.2.3. Desarrollo del Test 58
4.2.3.1. Preparación de Anticuerpos Monoclonales y Línea Control 58
4.2.3.1.1. Preparación de Anticuerpos Monoclonales 58
4.2.3.1.1.1. Fusión 58
4.2.3.1.2. Purificación de Hibridomas de Anticuerpos Monoclonales 58
4.2.3.1.3. Procesado de las Fracciones de Purificación de
Anticuerpos Monoclonales 59
4.2.3.1.4. Preparación de la Línea Control 60
4.2.3.2. ELISA 60
4.2.3.3. Western-Blot 61
4.2.3.4. Inmunofluorescencia 61
4.2.3.5. Preparación del Strip. Dosificación de Tarjetas 62
4.2.3.6. Preparación del Oro Coloidal 63
4.2.3.7. Determinación de la Mínima Concentración que Protege al Oro (MPC) 63
4.2.3.8. Conjugación de Anticuerpos Monoclonales al Oro Coloidal 63
4.2.3.9. Dosificación de Pads 64
4.2.3.10. Impresión de Covertape 64
4.2.3.11. Montaje de los Strips 64
4.2.3.12. Determinación del Sistema Óptimo. Procedimientos Generales 65
4.2.3.13. Preparación del Medio de Reacción 66
4.2.4. Evaluación del Test 66
4.2.4.1. Fundamento del Método y Protocolo de Desarrollo del Test 66
4.2.4.2. Lectura Visual 67
4.2.4.3. Determinación del Límite de Detección de la Técnica 68
4.2.4.4. Tratamientos Estadístico de los Datos 68
4.2.4.5. Estudios de Estabilidad 71
4.2.4.5.1. Estabilidad de los Strips 71
4.2.4.5.2. Estabilidad del Medio 72
ii
5. Resultados 75
5.1. Placas Inoculadas 75
5.2. Desarrollo del Test 75
5.2.1. Anticuerpos Monoclonales 75
5.2.2. Purificación de Anticuerpos Monoclonales 76
5.2.3. ELISA para la Comprobación de la Actividad de los
Anticuerpos Monoclonales 80
5.2.4. Unión de Lotes de Anticuerpos Monoclonales 81
5.3. Oro Coloidal 82
5.4. Determinación de la Mínima Concentración de Proteína que Protege
al Oro (MPC) 84
5.5. Conjugación de Anticuerpos Monoclonales al Oro Coloidal 86
5.6. Determinación del Sistema Óptimo 87
5.6.1. Línea Género 87
5.6.2. Línea de Serogrupo 1 92
5.6.3. Líneas Género y Serogrupo 1 95
5.6.4. Solución de Problemas de la Línea Género 105
5.6.5. Solución de Problemas de la Línea Serogrupo 1 110
5.6.6. Línea de Especie 113
5.6.7. Líneas Género, Serogrupo 1 y Especie 118
5.7. Resultados Obtenidos por Inmunocromatografía 123
5.8. Resultados de la Valoración por ELISA e Inmunofluorescencia de
Cepas del Grupo II Discrepantes 139
5.9. Tratamiento Estadístico de los Resultados del Análisis de Muestras
con el Test Desarrollado 140
5.10. Resultados del Cálculo del Límite de Detección de la Técnica 143
5.11. Resultados de los Estudios de Estabilidad 144
5.11.1. Estabilidad de los Strips 144
5.11.2. Estabilidad del Medio 145
6. Discusión 149
6.1. De la Morfología de la Membrana de Legionella y la Epidemiología
y Patogénesis de la Infección por Legionella pneumophila 149
6.2. De los Métodos de Detección de Legionella 153
6.3. De la Inmunocromatografía y el Oro Coloidal 155
iii
6.4. De los Resultados 162
6.4.1. De las Placas Inoculadas 162
6.4.2. De los Anticuerpos Monoclonales 163
6.4.3. De la Preparación de Oro Coloidal y la Conjugación de Monoclonales 165
6.4.4. De la Determinación del Sistema Óptimo 166
6.4.4.1. De la Funcionalidad de los Monoclonales 166
6.4.4.2. De la Rotura de la Membrana 166
6.4.4.3. De las Condiciones de Reacción 170
6.4.4.4. De la Evaluación Inicial del Test 172
6.4.4.5. De la Solución de Problemas de la Línea Género y la Línea
Serogrupo 1 172
6.4.4.6. De la Línea de Especie 175
6.4.4.7. De los Resultados con el Sistema Inmunocromatográfico Final 177
6.4.4.7.1. De la Unión de las Líneas 177
6.4.4.7.2. Del Sistema Final 178
6.4.4.7.3. Del Límite de Detección del Test 182
6.4.4.7.4. De las Estabilidades de los Strips y del Medio 182
7. Conclusiones 187
8. Bibliografía 191
9. Anexos 203
9.1. Anexo Materiales y Métodos 203
9.2. Anexo Resultados 210
iv
ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS
A280: Absorbancia a 280 nanómetros

Ab: anticuerpo
AD: ácido deoxicolato
Ag: antígeno
ATCC: American Type Culture Collection/Colección Americana de Cultivos Tipo
BCD: acrónimo usado para designar la mezcla de conjugados de monoclonales de LPPA B,
LPPA C y LPPA D
BCYE: extracto tamponado de levadura y carbón
BSA: albúmina sérica bovina
CAP: neumonía adquirida en comunidad
CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-propano
CHOOB: acrónimo usado para designar al grupo de legionellas: L. pneumophila serogrupo 1
Camperdown, L. pneumophila serogrupo 1 Heysham, L. pneumophila serogrupo 1 Oxford, L.
pneumophila serogrupo 1 OLDA y L. pneumophila serogrupo 1 Bellingham
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio
DEV: Developer/solución desarrolladora
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen/Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares
EDTA: ácido etilendiaminotetraacético
ELISA: ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
ESP: especie, línea de detección de especie o Legionella pneumophila serogrupos 1 a 15
F1: Fracción 1
F2: Fracción 2
FNTP: medio compuesto de tampón fosfato, NaCl, Tween-20 y Polimixina-B
FNTPE: medio compuesto de tampón fosfato, NaCl, Tween-20, Polimixina-B y EDTA.
GÉN: género, línea de detección de género Legionella
HI: acrónimo usado para designar la mezcla de conjugados de monoclonales de LPS-1 H y
LPS-1 I.
HI-LPN: acrónimo usado para designar la mezcla de conjugados de monoclonales de LPS-1
H y LPS-1 I y el monoclonal de especie LP3IIG2
v
HNTJ: Hospital Neurotraumatológico de Jaén
LD: Enfermedad del Legionario
LPPA (o PAL): lipoproteína asociada al peptidoglicano
Lpn(X): Legionella pneumophila serogrupo X, siendo X un número posible del 1 al 15
LPS: lipopolisacárido
LPS-1: lipopolisacárido del serogrupo 1 de Legionella pneumophila
LPS-1 AEF: línea de monoclonales de LPS-1 A, LPS-1 E y LPS-1 F dosificados
conjuntamente
LPS-1 AEFI: línea de monoclonales de LPS-1 A, LPS-1 E, LPS-1 F y LPS-1 I dosificados
conjuntamente
LPN: línea de detección de Legionella pneumophila serogrupos 1 a 15
Mab: anticuerpo monoclonal
McF: McFarland
MOMP: proteína mayoritaria de la membrana externa
MPC: mínima concentración de proteína que protege al oro
NL: N-Laurilsarcosina
NC: nitrocelulosa
NCTC: National Collection of Type Cultures/Colección Nacional de Cultivos Tipo
NP40: Nonidet P-40
NTP: medio compuesto por NaCl, Tween-20 y Polimixina-B
OD: densidad óptica
PBS: tampón fosfato salino
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PMB: polimixina-B sulfato
POL: pad de poliéster
POLCAS: pad de poliéster bloqueado con caseína
POLCASENL: pad de poliéster bloqueado con caseína, EDTA y N-laurilsarcosina
ROC (curva ROC): característica operativa del receptor
SDS: dodecilsulfato sódico
Sg.: serogrupo
SR1: serogrupo 1, línea de detección de Legionella pneumophila serogrupo 1
T20: Tween-20
TA: temperatura ambiente
TrA: neumonía asociada al viajero
vi
TS: tampón Tris salino
TX100: Tritón X-100
TX114: Tritón X-114
UFC: unidades formadoras de colonias
vii
RESUMEN
RESUMEN
RESUMEN
La bacteria Legionella pneumophila es la causante de la Enfermedad del Legionario (LD),

la fiebre de Pontiac o el Síndrome Extrapulmonar. La LD puede causar una neumonía mortal.
De todos los serogrupos de L. pneumophila, el 1 es el causante más común de LD, aunque
otras serogrupos de L. pneumophila, e incluso otras especies, pueden producir la misma
enfermedad.
El control de Legionella pneumophila en las instalaciones, ecosistemas o sistemas

acuáticos creados por el hombre, es obligatorio en gran número de países. De los diversos
métodos de identificación o detección de Legionella, el cultivo sigue siendo la técnica de
referencia, seguido de algún método de confirmación.
Para la identificación de Legionella en muestras de cultivo, se ha desarrollado un test

inmunocromatográfico basado en anticuerpos monoclonales diseñados frente a constituyentes
específicos de la membrana de la bacteria. Estos son la lipoproteína asociada al
peptidoglicano (PAL), el lipopolisacárido (LPS) y la proteína mayoritaria de la membrana
externa (MOMP). Estos monoclonales se han adsorbido tanto a oro coloidal como a
membranas de nitrocelulosa y se ha estudiado su reactividad. Para ello se han desarrollado
métodos de rotura química de la membrana de la bacteria, implicando factores como
temperatura, pH, salinidad, detergentes o tiempo de reacción, consiguiendo un medio y un
método eficaz para lograr la exposición de dichos antígenos de membrana.
Se han analizado diversos grupos de muestras de cultivo, incluyendo especímenes

procedentes de fuentes ambientales y clínicas con gran éxito. Para los resultados obtenidos, se
han calculado diversos parámetros estadísticos, produciendo una valoración satisfactoria y
demostrando que la clasificación de las muestras no fue aleatoria.
1
INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Legionella pneumophila es una bacteria Gram-negativa aerobia que puede infectar al

hombre por inhalación de aerosoles1, 2. Puede encontrarse en ambientes naturales como ríos,
lagos o fuentes, y sistemas de agua como torres de refrigeración, spas, hoteles o circuitos de
agua sanitaria entre otros3, 4.
Fue identificada por primera vez en 1977 tras un brote de neumonía aguda ocurrido en
una convención de legionarios en Philadelphia5 y su género fue establecido en 19792. Fue
Joseph McDade6 quién descubrió el agente etiológico de dicho brote cuando tras el mismo se
llevó a cabo una extensa investigación para determinar si el causante era algún tipo de
microorganismo conocido. Inoculó cobayas con suspensiones procedentes de tejidos de
pacientes de dicho brote y obtuvo exudados contaminados (provenientes de hígado, bazo y
pulmón) con los que preparó suspensiones e inoculó sacos vitelinos de embriones de huevos
de gallina, que murieron a los siete días siguientes. Con los frotis de los mismos realizó una
tinción según el método de Giménez7 que le permitió observar numerosos bacilos. Esta
bacteria aislada resultó ser reactiva con sueros procedentes de pacientes del brote de
Philadelphia así como de otros brotes de enfermedades respiratorias anteriores de las que no
se conocía la causa, como la ocurrida en Washington en 1965 o en Pontiac (Michigan) en
19688.
Desde entonces se han encontrado más de 50 especies diferentes (J.P. Euzéby:

www.bacterio.cict.fr) con numerosos serogrupos. De ellos L. pneumophila serogrupo (sg.) 1
es la causa más frecuente de la infección por Legionella en el ser humano9, aunque otros
serogrupos como el 3, el 4, el 5 ó el 6 pueden causar con frecuencia legionelosis10, 11.
Desde su descubrimiento han habido diferentes brotes a nivel mundial12, y en España

cabe destacar el mayor de todos ocurrido en Murcia en 200113, 14, el acaecido en Mataró en
200215, los de la Comunidad de Aragón en 2004 y 200516, en Pamplona en 200617 o en
Benalmádena (Málaga) en 2007, entre otros.
5
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Características Generales de Legionella pneumophila
1.1.1. Taxonomía y Descripción de Legionella pneumophila
Legionella es una bacteria clasificada como Proteobacteria, clase Gamma-

Proteobacteria, orden Legionellales, familia Legionellaceae y género Legionella4. Crece
óptimamente a 35 ºC pero puede hacerlo entre un rango de 25 a 42 ºC2, 4, 18. Es capaz de
replicarse intracelularmente en protozoos y amebas como Vahlkamphia, Hartmanella,
Acanthamoeba, Naegleria, Echinamoeba, Cyclidium ó Tetrahymena, así como en
cianobacterias4, 19 y en macrófagos alveolares humanos20.
De las más de 50 especies de Legionella conocidas21, destaca L. pneumophila por ser la

causante de al menos un 90% de las infecciones causadas por la bacteria10, 21, y de este
porcentaje L. pneumophila sg. 1 por causar el 70-80% de las neumonías severas2. Otras
especies de Legionella causantes de brotes son L. micdadei, L. dumoffi, L. bozemanii, L. feeli
y L. longbeachae 2.
L. pneumophila sg. 1 es una bacteria Gram-negativa que se tiñe débilmente4, 5, 22, de

forma alargada y con un tamaño medio de entre 0,3 a 0,9 µm de ancho por 1,5 a 20 µm de
largo1, 4, 22. Aerobia estricta, no esporulada, capnófila y débilmente sacarolítica1, 4, 20. Motil
debido al flagelo que posee (puede tener dos o ninguno dependiendo de la temperatura),
exceptuando a L. oakridgensis, L. londinenses y L. nautarum2, 4, 22
. Catalasa, oxidasa,
dismutasa, gelatinasa y de reducción de hipurato positiva (excepto los serogrupos 4 y 15)1, 4, 5,
no reduce nitratos ni ureasas y las reacciones de carbohidratos para oxidación o fermentación,
son negativas. La mayoría de las especies son β-lactamasas positivas 2, 4.
Algunas cepas requieren isoleucina, leucina, fenilalanina y tirosina para crecer, además
de los habituales hierro y L-cisteína en medio de cultivo1, 4, 23
, siendo en ocasiones una
excepción a esta regla L. jordanis, L. oakridgensis y L. spiritensis ya que pueden crecer en
ausencia de L-cisteína. Las características bioquímicas de la bacteria unida a la composición
de ácidos grasos y ubiquinonas de su pared celular delgada, y la necesidad de aminoácidos
como la arginina, cisteína, metionina, serina, treonina y valina, como principal fuente de
energía22, hacen que estas propiedades puedan ser usadas para el diagnóstico y aislamiento de
especies de Legionella.
6
1. INTRODUCCIÓN
1.1.2. Características Biológicas de Legionella pneumophila
Legionella se encuentra frecuentemente en aguas e incluso en lodos como el caso de L.

pneumophila, L. micdadei y principalmente L. longbeachae23, donde se multiplica fácilmente
mientras que no sobrevive en ambientes secos22. Los ambientes alterados por el ser humano
pueden favorecer su crecimiento, pues necesita de un contenido de nutrientes en el mismo que
no suele haber en aguas móviles. Parece evidente que Legionella está asociada al biofilm24 y
necesita de protozoos en el medio ambiente para su crecimiento23, donde es capaz de
sobrevivir como parásito intracelular, además de en células de mamíferos, pudiendo replicarse
en diferentes especies de amebas, protozoos ciliados y mohos, así como de macrófagos. Los
protozoos que usan legionellas para su crecimiento les proporcionan a éstas la resistencia a las
condiciones medioambientales adversas. El número de legionellas encontradas en aguas
subterráneas es menor que en colectores de agua medioambientales construidos por el hombre,
pudiendo ser quizás por la escasez de biofilm en las subterráneas2, 25.
Para sobrevivir en el medio ambiente, L. pneumophila entra en la célula hospedadora

ocupando un único fagosoma. El mecanismo de fagocitosis de Legionella por parte de los
macrófagos está controlado por un sistema de receptores complementarios (CR1 y CR3)2, 4, 26,
27
y consiste en la separación de la vacuola de la vía endosomal para continuar la replicación y
el bloqueo de la fusión con el compartimiento lisosomal rico en nutrientes (12-15 horas tras la
infección),2, 26
. Los genes involucrados en este mecanismo son los denominados
colectivamente dot (defective in organelle trafficking o defecto en el tráfico de orgánulos) que
están encargados de alterar la vía endocítica27, e icm (intracelular multiplication o
multiplicación intracelular)24, 27-29, y pertenecen al sistema de secreción tipo IV, crítico para la
virulencia de Legionella25. Algunos genes dot son esenciales para que L. pneumophila crezca
en agar BCYE (buffered charcoal yeast extract o extracto tamponado de levadura y carbón)28.
Defectos en los genes icm o dot resultan en una fusión lisosoma-fagosoma máxima29, 30. L.
pneumophila induce apoptosis en estados tempranos de la infección seguida de una fase de
necrosis y la formación de un poro. La fase final del ciclo de la infección es la muerte del
hospedador y la liberación de la bacteria (unas 20 horas tras la infección). Se han descrito
diferentes fases del crecimiento; multiplicativa donde no hay motilidad ni β-hidroxibutirato y,
la no multiplicativa, donde se dan formas más pequeñas, hay motilidad y numerosas
inclusiones de β-hidroxibutirato2. En el caso de los protozoos se introducen numerosas
7
1. INTRODUCCIÓN
bacterias por vesícula2. En el ser humano, donde puede producir una neumonía mortal26, el
ataque se lleva a cabo sobre los macrófagos alveolares.
Se ha identificado la proteína Mip (macrophage infectivity potentiator o potenciador de la

infectividad por macrófagos) (24kDa) en la membrana de Legionella como una proteína
necesaria para la completa virulencia de L. pneumophila. Esta proteína exhibe actividad
isomerasa peptidil-propil-cis/trans31, y es requerida para la infección eficiente en cobayas,
células fagocíticas mamíferas y protozoos. El gen mip es el primero que mostró estar
involucrado en la patogénesis de hospedadores mamíferos y protozoos2. Otros factores de
virulencia son: citoxinas, proteínas de choque térmico, fosfolipasas, lipopolisacáridos,
compuestos asociados con la adquisición de hierro y metaloproteasas2. También se ha visto
que la actividad de la fusión puede verse alterada por el ión Ca2+ 29.
1.1.3. Morfología de la Membrana de Legionella pneumophila. Antígenos
La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas, y por tanto de Legionella, está

compuesta de la membrana interna, la membrana externa y el peptidoglicano (ver figura
1.1.3.1.).
Figura 1.1.3.1. Estructura esquemática de la membrana de las bacterias Gram-

negativas.
En estas membranas se encuentran componentes con actividad antigénica que son

específicos para determinar el género Legionella, la especie o el serogrupo de L. pneumophila,
lo que la hace interesante para su posible uso en sistemas de diagnóstico20, 32, 33. Algunos de
estos componentes útiles son: la lipoproteína asociada al peptidoglicano (PAL o LPPA,
8
1. INTRODUCCIÓN
peptidoglycan-associated lipoprotein), el lipopolisacárido (LPS, lipopolysaccharide) y la

proteína mayoritaria de la membrana externa (MOMP, major outer membrane protein), que
pueden servir para determinar el género, la especie y el serogrupo de L. pneumophila,
respectivamente. Se trata de regiones de la membrana comunes a todas las legionellas como
es el caso de PAL, sólo a L. pneumophila en el caso de MOMP y a L. pneumophila sg. 1
como sucede con el LPS-1 (LPS de legionellas del serogrupo 1). Otra posibilidad es el
análisis de productos químicos, tales como ubiquinonas o ácidos grasos, aunque la
determinación de Legionella no es completa, ya que por ejemplo a partir de los ácidos grasos
sólo es posible identificar género (diferenciar Legionella de otro bacteria) y no la especie de
Legionella34. También se puede realizar un análisis por SDS-PAGE de su contenido en
péptidos solubles y proteínas nativas2, 35, o un análisis del ADN de Legionella teniendo en
cuenta que entre diferentes especies la semejanza en su ADN es menor del 70%, mientras que
en cepas de una misma especie puede llegar a ser mayor del 90%2, 22.
Otro componente de la superficie de la membrana de Legionella y de gran interés

diagnóstico es el anteriormente comentado gen mip (ver punto 1.1.2.) necesario para la
virulencia de la bacteria. Su peso molecular está en torno a los 24 kDa para L. pneumophila y
de 24 a 31 kDa para otras especies, lo que evidencia diferencias estructurales. Su uso permite
la diferenciación de género y especie de L. pneumophila, pero no de serogrupos de la misma22,
31, 36
.
1.1.3.1. Lipoproteína Asociada al Peptidoglicano (PAL)
El PAL (o LPPA) es un antígeno soluble de superficie de 19 kDa, común y altamente

conservado en el género Legionella37, 38. Tiene gran homología con los genes que codifican el
PAL de Escherichia coli y de Haemophilus influenzae20, 39, 40, ya que hay múltiples epítopos y
diferencias estructurales entre algunas especies al existir distintos patrones de reactividad38.
Se ha visto que está presente en todas las cepas de Legionella41, lo que puede permitir su uso
en el diagnóstico del género.
El peptidoglicano interacciona con numerosas proteínas de la envoltura celular

condicionando la estabilidad de las mismas, y una de ellas es PAL. Es similar al presente en E.
coli donde el extremo N-terminal de la lipoproteína es hidrofóbico y es el responsable del
anclaje de la proteína a la membrana. El extremo C-terminal interacciona con la pared celular
del peptidoglicano39. PAL se encuentra en la membrana externa de la bacteria unido por un
9
1. INTRODUCCIÓN
enlace N-diacilglicerol e interacciona fuertemente con la capa del peptidoglicano a través de

su región carboxilo terminal, pero no está unido covalentemente20, 32. Parece que PAL forma
enlaces puente entre la membrana externa y el peptidoglicano39 y que está implicado en un
sistema involucrado en el mantenimiento de la integridad de la envoltura celular y el
transporte de nuevos componentes sintetizados a través del periplasma (sistema Tol-Pal)32, 40
(ver figura 1.1.3.1.).
El gen ppLA (de PAL) codifica una proteína de 176 aminoácidos con un peso molecular
calculado de 18.9 kDa. Se ha confirmado que esta proteína es la de 19 kDa que se encuentra
presente en L. pneumophila, y aunque no es la mayoritaria de la superficie de la membrana, si
es una de las más inmunogénicas20, 38, 42.
PAL puede estar involucrado en el sistema de receptores de inmunidad innata tipo Toll
que están ligados al desarrollo de respuestas inmunes específicas. Estos receptores reconocen
varios patrones moleculares asociados a patógenos y se ha demostrado que se activan por
PAL43.
1.1.3.2. Lipopolisacárido (LPS)
El LPS es un constituyente mayoritario de la pared celular de las bacterias Gram-

negativas44, 45. Se compone de tres regiones estructuralmente distintas: el lípido-A (lípido
componente de las endotoxinas considerado responsable de la toxicidad en bacterias Gram-
negativas), el núcleo de polisacárido y la cadena O-antigénica u O-polisacárido (porción de la
molécula que determina la especificidad del serotipo y difiere entre las distintas cepas de la
bacteria)46. Ver figura 1.1.3.2.1.:
Figura 1.1.3.2.1. Estructura del LPS-1 de Legionella pneumophila. Adaptado de

Journal of Bacteriology, July 1999, Vol.181, No. 13, p. 413847.
10
1. INTRODUCCIÓN
Abreviaturas: GlcN3N, 2,3-diamino-2,3-dideoxi-d-glucosa; Kdo, ácido 3-deoxi-d-mano -oct-2-ulosonico; Man, d-manosa; GlcNAc, 2-
acetamido-2-deoxi-d-glucosa (N -acetil-d-glucosamina); QuiNAc, 2-acetamido-2,6-dideoxi-d-glucosa (N -acetil-d-quinovosamina); Rha, l-
rhamnosa; Leg y 4e-Leg, derivan de legionaminico y ácido 4-epilegionaminico, respectivamente. OAc significa grupo O-acetilo.
En el caso de L. pneumophila, el LPS tiene una estructura inusual respecto a otras Gram-
negativas48, ya que predominan cadenas ramificadas de ácidos grasos y los ácidos grasos
hidroxilados comunes en la región del lípido A están prácticamente ausentes42, 46, 49. Esto,
unido al elevado número de enlaces disulfuro, hace que sea muy poco soluble en agua44, 50.
Es importante en la sepsis mediada por bacterias Gram-negativas, aunque el papel

desempeñado por el LPS no se conoce exactamente. Sus propiedades se relacionan con la
especificidad de serogrupo de L. pneumophila46, 51, 52. El LPS producido por L. pneumophila
es el determinante inmunogénico mayoritario de la superficie celular y confiere especificidad
de serogrupo42, 53. De hecho parece que la especificidad de serogrupo reside en la región O-
antigénica del LPS54.
El LPS de la mayoría de los serogrupos de L. pneumophila al ser analizado por SDS-

PAGE se muestra con forma de bandas a semejanza de una escalera, lo que sugiere que es un
lipopolisacárido por sus bandas regulares y repetitivas55. Para serogrupos de L. pneumophila
distintos el patrón es diferente en intensidad56, y para especies diferentes a L. pneumophila no
se ve este fenómeno tan acentuado, observándose un perfil distinto entre ellas que sin
embargo posee un gran número de bandas, indicando la existencia de diferentes especies
moleculares que pueden variar en intensidad y densidad34.
El LPS de L. pneumophila tiene distintos epítopos de reactividad cruzada de serogrupo51,

lo que se puede aplicar en el aislamiento de legionellas o mejorar la caracterización
bioquímica de las mismas con la preparación de anticuerpos monoclonales (Mab) específicos
a estos epítopos57. Los cambios en la unión del LPS a los Mab se asocian a variaciones de las
propiedades de virulencia de L. pneumophila durante el crecimiento intracelular44, 47
. La
mayoría de los aislados clínicos (sobre todo de brotes epidemiológicos) portan un epítopo
para LPS que reacciona con el Mab 2 del panel estándar internacional y el Mab 3/151, 58. Este
Mab 3/1 reconoce al epítopo asociado a la virulencia del LPS44. De hecho se ha determinado
que el Mab 3/1 reconoce a un epítopo asociado con el grupo 8-O-acetil del ácido
legionamínico que ha sido identificado como un componente básico del LPS de L.
pneumophila sg. 153. Recientemente se ha identificado un gen denominado lag-1 (gen
asociado al lipopolisacárido-1) que codifica una O-acetiltransferasa que es responsable de la
11
1. INTRODUCCIÓN
O-acetilación del ácido legionamínico del O-antígeno de L. pneumophila y la unión del Mab
3/1 al LPS de L. pneumophila sg. 153 y no en otros serogrupos. Mutantes espontáneas con
falta del gen lag-1 pierden la reactividad con el Mab 3/1 y también la actividad
acetiltransferasa ya que sin la presencia del gen lag-1 no se acetila específicamente el LPS44.
Esto también da lugar a la pérdida de reactividad con el Mab 2, lo que permite la unión con
otros Mab que no lo hacen con el LPS no modificado47. La acetilación del LPS ocurre durante
la etapa replicativa, ya que durante la primera fase, o fase exponencial, la bacteria reacciona
fuertemente con el Mab 3/1, pero no lo hace en la segunda o post-exponencial44.
El LPS es una molécula dinámica, lo que le permite modificar la superficie del patógeno
de acuerdo a la fase de crecimiento y alternativamente contribuir a la transmisión o la
replicación dentro de los macrófagos humanos44. Además de permitirle construir estructuras
lamelares y vesículas para liberar LPS soluble que puede modular la célula hospedadora,
gracias a su dinamismo, puede incrementar la supervivencia en forma de aerosol o
estabilizarse en biofilms59.
1.1.3.3. Proteína Mayoritaria de la Membrana Externa (MOMP)
La membrana externa de todos los serogrupos de L. pneumophila contiene una proteína

mayoritaria que existe como un agregado estable unido por enlaces disulfuro que se encuentra
asociada al peptidoglicano60, 61
. A esta proteína de la membrana externa se le denomina
MOMP20, 62, 63.
MOMP tiene una masa molecular de entre 24 y 29 kDa y se ha determinado que puede
funcionar como una porina, ya que forma canales en la membrana64, 65
. También se ha
observado que tiene la capacidad de formar un complejo de alto peso molecular61, 64, 66 de
unos 95 kDa, que en realidad está compuesto por cuatro unidades de entre 24 y 29 kDa. Este
antígeno MOMP reacciona con un Mab tipo LP3IIG2 y requiere tratamiento con detergentes,
lisozima y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), para su exposición y reacción, ya que se
encuentra sólo parcialmente expuesto61, 64. Se ha encontrado por análisis con el Mab LP3IIG2
en L. pneumophila serogrupos 1 a 15 y no en legionellas no pneumophilas60, 64, 67, por lo que
podría ser un buen marcador para detección de especie pneumophila.
MOMP se une al complemento C3 y media en la unión de L. pneumophila por la vía de

los ya mencionados receptores CR1 y CR3 del macrófago62. La proteína de 24 kDa parece
12
1. INTRODUCCIÓN
estar presente en cepas virulentas y avirulentas, por lo que su papel en la patogénesis se

desconoce66.
1.2. Epidemiología y Patogénesis de la Infección por Legionella pneumophila
L. pneumophila infecta al hombre por inhalación de aerosoles. Presenta dos formas

clínico-epidemiológicas: la Enfermedad del Legionario (LD, Legionnaire’s Disease) y la
Fiebre de Pontiac. También provoca el Síndrome Extrapulmonar que ocurre cuando L.
pneumophila se extiende desde el sistema respiratorio a otros órganos1, 22. La LD es una
enfermedad multisistémica que implica una neumonía indistinguible de otros tipos de
neumonía2, 22
, con alto nivel de mortalidad4, mientras que la Fiebre de Pontiac es una
enfermedad autolimitada con sintomatología similar a una gripe. Factores que influyen en la
infección son entre otros el alcoholismo y el tabaquismo, la edad (ser mayor de 40 años), la
ingestión de esteroides, enfermedades crónicas del pulmón y la diabetes, además del sexo,
siendo más frecuente en hombres que en mujeres4, 19.
Existen unos 15 serogrupos de L. pneumophila, pero el sg. 1 es el aislado más

comúnmente (70-90%), seguido del sg. 61, 4. Otros serogrupos encontrados en Estados Unidos,
Japón o Europa en muestras clínicas han sido el 3, 4 y 5, y en menor proporción el 221. En los
Estados Unidos, L. micdadei es la segunda causa de la LD mientras que en Australia está
debida principalmente a L. longbeachae4.
La LD afecta a los sistemas nervioso, gastrointestinal y urinario4, siendo sus principales

síntomas: fiebre, tos seca, dolor de cabeza, mialgia, rigor, disnea, diarrea y delirio. Los
infiltrados alveolares son también más frecuentes que en otras neumonías2, 68. El periodo de
incubación es de 2-14 días y la enfermedad puede presentarse bastantes meses después y
persistir durante semanas4. La neumonía provocada por L. pneumophila es indistinguible de
otras neumonías por análisis de rayos-X pero a partir del tercer día del inicio de la infección
pueden encontrarse diferencias, sobre todo en la acumulación de fluidos en el pulmón. El
índice de infección de LD es de hasta un 5% en la población normal expuesta y de hasta un 14%
en hospitales4, 22.
La Enfermedad de Pontiac presenta los siguientes síntomas: escalofríos, fiebre, mialgia y

dolor de cabeza4. El periodo de incubación es de 5 a 66 horas, aunque puede llegar a 7 días, y
13
1. INTRODUCCIÓN
la duración se encuentra entre 2 y 5 días4, 22. La enfermedad es más común que la LD, siendo
el ratio de infección de un 95% en población expuesta22.
Por otra parte, el Síndrome Extrapulmonar se produce cuando L. pneumophila pasa del
sistema respiratorio a otros órganos como son el bazo, hígado, riñón, miocardio, hueso y
médula, articulaciones, nódulos linfáticos inguinales e intratorácicos, así como el tracto
digestivo. El órgano más afectado suele ser el corazón y algunos de los síntomas más
destacados son fiebre de baja intensidad, sudores nocturnos, pérdida de peso o malestar
general. Cuando afecta al sistema nervioso puede provocar encefalomielitis y neuropatías que
involucren la envoltura del cerebelo. Este síndrome está provocado en la mayoría de los casos
por L. pneumophila22.
Dependiendo del lugar donde se produce el contagio de LD, se distingue entre asociada al
viajero (TrA: travel associated), nosocomial y adquirida en comunidad (CAP: community-
acquired pneumonia).
La TrA se produce por inhalación de aerosoles y las principales fuentes de contagio son
sistemas de agua fría o caliente como humidificadores, spas, piscinas y aguas termales4. Suele
producirse por una inadecuada vigilancia de las instalaciones en hoteles, cruceros, centros
comerciales, restaurantes o clubs. Es más común en el varón, siendo un factor de riesgo la
edad, donde los hombres mayores de 40 años son los más afectados. Otros factores son la
diabetes, el tabaquismo y alcoholismo, enfermedad crónica del corazón u otra
inmunosupresión22. Se caracteriza por una baja tasa de infección, largos periodos de
incubación, dispersión del foco de infección y dificultad de relacionar casos entre sí. El caso
más representativo de este tipo de LD es el brote ocurrido en Philadelphia en 1976 en la
convención de legionarios donde se descubrió L. pneumophila sg. 12.
La CAP se debe también a la inhalación de aerosoles contaminados. Las principales

fuentes son las mismas que para TrA, añadiéndose las tuberías domésticas, los abonos y
fertilizantes (en este caso L. longbeachae es la predominante)4, 22. Se produce en centros
comerciales, zonas industriales, residencias privadas o centros de ocio. Igualmente afecta más
a hombres mayores de 40 años. Otros factores de riesgo son los del TrA, además de fallo
renal crónico o exceso de hierro. En este caso, la neumonía severa tiene gran incidencia con
un alto índice de mortalidad22, aunque ésta depende de la terapia antibiótica empleada2.
14
1. INTRODUCCIÓN
La LD nosocomial se produce por la inhalación de aerosoles contaminados además de por

aspiración e infección de heridas. Las principales fuentes son sistemas de agua caliente y fría
sanitaria, piscinas naturales, sistemas de terapia respiratoria y tratamientos médicos4, 22
.
Afecta a un rango de población mayor, ya que lo hace a mayores de 25 años y más a
mujeres22. Factores de riesgo son los trasplantes, la cirugía, el cáncer, los linfomas, la diabetes,
el tratamiento con máquinas respiratorias, la enfermedad crónica del pulmón o el corazón, así
como el alcoholismo22. Para evitar estos casos, se recomienda el mantenimiento adecuado de
los sistemas de agua y un buen control, así como revisiones periódicas de las instalaciones2.
El rápido diagnóstico y el tratamiento con terapia antibiótica parece ser el más adecuado
para combatir a Legionella en el organismo1, 37. Se han realizado diferentes estudios con
antibióticos68 y parece que la eficacia de los tratamientos frente a Legionella podría mejorar si
se combinasen entre sí68, 69. Los β-lactámicos no son efectivos contra la LD22. Originalmente
se administraba eritromicina2, pero debido a los numerosos efectos secundarios que producía,
se ensayaron otros como rifampicina, claritromicina, doxiciclina, co-trimoxazole, miembros
de las 5-fluoroquinilonas, azitromicina, ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina,
gentamicina, tetraciclina, estreptomicina, sulfadiazima, penicilina o cloranfenicol2, 4, 69, 70. La
FDA (Food and Drug Administration) aprueba la azitromicina y la levofloxacina para el
tratamiento de la LD frente a la eritromicina70, pero no lo hace con la rifampicina, ya que su
uso no está avalado por resultados in vitro2. Otros estudios han indicado que los mejores
resultados se obtienen con tetraciclina y eritromicina68.
1.3. Métodos de Detección de Legionella
El aislamiento de Legionella se realiza principalmente por medio del cultivo y el

diagnóstico (anticuerpo (Ab) o antígeno (Ag)) puede realizarse por muy diversas técnicas que
incluyen métodos directos (Inmunofluorescencia Directa (DFA)); serológicos (ELISA
(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay o Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas),
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI o IFA en inglés), microaglutinación, hemaglutinación
indirecta, contrainmunoelectroforesis); detección de antígenos en orina (antigenuria);
aglutinación con partículas de látex, radioinmunoensayo (RIA), hemaglutinación pasiva,
inmunocromatografía19; análisis bioquímicos (ácidos grasos, ubiquinonas, etc.) o detección
de antígenos por técnicas basadas en ácidos nucleicos (técnicas de PCR (Reacción en Cadena
de la Polimerasa)), entre otros8, 19, 23, 71. También es posible la identificación de Legionella en
15
1. INTRODUCCIÓN
muestras ambientales por técnicas enzimáticas, aglutinación con partículas de látex, tipado
con Mab o inmunocromatografía37, 72-74. De todos ellos los más habituales son el cultivo, la
serología y la antigenuria1, 2, 22, 75. De hecho, el cultivo se considera la técnica estándar para la
identificación de Legionella, seguido de otras técnicas de las anteriormente comentadas como
métodos de confirmación2, 19.
El diagnóstico de la LD debe de llevarse a cabo sobre todo en personas mayores de

cuarenta años, pacientes inmunodeprimidos que no responden a los antibióticos β-lactámicos,
o en aquellos individuos que hayan estado expuestos a un brote de Legionella22.
Usualmente el diagnóstico está más orientado a la detección de L. pneumophila sg. 1, ya

que es la que causa mayor infección en el ser humano22, por lo que son de gran interés los
métodos que la detectan.
1.3.1. Cultivo
El aislamiento de Legionella spp. se realiza principalmente en un medio de cultivo

determinado que contiene L-cisteína, aunque algunas legionellas como L. oakridgensis o L.
spiritensis no la necesitan para su crecimiento2, así como también agar BCYE con α-
cetoglurato2, 22. Este medio tiene un típico color negro debido al carbón activo. Por su parte la
levadura es la fuente de aminoácidos2. Suele llevar aditivos cuya misión es la de reducir el
crecimiento de otras bacterias, como por ejemplo son anisomicina, polimixina-B o
cefamandol tamponado (puede inhibir algunas especies de Legionella). Algunas legionellas
necesitan otros suplementos como la glicina o antibióticos, como vancomicina, combinados
con cicloheximida o natamicina (fungicida opcional a la cicloheximida menos tóxico para el
ser humano) denominándose este medio BCYE suplementado con GVPC (glicina,
vancomicina, polimixina, cicloheximida)19, 73, 76
. Otros medios alternativos incluyen
colorantes como el bromotimol azul o bromocresol púrpura para aumentar la diferenciación
de Legionella sobre otros microorganismos. Por su parte el uso adicional de albúmina
estimula el crecimiento de especies como L. micdadei o L. bozemanii 2, 22.
El cultivo sirve tanto para muestras ambientales como clínicas y se considera la técnica
Gold Standard o de referencia para la identificación de Legionella73. Todas las muestras han
de ser homogeneizadas previamente al sembrado y debe eliminarse otra flora con el primer
16
1. INTRODUCCIÓN
cultivo. Las muestras se concentran por centrifugación o filtración o ambas técnicas si es

necesario4, 22.
En el caso de especímenes humanos, pueden ser lavados y aspirados bronquioalveolares,

esputos, biopsias del pulmón y sangre2. De estos, los lavados necesitan ser concentrados antes
de su siembra22, 77, mientras que en el caso de esputos las muestras se deben de sembrar antes
del inicio de la ingesta de antibióticos22. En este último caso, la siembra ha de realizarse de
forma inmediata ya que la bacteria sobrevive muy mal en las secreciones respiratorias2. Se
recomienda su uso en pacientes inmunocomprometidos con neumonía severa, en infecciones
nosocomiales, o en casos en los que el agente infeccioso sea distinto a L. pneumophila sg. 122.
Para especímenes medioambientales se debe de concentrar la muestra de agua, que

normalmente suele ser de un litro. Para eliminar otra flora presente suele hacerse un
tratamiento ácido a pH 2.2 o con calor, aunque esto puede inhibir el crecimiento de
Legionella 22, 77, 78.
El cultivo de las muestras suele realizarse con 0’1 o 0’2 ml con la técnica de siembra en
superficie o extensión. La incubación se lleva a cabo a unos 36 ± 2 ºC, en un ambiente
húmedo y con un 2.5% de CO2 durante al menos cinco días. Se obtienen colonias gris-
blanquecinas, brillantes, convexas y con un diámetro medio de tres a cuatro milímetros4, 22.
Un ejemplo es la foto de la colonia 1920.2 B (ver ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS)
que se muestra en la siguiente figura:
Figura 1.3.1.1. Colonia de Legionella pneumophila serogrupo 1

(placa1920.2 colonia B).
Esta técnica tiene como mayores inconvenientes la necesidad de tratar la muestra con
ácido o calor para eliminar otras bacterias que no sean Legionella, el uso de antibióticos en el
medio para el crecimiento de Legionella, el propio rendimiento del crecimiento de L.
17
1. INTRODUCCIÓN
pneumophila así como de otras especies o que hay algunas, como las ya mencionadas L.
micdadei y L. bozemanii, que necesitan de otros requerimientos adicionales22. Otros
inconvenientes son la cantidad de días necesarios para el crecimiento y que es relativamente
poco sensible en el aislamiento (sensibilidad en torno al 60%), por lo que se requiere de un
personal experimentado para su ejecución2, 22. A pesar de todo sigue siendo el método más
conveniente para la correcta caracterización epidemiológica de brotes79, ya que es la técnica
más específica (100% de especificidad)75.
Cómo métodos de confirmación del cultivo se pueden citar el tipado con anticuerpos
monoclonales, la aglutinación con partículas de látex o la inmunocromatografía. Los
anticuerpos policlonales pueden producir reacciones cruzadas de unas especies con otras, así
como con otras bacterias, por lo que se ha desarrollado un panel completo de anticuerpos
monoclonales para el diagnóstico de Legionella que evitan estas situaciones2, 31, 80. Debido a
la diversidad de serogrupos de L. pneumophila, en 1986 se desarrolló un panel con siete Mab
propuestos para subtipar L. pneumophila sg. 12, 9. Estos Mab se seleccionaron en base a su
reactividad, reproducibilidad y facilidad de interpretación con unas 83 cepas de L.
pneumophila sg. 1. Con ellos se hallaron 10 subgrupos de L. pneumophila sg. 19. Para este
análisis se vio que no influía la edad del cultivo, la concentración del Mab, la temperatura de
incubación con el Mab o el tiempo invertido en ello, aunque lo que si tenía influencia era la
concentración del cultivo. Estos Mab y los subgrupos pueden verse en la siguiente figura:
Figura 1.3.1.2. Subgrupos de L. pneumophila sg. 1 identificados con siete

anticuerpos monoclonales desarrollados en 1986. Tomado de Journal Clinical of
Microbiology, Apr. 1986, Vol. 23, No. 4, p. 7709.
(V: resultados variables. 3: fluorescencia brillante, 0: no fluorescencia).
18
1. INTRODUCCIÓN
Tras este panel, en 1997 se desarrolló el denominado Panel de Dresden51, 58 donde se

estudiaba, como en el caso anterior, el tipado de Legionella en serogrupos y especies, en
función de los epítopos que reconocen dichos Mab. Éste contiene 98 Mab y de ellos unos 34
reconocen al menos dos o más serogrupos51. De este panel cabe destacar el anteriormente
mencionado Mab 3/1 que reconoce el componente asociado a la virulencia59. Dicho Mab
puede ser un diferenciador de casos nosocomiales o TA y CAP, ya que en el primer caso son
más frecuentes los resultados Mab 3/1 negativos y en los segundos Mab 3/1 positivos,
asociándose así las cepas Mab 3/1 positivas a los brotes58, 62, 81, 82. En el caso de muestras
ambientales también es más frecuente el tipo Mab 3/1 negativo58. El epítopo que reconoce
dicho Mab no está presente en cepas pertenecientes a serogrupos distinto del 1 de L.
pneumophila58. En el caso de técnicas enzimáticas, la mayoría de los ELISA presentes en el
mercado están diseñados para la detección de L. pneumophila sg. 1 y tienen alta sensibilidad y
especificidad (70-100%), mientras que los existentes para L. pneumophila o el género
Legionella, tienen una sensibilidad variable37. Suelen tener un formato directo y usan
anticuerpos policlonales específicos para L. pneumophila sg. 1 y/o anticuerpos de captura
reactivos frente a extractos solubles de L. pneumophila y otras legionellas37. Otro método de
confirmación mencionado, son las reacciones de aglutinación que usan látex (partículas de
poliestireno) sensibilizado con anticuerpos policlonales anti L. pneumophila sg. 1, anti L.
pneumophila o anti Legionella spp., que están dirigidos a partes específicas de la pared celular
(por ejemplo la gama Legionella Látex test de Oxoid,
http://www.oxoid.com/uk/blue/index.asp). Una limitación importante es que no detectan todas
las especies de Legionella, ya que suele estar preparado sólo para una mezcla de legionellas
frecuentes en el medio ambiente o que causan enfermedad. La sensibilidad y la especificidad
suelen ser elevadas74. En el caso de la inmunocromatografía para muestras ambientales
procedentes de cultivos, estos detectan generalmente sólo L. pneumophila sg. 1 o éste y
Legionella spp., por lo que su aplicación es limitada. Son sensibles y específicos con valores
cercanos al 90-100%72, 73.
1.3.2. Métodos Directos
La Inmunofluorescencia Directa (DFA) fue el primer método usado para detectar

Legionella en tejido pulmonar y secreciones respiratorias, teniendo como mayor ventaja
frente al cultivo que puede haberse iniciado la toma de antibióticos antes de la determinación2.
Se usan conjugados policlonales marcados con fluoresceína que reaccionan con las proteínas
19
1. INTRODUCCIÓN
externas de membrana de L. pneumophila, lo que está especialmente indicado en la detección

de los diferentes serogrupos de L. pneumophila2, aunque esta técnica no se recomienda para el
diagnóstico de Legionella spp.22. La duración es de unas 2-3 horas o de días en el caso de
muestras de esputo. Se usa con éxito en esputos expectorados, aspirados endotraqueales y
biopsias pulmonares. Una de sus principales desventajas es que es difícil de leer22, ya que se
realiza al microscopio y necesita de un personal entrenado y cualificado para su
interpretación2. La sensibilidad está entre el 25-75% y la especificidad es mayor del 99%2, 81,
lo que no mejora al cultivo. A diferencia de la antigenuria, en la DFA no hay variación de
sensibilidad entre casos asociados al viajero, adquiridos en comunidad o nosocomiales. Se
han observado falsos positivos debido a Staphylococcus aureus81.
1.3.3. Métodos Serológicos
Los métodos serológicos para el diagnóstico de Legionella tienen la limitación de las

posibles reacciones cruzadas con otros antígenos y que están restringidos a unas pocas
especies frecuentemente aisladas36. Incluyen los ya mencionados Inmunofluorescencia
Indirecta (IFI o IFA en inglés) y ELISA, así como también las reacciones de aglutinación,
entre otros2, 37.
En el caso de reacciones de microaglutinación, son fáciles de ejecutar y permiten el

análisis de elevado número de muestras al mismo tiempo. La sensibilidad está en torno al 80%
y la especificidad sobre el 95%19.
En el caso del ELISA, las placas suelen sensibilizarse con extractos de bacterias
inactivados83 o antígenos de LPS de los serogrupos más comunes75 que detectan anticuerpos
de Legionella. Puede utilizarse después de iniciar el tratamiento con antibióticos. La
sensibilidad y la especificidad son aceptables aunque no demasiado elevadas. Permiten
evaluar un gran número de muestras simultáneamente, pero podría mejorarse el diagnóstico si
se empleasen los ya mencionados PAL o MOMP, ya que de esta forma aumentarían
significativamente la sensibilidad y especificidad de los ELISA complementando los
resultados obtenidos con LPS2, 37.
La Inmunofluorescencia Indirecta (IFI o IFA en inglés) presenta buena sensibilidad

pero depende de la seroconversión (15-20 días)79. Debido a esto se recomienda el uso de una
mezcla de anticuerpos anti inmunoglobulinas (Ig) G, IgM o IgA para la detección en todas las
20
1. INTRODUCCIÓN
fases. Es un método estudiado extensamente y disponible comercialmente. Frecuentemente se

usa L. pneumophila sg. 1 Pontiac como antígeno, ya que la utilización de mezclas de
antígenos de Legionella es complicado para la realización de un diagnóstico, y las reacciones
cruzadas son más frecuentes con especies distintas a L. pneumophila2. La sensibilidad para L.
pneumophila sg. 1 está en torno al 70-80% y la especificidad sobre el 99%8, 19. Para el género
Legionella o la especie pneumophila no se dispone del dato exacto81.
Es importante que los test detecten el mayor número de inmunoglobulinas (G, M o A)

posibles para aumentar la sensibilidad8, 23. La IgM se produce al inicio de la enfermedad y es
útil para el diagnóstico temprano, aunque algunos pacientes mantienen la IgM durante un
largo tiempo, lo que limita su utilidad para detectar las fases tempranas. Así la serología, en
ocasiones, necesita el análisis de muestras a tres y seis semanas, lo que alarga el diagnóstico
comparado con otras técnicas como la antigenuria2.
1.3.4. Antigenuria
En el caso de detección de Legionella en orina (antigenuria) los ensayos más utilizados

son los enzimáticos y la inmunocromatografía, aunque también se puede emplear la
aglutinación con partículas de látex84, 85. En el caso de L. pneumophila sg. 1 lo que se detecta
es el antígeno soluble de LPS para el sg. 12, 72, 81.
Los métodos enzimáticos permiten la detección temprana a los 1-3 días del inicio de la
infección con alta sensibilidad (70-100%) y especificidad, aunque esta última es inferior al
cultivo (80-85%)79. Pueden utilizarse después de iniciar el tratamiento con antibióticos. La
mayoría de los enzimo-inmunoensayos presentes en el mercado sólo detectan L. pneumophila
sg. 1 con alta sensibilidad y especificidad, mientras que los existentes para L. pneumophila o
el género Legionella tienen una sensibilidad variable37. Suelen tener un formato de sándwich
directo: usan anticuerpos policlonales específicos para L. pneumophila sg. 1 y/o anticuerpos
de captura reactivos frente a extractos solubles de L. pneumophila y otras legionellas37.
En el caso de la inmunocromatografía con muestras de orina, la sensibilidad está en

torno al 80% y la especificidad es del 95%2, 10, 72. La concentración de la muestra de orina
puede aumentar la sensibilidad sin rebajar la especificidad22. La sensibilidad es mayor para
casos de CAP o TA que para nosocomiales, es decir, para los casos en que el Mab 3/1 es
positivo, ya que el test es más sensible para muestras tipo L. pneumophila sg. 1 Pontiac que
21
1. INTRODUCCIÓN
no-Pontiac22, 81, 86. La rápida detección por medio de la inmunocromatografía en muestras de

orina permite el inicio precoz de la terapia antibiótica2. Normalmente los test
inmunocromatográficos son específicos sólo para L. pneumophila sg. 1 y, aunque es el agente
mayoritario causante de enfermedad en humanos, alrededor de un 40% de los casos no son
diagnosticados correctamente2. La inmunocromatografía está sustituyendo a los métodos
enzimáticos por su rapidez, fiabilidad, fácil realización y comodidad, ya que no precisan de
instrumentación como el caso del ELISA o la inmunofluorescencia, y su interpretación es
visual2.
Como mayores desventajas de la inmunocromatografía para muestras de orina se

encuentra que no puede emplearse en pacientes con disfunción renal y con anuria (cese total
de la secreción urinaria. Ausencia total de orina o en cuantía inferior a 50 ml en 24 horas), que
pueden aparecer falsos positivos en un estado avanzado de la infección o que hay posibilidad
de obtener resultados positivos después de la recuperación de la infección72, y como ya se ha
comentado, la necesidad de concentrar las muestras para aumentar la sensibilidad2, 79, 87
.
Finalmente, otra gran desventaja es el hecho de que detectan sólo sg. 1 quedando el resto sin
diagnosticar2.
En el caso de reacciones de aglutinación se suele usar látex (partículas de poliestireno)

sensibilizado con anticuerpos poli o monoclonales dirigidos a partes específicas de la pared
celular84. Una limitación importante es que no detectan todas las especies de Legionella ya
que suele estar preparado sólo para una mezcla de legionellas más frecuentes en el medio
ambiente o que causan enfermedad. La sensibilidad y la especificidad no son elevadas.
1.3.5. Análisis Bioquímicos
Este tipo de análisis sirve en el caso de que se encuentre una nueva Legionella y se desee
conocer a que especie o serogrupo de una misma especie puede pertenecer.
Se puede realizar un análisis para la caracterización de diferentes grupos químicos

presentes en la membrana de la bacteria. Algunas reacciones químicas a realizar y que además
deben ser negativas son: catalasa, oxidasa, reducción de nitratos, ureasa y carbohidratos. Otras
reacciones son gelatinasas, actividad peroxidasa y β-lactamasa, hidrólisis del ácido hipúrico,
autofluorescencia y oscurecimiento de agar-sangre suplementado con tirosina2, 5, 22. Las más
comunes son el análisis de ácidos grasos, carbohidratos y ubiquinonas22. El contenido en
22
1. INTRODUCCIÓN
ácidos grasos puede realizarse por cromatografía gas-líquido5, 35, 88

, lo que permite por
ejemplo la clasificación de una bacteria dentro del género Legionella, al igual que el análisis
de ubiquinonas que puede llevarse a cabo por cromatografía de capa fina en fase reversa, y
que permite clasificar una Legionella dentro de una especie35.
1.3.6. Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos
El análisis de ácidos nucleicos se usa normalmente para especímenes ambientales,

aunque también se ha empezado a utilizar en muestras clínicas22. Con la PCR se puede
detectar el género Legionella o la especie L. pneumophila, utilizando como diana el ARN
ribosómico (16S ARNr) y ADNr (16S ADNr), genes que codifican la región heat-shock
(dnaf), el gen de la ARNpolimerasa (rpoB) y el gen mip2, 22. Tradicionalmente se ha usado
ARNr para el género y el gen mip para ensayos específicos de L. pneumophila22. El gen mip
parece ser genéticamente estable y no presentar recombinación homóloga36.
La hibridación de ADN se ha considerado como un análisis definitivo para establecer la

identidad de una cepa de Legionella o una nueva especie2. El análisis de los genes 16S ARNr
se ha usado para mostrar la relación filogenética de nuevas especies del género Legionella22.
Se ha propuesto que miembros de un género que compartan menos del 97% del 16S ADNr se
deben considerar de otra especie5. Por ejemplo, se ha realizado un esquema de clasificación
de secuencias en base al gen mip y se ha podido distinguir inequívocamente la mayoría de las
especies de Legionella analizadas2, 36, 73.
La sensibilidad para muestras respiratorias está aproximadamente en un 85% y la

especificidad es mayor del 99%22, 81, 89
. Se pueden detectar todos los serogrupos de L.
pneumophila en infección temprana y en casos nosocomiales22. Puede usarse para muestras de
lavados bronquioalveolares o recogidas de la zona de la faringe y nasofaringe, células
mononucleares de sangre periférica, orina y suero2.
Como mayores limitaciones presentan la necesidad del uso de controles, que no son
análisis cómodos o fáciles de realizar, que existen pocos datos para su evaluación, los posibles
inhibidores de la PCR que pueden dar falsos negativos, siendo dicha inhibición mayor en
muestras de aspirados traqueales que en lavados bronquioalveolares22, 90
. Otros factores
negativos son que sus reacciones no son específicas con otros microorganismos y que no
distingue entre organismos viables y no viables22, 74.
23
1. INTRODUCCIÓN
1.4. Legislación sobre Legionella
En muchos países existe una regulación para el control y la prevención de la legionelosis,

existiendo para ello normativas o protocolos a seguir ante un posible brote de Legionella.
España dispone de su propia normativa que regula las diferentes instalaciones, recintos,
centros, lugares, etc., donde debe aplicarse. Existe una guía publicada por el Ministerio de
Sanidad y Consumo: “Recomendaciones para la Prevención de la Legionelosis”, y un Real
Decreto (RD): 865/2003, de 4 de Julio, por el que se establecen los criterios higiénico-
sanitarios para la prevención y el control de la legionelosis91, 92. También deberá tenerse en
cuenta la Ley de Aguas 29/1985 del 2 de Agosto93.
Las instalaciones se clasifican en función de la probabilidad de proliferación y dispersión

de Legionella, pudiendo ser de: 1) alto riesgo: las torres de refrigeración, los condensadores
evaporativos, humectadores, sistemas de agua caliente y fría sanitaria, instalaciones termales
(spas, jacuzzis, piscinas terapéuticas, chorros a presión, etc.), equipos de terapia respiratoria o
sistemas de agua contra incendios; 2) bajo riesgo: sistemas de interior de agua fría de
consumo humano, sistemas de riego por aspersión, fuentes ornamentales, refrigeradores por
aerosolización al aire libre, bañeras de hidromasaje o conductos de aire acondicionado91, 94-96;
3) clasificación en función del riesgo en terapia respiratoria: equipos de terapia respiratoria,
respiradores, nebulizadores y otros equipos médicos en contacto con las vías respiratorias94.
Los propietarios de las instalaciones implicadas son los encargados del cuidado y
mantenimiento de las mismas, así como del cumplimiento del RD 865/2003 y la notificación
de los posibles brotes. Para ello deben llevar un registro de las operaciones de mantenimiento
de las instalaciones y los encargados de su limpieza, los productos utilizados y el responsable
técnico94, 95.
Las medidas preventivas se basan en la aplicación de dos principios fundamentales, la

eliminación o reducción de zonas sucias mediante un buen diseño de las instalaciones y el
mantenimiento de las mismas, evitando aquellas condiciones que favorezcan la supervivencia
y multiplicación de Legionella, con el control de la temperatura del agua y la desinfección
continua de la misma. Para ello se deben aplicar diferentes RD o normas UNE que regulan las
instalaciones frigoríficas, el reglamento de instalaciones térmicas de edificios (RITE), o los
criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano (RD 3099/1977 8 Septiembre,
24
1. INTRODUCCIÓN
RD 1751/1998 31 Julio, RD 1218/2002 22 Noviembre, RD 140/2003 7 de Febrero, norma

UNE 100030 IN)94, 96, 97.
Ante un posible caso de legionelosis las autoridades sanitarias deben coordinar las
acciones a realizar y realizar una investigación epidemiológica en función del RD 2210/1995
del 28 de Diciembre por el que se crea la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica, que
engloba los servicios básicos de vigilancia (notificación de enfermedades de declaración
obligatoria (EDO), agrupaciones de casos, brotes e información microbiológica) y los
sistemas especiales (registros de casos, muestras de seroprevalencia, SIDA y enfermedades
inmuno-prevenibles)94. Las actuaciones a realizar pueden ser de tres tipos: 1) limpieza y
desinfección, 2) reformas estructurales, ó 3) paralización total o parcial de la instalación94.
Para la prevención en el trabajo y los posibles riesgos laborales derivados de Legionella,

se aplicará lo determinado por la Ley de Prevención de Riesgos Laborales 31/1995 del 8 de
Noviembre, el RD 39/1997 del 17 de Enero por el que se establece el reglamento de los
servicios de prevención, y los RD 664/1997 del 12 de Mayo y 374/2001 del 6 de Abril, para la
protección de los trabajadores a agentes biológicos y químicos respectivamente94, 95, 98, 99. Los
diferentes biocidas que se pueden utilizar y su regulación están recogidos en el RD 1054/2002
del 11 de Octubre91, 100.
Los parámetros límite de sustancias en agua vienen regulados por el RD 865/2003 del 4
de Julio, así como en la norma UNE 100030 IN94, 96. En ellos se admite para Legionella un
valor límite de 100 UFC/ml y que los análisis de aguas deben realizarse trimestralmente y
quince días después de un posible tratamiento de choque, tanto en las torres de refrigeración
como en los condensadores evaporativos91, 94, 96.
Por todo lo anterior es muy importante la recogida de muestra para el análisis de

Legionella, ya que un procedimiento incorrecto puede llevar a un resultado erróneo. La toma
de muestra se realizará en función del elemento a analizar94: para depósitos de agua caliente
y fría se tomará un litro de agua preferiblemente de la parte baja del mismo, recogiendo, si
existen, materiales sedimentados. Se debe medir la temperatura y la cantidad de cloro libre;
para la red de agua fría y caliente se tomarán muestras en los puntos terminales de la red. En
el caso del agua caliente el muestreo se realizará en la salida más cercana y en la más lejana
del depósito, en la más próxima al lugar de retorno y otros puntos terminales de interés. Se
tomará un litro de agua, aunque inicialmente se recogerán aproximadamente cien mililitros
25
1. INTRODUCCIÓN
rascando con un bastoncillo las paredes y arrastrando el posible depósito hasta completar el
resto del volumen de agua. Se debe medir la temperatura y la cantidad de cloro libre; para
torres de refrigeración, condensadores evaporativos u otros aparatos de refrigeración
que utilicen agua en su funcionamiento y generen aerosoles, se tomará un litro de agua del
depósito en el punto más alejado del aporte y en el retorno, y los posibles restos de
incrustaciones. Se debe medir la temperatura y la cantidad de cloro libre; en otras
instalaciones como piscinas, pozos, fuentes, etc., la cantidad de muestra dependerá del tipo
de instalación y su accesibilidad, debiéndose siempre de medir la temperatura y el cloro libre.
En general las muestras han de ser recogidas en envases estériles y se les debe añadir
neutralizante. Es necesario que lleguen al laboratorio lo antes posible, manteniéndolas a
temperatura ambiente en todo momento. Los recipientes deben de estar diseñados para evitar
su fácil rotura y la deposición de sustancias en suspensión. Además han de transportarse
protegidas de agresiones externas, según el Acuerdo Europeo de Transporte Internacional de
Mercancías Peligrosas por Carretera (ADR 2003) o el Reglamento sobre Mercancías
Peligrosas de la Asociación de Transporte Aéreo Internacional IATA-DGR, 44 edición, de
enero de 200394.
26
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
Desde la identificación de L. pneumophila como agente causante de neumonía, se han

desarrollado test de diagnóstico en muy diversas áreas, que incluyen técnicas basadas en
serología, métodos directos, detección en orina, análisis de PCR, cultivo,
inmunocromatografía o aglutinación con partículas de poliestireno. Pero de todos ellos, el
cultivo sigue siendo la técnica de referencia por su alta especificidad y su ambivalencia para
muestras clínicas y ambientales, seguido de algún método de confirmación.
Por otro lado, la mayoría de los test de diagnóstico disponibles para la detección de
Legionella están dirigidos al sg. 1 de L. pneumophila, mientras que otros serogrupos, como el
3, 4, 5 ó 6, u otras especies de Legionella como L. micdadei o L. longbeachae, pueden causar
frecuentemente legionelosis.
Teniendo en cuenta la gravedad de la enfermedad causada por Legionella y la escasez de

métodos de detección no orientados exclusivamente al sg. 1 de L. pneumophila, el objetivo
principal de este trabajo es diseñar un método de diagnóstico que diferencie entre el sg. 1 y
los serogrupos 2 a 15 de L. pneumophila, así como entre L. pneumophila y otra especie. Los
objetivos específicos son los que se enumeran a continuación:
- Selección, estudio y valoración de anticuerpos monoclonales preparados contra

antígenos específicos de la membrana de L. pneumophila.
- Diseño de métodos de rotura de la membrana de Legionella para la liberación de los
antígenos específicos de la misma.
- Estudio de la conjugación de anticuerpos monoclonales a partículas de oro coloidal.
- Determinación de las condiciones de reacción en sistema inmunocromatográfico para
la detección de antígeno.
- Evaluación de diferentes grupos de muestras de procedencia ambiental y clínica.
- Análisis de los resultados obtenidos para la evaluación del rendimiento del sistema de
diagnóstico.
29
INMUNOCROMATOGRAFÍA Y ORO COLOIDAL
3. INMUNOCROMATOGRAFÍA Y ORO COLOIDAL
A continuación se expone a modo de introducción, y para poner en contacto al lector con

la tecnología de cromatografía de flujo lateral o inmunocromatografía, una breve descripción
de los principales factores y las características más importantes de la misma, así como de las
propiedades y aplicaciones básicas del oro coloidal.
3.1. Inmunocromatografía
Desde la aparición de los primeros inmunoensayos, se ha buscado siempre, obtener un

resultado rápido para intentar tratar al enfermo con eficacia y en la mayor brevedad posible,
con el objetivo de proporcionarle una curación. En este tipo de diagnóstico es donde encaja la
inmunocromatografía. Es un método rápido y sencillo de detectar anticuerpos (Ab), antígenos
(Ag), hormonas, bacterias, etc., basándose en reacciones enzimáticas, inmunológicas, etc., que
en muchos casos puede realizar cualquier persona. Un ejemplo claro de este tipo de test son
las pruebas de embarazo que se venden en farmacias y que están al alcance de individuos de
cualquier nivel socio-económico.
De forma esquemática, un test rápido funciona haciendo fluir una muestra por una
membrana porosa, donde se encuentran inmovilizados los Ab o Ag que serán capaces de
unirse al analito (Ag o Ab de la muestra) y retenerlo en la línea. Esta reacción de unión es
visible por medio del color (rojo, azul, etc.), dependiendo éste también del tipo de partícula
que se ha conjugado, como son el oro coloidal (rojo) o las partículas de látex (azules, rojas,
verdes, etc.), por ejemplo. La interpretación es cualitativa, de forma que si hay color es
positiva y si no es negativa (en otros sistemas puede ser al contrario). En otras ocasiones
también puede cuantificarse dependiendo de la intensidad de la línea y conociendo los
patrones de concentración.
Los componentes necesarios para un test inmunocromatográfico son101:
1) backing o soporte, que es la estructura “rígida” sobre la que va pegada la membrana.

Puede ser de diferentes materiales y distintos grosores. El material depende de los fines y de
la estructura del test. Sirve para dar consistencia a la membrana;
33
2) membrana: es el material poroso por donde fluye la reacción, normalmente de

nitrocelulosa. Sobre ella se dosifican las líneas test y control;
3) pad de conjugado: de material inerte, en él se encuentra el Ab o Ag conjugado a látex

o metal coloidal que se unirá al Ag o Ab que se pretende analizar;
4) pad de muestra: sobre él se añade la muestra de forma que se absorbe y se mezcla

con el conjugado, fluyendo posteriormente todo por capilaridad por la membrana;
5) pad de absorción: es una almohadilla de papel del grosor adecuado para que por
capilaridad arrastre a la muestra para que se complete el test facilitando así la ejecución del
mismo;
6) líneas test y control: aparecen con el paso del flujo del conjugado unido al analito en
el caso de la test (reacción positiva) y en el caso de la control con el paso del flujo del
conjugado, e índica que la reacción ha ido bien. La línea control se elige en cada test en
función de las necesidades que se planteen, como son el Ag o Ab a detectar, el Ag o Ab usado,
etc. Por otro lado debe de no interferir con el resto de componentes que se estén usando; y
7) casete: es donde se sitúa el strip ya terminado para protegerlo y poder llevar a cabo la
reacción. Proporciona los lugares de presión adecuados sobre el strip y hace que la reacción
fluya adecuadamente.
El esquema básico del funcionamiento de una inmunocromatografía sería el que se

muestra en la figura 3.1.1. Inicialmente la membrana (blanca en paso 1) está adherida al
backing o soporte (gris) y sobre ella se encuentran inmovilizados los Mab o anticuerpos
secundarios (negros) que conforman la línea test y la línea control respectivamente. Sobre la
membrana se disponen los diferentes pads con el solapamiento correspondiente y de forma
que el flujo sea posible. Para ello el pad de muestra (azul) solapa con el de conjugado (rojo en
paso 1) y éste sobre la membrana. Al final del strip se encuentra el pad de absorción (marrón
en paso 1) que recogerá todos los reactivos. En el paso 1, en el pad de conjugado se
encuentran las partículas de oro coloidal conjugadas con los Mab y se añade la muestra, que
en caso de ser positiva contendrá el antígeno correspondiente. En el paso 2, tras añadir la
muestra, el oro coloidal conjugado se rehidratará y fluirá por la membrana (roja en paso 2)
reaccionando con la línea test en caso de ser una muestra positiva. El flujo llegará a la línea
34
control y ésta retendrá partículas de oro conjugadas a Mab. En el paso 3, la reacción se ha

completado y el exceso de reactivos, oro conjugado y antígeno no capturado, se recogerá en el
pad de absorción (rojo en paso 3).
Figura 3.1.1. Esquema básico del funcionamiento de un sistema

inmunocromatográfico (ver explicación en el texto).
En el transcurso del tiempo la reacción se completa, por lo que la intensidad de la línea

irá aumentando hasta que ya no pasen más partículas de conjugado. El buen funcionamiento
del test viene indicado por la aparición de la línea control. Esta clase de inmunocromatografía
se llama Directa o Tipo Sandwich.
3.1.1. Componentes de la Inmunocromatografía
Se van a ver las características generales y más relevantes de cada uno de los
componentes:
Backing o soporte101-104: da rigidez a la membrana, ya que ésta por si sola no posee

consistencia y se rompe. Es un material duro pero flexible que debe soportar todos los
componentes del strip y darle forma al mismo, ser consistente, permitir su posterior corte, unir
fuertemente la membrana impidiendo que se despegue, así como facilitar que los diferentes
reactivos que se añadan a la membrana fluyan sin problemas debido a un mal acoplamiento
35
con la misma o unas propiedades inadecuadas. Del mismo modo debe permitir que cuando se
dosifiquen los Ag o Ab, éstos queden inmovilizados en las membranas, se puedan adherir a
ésta y se fijen correctamente. Por lo general, están compuestos de poliestireno y puede tener
diferentes grosores, dependiendo el elegido de los fines del test, el esquema final del strip y su
configuración en el casete.
Membrana101, 105-107: es la parte fundamental del test, ya que sobre ella se montan el resto
de elementos y se inmovilizan los Ag o Ab que conformarán la línea test y la control. Puede
ser de diferentes materiales, siendo muy importante elegir el adecuado dependiendo de los
fines deseados101, 102, 105
. Puede estar fabricada de compuestos tales como nitrocelulosa
(fuerzas de unión electrostáticas), PVDF (fluoruro de polivinilideno) (fuerzas de unión
hidrofóbicas), Nylon (poliamidas) (fuerzas de unión electrostáticas) o acetato de celulosa,
entre otras101. De ellos, la nitrocelulosa y el nylon son los más conocidos y comunes. La
elección de un tipo de membrana u otra depende de: la capacidad de unir proteínas, la
porosidad, tamaño medio de los poros y distribución de los mismos, y la fuerza de tensión101,
105
. El nylon cargado positivamente es el que más capacidad de unión de proteínas tiene105,
aunque otros materiales como nitrocelulosa, poseen la suficiente como para realizar ensayos
inmunológicos donde se requiere inmovilizar Ab. Esta menor unión puede eliminar fondos no
deseados en las reacciones que con el nylon por ejemplo, que posee mayor capacidad, pueden
aparecer. A la hora de calcular la capacidad de unión de la membrana, hay que tener en cuenta
el área superficial, factor que depende del tamaño de poro, siendo ésta mayor cuánto más
grande sea el poro. Para calcular el volumen de muestra que puede pasar por la membrana por
unidad de tiempo, se usa una ecuación que incluye la longitud (L), ancho (A), grosor (G) y
porosidad de la membrana (P)102:
L·A·G·P= capacidad de la membrana
La capacidad de unión de la membrana se puede calcular determinando la cantidad de

polímero por superficie disponible para la inmovilización de la proteína101. Estos parámetros
pueden optimizarse para cada caso concreto en función de diversas pruebas de ensayo y error.
La unión en la nitrocelulosa se produce por la interacción electrostática entre el fuerte dipolo
del éster del nitrato con el fuerte dipolo del péptido de la proteína como puede verse en la
siguiente figura:
36
Figura 3.1.1.1. Interacción entre la membrana de nitrocelulosa y el péptido.
El tamaño de poro de la membrana es otro factor importante, ya que de él depende la

cantidad de proteína que es posible unir a la membrana. Partículas con el mismo tamaño que
el poro que la membrana, pueden no ser retenidas en ella, por lo que es recomendable que su
tamaño sea unas dos veces aproximadamente el del poro. Por tanto, a mayo poro, menor será
la capacidad de unión de la proteína a la membrana105. Se pueden encontrar muy diferentes
tamaños, existiendo poros por ejemplo de 0’1, 3, 5, 8 ó 10 µm entre otras medidas107. Por otro
lado, es importante que la distribución de los poros sea homogénea y regular, ya que ello
permitirá que el flujo de la membrana sea más apropiado. Por último, la porosidad es otro
factor importante a tener en cuenta en la elaboración del test101. La membrana está formada
por poros que son el volumen de aire en las tres dimensiones que ésta posee y se expresa
como porcentaje sobre el volumen total de la misma. De la porosidad depende el flujo de los
reactivos por la membrana, ya que en función de la forma de los poros, el tamaño y la
distribución de los mismos, el flujo será más o menos rápido107. A mayor velocidad de flujo,
menor tiempo de contacto hay entre el Ag y Ab o viceversa, por lo que la reacción puede ser
menos sensible. El compromiso es, por tanto, encontrar un flujo adecuado con el objetivo del
propio test. Otro factor es la fuerza de tensión de la membrana. Para que la membrana no se
rompa es necesario proporcionarle un soporte como ya se ha comentado, ya que por ella
misma no tiene suficiente resistencia para ser manejada101. Esto también depende del tipo de
membrana. La más frágil es posiblemente la de nitrocelulosa, que se puede romper fácilmente,
al contrario que el nylon, que puede manejarse sin problema, al igual que el PVDF. Otras
opciones, además de ponerla sobre un soporte, pueden ser fabricarla con él incorporado de
forma que se pueda manipular por el usurario sin gran dificultad. Normalmente en el diseño
de una inmunocromatografía se eligen membranas de nitrocelulosa de 3 ó 5 µm por sus
prestaciones, buen flujo de los reactivos y limpieza de la misma107, 108.
37
Pads de absorción, muestra y conjugado101, 109: normalmente estos componentes son de

poliéster en el caso del conjugado y de poliéster, papel o fibra de vidrio para el de muestra. El
de absorción suele ser de papel de varios milímetros de grosor. La función de cada uno de
ellos es diferente. En el caso del pad de muestra, es sobre el que se añade la muestra a
analizar. Su misión es distribuir adecuadamente en el pad de conjugado el volumen de
muestra que se añade. Puede ser pretratado previamente con detergentes, proteínas, tampones,
101, 108
etc., para mejorar el desarrollo del test cuando sea necesario . Otra de las ventajas del
pretratamiento del pad es que puede evitar el bloqueo de la membrana, lo que es
desaconsejable en la mayoría de los casos107. El pad de conjugado es el componente sobre el
que se seca el reactivo de oro con el Ag o Ab pegado a él. Cuando la muestra pasa, lo
redisuelve y se une a él si el analito está presente. Un pad ideal debe tener baja capacidad de
unión (para que permita liberar todo el reactivo y no se una nada de la muestra), buenas
propiedades de mojado (para que la muestra entre fácilmente y redisuelva al conjugado), y
constante capacidad de volumen de muestra (para que siempre sea reproducible y se pueda
controlar como fluye el total de volumen añadido)101, 102. Algunos materiales usados para tal
fin y sus propiedades se muestran en la siguiente tabla101:
MATERIAL GROSOR VENTAJAS DE USO PROPIEDADES

alta capacidad de volumen
FIBRA DE VIDRIO 100 - 500 µm difícil de manejar y cortar
baja unión inespecífica
Alta capacidad de volumen
CELULOSA 300 - 1000 µm muy baja unión inespecífica frágil cuando se moja
muy uniforme
baja unión inespecífica
POLIÉSTER 100 - 300 µm baja capacidad de volumen
alta resistencia
Tabla 3.1.1.1. Materiales más comunes usados como pads de muestra y conjugado
en inmunocromatografía y sus propiedades.
El pad de absorción se sitúa al final del strip. Se usa para absorber el exceso de los
reactivos que fluyen por la membrana. Normalmente son de papel de elevado grosor y se
eligen en función de su compresibilidad, manejabilidad, etc.101.
Casetes: es el habitáculo plástico que contiene al strip y en el que se desarrolla la

reacción. Puede llevar diferentes ventanas, como por ejemplo la zona donde se aplica la
muestra o la de lectura de resultados. Es un elemento muy importante en el desarrollo del test
y sobre todo en el resultado107. Se compone de dos partes que encajan una en la otra. La parte
superior lleva unas pestañas de presión que hacen que los reactivos fluyan por la membrana,
38
porque los obliga a salir de pad de muestra y llegar al de absorción. Una mala configuración
en la presión puede hacer que la señal sea más baja de lo esperado produciendo resultados
erróneos. Hay muchos tipos de modelos a elegir (redondos, cuadrados, múltiples, alargados,
con bastoncillo, etc.), dependiendo de la idea del producto. Algunos diseños de casetes tienen
en cuenta la estética exterior y otros son más sencillos, pero lo más importante a tener en
cuenta es el interior, que es lo que hará que la reacción se desarrolle correctamente.
3.2. Oro Coloidal
Figura 3.2.1. Suspensión de oro coloidal. Vircell, S.L.
El oro coloidal es una suspensión de nanopartículas de oro, normalmente en agua, de

intenso color rojo que alternativamente puede ser anaranjado o incluso púrpura. El color
depende del tamaño de la partícula, que puede oscilar entre 2 ó 150 nm. Michael Faraday fue
quién encontró la relación entre el color de la solución y el diámetro de las partículas110, 111.
La elección del tamaño del oro dependerá principalmente del límite de detección del test.
Este oro coloidal permite conjugar proteínas en su superficie, lo que posibilita su uso para
la inmunocromatografía. Como ya se ha comentado, el funcionamiento es sencillo ya que, una
vez se haya conjugado el Ag o Ab al oro, se puede secar en un pad que luego se rehidratará
con el paso de la muestra. Si la reacción es positiva, en la línea se obtendrá un color rojo-rosa
que será el que proporciona la partícula de oro (ver figura 3.1.1.).
El oro coloidal es un material versátil y de fácil preparación, que puede usarse porque es
estable conjugado a proteínas y no se agrega fácilmente, como puede ser el caso del
poliestireno. Si se prepara adecuadamente es muy estable en el tiempo110.
39
3.2.1. Preparación, Tipos y Tamaños
Para preparar una suspensión de oro coloidal hay que tener en cuenta primero el tamaño
que se desea de partícula, ya que el método puede variar dependiendo del nucleante o los
reactivos. El tamaño estándar de oro coloidal oscila entre 20 y 45 nm, variando también el
color entre ellos112. A un mayor tamaño, el color rojo se hace más intenso. Así el de 45 nm es
más rojo que el de 30 nm, lo que puede aumentar la señal de la línea test113.
Es muy importante ser cuidadoso en la elaboración del oro coloidal ya que si no se hace
correctamente, éste nuclearía inadecuadamente formando partículas de un tamaño inapropiado,
pudiendo obtenerse agregados de color púrpura o marrón113, 114. El tamaño también depende
de la fuerza del reductor, de forma que a mayor capacidad, menor será el tamaño de la
partícula.
Figura 3.2.1.1. Diferencia de color y homogeneidad de oro bien y mal

preparado. Tomado de Chandler, J. et al., IVD Technology, March 1st 2000113
Por lo general, para la elaboración del oro coloidal se parte del ácido tetracloroaúrico
(HAuCl4). La reacción consiste en que un reductor (citrato sódico, borohidruro sódico,
fósforo amarillo, tiocianato sódico, etc.) dona los electrones a los átomos de oro cargados
positivamente, y se produce oro atómico. La reacción de reducción que ocurre es la
transformación de Au3+ en oro atómico, Au0, y se puede escribir como115, 116:
Au3+ (ac) + 3e- → Au0(s) Semirreacción 1

3- 2- + -
C6H5O7 (ac) + H2O (l) → C5H4O4 (ac) + CO2 (g) + H3O (ac) + 2e Semirreacción 2
Tras añadir el reductor, todos los iones de oro se van transformando en oro atómico hasta
que se alcanza el estado de supersaturación. Es entonces cuando se produce la nucleación por
agregación de las partículas presentes. Este es un proceso muy rápido y de él dependerá en
gran parte la calidad del coloide. El crecimiento de la partícula seguirá dándose en función del
40
reductor usado y su fuerza, hasta que se forme completamente la partícula de oro coloidal. Se
produce un cambio de color del amarillo inicial a un tono rojo intenso. En pasos intermedios,
el color amarillo pasa a incoloro con tonos negros y a continuación cambia rápidamente a
negro azulado, negro y finalmente rojo. Pueden verse estos cambios en la figura 2.2.1.2.
Figura 3.2.1.2. Cambios de color en la preparación de oro coloidal. Vircell. S.L.
Estas partículas están cargadas negativamente, lo que da lugar a la capa “Potencial

ZETA”113, 117. Esta carga negativa alrededor, permite a las partículas repelerse unas a otras y
mantenerse estables en la suspensión.
Figura 3.2.1.3. Partícula de oro rodeada de la doble capa iónica. Tomado de Chandler,
J. et al., IVD Technology, March 1st 2000113.
Existen diferentes protocolos para la preparación de oro coloidal. La técnica más usada
sigue siendo el método desarrollado por Frens112, que realizó un estudio de cómo controlar el
tamaño de partícula en función de las cantidades de reductor añadido118, 119
, lo que ha
permitido la elaboración de diferentes tamaños de oro coloidal estables en el tiempo. Hay
otros métodos como el obtenido por reducción con hidroxialmina118, aunque la elaboración de
éste último parte de las denominadas “semillas” (2-3 nm). El oro hidroxilamina tiene un
tamaño final de entre 40-50 nm. Se trata de un método más lento y laborioso, pero el coloide
tiene un color mucho más llamativo debido a su mayor tamaño. Hay diferentes
procedimientos de preparar las semillas120, 121, como por ejemplo por radiación ultravioleta.
Otros métodos no necesitan radiación y son más sencillos de llevar a cabo, involucrando
41
únicamente procesos químicos118, 122, y otros son mucho más sofisticados como la reducción
fotoquímica o la electrodeposición por radiación123, que necesitan una instrumentación mucho
más sofisticada y compleja.
3.2.2. Determinación de Parámetros de Validez
Una vez obtenida la solución de oro coloidal hay que comprobar si efectivamente es de
buena calidad, el tamaño de partícula es el deseado, el color es el esperado o si es
monodisperso. Para ello existen diversas formas que incluyen desde la medida
espectrofotométrica hasta la visualización al microscopio electrónico, como describen
Chaudhuri y Raychaudhuri124, Chun114, Bozlee y Exarhos125, o Mallick et al.120 entre otros
autores.
Un buen oro será monodisperso cuando todas sus partículas sean más o menos de igual
tamaño y estén poco agregadas124. En el caso de la medida espectrofotométrica, los
parámetros que indican la monodispersión son la absorbancia máxima y la relación de
absorbancias a 575 y 500 nm. El oro coloidal de entre 20-40 nm, el más comúnmente usado
en inmunocromatografía, suele producir un máximo a 520 nm120, y a 575 nm se produce una
absorbancia típica de los coloides125. Otro parámetro es la medida a 540 nm, que es la
longitud de onda a la que se produce una resonancia de los plasmones superficiales en el
proceso de formación126-128. La concentración del oro se suele medir con la A540. Un ejemplo
de medida es la curva de la figura 5.3.1. del capítulo resultados.
Es posible ver la calidad del oro por medio de microscopia electrónica de transmisión
(TEM). La observación por TEM produce imágenes de las esferas del oro coloidal113, 121 que
pueden informar de si las partículas son regulares, si forman agregados o no, si están
solapadas unas con otras o de si el tamaño es el adecuado. Es por todo ello una herramienta
útil en la determinación de la calidad del oro coloidal.
Por otro lado, la estabilidad del oro coloidal depende, entre otros factores, de la fuerza
iónica del medio, del pH, de las proteínas que pueden añadirse para estabilizarlo, etc.115. Con
una alta fuerza iónica, las partículas se agregan, coagulan y precipitan, ya que se rompe la
estabilidad coloidal debido a las repulsiones electrostáticas. La adición de proteínas como la
BSA (bovine serum albumin o albúmina de suero bovino) puede contribuir a la estabilización
del medio al unirse a la superficie del oro, aún cuando haya una elevada concentración de
42
electrolito108, 122, 127, 129, 130. Todos estos factores se deben de tener en cuenta en la preparación
de un oro coloidal o un conjugado, para que se mantengan estables en el tiempo.
3.2.3. Conjugación con Proteínas
Como ya se ha comentado, el oro coloidal permite elaborar un test sencillo de realizar y

fácil de interpretar por medio de la aparición o no de bandas de color. Se pueden conjugar
diferentes proteínas, Ag, Ab, etc., que pueden estar incluso marcadas con yodo o
peroxidasa130, 131 en función de lo que se quiera determinar.
Antes de pasar a la unión del Ab o Ag al oro coloidal, se deben conocer las condiciones
necesarias para ello, lo que significa determinar la concentración de sal y pH del medio, y la
concentración a la que debe unirse el Ag o Ab a la partícula de oro. Estos parámetros se
determinan experimentalmente para cada proteína a conjugar, ya que dependerán también del
punto isoeléctrico de las mismas. Se debe calcular la mínima concentración de proteína que
protege al oro (MPC: minimum protective concentration)114, 129, 131 y lo estabiliza, por debajo
de la cual el oro se agrega y por encima de la cuál es estable, pero sin ganancia en la respuesta.
Para su determinación se realiza un barrido con oro a diferentes pH, generalmente 5, 7 y 9,
fuerza iónica, dilución y tamaño de coloide129, 131. A cada una de estas condiciones se le une
una pequeña cantidad de proteína a distintas concentraciones (del orden de
microgramos/mililitro) en el mismo tampón usado para diluir el oro, de forma que tengamos
una serie de datos que se podrán representar gráficamente, como puede verse en la figura
3.2.3.1. La prueba acaba con la adición de NaCl, el cuál coagula el coloide si este no está
estabilizado por la proteína114. Con este ensayo se conocerá el pH, dilución, fuerza iónica y
cantidad de proteína a la que se puede realizar la conjugación. Por lo general, se obtiene una
curva que en su parte final es una recta, de forma que la MPC corresponde a la primera
concentración de proteína donde se observa una caída significativa en la absorbancia y ésta se
hace relativamente constante132.
43
Figura 3.2.3.1. Representación esquemática de una curva obtenida para una MPC
(representación de la concentración de proteína añadida al oro frente a la absorbancia a 580 nm).
Tras conocer la MPC, se debe pasar a una escala mayor y es cuando se realiza la
conjugación, adicionando la proteína a conjugar según las proporciones determinadas en el
microensayo.
En la preparación de un conjugado, otro factor a tener en cuenta es el agente bloqueante,

su concentración y compatibilidad con el test. Debe hacerse un estudio para determinar las
condiciones más apropiadas. Uno de los principales bloqueantes es la albúmina sérica bovina
(BSA), pero pueden añadirse otros como la caseína, copolímeros como el polietilenglicol
(PEG), polivinilpilorridona (PVP), polivinil alcohol (PVA), etc.108, 122, 127, 129, 130.
Para unir el Ab o Ag al oro, una vez esté en las condiciones de pH y fuerza iónica
adecuadas, éstos se adicionan en agitación, como recomiendan Geoghegan129, y Geoghegan y
Ackerman131. Posteriormente debe añadirse un agente bloqueante para estabilizar las
partículas y parar el proceso de adsorción. Copolímeros como el PEG son de lo más utilizados.
Como paso final, el conjugado debe lavarse varias veces para eliminar los Ag o Ab no unidos
y bloquear todos los sitos libres del oro. Tras este proceso el conjugado debe ser estable y es
cuando puede evaluarse, una vez conocidos los parámetros espectrofotométricos.
44
MATERIALES Y MÉTODOS
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Materiales
4.1.1. Muestras Analizadas
Se han analizado un total de 211 muestras procedentes de:
Grupo I) 42 legionellas de diferentes colecciones de referencia (de procedencia ambiental

y clínica) (42 Legionella género, 27 Legionella pneumophila (17 L. pneumophila sg. 1 + 14 L.
pneumophila serogrupos 2-15)): National Collection of Type Cultures (NCTC), Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (o Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ)) y American Type Culture Collection (ATCC)
(ver Tabla 4.1.1.1.).
Tabla 4.1.1.1. Cepas bacterianas de Legionella de colecciones de referencia usadas.
DESIGNACIÓN DE LA NCTC/DMSZ/ATCC
CEPA BACTERIANA
CEPA No.
Legionella pneumophila serogroup 1 Heysham Heysham-1 NCTC1 12029
Legionella pneumophila serogroup 1 Benidorm Benidorm 030E NCTC 12006
Legionella pneumophila serogroup 1 Camperdown Camperdown-1 NCTC 12098
Legionella pneumophila serogroup 1 Kingston Kingston-1 NCTC 11378
Legionella pneumophila serogroup 1 Bellingham Bellingham-1 NCTC 11404
Legionella pneumophila serogroup 1 Knoxville Knoxville-1 NCTC 11286
Legionella pneumophila serogroup 1 Allentown Allentown-1 NCTC 12024
Legionella pneumophila serogroup 1 France France 5811 NCTC 12007
Legionella pneumophila serogroup 1 OLDA OLDA NCTC 12008
Legionella pneumophila serogroup 1 Pontiac Pontiac NCTC 11191
Legionella pneumophila serogroup 1 Oxford Oxford 4032E NCTC 12009
Legionella pneumophila serogroup 1 Cambridge Cambridge-1 NCTC 11231
Legionella pneumophila serogroup 1 Philadelphia Philadelphia-1 ATCC2 33152
Legionella pneumophila serogroup 2 Togus-1 ATCC 33154
Legionella pneumophila serogroup 3 Bloomington-2 ATCC 33155
Legionella pneumophila serogroup 4 Los Angeles-1 ATCC 33156
Legionella pneumophila serogroup 5 Dallas 1E ATCC 33216
Legionella pneumophila serogroup 6 Chicago 2 ATCC 33215
Legionella pneumophila serogroup 7 Chicago 8 NCTC 11984
Legionella pneumophila serogroup 8 Concorde 3 NCTC 11985
Legionella pneumophila serogroup 9 IN-23-GI-C2 NCTC 11986
Legionella pneumophila serogroup 10 Leiden 1 NCTC 12000
Legionella pneumophila serogroup 11 - NCTC 12179
47
Tabla 4.1.1.1. Continuación

DESIGNACIÓN DE LA NCTC/DMSZ/ATCC
CEPA BACTERIANA
CEPA No.
Legionella pneumophila serogroup 14 1169-MN-H NCTC 12174
Legionella pneumophila serogroup 15 - ATCC 35251
Legionella longbeachae serogroup 1 Longbeach 4 NCTC 11477
Legionella longbeachae serogroup 2 Tucker 1 NCTC 11530
Legionella bozemanii serogroup 1 WIGA NCTC 11358
Legionella bozemanii serogroup 2 Toronto-3 NCTC 11975
Legionella gormanii LS-13 NCTC 11401
Legionella dumoffi NY-23 NCTC 11370
Legionella micdadei Tatlock NCTC 11371
Legionella oakridgensis Oak Ridge 10 DSMZ3 21215
Legionella taurinensis Turín I no 1 DSMZ 21697
Legionella sainthelensis MSH-4 DSMZ 19231
Legionella rubrilucens WA-270A-C2 DSMZ 11884
Legionella cicinnatiensis 72-OH-0 DSMZ 19233
Legionella quinlivanii 1442-AUS-E NCTC 12433
Legionella spirithensis MSH-g NCTC 11990
Legionella anisa WA-316-C3 DSMZ 17627
1
NCTC: National Collection of Type Cultures; 2ATCC: American Type Culture Collection; 3DSMZ: Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Grupo II) 141 (35 Legionella género, 30 Legionella pneumophila (17 L. pneumophila sg.
1 + 13 L. pneumophila serogrupos 2-15), 106 no Legionella) aislados ambientales
provenientes de 64 muestras de agua procedentes de SGS Tecnos S.A. Laboratorio de
Microbiología de Medio Ambiente y Prevención (Madrid) (ver apartado 5.1. de Resultados).
Las colonias aisladas se analizaron con un látex comercial según las instrucciones del
fabricante (Legionella Latex Test, Oxoid, UK).
Grupo III) 28 aislados clínicos: 1 Legionella pneumophila sg. 1 Murcia y 27 aislados

clínicos no Legionella procedentes del Hospital Neurotraumatológico de Jaén (HNTJ) (ver
tabla 4.1.1.2.). Los aislados clínicos no Legionella fueron caracterizados por paneles
bioquímicos (Microscan Walkaway, Siemens, Germany), según las instrucciones del
fabricante. El aislado de L. pneumophila sg. 1 Murcia pertenece a la colección propia de
Vircell, S.L., y procede del brote de LD ocurrido en Murcia en Julio de 200114.
48
Tabla 4.1.1.2. Aislados clínicos del grupo I usados en el desarrollo del test.
DESIGNACIÓN DE LA
CEPA BACTERIANA PROCEDENCIA
CEPA
Pseudomonas aeruginosa Aislado clínico HNTJ1 1 HNTJ
Salmonella Aislado clínico HNTJ 2 HNTJ
Proteus mirabilis Aislado clínico HNTJ 3 HNTJ
Xantomonas Aislado clínico HNTJ 4 HNTJ
Aeromonas Aislado clínico HNTJ 5 HNTJ
Enterobacter aerogenes Aislado clínico HNTJ 6 HNTJ
Staphylococcus auerus Aislado clínico HNTJ 7 HNTJ
Escherichia coli Aislado clínico HNTJ 8 HNTJ
Serratia Aislado clínico HNTJ 9 HNTJ
Staphylococcus epidermidis Aislado clínico HNTJ 10 HNTJ
Bacillus cereus Aislado clínico HNTJ 11 HNTJ
Klebsiella Aislado clínico HNTJ 12 HNTJ
Citrobacter Aislado clínico HNTJ 13 HNTJ
Pseudomonas sp. 1 Aislado clínico HNTJ 14 HNTJ
Aislado clínico Pseudomonas sp. 1 Aislado clínico HNTJ 18 HNTJ
Aislado clínico Acinetobacter sp. 4 Aislado clínico HNTJ 21 HNTJ
Staphylococcus aureus Aislado clínico HNTJ 22 HNTJ
Staphylococcus viridans Aislado clínico HNTJ 23 HNTJ
Haemophilus sp. Aislado clínico HNTJ 24 HNTJ
Streptococcus sp. Aislado clínico HNTJ 25 HNTJ
Streptococcus sp. Aislado clínico HNTJ 26 HNTJ
Legionella pneumophila serogroup 1 Murcia Aislado clínico Murcia Murcia 2001
1
HNTJ: Hospital Neurotraumatológico de Jaén.
4.1.2. Reactivos Usados
Los reactivos que se han usado en el desarrollo del test se especifican en cada caso. Los
más comunes se detallan en la siguiente tabla de forma resumida:
49
Tabla 4.1.2.1. Reactivos usados
ABREVIATURA TAMPÓN/DISOLUCIÓN COMPOSICIÓN

Bolas de vidrio de 0.1 mm para
BOLAS romper organismos/células por Biospec Products, Inc.
agitación física
Tris 0.2 M, NaCl 0,5 M, EDTA 2%,
DEV solución desarrolladora o developer
Tween-20® 1% pH 8.5
Conjugado de Goat anti Mouse
IgG cabra anti IgG ratón
GAM-FITC marcado con isotiocianato de
Sigma-Aldrich
fluoresceina
Conjugado de Goat anti Mouse IgG cabra anti IgG ratón HRP
GAM-HRP
marcado con peroxidasa 1/6000 Sigma-Aldrich
Conjugado de Goat anti Rabbit
IgG cabra anti IgG conejo HRP
GAR-FITC marcado con isotiocianato de
Sigma-Aldrich
fluoresceina
NaCl 8 g/l, KCl 0,3 g/l, NaH2PO4 0.85
Tampón fosfato salino pH 7.2 con
PBSBSA 0.3 % g/l, KH2PO4 0.55 g/l, BSA 3 g/l, pH
albúmina de suero bovino al 0.3 %
7.2
Tampón fosfato salino pH 7.2 con
PBSBSA 1 % g/l, KH2PO4 0.55 g/l, BSA 10 g/l, pH
albúmina de suero bovino al 1 %
7.2
PBSc Tampón fosfato salino pH 7.5
g/l, KH2PO4 0.55 g/l, pH 7.5
PBSe Tampón fosfato salino pH 7.2
g/l, KH2PO4 0.55 g/l, pH 7.2
PEG 1% Polietilenglicol al 1% Polietilenglicol 10g/L
PMB Sulfato de Polimixina-B Sigma-Aldrich
TMB ELISA Substrate

TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
NEOGEN Corporation
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina para TMB Membrane Substrate
TMBm
membranas NEOGEN Corporation
Tampón de resuspensión de Borax 5 mM, BSA 0,5 % (p/v), PEG
TR
conjugados de oro coloidal 0,025 %, pH 7.4
Borax 5 mM, BSA 1 % (p/v), Tritón X-
Tampón de secado de conjugados de
TSO 100® 0.1 % (v/v), Tween-20® 1 % (v/v),
oro coloidal
sacarosa 6 % (p/v), pH 8
La totalidad de los Mab usados en el test han sido desarrollados en Vircell, S.L., excepto
el Mab tipo LP3IIG2, que ha sido adquirido a la ATCC (ATCC, HB 8472), siendo
posteriormente el hibridoma crecido y purificado en las instalaciones de Vircell, S.L.
4.1.3. Inoculación de Placas
- Agar Legionella: Gélose Legionella (LEG-F/LEG SUP-M/LEG SEL-M) de

bioMérieux®, SA (Lyon, Francia) preparado según instrucciones del fabricante.
- Agar Sangre: Columbia agar with sheep blood ‘plus’ de Oxoid, UK.
50
4.1.4. Materiales para Inmunocromatografía
- Backing o Soporte: material plástico de poliestireno con bandas adhesivas

protectoras de G&L.
- Bolsita Desecante: Minipax de Multisorb Technologies INC.
- Casete Plástico: de HBI Co. Ltd., Corea.
Figura 4.1.4.1. Casete plástico con parte superior transparente.
- Membrana: membrana porosa de nitrocelulosa de 4 cm de ancho y 5 micrómetros de

poro de Whatman.
- Pad de Absorción: papel 10 359 992 de Whatman.
- Pads de Muestra y Conjugado: se componen del mismo material. Se trata de fibras

de poliéster, de Hollingsworth & Vose.
- Papel Imprimible: etiquetas resistentes a la humedad APPLI y papel G&L brillante

para impresión usado en el covertape.
- Sobre de Aluminio: de Rotek Industries, India.
4.1.5. Maquinaria e Instrumentación
Los sistemas mecánicos o automáticos e instrumentos usados en la elaboración de la

inmunocromatografía para detección de Legionella en cultivos han sido:
51
- Agitación/Calefacción:
· Agitador magnético/placa calefactora AREX de VELP Scientifica, para la

preparación de tampones, hervido de Legionella y preparación de oro coloidal.
· Agitador circular Heidolph instruments Rotamax 120 para la realización de
Western-blot y agitación de lavados de inmunofluorescencia.
· Termobloque Bio TDB-100, usado para el calentamiento/incubación de muestras.
· Vortex Rx3 de VELP Scientifica.
- Almacenamiento de Materiales para Inmunocromatografía:
· Armario Desecante Standard Adjust-A-Shelf™ Desiccator Cabinets, para

conservación de materiales a humedad constante de la marca Terra Universal.
Figura 4.1.5.1. Armario desecante.
- Centrifugación:
· Centrífuga Thermo Scientific Sorvall RC 6 PLUS, para la preparación de conjugados

de oro coloidal.
. Microcentrífuga Eppendorf Centrifuge 5424, para la sedimentación de suspensiones
de legionellas y concentración de monoclonales.
52
- Cerrado de Casetes
· Cerradora automática de casetes Assembly Roller YK1225, Shanghái Kinbio Tech

Co. Ltd.
- Concentración de Monoclonales
· Microcon Centrifugal Filter Devices MWCO 10000 de Millipore.
- Corte de Materiales:
· Guillotina automática ZETA GSI-600 para el corte de pads.
Figura 4.1.5.2. Cortadora de materiales para inmunocromatografía.
- Corte de Tarjetas
· Guillotina automática BIODOT CM 4000, que sirve para cortar los strips a una
medida exacta, de manera reproducible y de forma regular.
Figura 4.1.5.3. Guillotina automática BIODOT CM 4000 (izquierda) y

detalle de la cuchilla y rampa de recogida de strips (derecha).
· Guillotina manual DAHLE 565 para el corte de las hojas de covertape en tiras.
53
- Cromatografía
· Cromatógrafo de altas presiones ÄKTA Explorer 100, GE Healthcare.
- Cubetas de Lectura en Espectrofotómetro: Starna 1 16R/100/Q/10 y Hellma 1 104B-

OS 10 mm.
- Dosificación de Membranas:
· Dispensadora automática BIODOT ZX 1000.
Figura 4.1.5.4. Dispensadora automática BIODOT ZX 1000
- Electroforesis y Western-Blot:
· Cubeta de electroforesis vertical Mini PROTEAN 3 Cell de Bio-Rad.
· Cubeta de transferencia de proteína BlueBlot wet /100 de Serva.
· Fuente de alimentación Power Pac Basic de Bio-Rad.
·Membrana de PVDF Immobilon-P 0.45 µm de Millipore.
- Filtración de Oro Coloidal
· Bomba Welch 2534C-02 para la conexión al filtro del oro coloidal y hacer el vacío.
. Stericup Filter Millipore de 0.22 µm para la filtración en el proceso de obtención del
oro coloidal para eliminar nucleantes en exceso.
54
- Inmunofluorescencia
· Porta-objetos de vidrio para inmunofluorescencia de Immuno-Cell, Bélgica.
· Microscopio de fluorescencia de Olympus, Japón.
- Impresión
· Impresora láser HP Color LaserJet CP1215 para la impresión de los covertapes.
- Laminación de Membranas
Laminadora LCI-300 de ZETA. Esta máquina sirve para poner automáticamente la

membrana en la posición exacta en la tarjeta de manera rápida y reproducible.
Figura 4.1.5.5. Laminadora de tarjetas (izquierda) y detalle del punto de corte y

salida de las tarjetas (derecha).
- Lectura Espectrofotométrica
· Espectrofotómetro UV-Visible Cary 50 Bio de Varian conectado a un ordenador con

Windows NT para la medida de la absorbancia de proteínas, oro coloidal y conjugados.
Figura 4.1.5.6. Espectrofotómetro UV-Visible Cary 50 Bio de Varian.
55
- Liofilización
· Liofilizador modelo Telstar® Cryodos.
- Pipetas
· Pipetas Finnpipette con rango de volúmenes de 100-1000 µl, 30-300 µl, 3-30 µl, 0.5-
10 µl y 0.5-5 ml, de un solo canal y multicanal.
- Secado de Membranas
· Estufa 0-250 ºC Indelab Serie 6741 A, para el secado de las membranas y pads tras
el proceso de dosificación.
- Sellado de Casetes
· Selladora con aire comprimido y calor de Strocar.
- Sonicación
· Sonoplus GM70 de Bandelin Electronic para la homogeneización de los conjugados

de oro coloidal, así como de los cultivos que se pegan a las placas de ELISA.
4.1.6. Software
El software utilizado ha consistido en:
- Escáner: Hewlett Packard Officejet Pro 1150 C.
- Medida espectrofotométrica: Cary WinUV Software.
- Programa de diseño del covertape: Macromedia FreeHand MX V 11.0.2.
- Programa de estadística: MedCalc V 12.2.1. (http://www.medcalc.org/).
- Programa estadístico de tratamiento de datos: Clinical Research Calculators de

VassarStats: website for statistical computation (http://vassarstats.net/).
56
- Programa de lectura fotográfica: Microsoft Photo Editor V 3.0.1.
- Sistema operativo: Windows VistaTM Home Premium.
4.2. Métodos
4.2.1. Inoculación de placas
Las muestras de colecciones de referencia (grupo I) fueron sembradas en el laboratorio a

partir de las cepas conservadas a –80 ºC, con un asa de siembra estéril mediante la técnica de
inoculación por estrías, para conseguir el aislamiento de las colonias en agar BCYE, y se
incubaron durante cinco días a 35 ± 2 ºC en atmósfera de CO2. Los aislados ambientales
(grupo II) fueron obtenidos por SGS Tecnos S.A. Laboratorio de Microbiología de Medio
Ambiente y Prevención (Madrid), donde se procesaron e inocularon según la normativa
española94. Las muestras no Legionella del grupo de aislados clínicos (grupo III) se cultivaron
en agar sangre, mientras que el aislado de L. pneumophila sg. 1 Murcia se procesó como el
grupo I.
4.2.2. Recogida de las Colonias de las Placas y Preparación a McFarland 1
Para la valoración de las colonias, éstas se recogieron en la proporción 1 colonia/ 100 µl

de medio de reacción y se agitaron en un vortex para posteriormente ser analizadas según el
método o prueba correspondiente a realizar.
Para la preparación de suspensiones de colonias, éstas se recogieron en la proporción de 1

colonia/ 100 µl de PBSc. Las suspensiones así obtenidas se hirvieron durante 20 minutos en
un baño para su inactivación. A continuación se midieron en el espectrofotómetro a una
absorbancia de 600 nanómetros (A600). La A600 se ajustó con PBSc a 0.25,
correspondiendo a 1 en la escala de McFarland (McF)133, 134, para que todas las suspensiones
estuviesen en las mismas condiciones para su evaluación. Cuando fue necesario se prepararon
otras A600 (McF2~0.4-0.5, McF4~0.6-0.7).
57
4.2.3. Desarrollo del Test
4.2.3.1. Preparación de Anticuerpos Monoclonales y Línea Control
La preparación de los Mab se ha realizado por inmunización en ratones con los antígenos
LPPA y LPS (procedentes de Vircell, S.L. Resultados no publicados presentados en parte en
la 19th Annual Meeting of the European Working Group for Legionella Infections135). En el
caso de la línea control se ha usado una proteína comercial anti ratón.
4.2.3.1.1. Preparación de Anticuerpos Monoclonales
4.2.3.1.1.1. Fusión
Para la obtención de los Mab se debe realizar un proceso de inmunización en ratones para
producir células esplenocíticas que posteriormente se fusionan con células mielocíticas para
obtener un hibridoma. De la purificación de éste se podrá obtener el Mab deseado. Este
proceso lo realizó el departamento de Inmunología de la empresa Vircell, S.L., para la
obtención de Mab específicos contra epítopos de los ya mencionados LPPA y LPS-1. El
proceso llevado a cabo se explica en los anexos 1 a 3 de ANEXO MATERIALES Y
MÉTODOS.
Los Mab seleccionados se numeraron como A, B, C, D, etc. y son los que se usan en este
trabajo.
4.2.3.1.2. Purificación de Hibridomas de Anticuerpos Monoclonales
Para la purificación de los Mab, se ha llevado a cabo una cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC, High-Performance Liquid Chromatography) en un cromatógrafo de altas
presiones (ÄKTA Explorer 100, GE Healthcare) con una columna Hi-Trap de Proteína-A de 1
ml.
Un volumen de 50 ml de hibridoma de Mab filtrado por 0.22 µm se introduce en el

cromatógrafo a 0.5 ml/minuto (flujo downflow) y se lava con 15 volúmenes de columna con
un tampón Glicina/NaCl (IgG1) o TRIS (otras IgG). La elución depende de si es por gradiente
o isocrática y se realiza con tampones citrato 0’1M pH 6, 5 y 4 para el primer caso, o con
tampones citrato 0.1M pH 3 para el segundo, con 10 volúmenes de columna, obteniendo
58
finalmente fracciones de 0.5 ml. Para conservar la columna se lava posteriormente con
NaOH/NaCl y tras lavar con agua se almacena en etanol al 20% (v/v) con azida sódica.
4.2.3.1.3. Procesado de las Fracciones de Purificación de Anticuerpos Monoclonales
Las eluciones obtenidas en la columna cromatográfica (HPLC) para cada Mab se

midieron a una absorbancia de 280 nm (A280) y a A320. Se unieron en función de la A280 y
la agregación ((A320/A280) x100) y su posición en el cromatograma. Las fracciones (F) del
pico se unieron entre sí formando una fracción (F1) y con el resto de eluciones se creó otra
fracción (F2). Si no fue necesario tener más de una fracción, se unieron todas las eluciones
seleccionadas (F1+F2). Las eluciones con muy baja A280 y alta agregación fueron
descartadas.
La agregación se ha calculado como se indica en el párrafo anterior. Al pool de

fracciones obtenido se le ha medido la A280 y A320 nuevamente y se ha calculado la
concentración y agregación tras filtrar por 0’45 µm de poro y añadir azida sódica al 0.1%
(p/v).
La A280 se relaciona directamente con la concentración de la proteína a través de la

absortividad molar (o factor de extinción molar), ε, en L cm-1 mol-1, a través de la ecuación de
la Ley de Beer-Lambert:
A = εbc
donde A es absorbancia a 280 nm, b es el paso de luz de la cubeta del espectrofotómetro,

y c es la concentración en g/L136. Para el caso de los anticuerpos o inmunoglobulinas (MW
~150000 (g mol-1)), ε tiene un valor de ~210000 L mol-1 cm-1 137
, por lo que al tener 1 cm la
cubeta de medida de paso de luz (Starna 1 16R/100/Q/10) y aplicando la multiplicación por el
peso molecular, queda un valor de ε corregido de: 1.4 L g-1, que empleado en la fórmula
anterior proporcionó el valor de concentración en g/L o mg/ml.
Estos Mab obtenidos se analizaron a continuación por ELISA (ensayo por

inmunoabsorción ligado a enzimas) (ver punto 4.2.3.2. ELISA) con placa de LPPA, L.
pneumophila sg. 1 o L. pneumophila sg. 5, según corresponda, para comprobar la pureza del
mismo y su actividad. El criterio para aceptar el Mab se basó en obtener el mismo título a
ambas concentraciones, lo que indicaría la pureza del mismo. Los que no mantuvieron el
59
título a ambas concentraciones fueron desechados. Los que sí, se titularon para línea o
conjugado.
4.2.3.1.4. Preparación de la Línea Control
La línea control del test consiste en una proteína comercial IgG de cabra anti ratón (IgG
goat anti Mouse, Sigma M2650) dosificada en PBSe a 1 mg/ml. Cuando los conjugados con
los Mab de ratón llegan a ella, se produce una reacción inmunológica entre ambos,
apareciendo una línea coloreada, lo que indica que la inmunocromatografía ha funcionado
adecuadamente.
4.2.3.2. ELISA
Para los ensayos de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) se han
sensibilizado placas de 96 pocillos de poliestireno (NUNC, Dinamarca) con el antígeno de
LPPA, o la cepa de Legionella correspondiente (L. pneumophila sg. 1 y L. pneumophila sg. 5).
El procedimiento en esencia ha sido:
- Para el antígeno de LPPA, se ha diluido éste en PBSe y se han añadido 100 µl a cada
pocillo de la placa, dejándola ésta en una cámara húmeda de incubación durante toda
una noche. Al día siguiente se han lavado las placas con PBSe con Tween®-20 al 0.1%
y se han añadido 300 µl de bloqueante con BSA, que se ha dejado actuar 2 horas. Se
vacía el bloqueante y se deja secar a 37 ºC durante 4 horas y una vez terminadas se
guardan a 4 ºC en ausencia de humedad.
- Para los cultivos de Legionella, una vez han sido inactivados por calor (hervir 20
minutos), se ha medido la A600 en el espectro y se ha preparado el cultivo a una
A600 de 0’5 en PBSe. Se ha medido para comprobar que es correcta y se ha diluido
1/200 y sonicado 30 segundos a 50 ciclos y 75% de potencia. Se han añadido 100 µl
a los pocillos de las placas y se ha seguido el mismo proceso que en el caso anterior.
En la elaboración del ELISA, se añaden 100 µl de Mab a analizar a la concentración de 1

y 0.1 µg/ml en PBSBSA 1% y se incuba durante 45 minutos a 37 ºC. Tras lavar la placa con
PBSe con Tween®-20 al 0.1% se añade un conjugado de GAM-HRP 1/6000 y se deja incubar
durante 30 minutos. Tras un nuevo lavado se adiciona TMB que dará color a los pocillos en
los que haya señal positiva y a continuación H2SO4 0.5 M como agente de parada de la
60
reacción, para finalmente leer los resultados en un lector con filtros de 450/620 nm
(Whittakker Bioproducts EIA Reader 400 FW). Éstos se llevaron a una hoja de cálculo para
su manejo.
4.2.3.3. Western-Blot
Para la realización del Western-blot se han cargado en un gel SDS-Page cepas de L.

bozemanii serogrupos 1 y 2, L. gormanii y L. longbeachae sg. 1 a una A600: 0.25 y
posteriormente se han transferido a una membrana de PVDF. Éstas se bloquearon con leche al
5% (p/v) en PBSe con Tween®-20 al 0.1%, y se incubaron en agitación circular con los Mab
de LPPA diluidos 1/400 en la misma solución usada para el bloqueo. Se lavó posteriormente
dos veces durante 10 minutos con PBSe con Tween®-20 al 0.1%, y se añadió un conjugado
GAM-HRP 1/6000. Posteriormente se repitió el paso de lavado y se reveló con TMBm hasta
la aparición de señal.
4.2.3.4. Inmunofluorescencia
Para la realización de la técnica de inmunofluorescencia, se han preparado las diferentes

cepas bacterianas a usar a una concentración de aproximadamente 800 bacterias por campo
en Yolk Sac al 0.5 %. Se han puesto 5 µl de cada dilución por pocillo del portaobjetos y se ha
dejado secar durante una hora para a continuación fijar con acetona por inmersión durante 30
minutos. Tras el secado, se almacenaron a 4 ºC.
Para llevar a cabo la reacción, se han puesto 20 µl de los Mab o policlonales a analizar a
una concentración de 10 µg/ml en PBSBSA 0.3% en el pocillo correspondiente durante 30
minutos en una cámara húmeda y a 37 ºC. A continuación se han realizado dos lavados de 10
minutos con PBSe y se ha añadido al pocillo conjugado de GAM-FITC o GAR-FITC (según
el caso) diluido 1/100 con Evans blue 1% (p/v) diluido 1/1000, incubando y lavando
nuevamente como en el paso anterior. Tras lavar con agua destilada se han secado y leído con
ayuda de glicerina tamponada a pH alcalino en el microscopio de fluorescencia.
61
4.2.3.5. Preparación del Strip. Dosificación de Tarjetas
La membrana de nitrocelulosa se ensambló en las tarjetas de poliestireno mediante una

laminadora de tarjetas, siendo estas conservadas a continuación en un armario desecante con
humedad constante.
Los Mab usados se prepararon como punto de partida a 1 mg/ml y se les añadió metanol
al 5% (v/v) justo antes del momento de ser dosificados con una dispensadora de líneas.
Cuando fue necesario concentrar, se realizó por centrifugación a 16400xg y se recogió el
concentrado a 1000xg en concentradores para centrífuga (Microcon Centrifugal Filter Devices,
Millipore) según las instrucciones del fabricante. Si por el contrario fue necesario diluir, se
realizó en el medio en que se encontraban.
Los elementos fundamentales de la dispensadora se muestran en la figura 4.2.3.5.1. Se

puede observar un reservorio con los Mab a dosificar (muestra) que es recogido por una
bomba, que lo extrae y lo lanza hacia los conductos de plástico (tubos de alimentación y
dispensación) cuya salida se encuentra en el cabezal de dispensación. La tarjeta con la
membrana se coloca en un soporte móvil, de manera que al desplazar la membrana bajo el
cabezal, éste va dibujando una línea que se difunde por capilaridad.
Figura 4.2.3.5.1. Elementos fundamentales de la dispensadora.
Las condiciones de dosificación para los Mab de Legionella han sido 0.6 µl/cm y 300 mm
de longitud. Las tarjetas dosificadas se secaron en una estufa durante 10 minutos a 50ºC y
posteriormente, tras cubrir las membranas con bandas protectoras que evitasen el contacto
62
directo con la luz, se guardaron en un armario desecante. Este proceso fue el mismo para
todas las dosificaciones realizadas.
4.2.3.6. Preparación de Oro Coloidal
Para la preparación del oro coloidal se partió de HAuCl4·3H2O sólido. Se pesó en una
balanza analítica y se le añadió agua apirógena para obtener una disolución al 20% (p/v). A 1
g de citrato trisódico anhidro se le añadieron 500 ml de agua apirógena. A esta última
disolución se le adicionó 2.5 ml de la solución de hidrocloruro de oro al 20 % (p/v) y se
comenzó a calentar hasta ebullición, se paró la agitación y se dejó 10 minutos en una placa
calefactora. Se produce un cambio de color del amarillo al negro y posteriormente al rojo. La
disolución obtenida se filtró con filtros de nitrocelulosa de 0.22 µm de poro y se diluyó cinco
veces en agua apirógena para su posterior caracterización espectrofotométrica, donde se
recogieron los valores de A500, A540 y A575, y el valor de λ máxima para conocer la
monodispersión del coloide.
4.2.3.7. Determinación de la Mínima Concentración que Protege al Oro (MPC)
Para calcular la mínima concentración de Mab que protege al oro (MPC) y lo estabiliza,
se ha realizado un cribado con oro diluido 1/2 a pH 5, 7 y 9. A un mililitro de la condición
elegida se le ha añadido 0.1 ml de proteína a concentraciones de 0 a 14 µg/ml diluida en el
mismo tampón usado para diluir el oro y a continuación se ha añadido 0.1 ml de NaCl 10%
(p/v) para parar la reacción y se ha dejado actuar 10 minutos. El blanco se obtuvo de igual
forma con 1 ml de oro, 0.1 ml de tampón usado en cada caso y 0.1 ml de agua destilada.
Finalmente se ha medido la A580 para cada tubo y se ha obtenido una curva para cada pH
donde se representa A580 frente a la concentración de proteína en µg/ml.
4.2.3.8. Conjugación de Anticuerpos Monoclonales al Oro Coloidal
Con las condiciones obtenidas para cada Mab en el cálculo de su MPC, se ha conjugado
cada uno diluyendo el oro coloidal en el tampón apropiado (finalmente pH 9 para todos los
casos), a la concentración determinada y se ha dejado agitando durante 15 minutos. Tras este
tiempo, se les ha añadido PEG 1% (p/v) a razón de 0.05 ml/ml de conjugado, y se ha agitado
15 minutos más. Pasado este tiempo se ha introducido el conjugado en un tubo de
polipropileno y se ha centrifugado 4 veces durante 30 minutos a 31100xg, resuspendiendo los
63
conjugados en TR. Tras cada lavado se ha sonicado cada tubo durante 30 segundos a 50 ciclos
y 75 % potencia y tras el último lavado se han medido en el espectro las A500, A540 y A575,
así como el valor de λ máxima.
4.2.3.9. Dosificación de Pads
Para la evaluación de los conjugados se secaron en un pad de poliéster, preparando la

dilución deseada (normalmente OD de 2 y 4), siendo la mitad del volumen a preparar TSO y
la otra mitad del volumen una mezcla de conjugado y TR. Se dosificó manualmente para las
pruebas extendiendo el volumen, y se secó durante 20 minutos a 50 ºC en una estufa. En el
caso de usar la dispensadora automática, se usó el cabezal con espray a una velocidad de 30
mm/segundo y una razón de 25 µl/cm, secándose de igual forma.
Para el bloqueo de pads de muestra se hizo de igual forma, secando durante 30 minutos a
50 ºC. En el caso de usar la dispensadora se usó 30 mm/segundo y una razón de 83.9 µl/cm,
secándose de igual forma.
4.2.3.10. Impresión de Covertape
La impresión de hojas de covertape e identificación del pad de absorción se realizó a

color. Las hojas de covertape se cortaron con una guillotina en tiras y las hojas identificativas
del pad de absorción se pegaron sobre hojas de dicho pad para igualmente cortarlas en la
guillotina. Estos elementos se usaron posteriormente en el montaje del strip.
4.2.3.11. Montaje de los Strips
Se montó el pad de conjugado 2 mm sobre la membrana y el de muestra superpuesto al de

conjugado solapando 1 mm sobre la membrana para que las barras de presión del casete
ejercieran su acción adecuadamente. El pad de absorción se ajustó al borde inferior del strip.
El covertape se colocó sobre el pad de muestra y la membrana, y se dejó reposar al menos 1
hora antes de su uso para la correcta adhesión de los componentes entre sí.
64
4.2.3.12. Determinación del Sistema Óptimo. Procedimientos Generales
Una vez preparados todos los Mab y conocida la concentración de cada uno se procedió a
la evaluación y puesta a punto del test. En el caso de los Mab LPS-1 I y LPN sólo se dosificó
la fracción denominada como F1 por ser las de más elevada concentración (estos dos Mab
tienen dos fracciones porque obligatoriamente necesitaban estar presentes tanto en línea como
en conjugado como se puede ver en el apartado 5.6.5. de resultados). Se dosificaron con la
dispensadora a distintas concentraciones para encontrar la óptima y ésta fue la que se usó para
el desarrollo (datos de titulación no mostrados).
Para llevar a cabo las reacciones, se utilizaron diferentes métodos en función de las
variables a usar. El procedimiento general inicial consistió en la adición de 40 µl de muestra y
2 gotas de solución de desarrollo DEV sobre el pocillo del strip correspondiente (protocolo
común de una inmunocromatografía). En el caso de no usar DEV se añadieron 90 µl
directamente sobre el pocillo.
En cuanto a la incubación de las muestras, se realizó a temperatura ambiente y/o en un

termobloque a la temperatura deseada.
Para la rotura física se usó una sonicación de 30 segundos con 50 ciclos al 25% de los
cultivos. Cuando se usaron bolas de vidrio, éstas se agitaron con el cultivo correspondiente en
un vortex y posteriormente se dejaron decantar para recoger el sobrenadante.
Cuando se analizaron cultivos de placas, éstos se recogieron con un asa de siembra estéril
y se introdujeron en un vial con el medio a usar en función del experimento, agitándose a
continuación. El siguiente paso, cuando así se requirió, fue la inactivación por calor mediante
hervido de las suspensiones durante 20 minutos. Para el análisis de suspensiones fue necesaria
la centrifugación de las muestras con una microcentrífuga a 15800xg durante 5 minutos. Se
retiró el sobrenadante, se añadió la solución correspondiente y se agitó para resuspender dicho
pellet.
Las principales líneas de las que debía constar el test: (género (GÉN), serogrupo 1 (SR1)
y serogrupo 1 a 15 (ESP)), se estudiaron inicialmente por separado, aunque en paralelo, para
una mayor facilidad y agilidad.
65
4.2.3.13. Preparación del Medio de Reacción
El medio final desarrollado se preparó diluyendo los componentes en agua destilada y

ajustándolo a un pH de 7.2. Se prepararon alícuotas de 1 ml/vial y se congeló a –80 ºC. A
continuación se realizó su liofilización durante 15 horas y una vez finalizado el proceso se
cerraron los viales manteniendo el vacío. Los viales liofilizados se mantienen almacenados a
temperatura ambiente. Para su uso se reconstituyen con 1 ml de agua destilada y se agitan.
4.2.4. Evaluación del Test
4.2.4.1. Fundamento del Método y Protocolo de Desarrollo del Test
El procedimiento a seguir para la realización del test consiste en:
- Al tratarse de colonias vivas debe realizarse en una cabina de seguridad biológica.
- Se atemperan todos los reactivos del test.
- Se identifica cada tubo con la colonia a analizar.
- Se abren los sobres necesarios y se identifican con cada colonia a analizar.
- Se añaden 1 ml de agua destilada al medio de reacción y se agita.
- Se añaden 200 µl de medio por tubo a usar.
- Se recogen con un asa estéril dos colonias típicas de entre 1-3 mm y se resuspenden
en 200 µl de medio asegurándose que todo ha quedado desprendido del asa. En el
caso de suspensiones de colonias inactivadas por calor, 200 µl de éstas se
centrifugan 5 minutos a 15800xg, se retira el sobrenadante y al pellet se le añaden
200 µl de medio.
- Se agita para resuspender y se deja incubar 10 minutos a 95 ºC.
- Se deja atemperar y se pipetean 90 µl para el pocillo del strip L.genus y otros 90 µl

para el del strip de Lpn1/1-15.
- Se deja desarrollar el test durante 15 minutos.

66
- Se realiza la lectura visual tras los 15 minutos.
4.2.4.2. Lectura Visual
La positividad de las muestras se determina mediante una escala de color, en función de

la intensidad de la banda obtenida con las tarjetas de lectura que poseen todos los equipos
VIRapid® de Vircell, S.L. (ver figura 4.2.4.2.1.) y a la cual se ajustan los productos que se
desarrollan en la empresa. La escala va desde el 0.5, que es la intensidad cut-off de la técnica,
hasta el 3 que se valora como positivo alto. Las lecturas inferiores a 0.5 se consideran un
resultado negativo y por encima positivo.
En el caso de ser intensidades cercanas al 0.5 (0.5- o 0.5-/0.5) se consideran

indeterminadas. Por debajo de 0.5 (<0.5), como ya se ha explicado, se tendría un resultado
negativo, pero entre el 0 y el 0.5 puede aparecer algo de color, lo que se denomina como <0.5
color. Cuando el valor es negativo, pero no es totalmente blanco, sino que se intuye la forma
de la línea, se denomina sombra, y aunque es negativo, indica señal visible en la línea.
Cuando la intensidad de las líneas se encuentra por encima de un valor, pero no muy
alejado, se le denomina como el valor y el símbolo +, por ejemplo, 1+, y cuando el color es
próximo a un valor, pero algo menos, se le denomina el valor y el símbolo -, por ejemplo, 2-.
Cuando la intensidad está justo entre dos números de la tarjeta de lectura, se le denomina
como valor y símbolo + y valor y símbolo -, por ejemplo 1+/2-.
Figura 4.2.4.2.1. Tarjeta de intensidades mostrando la escala de intensidad de 0 a 3.
67
4.2.4.3. Determinación del Límite de Detección de la Técnica
Para determinar el límite de detección del test, se prepararon suspensiones de bacterias no

inactivadas y se realizaron diluciones 1/10 seriadas de las mismas en PBSc, siendo
posteriormente cultivados 10 µl de las mismas en BCYE. Dichas placas fueron incubadas
durante 5 días a 35±2 ºC en atmósfera de CO2. Las colonias obtenidas se contaron. Las
suspensiones se analizaron y se comprobó hasta que unidades formadoras de colonias por
mililitro se detectaba señal en el test inmunocromatográfico.
4.2.4.4. Tratamiento Estadístico de los Datos
Para validar e interpretar correctamente los resultados obtenidos por el kit que se ha
desarrollado, fue necesario realizar un estudio estadístico. Los valores que se deben
determinar para valorar la exactitud (capacidad del clasificador de detectar correctamente una
condición cuando está presente y descartarla cuando está ausente) del método son la
especificidad, sensibilidad y los valores predictivos principalmente, pero también pueden
considerarse por ejemplo las tasas de verosimilitud.
Las curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Característica Operativa del

Receptor)138-140, son una representación gráfica del rendimiento de un clasificador que
proporciona visualmente la capacidad de dicho método para detectar correctamente los
individuos con presencia de la condición de interés y su incapacidad para identificar los
individuos del grupo de ausencia141, 142,143. Brevemente, se genera una curva que proporciona
un punto de corte para los datos. Por encima de éste la respuesta del clasificador se considera
positiva y por debajo negativa. Pero esto puede producir errores por posibles falsas
clasificaciones de los datos. Dichos fallos generan una probabilidad de error al tomar una
decisión que depende del punto de corte elegido. Estas probabilidades de error se relacionan
numéricamente con la sensibilidad y la especificidad a través de la fracción de falsos positivos
o de verdaderos positivos y la representación en el plano de estos porcentajes o fracciones
recibe el nombre de curva ROC.
68
Figura 4.2.4.4.1. Representación de las fracciones de falsos positivos (FP) frente a la

de verdaderos positivos (VP). Curva ROC.
La máxima exactitud del test se producirá cuando el área bajo la curva sea igual a 1, es
decir, un ángulo recto que se dibuje sobre los ejes y no una curva entre los mismos144. Por ello,
cuanto más próximo a 1 sea el área calculada bajo la curva, más exactitud tendrá el
clasificador valorado.
Esta metodología tiene aplicación en los sistemas de diagnóstico y predicción. Los

cálculos y curvas se han realizado con el programa MEDCALC145, 146 (MedCalc Software,
Acacialaan 22, B-8400 Ostend, Belgium, http://www.medcalc.org/), que elabora el cálculo de
estas curvas en función de los pares de valores (sensibilidad, especificidad).
A continuación se definen estos conceptos que se calcularán posteriormente para

determinar la validez del test desarrollado como método de detección de Legionella en
cultivos procedentes de muestras ambientales y humanas:
- Falsos negativos (FN): número de casos en los que está presente la condición y se da
una predicción negativa de forma incorrecta.
- Falsos positivos (FP): número de casos en los que está ausente la condición y se da
una predicción positiva de forma incorrecta.
- Verdaderos negativos (VN): número de casos con ausencia de la condición y a los
que se les da una predicción negativa correcta.
69
- Verdaderos positivos (VP): número de casos con presencia de la condición y a los

que se les da una predicción positiva correcta.
- Especificidad (E): probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo
estado real sea la ausencia de la condición de interés. Se calcula como:
VN
E= = FVN
FP + VN , siendo FVN la fracción de verdaderos negativos. Y siendo la
FFP la fracción de falsos positivos, que se calcula como 1-E.
- Sensibilidad (S): probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado
real sea la presencia de la condición de interés. Se calcula como:
VP
S= = FVP
VP + FN , siendo FVP la fracción de verdaderos positivos. Y siendo la
FFN la fracción de falsos negativos, que se calcula como 1-S.
- Valor predictivo negativo (VPN): probabilidad de identificar correctamente los casos
VN
VPN =
negativos. Se calcula como: FN + VN .
- Valor predictivo positivo (VPP): o precisión de un clasificador. Es la probabilidad de
VP
VPP =
identificar correctamente los casos positivos. Se calcula como: VP + FP .
- Tasa de verosimilitud (LR): para cada tipo de respuesta del clasificador, se define
como el cociente entre la probabilidad de la respuesta bajo presencia de la condición
y la probabilidad de dicha respuesta bajo el estado de ausencia. Puede ser positiva
S FVP
LRP = =
(LRP) o negativa (LRN), y se calculan como: 1 − E FFP y
1 − S FFN
LRN = =
E FVN . Los valores igual a 1 (positivos o negativos) indican que la
respuesta del clasificador es igual de probable entre individuos con y sin presencia
de la condición. Si es mayor de 1, indica que es más probable entre individuos con
presencia de la condición. Tasa por debajo de 0’1 y por encima de 10 significarían
que el clasificador es excelente, mientras que el peor resultado para el clasificador es
cuando se encuentra entre 0’5 y 2.
- Exactitud (o accuracy, AC): es la probabilidad de un clasificador de predecir
VP + VN
AC =
correctamente. Se calcula como: N . Cuanto más cercano a 1 sea su
valor, más exacto será el resultado, o a 100 en términos de tanto por ciento.
70
- Índice de Youden (γ): es la diferencia entre la proporción de respuestas positivas del

clasificador cuando la condición está presente y la proporción de respuestas positivas
cuando la condición está ausente. Se calcula como: γ= S + E -1. Con este parámetro
de puede ver si la clasificación es aleatoria. Cuando este ocurre es 0. Si la
clasificación es ideal será 1.
Con estos datos pueden generarse tablas de doble entrada con el siguiente esquema140, 141,
144
.
Tabla 4.2.4.4.1. Tabla de doble entrada
PREDICCIÓN CLASIFICADOR
POSITIVO NEGATIVO
ESTADO TOTAL
PRESENCIA VP1 FN2
REAL DE PRESENCIA
LA
AUSENCIA FP3 VN4 TOTAL AUSENCIA
CONDICIÓN
TOTAL TOTAL
TOTAL
POSITIVOS NEGATIVOS
1
VP: verdaderos positivos; 2FN: falsos negativos; 3FP: falsos positivos; 4VN: verdaderos negativos.
Con estas tablas de doble entrada puede verse la diagonal de aciertos (VP-VN) y la de
errores (FN-FP) que nos informa del rendimiento o exactitud del clasificador en comparación
con el estado real de la condición. A partir de la tabla de doble entrada podemos calcular el
resto de parámetros mencionados.
4.2.4.5. Estudios de Estabilidad
4.2.4.5.1. Estabilidad de los Strips
Para el estudio de la estabilidad de los strips, éstos se incubaron a 50 ºC durante una

semana y se analizaron en paralelo a temperatura ambiente (TA). Así mismo, se analizó el
strip tras un año a TA conservado con desecantes en ausencia de luz. Las suspensiones usadas
se prepararon a McF1 y fueron: L. pneumophila sg. 1 Philadelphia, L. pneumophila sg. 1
Oxford, L. bozemanii sg. 1, L. pneumophila sg. 3, Citrobacter y Ps. aeruginosa. Se probaron
con el método expuesto en el apartado 4.2.4.1. y a los 15 minutos se llevó a cabo la lectura
visual.
71
4.2.4.5.2. Estabilidad del Medio
Para estudiar la estabilidad del medio preparado, viales de 1 ml de éste se liofilizaron e

incubaron a 50 ºC durante dos meses, analizándose al mes y a los dos meses. Un vial se
reconstituyó al año y se valoró en paralelo a uno recién reconstituido del mismo lote.
Las suspensiones usadas se prepararon a McF1 y se conservaron a 4 ºC. Se prepararon: L.

pneumophila sg. 1 Philadelphia, L. pneumophila sg. 1 Oxford, L. pneumophila sg. 1 OLDA, L.
pneumophila sg. 1 Camperdown, L. pneumophila sg. 1 Bellingham, L. bozemanii sg. 1, L.
gormanii, L. pneumophila sg. 15, L. pneumophila sg. 7, L. pneumophila sg. 2, Aeromonas,
Salmonella, S. epidermidis, E. aerogenes y B. cereus.
Para la evaluación se reconstituyó el vial correspondiente de medio con 1 ml de agua

destilada y se homogeneizó por agitación. 200 µl de las cepas de centrifugaron durante 5
minutos a 15800xg y al pellet se le añadió la cantidad de medio correspondiente. Se agitaron e
incubaron 10 minutos a 95 ºC y finalmente se añadieron al test, dejando desarrollarse éste
durante 15 minutos, tras los cuál se realizó la lectura visual como se indica en el apartado
4.2.4.1.
72
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. Placas inoculadas
El grupo I se compone de cepas de colección (ATCC, NCTC, DSMZ) y sólo hay una
especie de Legionella por placa inoculada.
El grupo de mayor interés es el grupo II, porque es representativo del trabajo que se
puede realizar en un laboratorio de análisis de aguas. Se muestran las placas inoculadas y la
descripción de las colonias en el ANEXO 1 de ANEXO RESULTADOS. La numeración de
las placas fue dada por SGS Tecnos, S.A. y así se denominó a las colonias obtenidas para su
análisis. De cada placa se clasificaron las diferentes colonias por tamaño, color, tipo y textura.
El grupo III se compone de aislados clínicos. Las cepas no Legionella se inocularon en

placas de agar sangre y se obtuvieron colonias por aislamiento. En el caso del aislado de L.
pneumophila sg. 1 Murcia se hizo en BCYE como en el grupo I, y se obtuvo una placa con
colonias de dicha cepa.
5.2. Desarrollo del Test
5.2.1. Anticuerpos Monoclonales
Tras la inmunización de los ratones y el proceso de fusión para la obtención de los Mab,
se obtuvieron diferentes clones que se enumeraron con letras: A, B, C, etc. (consultar
ANEXO 1 de ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS). Se determinó el isotipo de cada Mab
y se creció dicho hibridoma a gran escala (ver ANEXO 2 y ANEXO 3 de ANEXO
MATERIALES Y MÉTODOS y el ANEXO 2 de ANEXO RESULTADOS).
Se enumeran los Mab obtenidos así como el isotipo de cada uno: LPPA A (IgG2a), LPPA
B (IgG1), LPPA C (IgG1), LPPA D (IgG1), LPPA E (IgG1), LPPA F (IgG1), LPS-1 A (IgG3),
LPS-1 B (IgG1), LPS-1 C (IgG1), LPS-1 D (IgM), LPS-1 E (IgG3), LPS-1 F (IgG3), LPS-1 G
(IgG1), LPS-1 H (IgG2b) y LPS-1 I (IgG3). Para el Mab comercial adquirido a la ATCC (HB
8472TM, LP3IIG2), designado para su estudio en este trabajo como LPN, la subclase o isotipo
era IgG2a. Los elegidos por su actividad (ver tabla 5.2.3.1.) fueron: LPPA B, LPPA C, LPPA
75
5. RESULTADOS
D, LPPA E, LPS-1 A, LPS-1 E. LPS-1 F, LPS-1 H, LPS-1 I y el Mab perteneciente a la

ATCC.
5.2.2. Purificación de Anticuerpos Monoclonales
Tras la purificación por la columna cromatográfica (HPLC), se obtuvieron diferentes

eluciones que se unieron en función de la A280, la agregación y su posición en el
cromatograma (ver apartado 4.2.3.1.3. de Materiales y Métodos).
Se obtuvieron los siguientes lotes (tabla 5.2.2.1.):
Tabla 5.2.2.1. Resultados de las medidas espectrofotométricas de Mab obtenidos y

su concentración
[] []
Mab A2801 A3202 AG3 (%) Mab A280 A320 AG (%)
(mg/ml)4 (mg/ml)
LPPA B 1 0,5326 0,0089 1,7 0,3888 LPS-1 A 1 0,8773 0,0023 0,3 0,6404
LPPA B 2 0,5407 0,0102 1,9 0,3947 LPS-1 A 2 1,8560 0,0563 3,0 1,3549
LPPA B 3 0,4910 0,0182 3,7 0,3584 LPS-1 A 3 1,3537 0,0652 4,8 0,9882
LPPA B 4 0,6947 0,0496 7,1 0,5071 LPS-1 A 4 1,3334 0,0752 5,6 0,9734
LPPA B 5 0,3921 0,0130 3,3 0,2862 LPS-1 A 5 1,8840 0,0562 3,0 1,3753
LPPA B 6 0,2319 0,0073 3,1 0,1693 LPS-1 A 6 1,0625 0,0452 4,3 0,7756
LPPA B 7 0,3743 0,0168 4,5 0,2732 LPS-1 C 1 0,5968 0,0625 10,5 0,4357
LPPA B 8 0,1666 0,0072 4,3 0,1216 LPS-1 C 2 0,1462 0,0125 8,6 0,1067
LPPA B 9 0,2174 0,0073 3,4 0,1587 LPS-1 C 3 0,0988 0,0089 9,0 0,0721
LPPA B 10 0,1704 0,0687 40,3 0,1244 LPS-1 C 4 0,3271 0,0285 8,7 0,2388
LPPA C 1 0,4795 0,0710 14,8 0,3500 LPS-1 C 5 0,1365 0,0211 15,5 0,0996
LPPA C 2 0,3449 0,0901 26,1 0,2518 LPS-1 C 6 0,2425 0,0422 17,4 0,1770
LPPA C 3 0,3763 0,0138 3,7 0,2747 LPS-1 C 7 0,0910 0,0147 16,2 0,0664
LPPA C 4 0,2314 0,0127 5,5 0,1689 LPS-1 C 8 0,0916 0,0062 6,8 0,0669
LPPA C 5 0,2158 0,0259 12,0 0,1575 LPS-1 E 1 2,4300 0,0857 3,5 1,7739
LPPA C 6 0,3032 0,0185 6,1 0,2213 LPS-1 E 2 3,1779 0,1250 3,9 2,3199
LPPA C 7 0,4906 0,0245 5,0 0,3581 LPS-1 E 3 3,0260 0,1756 5,8 2,2090
LPPA C 8 0,3417 0,0155 4,5 0,2494 LPS-1 E 4 2,9560 0,1012 3,4 2,1579
LPPA C 9 0,4164 0,0229 5,5 0,3040 LPS-1 F 1 1,4723 0,0254 1,7 1,0748
LPPA C 10 0,5230 0,0513 9,8 0,3818 LPS-1 F 2 0,8349 0,0089 1,1 0,6095
LPPA C 11 0,3940 0,1042 26,4 0,2876 LPS-1 F 3 0,9985 0,0065 0,7 0,7289
LPPA C 12 0,4038 0,1239 30,7 0,2948 LPS-1 F 4 1,1600 0,0058 0,5 0,8468
LPPA C 13 0,2757 0,0142 5,2 0,2013 LPS-1 F 5 0,9112 0,0085 0,9 0,6652
LPPA C 14 0,3387 0,1263 37,3 0,2473 LPS-1 H 1 0,4789 0,0512 10,7 0,3496
LPPA C 15 0,3888 0,1281 32,9 0,2838 LPS-1 H 2 0,2013 0,0338 16,8 0,1469
LPPA C 16 0,2676 0,0908 33,9 0,1953 LPS-1 H 3 2,0438 0,0516 2,5 1,4920
LPPA C 17 0,2951 0,1111 37,6 0,2154 LPS-1 H 4 2,1065 0,0451 2,1 1,5377
LPPA C 18 0,3470 0,1404 40,5 0,2533 LPS-1 I F1 1 1,0599 0,0292 2,8 0,7737
76
5. RESULTADOS

Mab A2801 A3202 AG3 (%) [ ] (mg/ml)4 Mab A280 A320 AG (%) [ ] (mg/ml)
LPPA C 19 0,1258 0,0414 32,9 0,0918 LPS-1 I F1 2 1,3678 0,0387 2,8 0,9985
LPPA D 1 0,2392 0,0125 5,2 0,1746 LPS-1 I F1 3 1,0423 0,0384 3,7 0,7609
LPPA D 2 0,3889 0,0057 1,5 0,2839 LPS-1 I F2 1 0,4670 0,0221 4,7 0,3409
LPPA D 3 0,2774 0,0256 9,2 0,2025 LPS-1 I F2 2 0,2341 0,0264 11,3 0,1709
LPPA D 4 0,4201 0,0395 9,4 0,3067 LPS-1 I F2 3 0,4787 0,0304 6,4 0,3495
LPPA D 5 0,2742 0,0210 7,7 0,2002 LPS-1 I F2 4 0,3503 0,0229 6,5 0,2557
LPPA D 6 0,3171 0,0154 4,9 0,2315 LPS-1 I F3 1 1,5216 0,0667 4,4 1,1108
LPPA D 7 0,2426 0,0088 3,6 0,1771 LPN F1 1 2,9710 0,0423 1,4 2,1688
LPPA E 1 1,1850 0,0111 0,9 0,8651 LPN F1 2 2,4750 0,0344 1,4 1,8068
LPPA E 2 0,3688 0,0356 9,7 0,2692 LPN F1 3 2,7530 0,0433 1,6 2,0097
LPPA E 3 0,5724 0,0324 5,7 0,4179 LPN F1 4 1,8520 0,0326 1,8 1,3520
LPPA E 4 0,3466 0,0083 2,4 0,2530 LPN F1 5 1,5662 0,0426 2,7 1,1433
LPPA E 5 0,4603 0,0312 6,8 0,3360 LPN F2 1 0,3475 0,0235 6,8 0,2537
LPPA E 6 0,6334 0,0161 2,5 0,4624 LPN F2 2 0,2953 0,0198 6,7 0,2156
LPPA E 7 0,2422 0,1181 48,8 0,1768 LPN F2 3 0,4389 0,0288 6,6 0,3204
LPPA E 8 0,3688 0,0250 6,8 0,2692 LPN F2 4 0,2719 0,0143 5,3 0,1985
LPPA E 9 0,2934 0,0075 2,6 0,2142 LPN F2 5 0,3995 0,0236 5,9 0,2916
LPPA E 10 0,1005 0,0532 52,9 0,0734
1
A280: absorbancia a 280 nm; 2A320: absorbancia a 320 nm; 3AG: agregación; 4[ ] (mg/ml): concentración en
miligramos/mililitro.
Los cromatogramas obtenidos en la purificación por HPLC de los Mab, en función del
isotipo de IgG, se muestran en la figura 5.2.2.1. Sólo se presenta un ejemplo de cada tipo de
Mab producido por el elevado número de lotes obtenidos.
Se puede ver el tipo de cromatograma (izquierda) y un detalle del pico (derecha). Las
líneas azules representan la A280 que se cuantifica en el eje de ordenadas. Las barras rojas del
eje de abscisas señalan las eluciones correspondientes a esa posición (A1, A2, etc.). Los
trazos grises simbolizan el cambio en el pH (al ir variando el pH se produce la elución de
la/las especie/s presentes y se obtienen por tanto diferentes picos). Las líneas marrones
indican la variación en la conductividad de la muestra en el proceso de purificación y, por
último, las verdes representan los gradientes de concentración de sales de los tampones
usados en la cromatografía.
77
5. RESULTADOS
TIPO IgG1 (LPPAB, LPPAC, LPPAD, LPPAE, LPS-1 C)

mAU mAU
2000
4000
1500
3000
2000 1000
1000 500
0
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B12 F2 C5 C9 D1 D5 D9 E1E4E7 E11 F3 F6F9 Waste 0 C1 Waste C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10C11C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml 48.0 50.0 52.0 54.0 56.0 58.0 60.0 62.0 ml
TIPO IgG2a (LPN)
mAU
mAU
800
1200
1000
600
800
600 400
400
200
200
0 0 A9 A11 B12 B10 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 C2C3C4C5C6C7C8C9 C11 D12 D10 D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E11 F12 F10
F3 W asteB2 D9 E6F5
720.0 730.0 740.0 750.0 760.0 ml
0 100 200 300 400 500 600 700 ml
78
5. RESULTADOS
TIPO IgG2b (LPS-1 H)

mAU
mAU
mAU
1200
1000 1000
1000
800 800
800
600 600
600
400
400
400
200
200
200
0
0
0 F3 F2 A1 A4 A7A10 B11B8 B5 B2 C2 C5 C8C11 D10D7 D4 D1 E3 E6 E9E12F10 F7F5F3F1 G3 G6 G9G12 H9 H6 H3 I1 I3I5 I6 B11 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D12 D11 D10 D9 D8 D7
0 100 200 300 400 500 600 0
ml 20 40 60 80 100 ml 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 ml
TIPO IgG3 (LPS-1 A, LPS-1 E, LPS-1F, LPS-1 I)

mAU
mAU
400
1200
300
1000
800
200
600
400
100
200
0 0 A12 B11 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C12 D11 D9 D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7

F3 WasteB6 C7 D5 E9
620.0 625.0 630.0 635.0 640.0 645.0 650.0 655.0 660.0 ml
0 100 200 300 400 500 600 ml
Figura 5.2.2.1. Cromatogramas obtenidos para la purificación de hibridomas por HPLC para cada tipo de Mab
79
5. RESULTADOS
5.2.3. ELISA para la Comprobación de la Actividad de los Anticuerpos Monoclonales
La actividad de los Mab purificados se analizó por la técnica de ELISA con placas
sensibilizadas con antígeno de LPPA o cultivos de L. pneumophila sg. 1 y L. pneumophila sg. 5
(ver apartado 4.2.3.2.), a las concentraciones de 1 y 0.1 µg/ml diluidos en PBSBSA 1%. Este
medio se utilizó como control negativo en los ensayos de ELISA. El criterio de selección se
basó en resultados previos en Vircell, S.L. con otros Mab desarrollados (resultados no
mostrados) y consistió en que debían de presentar alta actividad en el ensayo de ELISA y que la
absorbancia obtenida fuese similar en ambas concentraciones probadas.
Tabla 5.2.3.1. Absorbancias de los ensayos de ELISA para los Mab a 1 y 0.1 µg/ml,
concentración (mg/ml) y aceptación o rechazo de los diferentes lotes de Mab obtenidos
Abs. Abs.
Abs.2 Abs.
[] ELISA [] ELISA
Mab ELISA ACEPTAR Mab ELISA ACEPTAR
(mg/ml)1 0,1 (mg/ml) 0,1
1 µg/ml 1 µg/ml
µg/ml µg/ml
LPPA B 1 0,3888 4,430 3,700 SI LPS-1 A 1 0,6404 4,420 4,440 SI
LPPA B 2 0,3947 4,430 4,050 SI LPS-1 A 2 1,3549 4,421 3,635 SI
LPPA B 3 0,3584 3,910 0,910 NO LPS-1 A 3 0,9882 4,427 4,436 SI
LPPA B 4 0,5071 3,690 3,970 SI LPS-1 A 4 0,9734 4,425 4,425 SI
LPPA B 5 0,2862 4,031 4,446 SI LPS-1 A 5 1,3753 4,126 4,440 SI
LPPA B 6 0,1693 4,442 0,761 NO LPS-1 A 6 0,7756 4,421 4,436 SI
LPPA B 7 0,2732 3,700 3,801 SI LPS-1 C 1 0,4357 0,301 0,086 NO
LPPA B 8 0,1216 0,788 0,096 NO LPS-1 C 2 0,1067 1,038 0,126 NO
LPPA B 9 0,1587 0,480 0,062 NO LPS-1 C 3 0,0721 0,982 0,241 NO
LPPA B 10 0,1244 1,424 0,173 NO LPS-1 C 4 0,2388 0,861 0,151 NO
LPPA C 1 0,3500 2,100 0,270 NO LPS-1 C 5 0,0996 0,158 0,030 NO
LPPA C 2 0,2518 3,510 2,740 SI LPS-1 C 6 0,1770 2,532 0,316 NO
LPPA C 3 0,2747 3,690 3,710 SI LPS-1 C 7 0,0664 1,676 0,786 NO
LPPA C 4 0,1689 3,693 3,454 SI LPS-1 C 8 0,0669 0,972 0,697 NO
LPPA C 5 0,1575 4,422 3,745 SI LPS-1 E 1 1,7739 4,416 4,264 SI
LPPA C 6 0,2213 4,412 4,434 SI LPS-1 E 2 2,3199 4,416 4,411 SI
LPPA C 7 0,3581 4,425 4,443 SI LPS-1 E 3 2,2090 4,127 4,438 SI
LPPA C 8 0,2494 4,419 4,445 SI LPS-1 E 4 2,1579 4,427 4,428 SI
LPPA C 9 0,3040 4,121 4,432 SI LPS-1 F 1 1,0748 4,423 4,437 SI
LPPA C 10 0,3818 4,232 4,140 SI LPS-1 F 2 0,6095 4,427 2,404 SI
LPPA C 11 0,2876 4,413 2,657 SI LPS-1 F 3 0,7289 3,652 4,440 SI
LPPA C 12 0,2948 4,420 3,391 SI LPS-1 F 4 0,8468 4,427 4,432 SI
LPPA C 13 0,2013 4,419 0,935 NO LPS-1 F 5 0,6652 4,425 4,135 SI
LPPA C 14 0,2473 0,998 0,158 NO LPS-1 H 1 0,3496 9,999 9,999 SI
LPPA C 15 0,2838 1,173 0,131 NO LPS-1 H 2 0,1469 9,999 9,999 SI
80
5. RESULTADOS

2 Abs. Abs.
Abs. Abs.
[] ELISA [] ELISA
Mab ELISA ACEPTAR Mab ELISA ACEPTAR
(mg/ml)1 0,1 (mg/ml) 0,1
1 µg/ml 1 µg/ml
µg/ml µg/ml
LPPA C 16 0,1953 0,756 0,096 NO LPS-1 H 3 1,4920 3,953 4,428 SI
LPPA C 17 0,2154 0,471 0,065 NO LPS-1 H 4 1,5377 4,253 4,423 SI
LPPA C 18 0,2533 0,479 0,070 NO LPS-1 I F1 1 0,7737 3,874 4,427 SI
LPPA C 19 0,0918 0,752 0,091 NO LPS-1 I F1 2 0,9985 4,426 4,429 SI
LPPA D 1 0,1746 4,440 1,200 SI LPS-1 I F1 3 0,7609 3,683 4,427 SI
LPPA D 2 0,2839 4,140 0,900 NO LPS-1 I F2 1 0,3409 4,118 3,734 SI
LPPA D 3 0,2025 3,530 2,100 SI LPS-1 I F2 2 0,1709 4,142 4,433 SI
LPPA D 4 0,3067 3,700 2,020 SI LPS-1 I F2 3 0,3495 3,881 4,421 SI
LPPA D 5 0,2002 3,659 0,767 NO LPS-1 I F2 4 0,2557 4,130 4,260 SI
LPPA D 6 0,2315 4,033 1,641 SI LPS-1 I F3 1 1,1108 4,243 4,424 SI
LPPA D 7 0,1771 3,566 0,610 NO LPN F1 1 2,1688 1,188 0,817 SI
LPPA E 1 0,8651 4,420 4,050 SI LPN F1 2 1,8068 1,243 0,873 SI
LPPA E 2 0,2692 3,590 1,880 SI LPN F1 3 2,0097 1,269 0,843 SI
LPPA E 3 0,4179 4,423 4,266 SI LPN F1 4 1,3520 1,314 0,849 SI
LPPA E 4 0,2530 4,109 4,427 SI LPN F1 5 1,1433 1,236 0,831 SI
LPPA E 5 0,3360 4,427 4,401 SI LPN F2 1 0,2537 1,099 0,725 SI
LPPA E 6 0,4624 4,428 4,432 SI LPN F2 2 0,2156 1,328 0,898 SI
LPPA E 7 0,1768 3,693 1,619 SI LPN F2 3 0,3204 1,275 0,904 SI
LPPA E 8 0,2692 3,735 2,136 SI LPN F2 4 0,1985 1,300 0,873 SI
LPPA E 9 0,2142 3,448 0,537 NO LPN F2 5 0,2916 1,104 0,744 SI
LPPA E 10 0,0734 2,753 0,417 NO
1
[ ] (mg/ml): concentración en miligramos/mililitro; 2Abs.: absorbancia.
5.2.4. Unión de Lotes de Anticuerpos Monoclonales
Los Mab obtenidos y analizados por ELISA que mantuvieron la actividad, se unieron para
la obtención de un único lote final de cada Mab. Los valores de concentración finales se
muestran en la tabla 5.2.4.1.
Tabla 5.2.4.1. Valores finales de concentración tras la unión de lotes de Mab

obtenidos
A2801 A3202 AG3 (%) [ ] (mg/ml)4

LPPA B 0,4440 0,0117 2,6 0,3241
LPPA C 0,3216 0,0117 3,6 0,2348
LPPA D 0,3019 0,0049 1,6 0,2204
LPPA E 0,3550 0,0135 3,8 0,2592
LPS-1 A 1,5170 0,0420 2,8 1,1074
LPS-1 E 3,3470 0,0160 0,5 2,4433
81
5. RESULTADOS

A2801 A3202 AG3 (%) [ ] (mg/ml)4
LPS-1 F 1,1780 0,0570 4,8 0,8599
LPS-1 H 2,6780 0,3540 13,2 1,9549
LPS-1 I F1 1,6340 0,1080 6,6 1,1928
LPS-1 I F2 0,3597 0,0297 8,3 0,2626
LPN F1 3,0350 0,2220 7,3 2,2156
LPN F2 0,2953 0,0262 8,9 0,2156
1
absorbancia a 280 nm; 2A320: absorbancia
A280: absorbancia absorbancia a 320 nm; 3AG: agregación;
4
[ ] (mg/ml): concentración en miligramos/mililitro.
5.3. Oro coloidal
El oro coloidal citrato se caracterizó espectrofotométricamente y se obtuvieron los

parámetros que se reflejan en las tablas 5.3.1. y 5.3.2., y la curva de absorbancia-longitud de
onda (λ) que se muestra en la figura 5.3.1.:
λmáxima
Figura 5.3.1. Curva de absorbancia-longitud de onda (λ)

(λ)) (en un rango de 450 a 650
nm) del oro coloidal preparado.
preparado. El parámetro λmáxima se indica en la curva como el valor
de longitud de onda al que se
se produce la máxima absorbancia.
Tabla 5.3.1. Tabla de pares

pares absorbancia-longitud de onda del oro coloidal preparado
(se marcan en azul los parámetros que caracterizan al oro coloidal)
Long. Onda (nm)1 Abs2 Long. Onda (nm) Abs Long. Onda (nm) Abs
650,0 0,115 583,0 0,526 516,0 1,799
649,0 0,118 582,1 0,542 515,0 1,761
648,0 0,119 581,0 0,559
0,559 514,0 1,754
647,0 0,121 580,0 0,576 512,9 1,730
645,9 0,124 578,9 0,594 512,0 1,716
645,1 0,126 578,1 0,605 511,0 1,705
644,0 0,129 577,0 0,622 510,1 1,679
643,0 0,132 576,0 0,641 509,0 1,659
642,0 0,133 574,9 0,664 507,9 1,641
641,0 0,136 574,0 0,680 507,0 1,611
639,9 0,140 573,0 0,700 506,0 1,600
639,1 0,141 571,9 0,720 505,1 1,581
638,0 0,144 571,0 0,736 504,0 1,553
637,0 0,146 570,0 0,759 502,9 1,531
636,0 0,149 569,0 0,787 502,0 1,512
82
5. RESULTADOS
Tabla 5.3.1. Continuación

Long. Onda (nm)1 Abs2 Long. Onda (nm) Abs Long. Onda (nm) Abs
635,0 0,152 568,1 0,808 501,0 1,480
634,1 0,154 567,0 0,834 500,1 1,465
633,0 0,159 566,0 0,857 499,0 1,439
632,0 0,162 564,9 0,878 497,9 1,412
631,0 0,165 564,0 0,902 497,0 1,392
630,0 0,169 563,0 0,929 496,0 1,369
628,9 0,173 561,9 0,957 495,1 1,351
628,1 0,176 561,0 0,979 494,0 1,329
627,0 0,179 560,0 1,005 492,9 1,309
626,0 0,184 559,0 1,032 492,0 1,292
625,0 0,188 558,1 1,053 491,0 1,272
623,9 0,191 557,0 1,088 490,0 1,261
623,1 0,195 556,0 1,118 489,0 1,240
622,0 0,200 555,1 1,143 488,1 1,227
621,0 0,204 554,0 1,173 487,0 1,211
620,0 0,209 553,0 1,197 485,9 1,194
618,9 0,215 552,1 1,227 485,0 1,179
618,0 0,219 551,0 1,265 484,0 1,169
617,0 0,224 550,0 1,293 483,1 1,160
616,0 0,228 549,1 1,318 482,0 1,145
615,0 0,234 548,0 1,345 480,9 1,134
614,1 0,239 547,0 1,373 480,0 1,123
613,0 0,245 546,1 1,402 478,9 1,112
612,0 0,251 545,0 1,434 478,0 1,105
611,0 0,256 544,0 1,461 477,0 1,096
609,9 0,262 543,1 1,491 476,1 1,088
609,0 0,268 542,0 1,515 475,0 1,082
608,0 0,275 541,0 1,532 474,1 1,073
607,0 0,283 540,1 1,560 473,0 1,066
605,9 0,289 539,0 1,599 471,9 1,060
605,1 0,297 538,0 1,611 471,0 1,056
604,0 0,304 537,1 1,633 470,0 1,049
603,0 0,312 536,0 1,653 469,0 1,042
602,0 0,319 534,9 1,684 468,0 1,038
601,1 0,327 534,0 1,703 467,1 1,035
600,0 0,336 533,0 1,729 466,0 1,028
599,0 0,346 531,9 1,740 465,1 1,024
598,0 0,355 531,0 1,753 464,0 1,020
597,1 0,362 530,0 1,769 462,9 1,018
596,0 0,371 528,9 1,776 462,0 1,014
595,0 0,383 528,0 1,789 460,9 1,012
594,0 0,393 527,0 1,809 460,0 1,010
593,1 0,403 526,1 1,798 459,0 1,004
592,0 0,414 525,0 1,806 458,0 1,001
591,0 0,425 524,0 1,813 457,0 1,000
589,9 0,437 523,0 1,807 456,1 0,999
589,1 0,448 522,0 1,811 455,0 0,998
588,0 0,460 520,9 1,809 454,1 0,993
587,0 0,474 520,0 1,824 453,0 0,994
585,9 0,489 519,0 1,790 451,9 0,990
585,0 0,500 518,1 1,799 451,0 0,992
584,0 0,512 517,0 1,788 449,9 0,991
1
Long. Onda (nm): longitud de onda en nm; 2Abs: absorbancia.
Tabla 5.3.2. Resumen de parámetros del oro coloidal obtenido
A5401 A5752 A5003 A575/5004 Λmáx5 (nm)

Oro Coloidal 1,560 0,664 1,465 0,453 520,0
1
A540: absorbancia a 540 nm; 2A575: absorbancia a 575 nm; 3A500: absorbancia a 500 nm;
4
A575/A500: relación entre A575 y A500; 5λmáx: longitud de onda máxima.
83
5. RESULTADOS
5.4. Determinación de la Mínima Concentración de Proteína que Protege al Oro (MPC)
Para los Mab obtenidos (tabla 5.2.4.1.) se realizó, para cada uno, la determinación de la
mínima concentración de proteína que protege al oro (MPC) (ver 4.2.3.7. de Materiales y
Métodos). Las inmunoglobulinas tienen mayor tendencia a estabilizar el oro coloidal a su punto
isoeléctrico129, 131. Al ser una especie heterogénea (punto isoeléctrico 6-8)129, 147 se realizó a pH
9 y para aquellos Mab que no estabilizaron el oro a este pH, se repitió el ensayo a pH 5 y 7, con
una MPC reducida que incluía algunos de los valores más representativos de la curva. Fue el
caso de los Mab LPS-1 A, LPS-1 E y LPS-1 F. Estos Mab no estabilizaron tampoco a otros pH,
por lo que se conjugaron a pH 9 a la condición estándar de 6 µg/ml para que se encontraran en
las mismas condiciones que el resto. Los valores obtenidos para cada MPC se muestran en la
tabla 5.4.1.
Tabla 5.4.1. MPC obtenidas para los diferentes Mab estudiados (A: MPC realizadas a pH
9; B: MPC repetidas a pH 5 y 7, sólo puntos clave).
A580 nm1 LPPA LPPA LPPA LPPA LPS-1 LPS-1 LPS-1 LPS-1 LPS-1 LPN
[ ] µg/ml2 B C D E A E F H I F2 F2
0 0,1930 0,2135 0,1993 0,1375 0,1375 0,1591 0,1890 0,2325 0,2064 0,1884
1 0,3138 0,3272 0,3541 0,4956 0,1568 0,3549 0,3923 0,3448 0,4357 0,3404
2 0,4094 0,2234 0,2244 0,4256 0,2187 0,4895 0,4955 0,4276 0,0859 0,1056
3 0,1178 0,0793 0,0614 0,3946 0,2601 0,4739 0,4858 0,2179 0,0470 0,0492
4 0,0688 0,0764 0,0591 0,2136 0,3875 0,4756 0,4813 0,1167 0,0608 0,0425
5 0,0762 0,0710 0,0642 0,1569 0,4296 0,4699 0,4799 0,0964 0,0634 0,0491
6 0,0742 0,0729 0,0648 0,1164 0,4760 0,4692 0,4706 0,0928 0,0455 0,0474
8 0,0819 0,0794 0,0711 0,0929 0,4751 0,4654 0,4554 0,0658 0,0718 0,0584
10 0,0884 0,0783 0,0744 0,0925 0,4785 0,4632 0,4412 0,0615 0,0740 0,0660
12 0,0928 0,0852 0,0777 0,0918 0,4771 0,4701 0,4298 0,0568 0,0795 0,0531
14 0,0940 0,0774 0,0804 0,0879 0,4687 0,4234 0,4286 0,0625 0,0745 0,0866
MPC3
5 5 4 8 6 6 6 6 4 4
pH 9
84
5. RESULTADOS
A580 A580
LPS-1 E LPS-1 F LPS-1 A LPS-1 E LPS-1 F LPS-1 A
[ ] (µg/ml) [ ] (µg/ml)
0 0,1458 0,1902 NA4 0 0,1183 0,0395 NA
1 NA NA NA 1 NA NA NA
3 0,4791 0,4855 NA 3 0,5019 0,4062 NA
6 0,4865 0,4905 NA 6 0,5221 0,4469 NA
8 0,4883 0,4909 NA 8 0,4725 0,4416 NA
MPC MPC
- - - - - -
pH 7 pH 5
1
A580: absorbancia a 580 nm; 2[ ] (µg/ml): concentración en microgramos/mililitro; 3MPC: mínima
concentración de proteína que protege al oro; 4NA: no analizado.
La representación gráfica de dichas MPC se muestra en la figura 5.4.1.
MPC a pH 9
0,50
0,45
0,40
0,35 Mab LPPAB
A580 nm
0,30 Mab LPPAC

0,25
Mab LPPAD
0,20
0,15 Mab LPS-1 H
0,10 Mab LPS-1 I
0,05
Mab LPN
0,00
0 5 10 15
Concentración (µg/ml)
85
5. RESULTADOS
MPC a pH 9
0,6000
0,5000
0,4000
A580 nm
Mab LPPA E
0,3000
Mab LPS-1 A
0,2000
Mab LPS-1 E
0,1000 Mab LPS-1 F
0,0000
0 5 10 15
Concentración (µg/ml)
Figura 5.4.1. Representación gráfica de la MPC obtenidas (A: Mab LPPA B, LPPA C,
LPPA D, LPS-1 H, LPS-1 I F2 y LPN F2 y B: LPPA E, LPS-1 A, LPS-1 E Y LPS-1 F).
5.5. Conjugación de Anticuerpos Monoclonales al Oro Coloidal
Los parámetros obtenidos para los conjugados preparados para el estudio según su MPC
(ver apartado 4.2.3.7. y 4.2.3.8. de Materiales y Métodos) fueron los que se registran en la tabla
5.5.1.:
Tabla 5.5.1. Parámetros obtenidos en la conjugación de los diferentes Mab.
A5401 A5752 A5003 A575/5004 λmáx (nm)5

LPPA B 33,5 16,8 26,2 0,641 527,0
LPPA C 30,9 15,6 24,4 0,639 530,0
LPPA D 29,9 14,8 23,5 0,630 530,0
LPPA E 28,0 7,3 10,7 0,682 530,1
6
LPS-1 A NSPC NSPC NSPC NSPC NSPC
LPS-1 E NSPC NSPC NSPC NSPC NSPC
LPS-1 F 7,8 8,2 5,7 1,429 560,0
LPS-1 H 19,7 10,7 15,3 0,699 528,0
LPS-1 I F2 20,4 11,0 15,7 0,701 529,0
LPN F2 18,9 10,2 14,7 0,694 529,9
1 2 3
A540: absorbancia a 540 nm; A575: absorbancia a 575 nm; A500: absorbancia a 500 nm;
4
A575/A500: relación entre A575 y A500; 5λmáx: longitud de onda máxima; 6NSPC: no se pudo
conjugar.
86
5. RESULTADOS
5.6. Determinación del Sistema Óptimo
Se comenzó el estudio con las líneas género Legionella (GÉN) y L. pneumophila sg. 1
(SR1), y se continuó con el Mab comercial para la línea de serogrupos 1 a 15 (ESP). Finalmente
las tres líneas se evaluaron conjuntamente hasta el ajuste del sistema final.
5.6.1. Línea Género
Estudio de la funcionalidad de Mab en línea y conjugado
Se analizaron las líneas y conjugados de Mab de LPPA que se habían seleccionado

realizando cruces entre ellos. Como condiciones iniciales se dosificaron las líneas a 1 mg/ml y
los conjugados a una densidad óptica (OD) de 4. Se usó un protocolo estándar en
inmunocromatografía añadiendo 40 µl de L. pneumophila sg. 1 Philadelphia o E. coli
(suspensión de colonias recogida en PBSc e inactivadas por calor; A600~1) más dos gotas de
una solución desarrolladora o “developer” (DEV). Se usó pad de poliéster (POL) y se dejó fluir
durante 15 minutos.
El resultado obtenido fue el siguiente:
Tabla 5.6.1.1. Resultados de cruce de líneas y conjugados con Mab de LPPA.
E. coli LPPA B LPPA C LPPA D LPPA E

1
LPPA B 1 mg/ml OD0 4 OD4
<0.5 OD4
0 OD4
0
LPPA C 1 mg/ml 0 0 0 <0.5
LPPA D 1 mg/ml <0.5 0 0 0
LPPA E 1 mg/ml 0 0 <0.5 0
Lpn12 LPPA B LPPA C LPPA D LPPA E
Philadelphia
LPPA B 1 mg/ml OD4
<0.5 OD4
0,5 OD4
<0.5 OD4
2-
LPPA C 1 mg/ml <0.5 0 <0.5 1
LPPA D 1 mg/ml 0 <0.5 0,5+/1- 0,5+/1-
LPPA E 1 mg/ml 1+ 1+ 1+ <0.5
1
OD: densidad óptica; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Observando los datos se eligió como línea el Mab LPPA E (denominada GÉN) debido a
que era el que mayor reactividad presentaba con la muestra positiva con los demás Mab. Se
decidió para el conjugado combinar los otros Mab. Se preparó un mezcla OD 4 con BCDE
(OD1+OD1+OD1+OD1), una BCDE’ OD 8 (OD2+OD2+OD2+OD2), una BC OD 4
(OD2+OD2) y otra BD OD 4 (OD2+OD2). Se valoraron con la línea de Mab LPPA E y las
87
5. RESULTADOS
muestras de L. pneumophila sg. 1 Philadelphia (A600~1) 1/100 en agua (40µl+2 gotas DEV,
POL, 15’).
El resultado obtenido fue:
Tabla 5.6.1.2. Resultados de la evaluación de mezclas de conjugados de LPPA.
Lpn11Philadelphia LPPA E 1 mg/ml

BCDE OD24 <0.5
BCDE' OD8 <0.5
BC OD4 0.5+
BD OD4 1/1+
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1,
2
OD: densidad óptica;
Según indicaron estos resultados, la mejor mezcla fue la de BD OD 4. Por otro lado el
conjugado de Mab LPPA E con la línea de LPPA E (GÉN) no parecía ir bien en comparación
con los otros Mab. El siguiente en reactividad fue la mezcla BC. También había que tener en
cuenta que la muestra estaba muy diluida, por lo que se podría elegir una mezcla de BCD y con
las OD a partes iguales en principio.
Estudio de la rotura de la membrana de la bacteria
Dada la localización del LPPA en la membrana de la bacteria (ver apartado 1.1.3.), se

decidió iniciar el estudio de la rotura de la membrana celular para exponer mejor los epítopos
del LPPA a los Mab del conjugado y la membrana.
Métodos de Rotura Física
Se usó la sonicación. Se prepararon muestras de E. coli y L. pneumophila sg. 1

Philadelphia a McF1 en agua (A600:0.25) y se sonicaron a 50 ciclos y 25% de potencia durante
30 segundos. Se evaluaron con mezclas BD OD 4 y BCD OD 6 (OD2+OD2+OD2) (40µl + 2
gotas DEV, POL, 15’).
88
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.1.3. Resultados de la rotura de muestras por sonicación.
BD OD1 4 BCD OD 6
LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli <0.5 <0.5

Lpn12 Philadelphia <0.5 0,5+/1-
1
La sonicación no pareció mejorar el resultado para la mezcla BD y si para la BCD, pero la

señal no aumentaba considerablemente, por lo que se pensó en una rotura química en vez de
física para mejorar la eficiencia y reproducibilidad. Se incluyó ya en la mezcla el Mab LPPA C.
Métodos de Rotura Química
Detergentes
Se realizó un barrido con los detergentes comúnmente usados en tratamientos bioquímicos

con carga tanto negativa como positiva, no cargados o anfóteros. Fueron: no iónicos (Tween-
20® (T20), Brij®-35, Nonidet P-40 (NP40), emulfogen, Tritón® X-100 (TX100), Tritón® X-
114 (TX114)), aniónicos (N-Laurilsarcosina (NL), Ácido Deoxicolato (AD), Dodecilsulfato
sódico (SDS)), catiónicos (Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio (CTAB)) y zwiteriónicos (3-
[(3-Colamidopropil)-dimetilamonio]-propano sulfonato (CHAPS)). También se usó β-
mercaptoetanol (βm) por su capacidad desnaturalizante de proteínas.
Para la valoración de los detergentes se utilizó la mezcla BCD OD 6 (OD2+OD2+OD2)

que obtuvo mejores resultados en la rotura física. Se prepararon 100 µl de L. pneumophila sg. 1
Philadelphia y E. coli a McF1 y se añadió detergente a una concentración del 1 % en dichas
muestras. Se dejó reposar 10 minutos a TA y a continuación se añadieron 40 µl y 2 gotas de
DEV (15’, POL). Se comparó en paralelo con las muestras sin detergente (NADA). El resultado
obtenido fue:
Tabla 5.6.1.4. Resultados del análisis de diferentes detergentes al 1 % (NADA: extracto

sin detergente).
NADA T201 BRIJ

LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0 0
Lpn12 Philadelphia 0 0 <0.5
89
5. RESULTADOS

NP403 EMULFOGEN TX1004
E. coli 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 0 <0.5 <0.5
TX1145 CHAPS6 NL7
E. coli 0 0 0
Lpn1 Philadelphia <0.5 <0.5 0
AD8 SDS9 CTAB10
E. coli 0 0 <0.5
Lpn1 Philadelphia <0.5 color 0 0,5-
βm11
LPPA E 1 mg/ml
E. coli <0.5
Lpn1 Philadelphia 0,5-
1
T20: tween-20®; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3NP40: Nonidet P-40; 4TX100: Tritón®
X-100; 5TX114: Tritón® X-114; 6CHAPS: (3-[(3-Colamidopropil)- dimetilamonio]-propano
sulfonato; 7NL: N-laurilsarcosina; 8AD: ácido deoxicolato; 9SDS: dodecilsulfato sódico;
10
CTAB: Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio; 11βm: β-mercaptoetanol.
En el caso de βm, el oro se agregó por lo que en principio se descartó. Se vio que los
mejores resultados se obtuvieron con CTAB y AD (las líneas ya tenían color). Se decidió
realizar mezclas de ambos, CTAB-AD (1%-1%) y CTAB-AD (2%-2%). Se realizó el mismo
proceso de incubación (10 minutos a TA, 40 µl + 2 gotas DEV, POL, BCD OD 6,15’).
Tabla 5.6.1.5. Resultados del análisis de mezcla de detergentes más favorables.
CTAB-AD 1-12 CTAB-AD 2-23

E. coli 0 <0.5
Lpn11Philadelphia 0,5 0,5-/0,5
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2CTAB-AD 1-1: mezcla del
detergente bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 1% (p/v) con ácido
deoxicolato al 1% (p/v); 3CTAB-AD 2-2: mezcla del detergente bromuro
de hexadeciltrimetilamonio al 2% (p/v) con ácido deoxicolato al 2% (p/v).
La mezcla CTAB-AD 1-1 proporcionó mejor resultado comenzándose a ver una diferencia
más patente entre la muestra positiva y la negativa. Se determinó estudiar diferentes
incubaciones con dicha mezcla y el análisis con los componentes por separado (al 1 %) con la
muestra.
90
5. RESULTADOS
Temperatura
Otro factor importante en la desestabilización de la membrana de la bacteria es la

temperatura, por lo que se incluyó en paralelo a los experimentos con detergentes el efecto del
calor. Se probó a calentar a 50, 70 y 95 ºC, manteniendo el tiempo en 10 minutos. Se añadieron
los detergentes a 100 µl de L. pneumophila sg. 1 Philadelphia y de E. coli a McF1 y se
incubaron a las temperaturas indicadas durante 10 minutos dejando enfriar a continuación otros
10 minutos a TA. Se añadieron 40 µl + 2 gotas DEV y se usó POL y BCD OD 6, 15’. Se
comparó con muestra sin detergente.
El resultado fue:
Tabla 5.6.1.6. Resultados del análisis con detergentes y calor (NADA: muestra sin
detergente).
NADA CTAB2 AD3 CTAB-AD4

50 ºC LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0 0 0
Lpn11 Philadelphia <0.5 0,5-/0,5 <0.5 color <0.5 color
E. coli 0 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 0 <0.5 color <0.5 color 0.5-
E. coli 0 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 0 <0.5 color <0.5 1-/1
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio; 3AD: ácido deoxicolato;
4
CTAB-AD: mezcla del detergente bromuro de hexadeciltrimetilamonio con ácido deoxicolato.
Por tanto, tras este experimento se vio que la señal mejoraba con la mezcla de los
detergentes y calentando a alta temperatura.
pH
Puesto que el aumento de la temperatura y el uso de detergentes mejoraban el sistema, se

consideró modificar también el pH del medio como otro factor importante en la
desestabilización de la membrana. Por otro lado, se incluyó el estudio del aumento de cantidad
de muestra. Se prepararon las muestras en Tris salino (TS) pH 8 y en fosfato salino (PBS) pH
7.2 y se probaron en las mismas condiciones a 95 ºC. En el caso de mayor cantidad de muestra
se añadieron 100 µl y se eliminó el DEV. Se comparó con TA a 5 y 15 minutos de incubación.
91
5. RESULTADOS
El resultado fue:
Tabla 5.6.1.7. Resultados del análisis con mayor cantidad de muestra a TA y 95 º C.
TS con CTAB-AD2 PBS con CTAB-AD3

95 ºC, 40 µl LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli no sale del pad 0

Lpn11 Philadelphia 0,5-/0,5 0,5
PBS con CTAB-AD 5’ PBS con CTAB-AD 15’
95 ºC, 100 µl LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 1 1+
TA4, 100 µl LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia <0.5 <0.5 color
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2TS con CTAB-AD: detergente bromuro
de hexadeciltrimetilamonio con ácido deoxicolato en medio Tris salino pH 8;
3
PBS con CATB-AD: detergente bromuro de hexadeciltrimetilamonio con
ácido deoxicolato en medio fosfato salino pH 7.2; 4TA: temperatura ambiente.
Luego al aumentar la cantidad de muestra y la temperatura de incubación, se consiguió una

mejora en los resultados. El medio tamponado también ayudó. Al llevar dos detergentes en la
mezcla, ésta corrió bien por la membrana, por lo que se valoró la posibilidad de eliminar el
DEV en un siguiente paso.
5.6.2. Línea de Serogrupo 1
Se analizaron las líneas y conjugados de Mab de LPS-1 que se habían seleccionado

realizando cruces entre ellos. Como condiciones iniciales se dosificaron las líneas a 1 mg/ml y
los conjugados a OD 4. Se usó un protocolo estándar en inmunocromatografía añadiendo 40 µl
de L. pneumophila sg. 1 y E. coli (suspensión de colonias recogida en PBSc e inactivadas por
calor; A600~1) a McF1 más 2 gotas de DEV. Se usó pad POL y se dejó desarrollar durante 15
minutos.
92
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.2.1. Resultados del cruce de líneas y conjugados de Mab LPS-1. (A: condición
estándar inicial, B: titulación Mab)
A
E. coli LPS-1 F OD24 LPS-1 H OD4
LPS-1 A 1 mg/ml 0,5/0,5+ 1-
LPS-1 E 1 mg/ml 1/1+ 1-/1
LPS-1 F 1 mg/ml 1/1+ 0
LPS-1 H 1 mg/ml 0 0
Lpn11 Philadelphia LPS-1 F OD4 LPS-1 H OD4
LPS-1 A 1 mg/ml 1+ 2
LPS-1 E 1 mg/ml 2- 3+
LPS-1 F 1 mg/ml 1/1+ 2-
LPS-1 H 1 mg/ml 0 0
E. coli LPS-1 H OD4 Lpn1 Philadelphia LPS-1 H OD4

LPS-1 E 0,75 mg/ml <0.5 LPS-1 E 0,75 mg/ml 3+
LPS-1 E 0,5 mg/ml 0 LPS-1 E 0,5 mg/ml 1/1+
LPS-1 F 0,25 mg/ml 0 LPS-1 F 0,25 mg/ml 0,5
LPS-1 H 0,125 mg/ml 0 LPS-1 H 0,125 0
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2OD: densidad óptica. mg/ml
Al no poder conjugar los Mab de LPS-1 A y E al oro coloidal, se decidió evaluar su

funcionalidad en la membrana por las diferentes características superficiales respecto a las
partículas de oro coloidal. Para LPS-1 F, el conjugado dio lo mismo con la muestra negativa y
positiva, por lo que teniendo en cuenta los demás resultados, se dejó en la línea. En el resto de
Mab se vio diferencia entre negativo y positivo, indicando que podían funcionar, pero que sus
proporciones necesitaban ser ajustadas. Se estudiaron diferentes concentraciones para LPS-1 E,
ya que había dado muy alta señal con el positivo y el negativo, viéndose que a una
concentración menor el sistema funcionaría sin fondos en esa línea. Observando todos estos
datos se eligieron para la línea como mejor opción LPS-1 A, E y F, mientras que LPS-1 H se
reservó para el conjugado.
Se dosificaron entonces mezclas para la línea de Mab de LPS-1 A, E y F y el conjugado de

LPS-1 H se dosificó a OD 1, 2 y 4, seleccionándose finalmente OD 1.
93
5. RESULTADOS
Detergentes y Temperatura
Ya se habían probado en este punto los detergentes y el calor en el caso de la línea género,
por lo que se utilizaron las condiciones determinadas con este sistema. Se evaluaron las líneas
de LPS-1 A, E y F con 40 µl de muestra positiva y negativa tratada con CTAB-AD 1%-1%
incubando 10 minutos a 95 ºC + 10 minutos a TA y sólo 10 minutos a TA, así como sin
detergentes (2 gotas DEV, POL, 15’).
Tabla 5.6.2.2. Resultados del análisis de líneas de LPS-1 con mezclas de detergentes a
TA y 95 ºC (NADA: muestra no tratada).
NADA 95 ºC LPS-1 A 1 mg/ml LPS-1 E 0,5 mg/ml LPS-1 F 1 mg/ml

E. coli 0 0 0
1
Lpn1 Philadelphia 3/3+ 1/1+ 1+/2-
CTAB-AD2 95 ºC LPS-1 A 1 mg/ml LPS-1 E 0,5 mg/ml LPS-1 F 1 mg/ml
E. coli 1 1- 1-/1
Lpn1 Philadelphia 1 1/1+ 1-/1
CTAB-AD TA3 LPS-1 A 1 mg/ml LPS-1 E 0,5 mg/ml LPS-1 F 1 mg/ml
E. coli 0,5 1/1+ 0,5+/1-
Lpn1 Philadelphia 1-/1 1/1+ 1-/1
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2CTAB-AD: detergente bromuro de hexadeciltrimetilamonio con
ácido deoxicolato; 3TA: temperatura ambiente.
Por tanto, el tratamiento con detergentes aplicado a GÉN era bastante inespecífico con el
sistema para SR1 pero la incubación con calor le beneficiaba. Se probaron los detergentes por
separado y se observó que el problema estaba en la mezcla de ellos, no afectando el aumento de
temperatura a la señal específica, como se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 5.6.2.3. Resultados del análisis de líneas de LPS-1 con detergentes separados.
CTAB1 1% AD2 1%
10' TA3 + 10' 95 ºC LPS-1 F 1 mg/ml LPS-1 F 1 mg/ml
E. coli 0 0
4
Lpn1 Philadelphia 0,5-/0,5 0,5-
1
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio; 2AD: ácido deoxicolato; 3TA:
temperatura ambiente; 4Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
94
5. RESULTADOS
Fuerza iónica
Para el estudio de la fuerza iónica, se comenzó añadiendo NaCl al medio para aumentar la
cantidad de iones presentes y ver si tenía el mismo efecto que el detergente aniónico. Se probó
CTAB con NaCl 1.2, 0.6, 0.3, 0.15 y 0.075 M con SR1 (una sola línea compuesta de la mezcla
de LPS-1 A, E y F). Se incubaron las muestras con los medios 10 minutos a TA + 10 minutos a
95 ºC y se añadieron 40 µl + 2 gotas DEV (POL, 15’).
Tabla 5.6.2.4. Resultados del análisis de CTAB con NaCl a diferentes concentraciones
CTAB1-NaCl 1,2 M CTAB-NaCl 0,6 M

LPS-1 AEF LPS-1 AEF
E. coli 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 0 <0.5
CTAB-NaCl 0,3 M CTAB-NaCl 0,15 M CTAB-NaCl 0,075 M
LPS-1 AEF LPS-1 AEF LPS-1 AEF
E. coli NA3 NA NA
Lpn1 Philadelphia <0.5 0.5- <0.5 color
1
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3NA: no analizado.
Se vio que a menor concentración de NaCl mayor señal se producía en SR1, por lo que una
gran cantidad de NaCl en estas condiciones no incrementaba la respuesta, pero si se observó
que con 150 mM (salino) el sistema se quedaba igual y no afectaba demasiado para la señal
positiva, por lo que se tendría en cuenta para experimentos posteriores.
5.6.3. Líneas Género y Serogrupo 1
Se comenzaron a ver los mismos experimentos en paralelo para las dos líneas, porque se
pensó en la posibilidad de llevarlas juntas en un solo casete, pero de momento se iba a ver por
separado cada condición. Las muestras inactivadas por calor de cultivos de L. pneumophila sg.
1 Philadelphia y de E. coli se usaron a McF1 (A600:0.25).
95
5. RESULTADOS
Detergentes
Como la mezcla CTAB-AD produjo resultados muy inespecíficos para SR1, se prepararon
mezclas de detergentes diferentes manteniendo como base el CTAB, porque en GÉN había ido
bien. Para ello se mezcló CTAB (al 1 %) con AD, NL, NP40, Brij, SDS y T20. Se valoró la
línea de LPPA E con BCD OD 6 y las de LPS-1 con H OD 1. Se usó 40 µl (muestras 10
minutos a TA +10 minutos a 95 ºC) + 2 gotas de DEV (POL, 15’).
El resultado fue:
Tabla 5.6.3.1. Resultados del análisis de mezclas de CTAB con otros detergentes (A:
CTAB y CTAB-NP40 con LPPA-E y LPS-1 A y E, B: análisis de CTAB con otros detergentes para LPPA-E
y la línea de LPS-1 A).
A
CTAB1 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 A 1 mg/ml LPS-1 E 0,5 mg/ml
E. coli 0 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 0,5 <0.5 0,5/0,5+
CTAB-NP403 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 A 1 mg/ml LPS-1 E 0,5 mg/ml
E. coli 0 <0.5 <0.5
Lpn1 Philadelphia 1+ 1 0,5+
B
CTAB-T204 CTAB-T20 CTAB-Brij CTAB-SDS5
LPPA E 1 mg/ml LPS-1 A 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0,5+/1- 0 0
Lpn1 Philadelphia 1+ 1+ 0,5- 0,5/0,5+
1
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3NP40: Nonidet NP-40; 4T20: Tween®-20;
5
SDS: dodecilsulfato sódico.
La mezcla CTAB-NP40 funcionó bien para la línea GÉN, pero se obtuvieron fondos para
SR1. En el caso de los otros detergentes, la mayor señal se obtuvo con CTAB-T20 para GÉN,
pero era inespecífico para SR1, indicando estos resultados que los detergentes no iónicos eran
los que mejor respuesta proporcionaban con estas condiciones.
Se dosificaron los Mab A, E y F de LPS-1 conjuntamente en una misma línea (línea SR1)
para trabajar ya con un sistema único en membrana.
96
5. RESULTADOS
Antibiótico
Se comenzó a trabajar con Sulfato de Polimixina-B (PMB), un antibiótico fuertemente

catiónico. Esta sustancia produce la desestabilización de las membranas citoplasmáticas
induciendo la formación de poros en las paredes celulares en bacterias Gram-negativas al unirse
al lípido-A del LPS148-151. Se preparó a 10 mg/ml en agua. Según el fabricante (Sigma-Aldrich)
esto correspondería a unas 65000 IU (unidades internacionales)/ml. Esta solución se evaluó
añadiendo diferentes volúmenes de PMB 10 mg/ml a 100 µl de muestra de cultivo McF1,
incubando 5 minutos a TA, ó 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC (40 µl + 2 gotas DEV, POL,
15’, BCD OD 6, H OD 1):
Tabla 5.6.3.2. Resultados de la valoración de diferentes cantidades de PMB a

diferentes temperaturas.
10 µl PMB1
5' TA2 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli <0.5 3-/3
3
Lpn1 Philadelphia <0.5 color 3/3+
5' TA + 5' 95 ºC LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli <0.5 3/3+
Lpn1 Philadelphia 0,5 3+
1 µl PMB
5' TA LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 0,5- 2
1
PMB: sulfato de polimixina-B; 2TA: temperatura ambiente;
3
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Se pudo ver que con 10 µl para GÉN y SR1 las condiciones producían resultados
inespecíficos en la muestra negativa, pero mucho más para SR1. Al disminuir la cantidad y la
temperatura el sistema mejoró, aunque para GÉN se obtuvo menor señal que con CTAB, por lo
que se decidió ver en conjunto ambas condiciones.
Detergentes, Antibiótico y Fuerza Iónica
Ya se había valorado CTAB+NaCl (ver tabla 5.6.2.4), por lo que se añadió NaCl a la
mezcla CTAB+PMB para darle fuerza iónica al medio con el fin de ver la función de este sobre
los fondos obtenidos. Se incubaron las muestras con CTAB 1%-NaCl 150 mM y 1 y 10 µl de
97
5. RESULTADOS
PMB durante 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC, añadiendo 40 µl + 2 gotas DEV (POL, 15’,
BCD OD 6, H OD 1):
Tabla 5.6.3.3. Resultados de las muestras con medio con NaCl con PMB a diferentes
temperaturas.
5' TA1 + 5' 95 ºC 10' TA

1 µl PMB2 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli sombra 0 0 0
3
Lpn1 Philadelphia 0,5+/1- 0,5-/0,5 <0.5 color <0.5
10 µl PMB LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli sombra 0 sombra 0
Lpn1 Philadelphia 0,5+/1- <0.5 color <0.5 color 0,5-
1
TA: temperatura ambiente; 2PMB: sulfato de polimixina-B; 3Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
De este experimento se dedujo que con 10 µl de PMB la línea SR1 no tenía fondos en la
muestra negativa al llevar el CTAB, y que el calor parecía necesario ya que la señal era mayor
en GÉN.
Siguiendo estas directrices, se decidió ver el detergente no iónico T20 que era el que
llevaba el DEV y no parecía añadir inespecificidad, por lo que tal vez en la mezcla final sería
más efectivo y se podría eliminar dicho DEV. Se probó al 1 % como se había hecho con el resto
de detergentes. Por tanto, el medio ahora era NaCl-T20-PMB (no se puso CTAB para ver el
efecto del T20 sólo) (10 minutos a TA + 10 minutos a 95 ºC, 40 µl + 2 gotas DEV, POL; 15’,
BCD OD 6 y H OD 1):
Tabla 5.6.3.4. Resultados del análisis de medio sin CTAB pero con T20.
10 µl PMB1 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF

E. coli sombra sombra
2
Lpn1 Philadelphia 1+ 1-/1
1
PMB: sulfato de polimixina-B; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Por lo tanto, la mezcla con T20 y sin CTAB mejoraba la señal en SR1. Se decidió entonces
ver el ajuste de la cantidad de PMB a usar, añadiendo 1, 2.5, 5 y 10 µl por cada 100 µl de
muestra, con las condiciones del experimento anterior.
98
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.3.5. Resultados del análisis del medio T20-NaCl con diferentes cantidades
de PMB (A: diferentes cantidades de PMB, B: muestra más concentrada (McF2) con 5 µl de PMB)
A
1 µl PMB1 2,5 µl PMB
LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli 0 sombra 0 0
Lpn12Philadelphia 0,5 0,5 1-/1 0,5+/1-
A (continuación) 5 µl PMB 10 µl PMB
LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli 0 sombra 0 0
Lpn1 Philadelphia 1-/1 1- 1 1-
B
5 µl PMB
3
McF2 LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 1/1+ 1
1
PMB: sulfato de polimixina-B; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3McF2:
McFarland 2.
Se pudo ver que a mayor cantidad de PMB más específico se hacía el sistema, así como
aumentaba la señal positiva, por lo que cantidades de 5 y 10 µl de PMB parecían apropiadas
para la mezcla. Por otro lado, el sistema no se hacía más inespecífico si se probaba con mayor
cantidad de muestra, por lo que a priori se había desarrollado un medio eficiente en la rotura
química de la membrana de la bacteria.
Se decidió ver entonces el sistema con 90 µl (equivalente a 40 µl + 2 gotas DEV) de

muestra para evitar el uso de un DEV, ya que contenía el mismo detergente que se encontraba
en el sistema en este momento. El medio probado fue NaCl-T20-PMB (5 µl de PMB) con 5
minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC.
Tabla 5.6.3.6. Resultados del análisis de 90 µl de muestra sin DEV con NaCl-T20-
PMB.
LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF

E. coli 0 0
1
Lpn1 Philadelphia 1- 1
1
Daba bien por lo que se podría eliminar el DEV.
99
5. RESULTADOS
Se cruzaron las líneas y conjugados con estas condiciones para ver si podían ir juntos los
strips, pero se vio que aparecían fondos, por lo que de momento GÉN y SR1 irían en tiras
separadas. Quedó patente que sin CTAB SR1 mejoraba. Se decidió ver diferentes cantidades de
PMB en este medio NTP con 90 µl de muestra, probando 5, 10 y 20 µl.
Tabla 5.6.3.7. Resultados del análisis de NTP con diferentes cantidades de PMB.
NTP1 PMB2 5
E. coli 0 0
Lpn13Philadelphia 1+ 1+
NTP PMB 10
E. coli sombra 0
Lpn1 Philadelphia 0.5+/1- 1+
NTP PMB 20
E. coli sombra 0
Lpn1 Philadelphia 0.5 1/1+
1
NTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de Polimixina-B; 2PMB:
sulfato de polimixina-B; 3Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
A GÉN no parecía beneficiarle una alta cantidad de PMB y en SR1 no se veía mejoría
tampoco a mayor proporción, por lo que 5 µl se consideró una cantidad apropiada.
Estudio del tiempo de reacción
Se probó a incubar durante más tiempo para ver si manteniendo el medio y las condiciones
se mejoraba la señal. Se usó NTP y se incubó 5 minutos a TA y 5 minutos a 95 ºC, dejando
luego desarrollar el test 15 y 30 minutos (POL, BCD OD 6, H OD 1).
Tabla 5.6.3.8. Resultados de la valoración de diferentes tiempos de reacción.
15 min
1
Lpn1 Philadelphia 1+ 1+
30 min
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 1+/2- 2-
1
100
5. RESULTADOS
Se observó un incremento significativo en la misma, sin aumento de la respuesta de los

negativos, por lo que mayor tiempo de test podía mejorar la señal si era necesario.
Estudio de procedencia de la muestra
Se probaron entonces colonias directamente desde una placa en vez de extractos de cultivos
inactivados por calor para ver si la señal variaba respecto al método de estudio. Se probaron 1,
2 y 3 colonias en 200 µl de NTP a 15 y 30 minutos de test. Las colonias se recogieron de la
placa y se depositaron en el NTP, se vortearon y se incubaron los viales 5 minutos a TA + 5
minutos a 95 ºC (POL, BCD OD 6, H OD 1):
Tabla 5.6.3.9. Resultados del análisis de diferentes cantidades de colonias vivas

directas desde placas de cultivo a diferentes tiempos.
15 min 30 min
1
1 col /200 µl LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli 0 sombra sombra sombra
2
Lpn1 Philadelphia 1+ 1+ 1+ 1+
2 col/200 µl LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli sombra sombra sombra <0.5
Lpn1 Philadelphia 1+/2- 1+/2- 1+/2- 1+/2-
3 col/200 µl LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEF
E. coli sombra Sombra sombra sombra
Lpn1 Philadelphia 1+ 1+/2- 1+ 2-
1
col: colonias; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Por tanto, desde colonias vivas de una placa se obtuvieron los mismos resultados que con
los extractos en PBSc hervidos y almacenados a 4 ºC. Por otro lado, a mayor número de
colonias se obtenía algo más de señal. Esto permitiría conservar las muestras como extractos y
no como placas vivas cuando el número de ellas fuese elevado.
Evaluación inicial de muestras. Bloqueo de pads
Parecía que con el medio determinado en este momento, NTP, y la incubación a TA y 95

ºC, se tendría un sistema inicial apropiado que permitiese evaluar más muestras. Se decidió
probar algunos cultivos de colección del grupo I para ver en qué punto se encontraba el test. Se
testaron muestras de L. pneumophila del sg. 1 al 15 recogidos a razón de 1 col/100 µl. Se usó
NTP con 5 minutos a TA y 5 minutos a 95 ºC de incubación (POL, 15’, BCD OD 6, H OD 1):
101
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.3.10. Resultados del análisis de diferentes cepas de Legionella pneumophila.

1
Lpn 1 1+/2- 1+
Lpn2 1+/2- 0,5+
Lpn3 1+ 0,5-/0,5
Lpn4 1+/2- 0,5-
Lpn5 1+/2- <0.5
Lpn6 1+ <0.5
Lpn7 2-- <0.5
Lpn8 1+/2- <0.5
Lpn9 2- <0.5
Lpn10 2- 0,5+/1-
Lpn11 2- 0,5-
Lpn12 2- <0.5
Lpn13 2- <0.5 color
Lpn14 1+/2- <0.5 color
Lpn15 1+ <0.5
1
Lpn: L. pneumophila.
Aparecieron numerosos fondos en la línea de SR1, por lo que se planteó la posibilidad de

bloquear el pad de muestra. Se probó un pad con un bloqueo estándar en inmunocromatografía:
NaCl para darle fuerza iónica y caseína como proteína bloqueante. Se analizaron las cepas de
nuevo con un pad de POL bloqueado con NaCl 250 mM - Caseína 0.3 % (POLCAS):
Tabla 5.6.3.11. Resultados del análisis de diferentes cepas de Legionella pneumophila

con pad bloqueado.
LPS-1 AEF LPS-1 AEF

1
Lpn 1 1+ Lpn8 0
Lpn2 0 Lpn9 0
Lpn3 0 Lpn10 0
Lpn4 0 Lpn11 0
Lpn5 0 Lpn12 0
Lpn6 0 Lpn13 0
Lpn7 0 Lpn14 0
Lpn15 0
1
Se mantuvo la señal específica y desapareció la inespecífica, por lo que el strip de SR1

debería llevar un pad bloqueado.
102
5. RESULTADOS
Para ver entonces la especificidad con otros cultivos de bacterias no Legionella, se

probaron 13 diferentes que se recogieron en la proporción 1 col/100 µl. Para GÉN se usó POL y
para SR1 POLCAS, 15’:
Tabla 5.6.3.12. Resultados del análisis de diferentes cepas no Legionella.

Pseudomonas aeruginosa sombra 0
Salmonella sombra 0
Proteus mirabilis sombra 0
Xantomonas sombra 0
Aeromonas sombra 0
Enterobacter aerogenes sombra 0
Staphylococcus aureus sombra 0
Escherichia coli sombra 0
Serratia sombra 0
Staphylococcus epidermidis sombra 0
Bacillus cereus sombra 0
Klebsiella sombra 0
Citrobacter sombra 0
Luego en la línea de GÉN también había fondos, aunque menores que para SR1 sin
bloqueo, por lo que se probaron con el pad POLCAS.
Tabla 5.6.3.13. Resultados del análisis de diferentes cepas de no Legionella con pad
bloqueado.
LPPA E 1 mg/ml
1
Lpn1 Philadelphia 1
Pseudomonas aeruginosa 0
Proteus mirabilis 0
Xantomonas 0
Enterobacter aerogenes 0
Staphylococcus aureus 0
Staphylococcus epidermidis 0
Bacillus cereus 0
1
Pareció evidente que la tira de GÉN también necesitaba un pad bloqueado, por lo que se le
añadió a ambos strips.
103
5. RESULTADOS
Se siguieron evaluando cultivos de diferentes legionellas (NTP 5 minutos a TA + 5 minutos

a 95 ºC, 15’, POLCAS):
Tabla 5.6.3.14. Resultados del análisis de diferentes cepas de Legionella.

1
L. longbeachae sg. 1 2- 0
L. longbeachae sg. 2 2- 0
L. bozemanii sg. 1 sombra 0
L. bozemanii sg. 2 <0.5- 0
L. dumoffi 2-/2 0
L. micdadei 1+ 0
L. gormanii 0 0
Lpn12 Benidorm 1+ 1+/2-
Lpn1 Camperdown 1+ 0
Lpn1Heysham 1+ 0
Lpn1 Kingston 1+ 1
Lpn1 Bellingham 1+ 0
Lpn1 Murcia 1+ 1
Lpn1 Knoxville 1+ 2-
Lpn1 Allentown 1+ 1
Lpn1 France 1/1+ 2-
Lpn1 OLDA 1/1+ 0
Lpn1 Oxford 1/1+ 0
Lpn1 Pontiac 1 1+
Lpn1 Cambridge 1+ 1-/1
1
sg.: serogrupo; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Los resultados eran correctos excepto para L. bozemanii sg. 1 y 2 y para L. gormanii, que
daban valores negativos para la línea de GÉN, y para L. pneumophila sg. 1 Camperdown, L.
pneumophila sg. 1 Heysham, L. pneumophila sg. 1 Bellingham, L. pneumophila sg. 1 OLDA y
L. pneumophila sg. 1 Oxford para SR1, ya que daban negativas y eran muestras positivas para
esta línea. Se probó con pad no bloqueado (POL) y el resultado para estas legionellas fue el
mismo, negativo. De nuevo con pad bloqueado (POLCAS), se analizó el doble de colonias, y
mismo número de colonias pero sonicando, ya que aunque este método físico no ayudó mucho
anteriormente, con las nuevas condiciones quizá aportaba algo, pero seguían siendo negativas.
Antes de continuar evaluando más muestras, se intentó ver qué ocurría y cómo se podía
solucionar.
104
5. RESULTADOS
5.6.4. Solución de Problemas de la Línea Género
Estudio de funcionalidad
funcionalidad de los Mab con los cultivos preparados
Se preparó un Western-blot cargando las cepas problemáticas L. bozemanii sg, 1 y sg. 2, L.

gormanii y L. longbeachae sg. 1 como control en la membrana, cuyo resultado se muestra en la
siguiente figura (ver métodos 4.2.3.3.):
1
LBs1: carril con L. bozemanii sg. 1, 2LBs2: carril con L. bozemanii sg. 2, 3LG: carril con L. gormanii, 4LLs1:
carril con L. longbeachae sg. 1, 5Pm*: marcadores de pesos moleculares del Western-blot.
Figura 5.6.4.1. Western-blot realizado con cepas de Legionella problemáticas
(Los Mab de LPPA se pusieron como muestras (LPPA B, LPPA C, LPPA D Y LPPA E), y el revelado se realizó con un conjugado anti-
ratón peroxidado).
Se observó que todos los Mab daban señal con las cepas en mayor o menor grado, luego el
problema parecía ser del sistema en inmunocromatografía,
inmunocromatografía, o sea, no se estaba rompiendo
eficientemente la bacteria porque en estos casos no se detectaba el LPPA.
Con el fin de comprobar si había actividad con los cultivos preparados co

conn los Mab que se
estaban usando, se sensibilizaron placas de ELISA (ver métodos
métodos 4.2.3.2.) con L. bozemanii sg.
1 y 2 y L. gormanii, y como controles positivos se usaron L. longbeachae sg. 1 y L. micdadei y
como control negativo E. coli. Se
Se probaron los Mab como muestras. Se incluyó el Mab de
LPPA F por si se obtenía algún resultado
resultado que indicase si era necesario su uso. Se obtuvo como
resultado el que se muestra en la tabla siguiente:
105
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.4.1. Resultado del ensayo de ELISA realizado con placas sensibilizadas con
cepas de Legionella con Mab de LPPA B, C, D, E y F como muestra.
Mab LPPA B Mab LPPA C Mab LPPA D Mab LPPA E Mab LPPA F
1
L. bozemanii sg. 1 + - + + -
L. bozemanii sg. 2 + + + + -
L. gormanii + + + + -
L. longbeachae sg.1 + + + + -
E. coli - - - - -
1
sg.: serogrupo; -: negativo; +: positivo.
Se prepararon también unos porta-objetos de inmunofluorescencia (ver métodos 4.2.3.4.)

sensibilizados con L. longbeachae sg. 1 como control positivo y E. coli como control negativo,
y L. bozemanii serogrupos 1 y 2 y L. gormanii. El resultado puede verse en la siguiente tabla:
Tabla 5.6.4.2. Resultado del ensayo de inmunofluorescencia realizado con

portaobjetos sensibilizados con cepas de Legionella con Mab de LPPA B, C, D y E como
muestra.
Mab LPPA B Mab LPPA C Mab LPPA D Mab LPPA E

1
L. bozemanii sg. 1 - + - -
L. bozemanii sg. 2 - + - -
L. gormanii - + - -
L. longbeachae sg. 1 + + + +
E. coli - - - -
1
sg.: serogrupo; -: negativo; +: positivo.
En el ensayo de ELISA se obtuvo como resultado que todos los Mab de LPPA (B, C, D y E)
salvo LPPA F, proporcionaban señal positiva con L. longbeachae sg. 1. Los Mab daban
resultado positivo con L. bozemanii sg. 1 y 2 y L. gormanii en general, mientras que en
inmunofluorescencia con L. bozemanii serogrupos 1 y 2 y L. gormanii sólo tenía señal positiva
el Mab LPPA C. El ELISA es una técnica mucho más sensible, lo que justificaría la diferencia
de resultados. Pero aún así la conclusión era la misma, por otras técnicas los Mab sí reconocían
estas muestras.
106
5. RESULTADOS
Métodos de Rotura Física
Se realizó un estudio de rotura con bolas de vidrio. Se evaluaron diferentes volúmenes de

bolas con 200 µl de L. pneumophila sg. 1 a una concentración de McF1. Se agitó un minuto en
vortex, se dejó decantar y el sobrenadante se añadió al test. Se comparó con el método normal
sin y con tratamiento (90 µl, POLCAS, BCD OD6, NTP, 5’ TA + 5’ 95 ºC):
Tabla 5.6.4.3. Resultados del tratamiento con bolas de vidrio y NTP.
Lpn11 McF1 no tratada Lpn1 McF1 tratada

No bolas <0,5 color 1+/2-
10 µl de bolas sombra 1+
25 µl de bolas sombra 1+
50 µl de bolas <0,5 color 1+
100 µl de bolas <0,5 color 1+/2-
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1 Philadelphia.
A mayor número de bolas parecía que sin tratamiento mejoraba algo, pero nada
significativo en comparación con la tratada. Con la mayor cantidad de bolas en 200 µl de
muestra a McF1, combinada con calor y NTP, se probaron las legionellas problemáticas:
Tabla 5.6.4.4. Resultados del tratamiento con mayor cantidad de bolas de vidrio.
LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0
L. bozemanii sg.2 1 <0.5 color
L. bozemanii sg. 2 <0.5 color
L. gormanii sombra
1 2
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1 Philadelphia; sg.:
serogrupo
Pero el resultado no fue bueno, por lo que se pasó entonces a una agitación más agresiva en
el vortex con las bolas con tratamiento con calor y NTP (NTP + 5 minutos de vortex + 5
minutos a TA + 5 minutos a 95ºC + 5 minutos de vortex). El resultado es el que se muestra en
la siguiente tabla:
107
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.4.5. Resultados de la comparación con y sin bolas de vidrio con mayor
agitación.
NO BOLAS BOLAS
E. coli <0,5 color <0,5 color
Lpn11 Philadelphia 2- 2-
1
sg.: serogrupo
El resultado fue el mismo con ambos métodos, por lo que la conclusión era que había roto
el método químico y que el físico no había aportado más señal en principio. Como última
opción se decidió probar diferentes protocolos. Se analizaron las siguientes condiciones
manteniéndo como medio NTP:
1) normal: 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC

2) 1 minuto de vortex + 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC
3) 1 minuto de vortex + 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC + 1 minuto de vortex
4) 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC + 1 minuto de vortex.
Tabla 5.6.4.6. Resultados del tratamiento con bolas de vidrio y NTP con diferentes
protocolos.
1 2 3 4
LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml LPPA E 1 mg/ml
E. coli 0 0 sombra <0,5 color
Lpn11 Philadelphia 2- 2- 1+ 1+
L. bozemanii sg.2 1 sombra NA sombra NA
L. bozemanii sg. 2 <0,5 color NA <0,5 color NA
L. gormanii <0,5 color NA <0,5 color NA
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 2sg.: serogrupo;
1: 5 minutos a TA +5 minutos a 95ºC; 2: 1minuto de vortex + 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC; 3: 1 minuto de vortex + 5 minutos a
TA + 5 minutos a 95ºC + 1 minuto de vortex; 4: 5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC + 1 minuto de vortex.
El resultado no fue satisfactorio y mayor tiempo de agitación en vortex disminuía la señal,

por lo que se desestimó nuevamente los métodos de rotura física como solución.
108
5. RESULTADOS
Detergentes
Para resolverlo, se volvió a ver el detergente CTAB que se eliminó por ofrecer peores
resultados que los no iónicos. Se probó NTP con CTAB al 0.3, 0.6, 2 y 4 % (5’ TA + 5’ 95 ºC,
POLCAS, 15’, BCD OD 6):
Tabla 5.6.4.7. Resultados del análisis con diferentes tanto por ciento de CTAB.
CTAB1 4 CTAB 2
E. coli 0 0
Lpn12 Philadelphia 1- 1-/1
CTAB 1 CTAB 0,6
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 1-/1 2
CTAB 0,3 CTAB 0,1
Lpn1 Philadelphia 2 2-
CTAB 0,05 CTAB 0,025
E. coli sombra 0
Lpn1 Philadelphia 1+/2- 1+/2-
1
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Menor cantidad de CTAB producía mayor señal en la línea GÉN, pero mayor porcentaje de
CTAB perjudicaba a la línea SR1 (ver tabla 5.6.3.1.), por lo que finalmente se desestimó su uso.
Se pasó al estudio de otros factores como el pH.
pH
Se decidió entonces darle un pH al medio NTP, ya que hasta ahora no se había tenido en
cuenta y era el resultante de la mezcla de todos los reactivos (~pH 4-5). Se probó fosfato 50
mM a pH 7.2 y Borax 50 mM a pH 9 (5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC, POLCAS, 15’):
109
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.4.8. Resultados del análisis con NTP tamponado con fosfatos o Borax.
NTP1 BNTP2 FNTP3

E. coli sombra sombra sombra
Lpn14 Philadelphia 2-/2 1 2-
1
NTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de Polimixina-B; 2BNTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de
Polimixina-B tamponada con Borax pH 9; 2FNTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de Polimixina-B
tamponada con fosfato pH 7.2; 4Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Luego a pH 9 L. pneumophila sg. 1 Philadelphia empeoraba pero pH 7.2 daba igual, por lo
que se dejó pH 7.2 para que tamponase el medio y porque se mantenía la señal. Había que
probarlo entonces con las legionellas problema:
Tabla 5.6.4.9. Resultados del análisis de FNTP con las legionellas problemáticas.
FNTP1 LPPA E 1 mg/ml

L. bozemanii sg.2 1 0,5
L. bozemanii sg. 2 0,5-/0,5
L. gormanii 0,5+/1-
1
FNTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de
Polimixina-B tamponada con fosfato pH 7.2; 2sg.:
serogrupo.
Al utilizar un medio tamponado pasaban a ser positivas, por lo que se escogió pH 7.2.
5.6.5. Solución de Problemas de la Línea Serogrupo 1
Estudio de funcionalidad de los Mab con los cultivos preparados
Se sensibilizaron unos porta-objetos de inmunofluorescencia con E. coli y L. pneumophila

sg. 1 Knoxville como controles negativo y positivo respectivamente, y L. pneumophila sg. 1
Camperdown, L. pneumophila sg. 1 Bellingham, L. pneumophila sg. 1 Heysham, L.
pneumophila sg. 1 OLDA y L. pneumophila sg. 1 Oxford.
Tabla 5.6.5.1. Resultado obtenido en el análisis por inmunofluorescencia de porta-

objetos sensibilizados con cepas de Legionella y Mab de LPS-1 como muestra.
LPS-1 A LPS-1 E LPS-1 F LPS-1 H

E. coli - - - -
Lpn11 Knoxville - - + +
Lpn1 Camperdown - + + -
Lpn1 Bellingham - - - -
110
5. RESULTADOS

LPS-1 A LPS-1 E LPS-1 F LPS-1 H
Lpn1 Heysham - - - -
Lpn1 OLDA - - - -
Lpn1 Oxford - - + -
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; -: negativo; +: positivo.
El Mab de LPS-1 H no daba positivo con ninguna de las cepas problema. Por otro lado,
todos los Mab de LPS-1 tampoco reconocían a estas muestras, indicando que se debía añadir
otro Mab al sistema del conjugado y la línea.
Se probó entonces el Mab LPS-1 F en conjugado. Se dosificaron algunos cultivos en la

membrana (puntos 1 µl/strip 4 mm) y se les pasó directamente conjugado de Mab de LPS-1 F y
H a OD 4, con 90 µl DEV (15’, POLCAS).
Tabla 5.6.5.2. Resultados del análisis de cepas en membrana con conjugados de LPS-1.
Lpn11 Knoxville Lpn1 Oxford

LPS-1 H OD 4 2/2+ 0
LPS-1 F OD 4 2 <0.5
1
Estos resultados coincidieron con el ensayo de inmunofluorescencia. Por ello se probó el

Mab LPS-1 F con diferentes muestras para ver si mejoraba (90 µl tratados con NTP, 5 minutos
a TA + 5 minutos a 95 ºC, POLCAS, 15’):
Tabla 5.6.5.3. Resultados del análisis de legionellas problema con Mab LPS-1 H y F.
LPS-1 H OD1 4 LPS-1 F OD 4

LPS-1 AEF LPS-1 AEF
Lpn12 Camperdown 0 0,5-/0,5
Lpn1 OLDA 0 <0.5
Lpn1 Oxford 0 <0.5 color
Lpn9 0 1
Lpn4 0 0,5-
Citrobacter 0 0,5-
1
El Mab LPS-1 F reconocía a las muestras, así como a los cultivos pegados en la membrana
pero era altamente inespecífico (ya se vio en cruces iniciales que F-F era muy inespecífico), por
lo que no era la solución al problema.
111
5. RESULTADOS
Estudio de Mab no usados hasta el momento
Se decidió probar dos sobrenadantes de Mab que no se habían crecido inicialmente, el Mab
LPS-1 I y el LPS-1 G. Estos sobrenadantes se evaluaron directamente por inmunofluorescencia
buscando alguna señal positiva para purificarlos e incluirlos en el estudio. Se prepararon porta-
objetos con L. pneumophila sg. 1 Camperdown, L. pneumophila sg. 1 OLDA, L. pneumophila
sg. 1 Bellingham, L. pneumophila sg. 1 Oxford, L. pneumophila sg. 1 Heysham, L.
pneumophila sg. 1 France, L. pneumophila sg. 1 Cambridge, E. coli y P. mirabilis para
probarlos con estos sobrenadantes de Mab. Como se muestra en la tabla siguiente el
sobrenadante de Mab LPS-1 I reaccionaba con todas las L. pneumophila sg. 1 y no con las dos
muestras negativas, mientras que el sobrenadante de Mab LPS-1 G no reaccionaba con las
legionellas problemáticas.
Tabla 5.6.5.4. Resultados del análisis por inmunofluorescencia de sobrenadantes de

Mab LPS-1 G e I con cepas de Legionella problemáticas.
Mab LPS-1 G Mab LPS-1 I

1
Lpn1 Camperdown - +
Lpn1 OLDA - +
Lpn1 Bellingham - +
Lpn1 Oxford - +
Lpn1 Heysham - +
Lpn1 France + +
Lpn1 Cambridge + +
E. coli - -
P. mirabilis - -
1
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; -: negativo; +: positivo.
Por tanto se decidió crecer y purificar el Mab LPS-1 I y se realizó el mismo proceso que
con todos los demás Mab, en cuanto a purificación, pegado al oro y dosificación en membranas,
cuyos datos se han reflejado en el apartado 5.2., 5.4. y 5.5.
Se probó entonces este Mab en membrana con conjugado de LPS-1 I a OD 2 y OD 4 sin

tratar (el LPS-1 se encuentra en la superficie y se puede detectar sin tratamiento).
112
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.5.5. Resultados del análisis de legionellas problema con Mab LPS-1 I.
LPS-1 I OD1 2
LPS-1 I 1 mg/ml LPS-1 AEF
Lpn12 Philadelphia 3 2/2+
E. coli 0 sombra
Lpn1 Oxford 3 0,5
Lpn1 OLDA 1+/2- NA3
Lpn1 Camperdown 3 NA
Lpn1Bellingham 3-/3 NA
LPS-1 I OD 4
LPS-1 I 1 mg/ml LPS-1 AEF
Lpn1 Philadelphia 3/3+ 2+/3-
E. coli <0.5 <0.5
Lpn1 Oxford 3+ 1-/1
1
OD: densidad óptica; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3NA: no analizado.
Se observó que el Mab LPS-1 I reconocía también en inmunocromatografía a las cepas

como en el ensayo de inmunofluorescencia y que si no se encontraba en la membrana, la señal
era mucho menor, ya que I-AEF no daba como I-I, por lo que se tituló e incluyó en la mezcla de
LPS-1 en membrana a 0.25 mg/ml. Esta mezcla se denominó LPS-1 AEFI. En el conjugado se
incluyó también por tanto, siendo entonces la OD 3 (H OD 1 + I OD 2).
5.6.6. Línea de Especie
El Mab para la línea de especie se adquirió a la ATCC (HB8472TM, LP3IIG2). Se creció en

Vircell, S.L. y se trató y purificó como el resto de Mab analizados. Una vez conjugado al oro y
dosificado en la membrana, se valoró en las condiciones en las que se encontraba la
investigación en ese momento. La primera idea fue incluirlo en el strip de SR1. Se le denominó
Mab LPN por ser para la detección de L. pneumophila serogrupos 1 a 15.
Se probó el conjugado de Mab LPN a OD 4 con la línea de Mab LPN a 1 mg/ml con FNTP
5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC y sin tratar (90 µl, POL, 15’):
113
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.6.1. Resultados del análisis de Mab LPN con muestra tratada y no tratada.
NO TRATADA TRATADA
LPN 1 mg/ml LPN 1 mg/ml
E. coli sombra 0
1
Lpn1 Philadelphia <0.5 0,5+/1-
1
Si la muestra no se trataba no daba prácticamente nada, por lo que necesitaba tratamiento.
Se probaron algunas legionellas para ver cuál era el resultado tratando la muestra como en
el caso desarrollado para GÉN y SR1:
Tabla 5.6.6.2. Resultados del análisis de muestras tratadas con FNTP con Mab LPN.
LPN 1 mg/ml
1
Lpn 6 sombra
Lpn11 0,5/0,5+
Lpn13 <0.5
Lpn14 1+/2-
1
No todas las cepas de L. pneumophila probadas se veían aun habiendo tratado la muestra.
EDTA
Se decidió estudiar el medio NTP comparado con FNTP con el aditivo EDTA, que
recomienda la bibliografía33, 52, 64, 67, 151, ya que éste puede mejorar la completa exposición del
antígeno a los Mab. Se probó una condición con EDTA 10 mM para ver si había algún efecto
añadido al FNTP con 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC (90 µl, POL, 15’, LPN OD 2):
Tabla 5.6.6.3. Resultados del análisis de muestras tratadas con NTP y FNTPE.
FNTPE LPN 1 mg/ml

E. coli 0
1
Lpn1 Philadelphia <0.5
NTP LPN 1 mg/ml
E. coli 2-
Lpn1 Philadelphia 2
1
114
5. RESULTADOS
Luego el EDTA eliminaba fondos, pero también la señal positiva en esta condición y el
medio NTP era inespecífico con la muestra negativa.
Detergentes y EDTA
Se probó entonces otro tipo de detergente, el aniónico AD67. Éste se testó al 1% con EDTA
10 mM en paralelo a sólo EDTA 10 mM, con 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC (90 µl, POL,
15’, LPN OD 2).
Tabla 5.6.6.4. Resultados del análisis de detergente aniónico con EDTA 10 mM.
EDTA EDTA-AD1 AD
LPN 1 mg/ml LPN 1 mg/ml LPN 1 mg/ml
E. coli 3+ <0.5 0
2
Lpn1 Philadelphia 3+ 2/2+ 0,5+
1
AD: ácido deoxicolato; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Por tanto, parecía que al añadir un detergente aniónico se mejoraba el sistema y aumentaba
la señal y más si llevaba la combinación de EDTA. Ambos componentes por separado no iban
igual que juntos. Se probó entonces menor cantidad de EDTA (1 mM) con AD 1% y la
combinación de FNTP para ver si se podía añadir al medio ya desarrollado (5 minutos a TA + 5
minutos a 95 ºC, POL, 15’, 90 µl):
Tabla 5.6.6.5. Resultados del análisis del medio FNTP con la adición de EDTA y AD.
EDTA-AD1 FNTP2 FNTP-EDTA-AD

E. coli 0 0 0
3
Lpn1 Philadelphia 1+/2- 0,5/0,5+ 1+/2-
1
AD: ácido deoxicolato; 2FNTP: mezcla de NaCl, Tween®-20 y sulfato de Polimixina-B tamponada con
fosfato pH 7.2; 3Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Luego se podían mezclar porque rompía y no se había hecho más inespecífico. Se vio
entonces diferentes cantidades de AD del 1 al 4 %, manteniendo EDTA 1 mM.
Tabla 5.6.6.6. Resultados del análisis de FNTP con EDTA y diferentes cantidades de AD.
EDTA-AD1 1 EDTA-AD 2 EDTA-AD 4

E. coli 0 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 2- 2/2+ 2/2+
1
AD: ácido deoxicolato; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
115
5. RESULTADOS
Luego mayor cantidad de AD no mejoraba más que 1 %.
Por otro lado, siguiendo nuevamente las recomendaciones en la bibliografía60, 67 se probó el

detergente NL, también aniónico, porque el AD agregaba parcialmente el medio. Se probó al 1 %
para empezar con EDTA 1 mM y solo (90 µl, 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC, POL, 15’):
Tabla 5.6.6.7. Resultados del análisis con detergente aniónico NL y NL-EDTA.
NL1 NL-EDTA
E. coli 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 0 0,5+/0,5
1
NL: N-laurilsarcosina; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Se vio entonces que debía combinarse con EDTA para obtenerse señal. Se probaron
distintos tantos por ciento con EDTA 1mM:
Tabla 5.6.6.8. Resultados del análisis de EDTA con diferentes cantidades de NL.
EDTA-NL1 1 EDTA-NL 2 EDTA-NL 4

E. coli 0 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 0,5+ 1/1+ 2+/3-
EDTA-NL 8 EDTA-NL 10
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 2+/3- 3-
1
Al aumentar el tanto por ciento de NL aumentaba la señal y no se hacía inespecífico, por lo

que con NL 2 ó 4 % con EDTA 1mM se mejoraba a los resultados obtenidos con AD.
Se dosificaron entonces NL y EDTA en el pad de muestra para que las concentraciones

finales de reacción equivaliesen a las del medio (EDTA 2.82 mM para 1 mM final y NL 11.28 %
para 2 % final) y otros tantos por ciento para probarlos, porque se tenía la experiencia de que el
efecto es más acentuado en el pad que en formato líquido. Se prepararon también 3, 2, 1, 0.5,
0.25, 0.125 y 0.0625 % finales. A éstos se añadieron tres condiciones más: 0.085, 0.099 y
0.113 %). Se probaron con medio FNTP, 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC (90 µl, 15’):
116
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.6.9. Resultados del análisis de diferentes cantidades de NL en el pad de

muestra.
EDTA-NL1 4 EDTA-NL 3 EDTA-NL 2
E. coli 0 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 3+ 3 3/3+
EDTA-NL 1 EDTA-NL 0,5 EDTA-NL 0,25
E. coli 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 3 3 3
EDTA-NL 0,125 EDTA-NL 0,0625
E. coli 0 0
Lpn1 Philadelphia 3 1
EDTA-NL 0,085 EDTA-NL 0,099 EDTA-NL 0,113
E. coli sombra 0 <0.5
Lpn1 Philadelphia 2 3+ 2+
1
Entonces con EDTA 1mM y NL 0.25 % (POLENL) (final, 0.71 % para dosificar) se
obtenía una señal apropiada.
Evaluación inicial de muestras
Se probaron diferentes muestras.
Tabla 5.6.6.10. Resultados del análisis de diferentes cepas con pad de muestra tratado
con EDTA y NL con medio FNTP.
LPN 1 mg/ml
E. coli 0
1
Lpn1 Philadelphia 2-
Salmonella 0
Lpn25 1
Lpn1 Oxford 1+
1 2
Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; Lpn: L.
pneumophila.
En principio no parecía inespecífico y sí se detectaban L. pneumophila sg. 5 y L.

pneumophila sg. 1 Oxford.
Se pasó a estudiar las tres líneas entonces con estos medios y pads.
117
5. RESULTADOS
5.6.7. Líneas Género, Serogrupo 1 y Especie
Evaluación inicial de muestras
En este punto de la investigación ya se tenían las tres líneas bastante desarrolladas y de

momento todas ellas usarían FNTP como medio y diferentes pads de muestra. Con este sistema
se valoraron nuevas legionellas del grupo I que se habían crecido en el laboratorio. Se siguió
con 5 minutos a TA + 5 minutos a 95 ºC y 15 minutos de test (POLCAS para GÉN y SR1 y
POLENL para ESP, BCD OD 6, HI OD 3, LPN OD 2).
Tabla 5.6.7.1. Resultados de la valoración inicial de muestras con las tres líneas.
LPPA E 1 mg/ml LPS-1 AEFI LPN 1 mg/ml

E. coli 0 0 0
1
Lpn1 Philadelphia 2 1 2
L. oakridgensis 2 0 0
L. taurinensis 1+ 0 0
L. sainthelensi 1+ 0 0
L. rubrilucens 1 0 0
L. cincinnatensis 2 0 0
L: quinlivanii 1+ 0 0
L. spirithensis 0,5+/1- 0 0
L. anisa 0,5 0 0
1
Luego el sistema había funcionado de forma correcta y las nuevas legionellas eran
clasificadas apropiadamente.
Estudio del tiempo de reacción
El protocolo hasta ahora había sido la incubación 5 minutos a TA+ 5 minutos a 95 ºC, pero
se estudiaron diferentes tiempos. Se probaron 5, 10 y 15 minutos a 95 ºC sin incubación a TA
(mismas condiciones anteriores de pads y volúmenes):
118
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.7.2. Resultados de la comparación de diferentes tiempos y temperaturas de

incubación de las muestras.
5' TA1 + 5' 95 ºC

E. coli 0 0 0
2
Lpn1 Philadelphia 1+/2- 1+ 2
Lpn35 1+ 0 1+
Xantomonas 0 0 0
5' 95 ºC
E. coli 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 2 1+ 2-/2
Lpn5 2- sombra 1
Xantomonas 0 sombra 0
10' 95 ºC
E. coli 0 0 0
Lpn1 Philadelphia 2/2+ 1+/2- 2
Lpn5 2/2+ 0 1
Xantomonas sombra sombra 0
15' 95 ºC
E. coli 0 sombra 0
Lpn1 Philadelphia 2+ 1+/2- 2-
Lpn5 2+ 0 1
Xantomonas 0 sombra 0
1
TA: temperatura ambiente; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1: 3Lpn: L. pneumophila.
Se vio que podría sólo incubarse con calor sin tener que hacer el paso de TA, sobre 5-10
minutos. Se probaron las legionellas problema de GÉN a estos tiempos y se eligió 10 minutos
porque la señal era mayor, como se ve en la siguiente tabla.
Tabla 5.6.7.3. Resultados de la incubación a mayor tiempo sin paso de incubación a

TA con legionellas problema en la línea de género.
5' 95 ºC 10' 95 ºC
L. bozemanii sg.1 1 0,5/0,5+ 1-
L. bozemanii sg. 2 1 1+
L. gormanii 0,5 0,5
1
sg.: serogrupo.
119
5. RESULTADOS
Estudio de la combinación de líneas y conjugados
Se probó a cruzar los pads entre sí y se vio que con GÉN y ESP había reacción cruzada, por
lo que estas líneas no podrían ir juntas, mientras que SR1 y ESP sí (resultados no mostrados).
Por ello se dosificó el conjugado SR1 con el de ESP, es decir HI+LPN, con una OD final de 5
(OD1+OD2+OD2) y un pad con todos los componentes de SR1 y ESP: POLCASENL. Estas
mezclas se probaron con las líneas de SR1 y ESP (90 µl, FNTP, 10 minutos a 95 ºC):
Tabla 5.6.7.4. Resultados de la comparación de diferentes pads de muestra para las

líneas de serogrupo 1 y especie.
POLCAS1 POLCASENL2 POLCAS POLCASENL

LPS-1 AEFI LPS-1 AEFI LPN 1 mg/ml LPN 1 mg/ml
E. coli 0 0 <0.5 sombra
Lpn13 1+/2- 1+ 1+ 2/2+
Lpn45 0 0 1- 1/1+
1
POLCAS: poliéster bloqueado con caseína; 2POLCASENL: poliéster bloqueado con caseína, EDTA y N-laurilsarcosina; 3Lpn1:
L. pneumophila serogrupo 1; 4Lpn1: L. pneumophila.
Luego el sistema parecía que podría funcionar con un pad con combinación de los
detergentes, sales y bloqueantes que ambas líneas necesitan por separado.
Estudio de procedencia de la muestra
Con el sistema que se había optimizado hasta el momento, se evaluaron las muestras del
grupo I que habían dado problemas en el desarrollo del test directamente crecidas desde placas,
y algunas de origen ambiental del grupo II para comprobar su funcionamiento.
Las muestras preparadas a McF1 poseían distinta turbidez que recogidas desde placa, que
era mayor, y el procedimiento real del test sería desde placa, por lo que se realizó el
experimento recogiendo las colonias vivas con la intención de comprobar cómo afectaba
también mayor cantidad de muestra de la estudiada para el desarrollo (McF1).
120
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.7.5. Resultados del análisis de diferentes cantidades de colonias vivas

directas desde placas de cultivo a diferentes tiempos con el sistema final con cepas
problemáticas del grupo I y ambientales del grupo II.
15 minutos 30 minutos
LPPA E 1 LPN 1 LPPA E 1 LPN 1
2 col1/200 µl LPS-1 AEF LPS-1 AEF
mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml
l. bozemanii sg.21 1+ 0 0 1+/2- 0 0
L. bozemanii sg.2 2/2+ 0 0 2+ 0 sombra
L. gormanii 2 sombra 0 2 0 0
Lpn13Philadelphia 3+ 2+/3- 3 3+ 2+/3 3
Lpn1 Oxford 3 2 3 3+ 2 3
Lpn1 OLDA 3 1+ 3-/3 3 1+ 3
Lpn1 Bellingham 1-/1 0.5+/1- 2 1/1+ 1- 2
Lpn1 Camperdown 3+ 3- 3 3+ 3- 3/3+
1643.1 B 0 0 0 sombra sombra 0
15 minutos 30 minutos
LPPA E 1 LPN 1 LPPA E 1 LPN 1
2 col1/200 µl LPS-1 AEF LPS-1 AEF
mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml
1727.4 0 0 0 0 0 0
1788.2 A 0 0 0 0 0 sombra
1865.1 A 0 0 0 0 0 0
2069.1 S1 3 1 2+/3- 3 1 2+/3-
1420.3 S2_14 3 0 3- 3+ 0 2+
2069.2 S1 3 2-/2 2+/3- 3+ 2-/2 2+/3-
1419.3 S2_14 3 0 3- 3/3+ 0 3-
1
col: colonias; 2sg.: serogrupo; 3Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1.
Lo que se pudo comprobar es que el sistema funcionaba correctamente y que los negativos
seguían siéndolo, incluso a más cantidad de bacterias que McF1. Por otro lado se comprobó que
15 minutos era un tiempo adecuado, ya que el doble no mejoraba el resultado y aparecían
mayor número de sombras.
Por este motivo, se evaluaron una serie de cepas negativas a McF4 (A60: 0.6-0.7). El
resultado se muestra en la siguiente tabla:
121
5. RESULTADOS
Tabla 5.6.7.6. Resultados del análisis de muestras negativas a McFarland 4.
LPPA E 1
LPS-1 AEF LPN 1 mg/ml
mg/ml
E. coli sombra 0 0
Xantomonas 0 0 0
P. mirabilis 0 0 0
Ps. aeruginosa 0 sombra 0
Aeromonas 0 0 0
Citrobacter 0 0 0
B. cereus sombra 0 0
Serratia 0 0 0
S. aureus 0 0 sombra
S. epidermidis 0 0 0
Salmonella 0 0 0
E. aerogenes 0 0 0
Klebsiella 0 0 0
El resultado fue negativo para todos los cultivos, aunque algunos daban sombras, lo que
unido al resultado de la tabla anterior, demostraba que el sistema era muy específico incluso
con alta cantidad de muestra.
El sistema quedó por tanto como sigue:
Tabla 5.6.7.7. Composición del sistema final determinada para el test desarrollado.
(LPPA E: monoclonal de LPPA E; LPS-1 AEFI: mezcla de monoclonales de LPS-1 A, E, F e I; LPN:
monoclonal LPN de especie; LPPA BCD: mezcla de monoclonales de LPPA B, C y D; LPS-1 HI-LPN:
mezcla de monoclonales de monoclonales H e I y monoclonal LPN de especie; POLCAS: poliéster bloqueado
con caseína; POLCASENL: poliéster bloqueado con caseína, EDTA y N-laurilsarcosina; FNTP: mezcla de
NaCl, Tween®-20 y sulfato de Polimixina-B tamponado con fosfato pH 7.2).
LÍNEA CONJUGADO PAD MEDIO INCUBACIÓN

GÉNERO LPPA E LPPA BCD POLCAS
10 minutos a
SEROGRUPO1 LPS-1 AEFI FNTP
LPS-1 HI-LPN POLCASENL 95 ºC
ESPECIE LPN
Con este sistema se evaluarían todas las muestras de las que se disponía: grupos I, II y III.
122
5. RESULTADOS
5.7. Resultados Obtenidos por Inmunocromatografía
Las muestras se analizaron a partir de las suspensiones preparadas a McF1 (A600:0.25).

Esta condición fue considerada como la límite a la que todas las cepas debían de dar positivo.
El método real, la recogida de dos colonias típicas de 1-3 mm, conllevaba suspensiones con
A600 mayor que a McF1, por lo que se aseguró la respuesta del test para las colonias que se
testen por el mismo. Dado el gran número de muestras y trabajo a realizar fue el método más
sencillo, fiable y práctico de conservarlas.
Los resultados del test, así como las lecturas visuales se muestran en las tablas 5.7.2. y
5.7.3. La interpretación de los posibles resultados se muestra en la tabla 5.7.1.
Como ejemplo se puede consultar la figura 5.7.1., donde se observan los posibles
resultados que se pueden obtener para el test y su interpretación.
Figura 5.7.1. Resultados posibles que pueden obtenerse para el test

inmunocromatográfico diseñado.
A: Legionella género; B: Legionella pneumophila serogrupo 1; C: Legionella pneumophila serogrupos
2-15; D: negativo para Legionella.
(strip azul: dos líneas (T1 = línea de género Legionella, C = línea control); strip naranja: tres líneas (T1 =
línea L. pneumophila sg. 1, T2 = línea L. pneumophila serogrupos 1 a 15, C = línea control).
123
5. RESULTADOS
Tabla 5.7.1. Interpretación de resultados del test inmunocromatográfico diseñado.
Línea GÉN1 Línea SR12 Línea ESP3 LÍNEA CONTROL INTERPRETACIÓN

- - - + Negativo a Legionella
+ + + + L. pneumophila sg4. 1
+ - + + L. pneumophila sg. 2 a 15
+ - - + Género Legionella
- + + + Inválido
- + - + Inválido
- - + + Inválido
+ + - + Inválido
- ó+ - ó+ - ó+ - Inválido
1
GÉN: línea de género Legionella, 2SR1: línea de L. pneumophila sg. 1, 3ESP: línea de L. pneumophila
serogrupos 1 a 15, 4sg.: serogrupo.
124
5. RESULTADOS
Tabla 5.7.2. Resultados obtenidos por el test inmunocromatográfico diseñado de las muestras de Grupos I, II y III
(se muestran los resultados de cepas del grupo I y las positivas del grupo II y grupo III. Los resultados del grupo II y grupo III negativos se han omitido por ser
todos iguales. Puede verse como muestra el ejemplo D de la Figura 5.7.1.). Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; Lpn: L. pneumophila. Consultar la tabla 5.7.3.
Lpn1 Camperdown
Lpn1 Benidorm
Lpn1 Heysham
Lpn1 Kingston
Lpn1 Bellingham
Lpn1 Allentown
Lpn1 Knoxville
Lpn1 France
125
Lpn 9 Lpn 5 Lpn1 Cambridge Lpn1 OLDA
5. RESULTADOS
Lpn 10 Lpn 6 Lpn 2 Lpn1 Pontiac
126
Lpn 11 Lpn 7 Lpn 3 Lpn1 Oxford
Lpn 12 Lpn 8 Lpn 4 Lpn1 Philadelphia

L. micdadei L. longbeachae 2 Lpn 13
L. gormanii L. bozemanii 1 Lpn 14
127
L. oakridgensis L. bozemanii 2 Lpn 15
L. taurinensis L. dumoffi L. longbeachae 1

5. RESULTADOS
1864.1 A(izquierda) y L. spirithensis L. sainthelensi
B(derecha)
5. RESULTADOS
1920.2 B L. anisa L. rubrilucens
128
1419.1 S2_14 1727.1 S1 aislamiento L. cincinnatiensis
1420.3 S2_14 1808.8 B L. quinlivanii

2871.3 2871.3 AISLAMIENTO 2069.1 S1
3187.1 2161.3 0.1 2069.2 S1 A
129
1419.3 S2_14+otras
3469.3 2739.1
A(izquierda) y B(derecha)
1849.1 B (izq.), C (centro) y

2739.2 2766.1
D (der.)
5. RESULTADOS
2825.1 B 2337.1 2870.2 AISLAMIENTO
5. RESULTADOS
3469.1
3129.1 C 2925.2
A(izquierda) y B(derecha)
130
2768.2
3156.2 A 2739.4
A(izquierda) y C(derecha)
Lpn1 Murcia 2738.1 D 3468.2

5. RESULTADOS
Tabla 5.7.3. Lectura visual de los test inmunocromatográficos realizados e interpretación.
SR 1: L. pneumophila serogrupo 1, SR 2-15: L. pneumophila serogrupos 2 a 15, GÉN: género Legionella, NOL: no Legionella.
GRUPO I, GRUPO II y GRUPO III.
LECTURA
LECTURA LECTURA REFERENCIA
INTERPRETACIÓN de VISUAL de la INTERPRRETACIÓN de INTERPRETACIÓN de la
COLONIA VISUAL de la
línea la línea SEROGRUPO 1
VISUAL de la
línea ESPECIE
línea GÉNERO la línea GÉNERO línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
L. pneumophila 1
1 Heysham
1+/2- POSITIVO 1+ POSITIVO 1+ POSITIVO SR 1 1
L. pneumophila 1
2 Benidorm
1+/2- POSITIVO 2 POSITIVO 2- POSITIVO SR 1 2
L. pneumophila 1
3 Camperdown
2- POSITIVO 1+/2- POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 3
L. pneumophila 1
4 Kingston
1+/2- POSITIVO 2+ POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 4
L. pneumophila 1
5 Bellingham
2- POSITIVO 1+ POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 5
L. pneumophila 1
6 Knoxville
2 POSITIVO 2+ POSITIVO 1+ POSITIVO SR 1 6
L. pneumophila 1
7 Allentown
2- POSITIVO 2+ POSITIVO 2- POSITIVO SR 1 7
L. pneumophila 1
8 France
2-/2 POSITIVO 2-/2 POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 8
L. pneumophila 1
9 OLDA
2 POSITIVO 1+/2- POSITIVO 3- POSITIVO SR 1 9
L. pneumophila 1
10 Pontiac
1+/2- POSITIVO 2+ POSITIVO 2- POSITIVO SR 1 10
L. pneumophila 1
11 Oxford
1+/2- POSITIVO 1-/1 POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 11
L. pneumophila 1
12 Cambridge
2- POSITIVO 2/2+ POSITIVO 2+/3- POSITIVO SR 1 12
L. pneumophila 1
13 Philadelphia
1+/2- POSITIVO 2-/2 POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 13
14 L. pneumophila 2 2/2+ POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 1
15 L. pneumophila 3 2 POSITIVO 0 NEGATIVO 1- POSITIVO SR 2-15 2
16 L. pneumophila 4 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2- POSITIVO SR 2-15 3
17 L. pneumophila 5 2-/2 POSITIVO 0 NEGATIVO 2- POSITIVO SR 2-15 4
18 L. pneumophila 6 1+/2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2- POSITIVO SR 2-15 5
131
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
19 L. pneumophila 7 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 6
20 L. pneumophila 8 1+/2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 7
21 L. pneumophila 9 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 8
23 L. pneumophila 11 2-/2 POSITIVO 0 NEGATIVO 1+/2- POSITIVO SR 2-15 10
24 L. pneumophila 12 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 11
28 L. longbeachae 1 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 1
29 L. longbeachae 2 2- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 2
30 L. bozemanii 1 1+/2- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 3
31 L. bozemanii 2 2+/3- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 4
32 L. dumoffi 2-/2 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 5
33 L. micdadei 1+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 6
34 L. gormanii 2+/3- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 7
35 L. oakridgensis 2 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 8
36 L. taurinensis 1+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 9
37 L. sainthelensi 1+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 10
38 L. rubrilucens 1 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 11
39 L. cincinnatiensis 2 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 12
40 L. quinlivanii 1+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 13
41 L. spirithensis 1- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 14
42 L. anisa 1 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 15
43 1605.3 A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 1
44 1605.3 B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 2
45 1605.3 C 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 3
46 1605.3 D 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 44
1727,1 S1
47 aislamiento
2 POSITIVO 1- POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 14
48 1728,1 spp A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 5
1728,1 spp B
49 GRANDE
0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 6
132
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
1728,1 SPP B
50 PEQUEÑA
51 1800,8 A 0,25+ NEGATIVO sombra NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 8
52 1800,8 B 0,5+/1- POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 16
53 1864,1 A 2 POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 15
54 1864,1 B 2 POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 16
55 1920,2 A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 9
56 1920,2 B 3+ POSITIVO 2+ POSITIVO 2+/3- POSITIVO SR 1 15
58 1643,1 B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 11
59 1643,1 C 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 12
60 1643,1 D 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 13
74 1419,1 S2_14 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 17
78 1878,9 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 30
133
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
91 172? A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 43
92 172? B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 44
93 172? C 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 45
94 172? D 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 46
95 172? E 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 47
101 1420,3 S2_14 3+ POSITIVO 0 NEGATIVO 2+/3- POSITIVO SR 2-15 18
104 1455,3A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 55
106 2070,3 spp A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 57
107 2070,3 spp B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 58
108 2070,3 spp C 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 59
109 2069,1 S1 2+/3- POSITIVO 1+/2- POSITIVO 3+ POSITIVO SR 1 16
134
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
121 2069,2 S1 A 3 POSITIVO 1+/2- POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 17
122 2069,2 S1 B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 71
132 1757,1 TT A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 81
133 1757,1 TT B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 82
134 1757,1 TT C 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 83
135 1907,3 6 u/c A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 84
136 1907,3 6 u/c B 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 85
137 1455,1 pH 8 A 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 86
142 1727,3 E 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 91
1419,3 S2_14 +
143 OTRAS A
2+ POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 19
1419,3 S2_14 +
144 OTRAS B
3 POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 20
135
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
49 1849,1 B 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 2+/3- POSITIVO SR 2-15 21
150 1849,1 C 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 3 POSITIVO SR 2-15 22
151 1849,1 D 1 POSITIVO 0 NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 23
2871,3
152 AISLAMIENTO
2+ POSITIVO 0,5+/1- POSITIVO 2+/3- POSITIVO SR 1 18
153 2161,3 0.1 3 POSITIVO sombra NEGATIVO 2 POSITIVO SR 2-15 24
154 2739,1 2+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 17
155 2766,1 3+ POSITIVO 0 NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 2-15 25
156 2871,3 3 POSITIVO 2-/2 POSITIVO 2+/3- POSITIVO SR 1 19
157 3187,1 3 POSITIVO 0,25+ NEGATIVO 2+ POSITIVO SR 1 20
158 3469,3 3 POSITIVO 1+ POSITIVO 2-/2 POSITIVO SR 1 21
159 2739,2 2+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 18
2870,2
160 AISLAMIENTO
3+ POSITIVO 2 POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 22
161 2925,2 3 POSITIVO 1+/2- POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 23
162 2739,4 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO GÉN 19
163 3468,2 3 POSITIVO 0,5/0,5+ POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 24
164 2337,1 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 2+/3- POSITIVO SR 2-15 26
165 3469,1 A 0,5+ POSITIVO 0 NEGATIVO 0,25- NEGATIVO GÉN 20
166 3469,1 B 3+ POSITIVO 1+/2- POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 25
167 3156,2 A 3 POSITIVO 0,5+/1- POSITIVO 2+/3- POSITIVO SR 1 26
172 2738,1 D 3 POSITIVO 2- POSITIVO 2/2+ POSITIVO SR 1 27
174 2925,1 B 3 POSITIVO 1- POSITIVO 3 POSITIVO SR 1 28
179 3129,1 C 3 POSITIVO 0 NEGATIVO 3 POSITIVO SR 2-15 27
180 2768,2 A 3 POSITIVO 1 POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 29
136
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
182 2768,2 C 1+ POSITIVO 1-/1 POSITIVO 2+ POSITIVO SR 1 30
Pseudomonas
184 aeruginosa 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 107
(HNTJ1)
Salmonella
185 (HNTJ2)
Proteus mirabilis
186 (HNTJ3)
Xantomonas
187 (HNTJ4)
Aeromonas
188 (HNTJ5)
Enterobacter
189 aerogenes (HNTJ6)
Staphylococcus
190 aureus (HNTJ7)
Escherichia coli
191 (HNJT8)
192 Serratia (HNTJ9) 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 115
Staphylococcus
193 epidermidis 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 116
(HNTJ10)
Bacillus cereus
194 (HNTJ11)
195 Klebsiella (HNTJ12) 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 118
Citrobacter
196 (HNTJ13)
Pseudomonas sp. 1
197 (HNTJ14)
Pseudomonas sp. 2
198 (HNTJ15)
Pseudomonas sp. 3
199 (HNTJ16)
Pseudomonas sp. 4
200 (HNTJ17)
137
5. RESULTADOS

LECTURA
VISUAL de la
línea ESPECIE
TIPO
TOTAL
SEROGRUPO 1 COLONIA
Aislado clínico
201 Pseudomonas sp.1 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 124
(HNTJ18)
Aislado clínico
(HNTJ19)
Aislado clínico
(HNTJ20)
Aislado clínico
204 Acinetobacter 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO 0 NEGATIVO NOL 127
sp.(HNTJ21)
Staphylococcus
205 aureus (HNTJ22)
Streptococcus
206 viridans (HNTJ23)
Haemophilus sp
207 (HNTJ24)
Streptococcus sp
208 (HNTJ25)
Streptococcus sp
209 (HNTJ26)
Aislado clínico
(HNTJ27)
L. pneumophila 1
211 Murcia
2- POSITIVO 2- POSITIVO 2 POSITIVO SR 1 31
138
5. RESULTADOS
Los resultados obtenidos fueron por tanto:
Tabla 5.7.4. Resumen de los resultados obtenidos para el análisis de las colonias por
el test inmunocromatográfico desarrollado por línea y por grupo
GRUPO I GÉN1 SR 12 SR 2-153

INDIVIDUAL4 15 13 14
TOTAL5 42 13 27 (SR 1-15)
GRUPO II GÉN SR 1 SR 2-15
INDIVIDUAL 5 16 14
TOTAL 35 16 30 (SR 1-15)
GRUPO III GÉN SR 1 SR 2-15
INDIVIDUAL 0 1 0
TOTAL 1 1 1 (SR 1-15)
GLOBAL GÉN SR 1 ESP6
TOTAL TEST 78 30* 58
TOTAL
REFERENCIA
78 31* 58
1
GÉN: género Legionella, SR 1: L. pneumophila sg. 1, 3SR 2-
2
15: L. pneumophila serogrupos 2 a 15, 4INDIVIDUAL: para

cada línea número de muestras positivas, 5TOTAL: para cada
grupo cuántas muestras positivas hay para cada línea, 6ESP:
resultados globales para la línea de L. pneumophila serogrupos
2 a 15 incluyendo las L. pneumophila sg. 1 que también
reconoce.
*La muestra número 157 (3187.1) es negativa por la línea de sg.
1 por el test inmunocromatográfico, mientras que es positiva
para dicha línea por el método de referencia.
5.8. Resultados de la Valoración por ELISA e Inmunofluorescencia de Cepas del Grupo

II discrepantes
En el grupo II se obtuvo un resultado discrepante entre el método de referencia y el test

inmunocromatográfico evaluado, como se refleja en la tabla 7.5.4. Para comprobar el
resultado obtenido se analizó esta muestra discrepante, la 3187.1, junto con otras de colección
por el test comercial Bartels ELISA Legionella Urinary Antigen (Trinity Biotech, USA)
según las instrucciones del fabricante. También se realizó un ensayo de inmunofluorescencia
con los Mab de LPS-1 y un policlonal de conejo anti LPS-1 del que disponía la empresa
(desarrollado en el laboratorio) con porta-objetos sensibilizados con las mismas cepas que se
usaron como muestras para el ELISA con placa comercial. La muestra discrepante dio
negativa por todos los ensayos realizados como se muestra en la tabla 5.8.1.
139
5. RESULTADOS
Tabla 5.8.1. Resultados del análisis de la cepa discrepante del grupo II con ensayos
de ELISA e inmunofluorescencia.
Mab Mab Mab Mab Mab Mab

placa Pab3anti
LPS- LPS- LPS- LPS- LPS- LPN
BARTELS LPS-1
1H 1I 1A 1E 1 F ATCC
2870,2 + - + + + + + +
3187,1 - - - - - - - -
Lpn51 - - - - - - - -
2
Lpn1 Philadelphia + + + + + + + +
L. gormanii + - - - - - - -
E. coli - - - - - - - -
Lpn1 Oxford - - + - - + + +
1
Lpn5: L. pneumophila serogrupo 5; 2Lpn1: L. pneumophila sergogrupo 1; 3Pab: anticuerpo
policlonal anti LPS-1 de Legionella pneumophila serogrupo 1.
5.9. Tratamiento Estadístico de los Resultados del Análisis de Muestras con el Test
Desarrollado
Como se comentó en la sección de métodos, para determinar la exactitud de un

clasificador, en este caso un test de inmunocromatografía para la detección de Legionella en
muestras (ambientales o humanas) provenientes de cultivos, es necesario el cálculo de
diversos parámetros estadísticos.
Estos parámetros se han calculado para cada línea que compone el test por separado y
para el conjunto total del ensayo, obteniendo así diferentes tablas de datos de doble entrada
con las que poder calcular la sensibilidad, especificidad, valores predictivos (negativos y
positivos), tasas de verosimilitud, índice de Youden y exactitud de cada uno de ellos.
Tabla 5.9.1. Tablas de doble entrada para cada grupo por líneas y global por líneas.
GÉNERO SEROGRUPO 1 ESPECIE

PREDICCIÓN PREDICCIÓN PREDICCIÓN
CLASIFICADOR CLASIFICADOR CLASIFICADOR
GRUPO I POS 1 NEG 2 POS NEG POS NEG

ESTADO P3 42 0 42 13 0 13 27 0 27
REAL DE
LA
CONDICIÓN A4 0 0 0 0 29 29 0 15 15
42 0 42 13 29 42 27 15 42
140
5. RESULTADOS
GÉNERO SEROGRUPO 1 ESPECIE

PREDICCIÓN PREDICCIÓN PREDICCIÓN
CLASIFICADOR CLASIFICADOR CLASIFICADOR
GRUPO II POS NEG POS NEG POS NEG

ESTADO
REAL DE
P 35 0 35 16 1 17 30 0 30
LA
CONDICIÓN A 0 106 106 0 124 124 0 111 111
35 106 141 16 125 141 30 111 141
GRUPO III POS NEG POS NEG POS NEG
ESTADO
REAL DE
P 1 0 1 1 0 1 1 0 1
LA
CONDICIÓN A 0 27 27 0 27 27 0 27 27
1 27 28 1 27 28 1 27 28
GLOBAL POS NEG POS NEG POS NEG
ESTADO
REAL DE
P 78 0 78 30 1 31 58 0 58
LA
CONDICIÓN A 0 133 133 0 180 180 0 153 153
78 133 211 30 181 211 58 153 211
1 2 3 4
POS: positivo, NEG: negativo, P: presencia, A: ausencia.
Tabla 5.9.2. Tabla de de doble entrada para el global del test.
PREDICCIÓN CLASIFICADOR
GLOBAL POS1 NEG2

ESTADO REAL P3 77 1 78
DE LA
CONDICIÓN A4 0 133 133
77 134 211
1
POS: positivo, 2NEG: negativo, 3P: presencia, 4A: ausencia.
Por tanto, con los datos de las tablas 5.9.1. y 5.9.2. se pueden obtener los siguientes
valores de sensibilidad y especificidad, valores predictivos y tasas de verosimilitud, que se
han calculado con la herramienta Clinical Calculator 1 del sitio web http://vassarstats.net/ y se
ha añadido el índice de Youden y la exactitud (para los datos completos ver el ANEXO 3 de
ANEXO RESULTADOS).
141
5. RESULTADOS
Tabla 5.9.3. Parámetros estadísticos obtenidos para las líneas del test desarrollado
GÉN1 SR 12 ESP3
S4 (%) 100,000 96,774 100,000
E5 (%) 100,000 100,000 100,000
VPP6 (%) 100,000 100,000 100,000
VPN7 (%) 100,000 99,448 100,000
LRP8 ∞* ∞* ∞*
LRN9 0,000 0,032 0,000
AC10 1,000 0,995 1,000
γ11 1,000 0,968 1,000
1
GÉN: género Legionella, 2SR 1: L. pneumophila sg. 1, 3ESP: línea de L. pneumophila
serogrupos 1 a 15; 4S: sensibilidad, 5E: especificidad; 6VPP: valor predictivo positivo; 7VPN:
valor predictivo negativo; 8LRP: tasa de verosimilitud positiva; 9LRN: tasa de verosimilitud
negativa; 10AC: exactitud;11 γ: índice de Youden, *∞: el resultado tiene a infinito.
Si se trasladan estos datos a la representación en una curva ROC se obtendría visualmente

el rendimiento del test (clasificador) por líneas (los datos completos pueden verse en el
ANEXO 4 de ANEXO RESULTADOS):
GLOBAL GÉN GLOBAL_SR1 GLOBAL_ESP

100 100 100
Sensitivity: 100,0 Sensitivity: 100,0
Specificity: 100,0 Sensitivity: 96,8 Specificity: 100,0
Criterion : >0 Specificity: 100,0 Criterion : >0
80 80 Criterion : >0 80
Sensitivity
Sensitivity
Sensitivity
60 60 60
40 40 40
20 20 20
0 0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
100-Specificity 100-Specificity 100-Specificity
Figura 5.9.1. Curvas ROC obtenidas para los diferentes marcadores de los que se
compone el test desarrollado.
(Área bajo la curva para la línea de género: 1, área bajo la curva para la línea de L. pneumophila sg.
1: 0.968, área bajo la curva para la línea de L. pneumophila serogrupos 1 a 15: 1)
(representaciones obtenidas con el Software Medcalc® V 12.2.1.0 proporcionado por
http://www.medcalc.org).
Para el total del test, teniendo en cuenta todas las muestras clasificadas como un único
resultado correcto, se tienen los valores globales reflejados en la tabla 5.9.4. y la
representación gráfica que se muestra en la figura 5.9.2.
142
5. RESULTADOS
Tabla 5.9.4. Parámetros estadísticos del test obtenidos considerándolo globalmente.
TOTAL
S (%) 98,718
E (%) 100,000
VPP (%) 100,000
VPN (%) 99,254
LRP ∞*
LRN 0,013
AC 0,995
γ 0,987
1
GÉN: género Legionella, 2SR 1: L. pneumophila sg. 1, 3ESP:
línea de L. pneumophila serogrupos 1 a 15; 4S: sensibilidad, 5E:
especificidad; 6VPP: valor predictivo positivo; 7VPN: valor
predictivo negativo; 8LRP: tasa de verosimilitud positiva;
9 10
LRN: tasa de verosimilitud negativa; AC: exactitud;11 γ:
índice de Youden, *∞: el resultado tiene a infinito.
GLOBAL_TOTAL
100
Sensitivity: 98,7
Specificity: 100,0
Criterion : >0
80
Sensitivity
60
40
20
0
0 20 40 60 80 100
100-Specificity
Figura 5.9.2. Curva ROC obtenida para el test desarrollado globalmente.

(Área bajo la curva para el global: 0.987)
(representación obtenida con el Software Medcalc® V 12.2.1.0 proporcionado por http://www.medcalc.org).
5.10. Resultados del Cálculo del Límite de Detección de la Técnica
De las placas inoculadas con L. pneumophila sg. 1 Philadelphia se obtuvo que se podían
contar colonias desde la dilución 1/100.000 (154 colonias) a la 1/10.000.000 (2 colonias).
Para el cálculo se tomó el valor de la dilución 1/100.000, y aplicando la dilución preparada y
dado que se pusieron 10 µl de muestra por placa, se obtuvo que la dilución original (1x) tenía
1.54·109 unidades formadoras de colonias/ml (UFC/ml), lo que equivalía a aproximadamente
143
5. RESULTADOS
5 veces McF1 (A600: 0.25, 3·108 UFC/ml). Estas suspensiones se hirvieron y se midieron
espectrofotométricamente.
Tabla 5.10.1. Medida espectrofotométrica de las suspensiones sembradas para el

cálculo del límite de detección y sus resultados por el test desarrollado.
A6001 GÉN2 SR 13 ESP4

1x 1,0460 NA6 NA NA
Dil.5 1/10 0,0923 2 2 2-/2
Dil. 1/100 0,0259 2-/2 2/2+ 0,5-
Dil. 1/1.000 0,0109* 0,25- 0,5+/1- 0
Dil. 1/10.000 -0,0030* 0 sombra 0
Dil. 1/100.000 0,0106* NA NA NA
Dil. 1/10.000.000 0,0004* NA NA NA
2 colonias/200 µl NA 2+/3- 2/2+ 2-
*
medida fuera de rango del espectrofotómetro; 1A600: absorbancia a 600 nm;
2
GÉN: línea género Legionella, 3SR 1: L. pneumophila sg. 1, 4ESP: línea de L.
pneumophila serogrupos 1 a 15, 5DIL.: dilución; 6NA: no analizado.
El resultado de la evaluación por el test desarrollado de las suspensiones, proporcionó por

tanto, el límite de detección:
Tabla 5.10.2. Límite de detección del test desarrollado por líneas.
GÉN1 SR 12 ESP3
Dil.4 1/100 Dil. 1/100 Dil. 1/10
~1/20 McF1 ~1/20 McF1 ~1/2 McF1
7 7
1,54·10 1,54·10 1,54·108
UFC/ml5 UFC/ml UFC/ml
1
GÉN: línea género Legionella, 2SR 1: L. pneumophila sg. 1, 3ESP:
línea de L. pneumophila serogrupos 1 a 15, 4DIL.: dilución;
5
UFC/ml: unidades formadoras de colonias por mililitro.
5.11. Resultados de los Estudios de Estabilidad
Se realizaron estudios de estabilidad a los diferentes constituyentes del kit sometiéndolos

a estrés térmico. Los resultados se comentan a continuación.
5.11.1. Estabilidad de los Strips
Para comprobar la estabilidad de las tiras, éstas fueron sometidas a un estrés térmico de
una semana a 50 ºC y se valoraron en paralelo a temperatura ambiente. Posteriormente, se
evaluaron al año a temperatura ambiente. Los resultados obtenidos fueron:
144
5. RESULTADOS
Tabla 5.11.1.1. Resultado de estrés térmico de strips y valoración a un año a

temperatura ambiente
(la línea control no se muestra en la tabla y en todos los casos fue un valor de entre 2- y 2+).
TA1 1 SEMANA a 50 ºC TA 1 AÑO
GÉNERO SEROG.51 ESPECIE GÉNERO SEROG.1 ESPECIE GÉNERO SEROG.1 ESPECIE
Lpn12 Philadelphia 3- 2+ 1+ 3 2 1+/2- 2+/3- 2 2-
Lpn1 Oxford 3- 1+/2- 1+ 3 0,5+/1- 2- 3 1+ 1+/2-
L. bozemanii sg.31 2-/2 0 0 2 0 0 2+ 0 0
Lpn4 3 2+/3- 0 0,5++ 2+/3- 0 1 2+/3- 0 0,5+/1-
Citrobacter 0 0 0 0 0 0 0 sombra 0
Ps. aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 sombra
1
TA: temperatura ambiente; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3sg.: serogrupo; 4Lpn: L. pneumophila; 5SEROG.: serogrupo.
5.11.2. Estabilidad del Medio
El medio FNTP liofilizado se estudió a 50 ºC comparado a TA durante dos meses y

posteriormente se probó tras 1 año reconstituido frente a uno recién reconstituido del mismo
lote a TA. El resultado se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 5.11.2.1. Resultados del test para la evaluación de muestras tratadas con
medio sometido a estrés térmico. A: medio liofilizado sometido a 50 ºC durante 1 y 2
meses y reconstituido para valoración, B: medio liofilizado reconstituido al año para
valoración y medio liofilizado y reconstituido analizado tras 1 año a TA
(la línea control no se muestra en la tabla y en todos los casos fue un valor de entre 2- y 2+)
A TA1 1 MES a 50 ºC 2 MESES a 50 ºC

5
GÉNERO SEROG. 1 ESPECIE GÉNERO SEROG.1 ESPECIE GÉNERO SEROG.1 ESPECIE
2
Lpn1 Philadelphia 2+/3- 2 2- 3- 2/2+ 2/2+ 2+/3- 2/2+ 2
Lpn1 Oxford 3 1/1+ 2- 3 2- 2/2+ 3 2- 2
Lpn1 OLDA 3- 2- 2+ 3 2-/2 2+ 3- 2+ 2+
Lpn1 Camperdown 3- 2- 2 3 2- 2+ 2+/3- 2 2/2+
Lpn1 Bellingham 2+/3- 2- 2/2+ 2+/3- 2 2/2+ 2+/3- 2- 2+
L. bozemanii sg.31 1+ 0 0 1++ 0 0 1 0 0
L. gormanii 2+/3- 0 0 2+/3- 0 0 2-/2 0 sombra
Lpn4 15 2+/3- 0 2- 3 0 3- 3- 0 2+/3-
Lpn 7 3 0 2- 3 0 2+ 3 0 2
Lpn 2 1-/1 0 1+ 1 0 1+/2- 2- 0 1+/2-
Aeromonas 0 0 sombra sombra 0 sombra 0 0 sombra
Salmonella 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S. epidermidis 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E. aerogenes sombra 0 0 0 0 0 0 0 0
B. cereus 0 0 0 0 0 0 0 0 0
145
5. RESULTADOS
B TA 1 AÑO RECONSTITUIDO A TA
GÉNERO SEROG.1 ESPECIE GÉNERO SEROG.1 ESPECIE
Lpn 1 Philadelphia 2+/3- 2-/2 2 3 2 2
Lpn 1 Oxford 3 1- 2 3 1+ 2+
L. bozemanii sr1 1- 0 0 1-/1 0 0
L. bozemanii sr2 2+ 0 0 2 0 0
Lpn 15 3- 0 2+/3- 3 0 3-
Aeromonas 0 sombra 0 0 0 sombra
S. aureus 0 0 0 0 0 0
1
TA: temperatura ambiente; 2Lpn1: L. pneumophila serogrupo 1; 3sg.: serogrupo; 4Lpn: L.
pneumophila; 5SEROG.: serogrupo.
146
DISCUSIÓN
6. DISCUSIÓN
6. DISCUSIÓN
Desde que se descubrió Legionella pneumophila tras un brote en una convención de
legionarios ocurrido en Philadelphia5, numerosos han sido los casos conocidos provocados
por dicha bacteria13, 15-17
. De las diversas especies y serogrupos que forman la familia
Legionellaceae, es L. pneumophila la que provoca el 90 % de las infecciones10, 21, siendo de
ellas L. pneumophila sg. 1 la causante del 70-80 % de las neumonías severas2, 22. Otros
serogrupos como el 2, 3, 4, 5 ó 6, u otras especies como L. micdadei, L. dumoffi, L. bozemanii,
L. feeli o L. longbeachae, pueden causar también enfermedad pero son menos comunes10, 11.
Entre los hábitats de la bacteria se encuentran los naturales como ríos, lagos, fuentes o
lodos23, o los sistemas creados por el hombre como circuitos de agua sanitaria, sitios de recreo
(spa, piscinas, etc.) o torres de refrigeración2-4. El análisis de estos sistemas para determinar la
presencia de Legionella es obligatorio en gran número de países22, 94, 152, 153, lo que crea la
necesidad de métodos de diagnóstico eficaces.
6.1. De la Morfología de la Membrana de Legionella y la Epidemiología y Patogénesis de

la Infección por Legionella pneumophila
En la membrana de la bacteria Legionella se hallan diversos componentes con actividad

antigénica que son específicos de género, especie o serogrupo20, 32, 33 (ver figura 1.1.3.1.).
Estos componentes pueden ser útiles en el diagnóstico clínico de la bacteria porque permiten
su identificación y clasificación en casos que así lo requieran.
Se ha visto que la lipoproteína asociada al peptidoglicano (PAL ó LPPA) muestra

epítopos específicos para género. Este componente antigénico de la membrana es común y
altamente conservado en todas las legionellas37, 38, 41, lo que permitiría la detección del género
Legionella en principio para todas las nuevas especies que surgiesen. En un trabajo no
publicado de Rojas et al.135, este antígeno se obtuvo como recombinante y fue inoculado en
ratones a los que posteriormente se sangró para obtener suero. Estas muestras, así como
sueros control de otras enfermedades (Citomegalovirus, Leishmania o del Síndrome
respiratorio agudo severo (SARS)), se analizaron mediante la técnica de ELISA con placas
sensibilizadas con diferentes cepas de Legionella, antígeno no purificado de L. pneumophila
sg. 1 o de Escherichia coli. Los sueros obtenidos en ratones mostraron alta reactividad a las
diferentes legionellas, pero fueron negativos con el resto de antígenos. En otro trabajo, Kim et
149
6. DISCUSIÓN
al.37 detectaron el antígeno de PAL en orina de cobayas infectadas con diferentes serogrupos
de L. pneumophila o diferentes legionellas, así como en muestras humanas de pacientes sanos
y enfermos de Legionella. El resultado demostró que el antígeno de PAL se excreta en la
orina y que el análisis de este antígeno dio mejor rendimiento, para las mismas muestras, que
otros test comerciales que usan otros marcadores no capaces de detectar otras especies de
Legionella diferentes a L. pneumophila sg. 1, además de no mostrar falsos positivos. Parece
ser por tanto PAL un marcador importante del género Legionella, ya que para diferentes
especies su análisis produce resultados positivos mientras que para otros tipos de bacterias (E.
coli, Pseudomonas, Klebsiella, etc.37) el resultado es negativo, indicando así especificidad de
género y la ausencia de reactividad cruzada. La producción de un antígeno recombinante de
LPPA en el laboratorio135 permitió la obtención de Mab específicos para epítopos del mismo,
que una vez purificados se han analizado y han posibilitado la investigación y desarrollo de
una línea específica para la detección del género Legionella, como se ha descrito en este
trabajo, mostrando alta especificidad y elevada sensibilidad.
El lipopolisacárido (LPS) es un constituyente mayoritario de la pared celular de las

membranas de las bacterias Gram-negativas44, 45
. Sus propiedades se relacionan con la
42, 51-53
especificidad de serogrupo de L. pneumophila . Se compone de tres regiones
estructuralmente distintas: el lípido-A, el núcleo de polisacárido y la cadena O-antigénica46.
Parece ser que la especificidad de serogrupo reside de hecho en esta región O-antigénica.
Conlan y Ashworth54 examinaron los antígenos relacionados con el serogrupo de una cepa de
L. pneumophila sg. 3 virulenta y de cuatro cepas de L. pneumophila sg. 1 con diferente
virulencia, para determinar la conexión entre el antígeno relacionado con el serogrupo de L.
pneumophila y el LPS, el alcance de la heterogeneidad a lo largo de la cadena O-antigénica de
LPS y si la posesión de dicha cadena es un requisito previo para la virulencia. Para ello
realizaron una extracción fenol/agua mediante la cual se obtuvo el antígeno de LPS en la fase
fenólica y no en la acuosa, como es lo más común para otros microorganismos. Este hecho lo
explicaron como una consecuencia del alto contenido en lípidos o a la presencia de azúcares
en la cadena O-antigénica, ya que ésto provocaría un aumento de la hidrofobicidad del LPS.
Estos antígenos extraídos se analizaron por SDS-Page y Western-blot, y demostraron que la
especificidad de serogrupo de L. pneumophila es de hecho debida a la cadena O-antigénica de
LPS. En otro trabajo, Nolte et al.46 examinaron la heterogeneidad del LPS de L. pneumophila
y la relación serológica entre los LPS de los diferentes serogrupos de L. pneumophila. El LPS
fue preparado por digestión de la proteinasa-K de lisados celulares de diferentes subtipos de L.
150
6. DISCUSIÓN
pneumophila sg. 1, así como de diferentes serogrupos de L. pneumophila. Estos LPS se

analizaron por Western-blot con antisueros de conejo obtenidos con LPS de serogrupos 1, 2, 4
y 6, y se observó que sólo reconocían al LPS de cadenas de serogrupo homólogo. De esta
forma se demostró que el LPS de cada serogrupo de L. pneumophila era un agente
determinante de la especificidad del mismo. Por tanto, este constituyente de la membrana de
Legionella es útil para el diagnóstico del sg. 1 de L. pneumophila, lo que ha permitido
desarrollar Mab específicos para la detección del mismo135 y de ahí su utilidad en el test
inmunocromatográfico que se describe en este trabajo.
Por otro lado, también se relaciona al LPS con la posibilidad de clasificación en

serogrupos basada en la reactividad con monoclonales del Panel Internacional o del Panel de
Dresden9, 51, 58, 82. Hasta el momento en que se empezaron a desarrollar los paneles de Mab
para su uso en el diagnóstico del serogrupo de L. pneumophila, éste se realizaba
mayoritariamente mediante técnicas serológicas con antisueros mono o policlonales
producidos para diversos serogrupos2. Posteriormente se comenzaron a desarrollar los
mencionados paneles, primero en 1986 el Panel Internacional9 que contenía siete Mab (ver
figura 1.3.1.2.), y más tarde el Panel de Dresden que estaba conformado por 98 Mab51, 58.
Helbig et al.51 comprobaron que era posible la clasificación en serogrupos y subtipos de L.
pneumophila, analizando dichas cepas con los Mab seleccionados en el Panel de Dresden que
reconocían al LPS de Legionella, demostrando así de nuevo la utilidad de este componente
antigénico en el diagnóstico, así como su importancia en la clasificación de la bacteria86, 154.
En la mayoría de los aislados clínicos relacionados con brotes epidemiológicos se ha

encontrado un epítopo para LPS que reacciona con los Mab 2 y Mab 3/1. El Mab 3/1
reconoce a un epítopo asociado con el grupo 8-O-acetil del ácido legionamínico. Este grupo,
identificado como un componente básico del LPS de L. pneumophila sg. 1, interviene en la
unión del Mab 3/1 al LPS de dicho serogrupo de L. pneumophila y no en otros serogrupos59.
El subtipo asociado al Mab 2 es el que causa la mayoría de los casos de LD155. Helbig et al.58
estudiaron como los diferentes serogrupos de L. pneumophila se podían dividir en subgrupos
de Mab con aislados clínicos de casos CAP, TrA y nosocomiales. Las técnicas empleadas
para la determinación de los serogrupos fueron el ELISA o la inmunofluorescencia, usando
los Mab específicos de serogrupo del Panel de Dresden o policlonales específicos de
serogrupo preparados. El esquema de Joly et al.9 fue el utilizado para realizar la
determinación de serogrupo de Mab. En el mencionado trabajo de Helbig et al.58, se explica
151
6. DISCUSIÓN
cómo pueden caracterizarse los diferentes subgrupos de L. pneumophila sg. 1 en función del
patrón de reactividad. El Mab 1 del Panel de Dresden determina si es L. pneumophila sg. 1 o
L. pneumophila. Si se trata del sg. 1 (positivas al Mab 1), el Mab 3/1 discrimina entre las
legionellas que reaccionan con él y las que no. Las cepas Mab 3/1 positivas se denominan tipo
Pontiac e incluyen los tipos Knoxville, Philadelphia, Benidorm y France/Allentown. Estos
cuatro grupos de Mab representan el 67% de todos los aislados causantes de enfermedad y se
caracterizan por portar el epítopo reconocido por el Mab 3/1 asociado a la virulencia82. Por su
parte, las no reactivas al Mab 3/1 se denominan no Pontiac e incluyen el grupo OLDA,
Oxford, Bellingham, Heysham y Camperdown (CHOOB)154. Helbig et al.86 además indicaban
que la sensibilidad de las cepas de las infecciones causadas por el Mab 3/1 o el Mab 2 era
elevada. Todo ello es interesante porque las CHOOB son más frecuentes en casos
nosocomiales que en CAP o TrA156, 157, por lo que además podría determinarse la posible
fuente de la infección o ayudar a su localización más rápidamente. Los casos nosocomiales
son menores respecto a los CAP o TrA156, siendo el 80% de las cepas positivas al Mab 3/1
debidas a estas últimas2, 59. Los aislados ambientales son mayoritariamente negativos con el
Mab 3/182, 157, lo que indicaría que son predominantes las mismas especies que en los casos
nosocomiales. En el trabajo aquí desarrollado, todas estas legionellas se han detectado como
puede verse en la tabla 5.7.3., indicando su utilidad para muestras positivas al Mab 3/1 o
negativas al mismo, y que además se podrían identificar legionellas en muestras tanto
ambientales como clínicas. Frente a los ensayos para detección de Legionella en orina, en los
que frecuentemente la sensibilidad disminuye para los casos nosocomiales157, este test
desarrollado aportaría una ventaja importante.
Por su parte, la proteína mayoritaria de la membrana externa (MOMP) está presente

en todos los serogrupos de L. pneumophila y existe como un agregado estable unido por
enlaces disulfuro asociado al peptidoglicano60, 61. Este componente ha sido estudiado y se ha
determinado que es un antígeno específico de especie, pudiendo utilizarse como un marcador
64
para diagnóstico de la especie pneumophila de Legionella . Gosting et al.67 describieron y
caracterizaron un antígeno específico de especie. Para ello produjeron Mab con L.
pneumophila serogrupos 1 a 6 que analizaron mediante la técnica de ELISA con placas
sensibilizadas con L. pneumophila serogrupos 1 a 6 y Pseudomonas aeruginosa como control
negativo. Uno de los Mab obtenidos se observó que era reactivo a todos los serogrupos de L.
pneumophila estudiados y se denominó Mab LP3IIG2. Posteriormente, se realizó un estudio
con un Western-blot y un análisis por inmunofluorescencia. En el Western-blot con diferentes
152
6. DISCUSIÓN
cepas de L. pneumophila serogrupos 1 a 8 y otras legionellas no pneumophilas así como

microorganismos no Legionella, se observó que el Mab LP3IIG2 reconocía una banda de
aproximadamente 29 kDa en todos los serogrupos de L. pneumophila analizados pero no en
legionellas no pneumophilas, así como tampoco en microorganismos no Legionella. Se
obtuvo el mismo tipo de resultado con el análisis por inmunofluorescencia no existiendo
evidencia de reacción cruzada. Posteriormente, Nolte y Conlin64 pusieron de manifiesto que la
banda de entre 26 y 29 kDa obtenida por Gostin et al.67 correspondía a MOMP, lo que
determina la existencia de un antígeno común en la especie pneumophila que puede ser por
tanto útil para el diagnóstico de la misma. Su uso en el test ha aportado especificidad a la
línea de L. pneumophila 1-15 y ha permitido poder distinguir el sg. 1 del resto de serogrupos
de L. pneumophila, lo que es una gran ventaja, teniendo en cuenta que esta diferenciación
permite conocer si la enfermedad ocasionada por Legionella se debe al sg. 1 o no, ya que
dicho sg. 1 es el causante de 70-80 % de las neumonías severas provocadas por la bacteria. El
factor de la diferenciación entre género Legionella, sg. 1 y serogrupos 2 a 15 de L.
pneumophila puede ayudar también al correcto tratamiento del enfermo, ya que en algunos
casos el agente causante de la infección no es correctamente detectado, debido a que los test
disponibles en el mercado se dirigen mayoritariamente al diagnóstico del sg. 137, 156.
6.2. De los Métodos de Detección de Legionella
Entre los métodos de detección de Legionella, el aislamiento por cultivo sigue siendo el
usado como referencia con una especificidad del 100 %19. Los ensayos para confirmación del
cultivo pueden ser de diversa naturaleza, pero para su elección y uso es interesante la rapidez,
fiabilidad y facilidad de ejecución de los mismos. El cultivo de Legionella puede ser difícil,
ya que el medio necesita de suplementos específicos para su crecimiento y un personal
experimentado para evitar falsos negativos. No obstante, al ser el método más específico es el
más fiable para su aislamiento, ya que proporciona una ventaja significativa cuando la
prevalencia de la enfermedad en la población es baja23. Por otro lado, el aislamiento de la
colonia permite tenerla disponible posteriormente para otros análisis en estudios
epidemiológicos8. En muchos países el cultivo es obligatorio, por lo que son necesarios estos
test de confirmación para muestras de cultivo.
De los diferentes métodos de confirmación o detección existentes, se ha evolucionado de

los clásicos como la serología, los métodos directos o los análisis bioquímicos a la
153
6. DISCUSIÓN
detección por otros sistemas más modernos como son la antigenuria, las técnicas basadas en
ácidos nucleicos o la inmunocromatografía. Los sistemas directos o serológicos necesitan de
muestras en diferentes momentos de la enfermedad lo que limita su rápida detección2, ya
pueden producirse reacciones cruzadas y están restringidos a unas pocas especies
frecuentemente aisladas22, 36. La inmunofluorescencia es difícil de interpretar y posee una
sensibilidad variable2, 81, como el cultivo, y necesita de mezclas de reactivos para detectar las
inmunoglobulinas G, M y A, aunque normalmente los kits comerciales se dirigen
mayoritariamente hacia la detección de IgG2. Los análisis bioquímicos son útiles para la
clasificación de un microorganismo encontrado dentro de la familia Legionellaceae o el
género Legionella34, o incluso al nivel de especie35, pero son complicados y requieren un alto
coste de tiempo e instrumentación. Se usan mayoritariamente cuando aparece un nuevo
organismo no identificado, como se muestra en los trabajos de Morris et al.88, Helbig et al.158,
Park et al.5 o Tang et al.35, donde se analizan el contenido en ácidos grasos, ésteres, quinonas
y otros compuestos químicos relevantes por técnicas de cromatografía o espectrometría de
masas, obteniendo datos para la clasificación de los microorganismos encontrados. Esta
metodología tiene un objetivo más concreto y se aplica por tanto en los casos comentados, por
lo que no es un método de rutina en el laboratorio.
El análisis de ácidos nucleicos ha avanzado también en los últimos años, encontrándose

que esta técnica es aplicable tanto a muestras ambientales como clínicas. Pero en el campo de
la detección de Legionella la metodología no ha alcanzado las expectativas esperadas19. Sin
embargo ha mejorado con el desarrollo de la aplicación de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para detectar el género o la especie de Legionella mediante el ARN y ADN
ribosómicos y diversos genes que codifican la región heat-shock (dnaf), la región de la
2, 22, 159
ARNpolimerasa (rpoB) o el gen mip . La sensibilidad de la técnica es moderada2 y la
especificidad es elevada81, 89, y puede usarse en diversos tipos de muestras humanas como
lavados bronquioalveolares, orina y suero2. En el caso de muestras ambientales posee la
limitación de no distinguir entre organismos viables y no viables74, 156, lo que frente al cultivo
es una desventaja importante, ya que en este sólo pueden crecer organismos vivos, que son los
causantes de la enfermedad. Gutiérrez-Molina et al.13 estudiaron un brote de Legionella
acaecido en la ciudad de Murcia en el año 2001, el cuál ha sido el de mayor importancia
ocurrido en España. En el estudio se utilizó PCR y cultivo, entre otras técnicas, para el
análisis de las muestras y se encontró que la PCR frente al cultivo tenía muy baja sensibilidad
para la identificación preliminar y rápida de las posibles fuentes emisoras, lo que limitaba su
154
6. DISCUSIÓN
utilidad. Otra limitación de la técnica es que requiere una costosa instrumentación y

operadores experimentados para su ejecución. La contaminación de las muestras o la
presencia de inhibidores en las mismas son otros inconvenientes que presenta su realización19,
y además, pueden surgir problemas asociados a la obtención de falsos positivos debido a la
homología con otras bacterias2, 8.
En la actualidad, la antigenuria, o detección de Legionella en orina, se ha extendido

ampliamente porque permite el diagnóstico temprano de la bacteria en pacientes con un
cuadro de neumonía. Los métodos enzimáticos para la detección en orina de Legionella tienen
alta sensibilidad y especificidad, aunque esta última menor que el cultivo79. En el caso de la
inmunocromatografía para orina, también posee alta especificidad y sensibilidad10, 72, pero
normalmente necesita de la concentración previa de la muestra para obtener mejores
resultados156. Los test inmunocromatográficos para orina disponibles comercialmente tienen
la gran limitación de que sólo detectan L. pneumophila sg. 137 (por ejemplo el producto Alere
BinaxNOW® Legionella Urinary Antigen Card, http://www.alere.com/ww/en/product-
details/binaxnow-legionella.html), por lo que la enfermedad causada por otra especie o género
no queda diagnosticada. Por otro lado, el antígeno se excreta durante meses en la orina, por lo
que un resultado positivo puede no ser indicativo de una infección aguda23.
La inmunocromatografía se ha convertido en un método útil y eficaz para el diagnóstico

de Legionella, pero como ya se ha comentado, los existentes para muestras de orina tienen la
limitación de que sólo detectan el serogrupo 1 de L. pneumophila. A pesar de ello, es una
técnica cómoda, rápida y de fácil ejecución2, lo que invita al desarrollo de nuevos productos
que puedan detectar el resto de especies o indicar la existencia de otros serogrupos.
6.3. De la Inmunocromatografía y el Oro Coloidal
La inmunocromatografía pertenece a las técnicas denominadas Test Rápidos o Lateral

Flow (de flujo lateral). Son pruebas económicas debido a que no necesitan maquinaria
adicional para su ejecución e interpretación, y existen muy diversas aplicaciones como drogas,
embarazo o enfermedades infecciosas. Las configuraciones más frecuentes son las de tipo
sándwich o de inhibición competitiva. Se pueden detectar anticuerpos si las muestras son
sueros o plasmas, o antígenos si se usan para su análisis anticuerpos específicos101, 160.
155
6. DISCUSIÓN
De los múltiples componentes que conforman una inmunocromatografía, el principal

puede considerarse la membrana, ya que la elección de una apropiada es esencial para el
éxito de un test rápido101. Sobre ella se inmovilizan las Mab que posteriormente reaccionarán
con los posibles antígenos (Ag) de Legionella (PAL o LPPA, LPS-1 y MOMP) presentes en
las muestras. En la elección de la membrana los factores a tener en cuenta son: la capacidad
de unión de proteína, la porosidad (tamaño y distribución) y la fuerza de tensión101, 102, 105, 108.
La capacidad de unión a la membrana depende de su grosor y porosidad, siendo mayor a
menor dimensión de poro. De los tamaños más comunes de poro, 0.1, 3, 5, 8 y 10
micrómetros101, 105, para 8 y 10 micrómetros el flujo es más rápido. A mayor tamaño se
produce un descenso en la sensibilidad102, por lo que si no hay una mejora del test
significativa respecto a otros tamaños ampliamente usados como 5 micrómetros o no hay
requerimientos de tiempo mínimo, no son aconsejables. En el caso de 2 y 3 micrómetros el
flujo es más lento, por lo que debido a que fue innecesario el aumento de la sensibilidad, se
descartó su uso para evitar también el posible incremento de la señal inespecífica en este test.
Las membranas pueden estar compuestas de diferentes materiales, de los cuáles son
usados más comúnmente la nitrocelulosa (NC), el fluoruro de polivinilideno (PVDF), el nylon
o el acetato de celulosa105, 161. La vía de unión de las proteínas a la membrana varía en función
del material, siendo para la nitrocelulosa o el nylon de tipo electrostático, hidrofóbicas para el
PVDF o hidrofílicas para el acetato de celulosa101. La capacidad de unión de proteínas en el
nylon es mayor que en la NC pero el flujo en ésta es mejor105. Se eligió para la realización de
este test la membrana de NC por sus características y propiedades de pegado y por su gran
superficie interna, lo que favorece la adsorción de proteínas, así como por las experiencias
previas de nuestro laboratorio. La membrana de NC se une a los Mab a través de interacciones
electrostáticas producidas entre el fuerte dipolo del nitrato de celulosa y el fuerte dipolo del
péptido (ver figura 3.1.1.1.) y no necesita de un tratamiento previo para ello101, 106, 162. La
capacidad de unión de una IgG está en torno a los 50-200 µg/cm2 101, 162
, por lo que es
suficiente para la adsorción de los Mab utilizados. La máxima concentración de Mab
dosificado individualmente ha sido 1 mg/ml. Teniendo en cuenta que la razón de dosificación
ha sido 0.6 µl/cm, como recomienda la bibliografía105, y que la línea puede tener entre 1 y 2
mm y el strip un ancho de 3.8 mm (para el casete usado), la cantidad total de Mab unida fue
en torno a los 3 µg/cm2.
156
6. DISCUSIÓN
La correcta orientación de la molécula es esencial para el funcionamiento adecuado del

test, pero como Mansfield162 comenta, es un factor incontrolable y aleatorio, aunque gran
parte de las moléculas lo hacen apropiadamente como es el caso de la mayoría de los
anticuerpos. El medio que acompañe a la proteína o molécula a dispensar es importante y
debe poseer baja cantidad de sales y aditivos que eviten la mala adsorción de la misma y no
permitan su correcta orientación en la membrana107. Cuando el agua se evapora en el proceso
de secado y estos aditivos se concentran alrededor de la proteína, merman la habilidad de ésta
para capturar el agente biológico para el que está destinado. Es deseable también evitar
surfactantes y detergentes, ya que estos pueden impedir que la molécula entre en contacto con
la NC a nivel molecular sobre todo a concentraciones elevadas101, 161
. En el test aquí
desarrollado se ha evitado el empleo de gran cantidad de sales en la mezcla de anticuerpos
dispensados, usando únicamente citrato 0.1 M al pH recomendado para cada Mab,
acompañado de metanol108, 163
como coprecipitante, añadido en el momento de la
dispensación, para favorecer el pegado con la orientación deseada. Jones108 explica que la
adición de los agentes coprecipitantes tiene la misión de reducir la estabilidad del Mab en
disolución. La región Fc tiende a degradarse más con estos compuestos y expone mayor
número de grupos hidrofóbicos, lo que favorece la unión a la membrana por esta zona frente a
la Fab y de ahí que los anticuerpos se orienten de la forma deseada.
El equipo de dispensación es importante también a la hora de inmovilizar el Mab en la

NC109, 162. Para el test se utilizó una dispensadora automática (Biodot ZX 1000, ver figura
4.1.5.4.) que difunde por capilaridad la línea que dibuja a una razón constante de dosificación.
Del contacto del cabezal de dispensación con la membrana dependerá igualmente el ancho de
la línea, por lo que debe evitarse que el contacto sea muy severo y se raye, así como el uso de
un medio con alta molaridad108, ya que se produciría un resultado erróneo con una línea muy
fina y acumulación de los reactivos (oro, agente desarrollador del test, etc.) en el surco
creado105, 162. Las membranas de nitrocelulosa están pretratadas con detergentes y surfactantes
que permiten un fácil mojado durante la dispensación de las proteínas101, 106. En este caso, la
dosificación no presentó ningún tipo de limitación, quedando una línea uniforme y de ancho
apropiado (~1 mm). Esto ha permitido una lectura fácil de las líneas así como un llenado
completo de las mismas cuando el conjugado ha reaccionado con ellas, no quedando huecos o
bordes más intensos, como se espera de un test inmunocromatográfico108, 162, 164.
157
6. DISCUSIÓN
En cuanto a la fuerza de tensión, la membrana es frágil por lo que fue necesario para su
manejo la adición de un backing o soporte que le proporcionase la consistencia, cumpliendo
con la necesidad de no interferir en el proceso ni química ni físicamente102, 109. Para ello se
laminó en tarjetas de poliestireno, lo que permitió su corte y le dio la rigidez necesaria para su
uso, siendo totalmente inerte al proceso. Otros factores importantes han sido los pads de
absorción, muestra y conjugado. Estos componentes son normalmente de fibra de vidrio,
celulosa o poliéster109, 162 cuyas propiedades son baja capacidad de unión inespecífica y alta
capacidad de absorción101. Finalmente se usó poliéster para la muestra y el pad de conjugado,
por ser inerte a los reactivos químicos102 y permitir la liberación del flujo de pad a pad o a
membrana cuando se rehidratan con la muestra107. Una variación en la liberación del reactivo
dosificado en el pad de conjugado puede introducir cambios en la sensibilidad162 debido a la
salida mayor o menor de reactivo en cada caso. Para el pad de absorción se utilizó papel de 2
mm de grosor por tener la capacidad suficiente para recoger todo el volumen de la muestra.
Todos estos componentes deben de elegirse de acuerdo a las propiedades que se desean para
ellos162, 165, pero una vez seleccionados han de ensamblarse en el strip con la configuración
adecuada que permita que el flujo por capilaridad no se vea interrumpido, que la muestra
avance y que sea recogido finalmente para que la reacción se vea completada en el tiempo101,
160
. Los pads se colocaron en el orden adecuado (ver figura 3.1.) y con el solapamiento
estudiado que permitió mejor flujo y sensibilidad (ver apartado 4.2.3.11.). Carlberg160
recomienda al menos un solapamiento de 1 mm sobre la membrana cuando sea posible porque
mejora el flujo. En este test se probaron 1 y 2 mm de solapamiento del pad de conjugado
sobre la membrana, pero 2 se adaptaba mejor al casete disponible. Por su parte, el pad de
muestra se probó con 1 y 2 mm de solapamiento sobre el pad de conjugado y con diferentes
tamaños, 1, 1.1, 2 y 2.1 cm, eligiéndose el solapamiento de 1 mm sobre el de conjugado. La
incorrecta configuración de los pads podría provocar una diferencia en el flujo del test101, ya
que un solapamiento erróneo de estos causaría una liberación inapropiada del conjugado, lo
que inevitablemente conllevaría un descenso de la señal y de reproducibilidad entre ensayos.
Por su parte el pad de absorción, de 2 mm de grosor, era capaz de retener los 90 µl de muestra
y permitir que la membrana quedase sin restos de conjugado al término del tiempo, lo que
permitía una clara lectura de las líneas.
Finalmente, los casetes plásticos son el último componente inmunocromatográfico a

destacar. La configuración de los casetes es muy importante para el correcto desarrollo de la
inmunocromatografía160, ya que estos poseen barras de presión las cuáles actúan sobre el strip
158
6. DISCUSIÓN
que irá en su interior para mantenerlo en su posición101 y permitir que cada componente se
encuentre en el sitio adecuado mientras se ejecuta el test. Para el test desarrollado se ha usado
uno con la parte superior transparente que permite ver el flujo de los reactivos (ver figura
4.1.4.1.). Por su parte, el grosor del strip no interfirió con el casete, siendo apropiado para su
uso160.
Las membranas deben de almacenarse en condiciones de ausencia de luz y disolventes

orgánicos108 así como a temperatura y humedad controladas101. Por ello se han guardado los
casetes individualmente en sobres de aluminio (opacos) con desecantes en su interior como se
recomienda en la literatura102. Las tarjetas o pads dosificados se han almacenado en un
armario desecante (ver figura 4.1.5.1.) donde se mantenían las condiciones apropiadas de
conservación mencionadas.
El oro coloidal, como ya se ha explicado en el capítulo 3, es una suspensión de

nanopartículas de oro de color rojo por lo general, que puede ser de diferentes tamaños y que
permite la conjugación de proteínas en su superficie. Para la obtención de oro coloidal existen
diversos métodos entre los que caben destacar algunos muy sofisticados, como la síntesis a
partir de partículas sólidas en un medio acuoso por medio de fuerzas eléctricas166, la
reducción fotoquímica de soluciones de ácido tetracloroáurico (HAuCl4)120, 121
o
electrodeposición por radiación123, o más sencillos y rutinarios como la reducción de una
solución de HAuCl4 con citrato sódico, ácido ascórbico, ácido aspártico o borohidruro de
sodio, entre otros111, 132, 167, 168. En función del método llevado a cabo y de la cantidad de
reductor puede obtenerse un tamaño deseado111, 112, 121
. Frens112 preparó diferentes
suspensiones de distintos tamaños de oro coloidal en función de la cantidad del reductor
citrato sódico que se adicionaba a una disolución de HAuCl4. El método seguido por Frens
consistió en el calentamiento hasta ebullición de las mezclas y la producción de soluciones
que iban desde el naranja hasta el violeta, siendo éste último el de mayor tamaño y peor
monodispersión. Esto muestra que el procedimiento sencillo de reducción química es una
opción apropiada y económica de producción de soluciones de oro coloidal estables
monodispersas de hasta al menos 70 nm. Otros métodos más costosos como el desarrollado
por Sau et al.121 para la obtención de partículas entre 5 y 20 nm por radiación o el de van der
Zande et al.123 para la preparación de soluciones acuosas de oro con el fin de estudiar sus
propiedades ópticas, requieren instrumentación compleja y costosa. En este trabajo el método
seguido ha sido el desarrollado por Frens para la obtención de partículas de un tamaño de
159
6. DISCUSIÓN
entre 20 y 30 nm, lo que se ha conseguido sin dificultad. Para esto, el material utilizado se ha
mantenido siempre limpio y destinado exclusivamente a este uso114, para evitar posibles
impurezas que pudieran afectar a la nucleación de las partículas, como se comenta en los
trabajos de Chaudhuri y Raychaudhuri124 o de Geoghegan y Ackerman131. La nucleación
incorrecta del oro coloidal puede provocar partículas no homogéneas, que producen una
suspensión coloidal de baja calidad que no los hace aptos para su uso, debido a la formación
de agregados informes (no esféricos) y de tamaños elevados cuyo color suele ser azul o
violeta-negro, así como a la destrucción del potencial zeta que se forma en la partícula de oro
y que hace que la suspensión coloidal sea estable por repulsión entre partículas113.
La validez del oro coloidal se ha determinado de acuerdo a los parámetros descritos en la

bibliografía. Según Chaudhuri y Raychaudhuri124 y Chun114, todos las suspensiones de oro
coloidal proveen un único pico de absorción en el rango del visible entre 510 y 550 nm,
encontrándose por tanto en este intervalo la denominada longitud de onda máxima (λmáx).
Mallick et al.120 determinaron que esta λmáx se encuentra en torno a los 520 nm. Bozlee y
Exarhos125 mostraron que la absorbancia a 575 (A575) nm correspondía a una absorción
típica de los coloides de metales debido a una resonancia en las proximidades de esta longitud
de onda. La medida espectrofotométrica del oro coloidal debe producir una única curva
indicando la forma esférica de las partículas coloidales169, en la que los valores de A500 y
A575 nm quedan a ambos lados del pico de absorción (ver figura 5.3.1.). La relación entre
estas absorbancias puede proporcionar una idea de la abertura del mismo, lo que se relaciona
con la monodispersión del coloide. Por ejemplo, si la curva es muy abierta y el valor de la
relación entre A500 y A575 nm elevado, la solución sería más polidispersa. Tarozaité et al.126,
Norman et al.127 y Rico-Moctezuma et al.128, entre otros autores, describen que la formación
de partículas de oro coloidal produce una absorción alrededor de A540 nm debido a la
resonancia de los plasmones superficiales (una resonancia transversal y otra longitudinal
cuyas absorbancias están centradas en aproximadamente 540 nm). Esta A540 nm aumenta
hasta alcanzar un valor estable cuando la reacción se ha completado128. La A540 nm es el
valor que se toma como concentración del oro y posteriormente de los conjugados.
La obtención de un oro coloidal perfecto y estable es esencial para la conjugación de

proteínas. Hermanson132 explica cómo se produce el fenómeno de la adsorción de proteínas
en la superficie de la partícula de oro, enfatizando el hecho de que la partícula debe quedar
rodeada de la cantidad necesaria para evitar que queden libres cargas negativas y puedan
160
6. DISCUSIÓN
provocar la coagulación de la suspensión con la adición de electrolitos a la suspensión (como

NaCl)114. Esto quiere decir que la cantidad de proteína ha de ser al menos la mínima
necesaria, primero para proteger a la partícula de oro frente a otras sales que puedan
adicionarse posteriormente y también para mantener la solución conjugada en perfecto estado.
Es la denominada MPC (mínima concentración que protege al oro), tal y como se comentó en
el capítulo 3. Geoghegan129, Geoghegan y Ackerman131 o Chun114, explican como la
adsorción de las proteínas a las partículas coloidales depende del pH a la que se realice, por lo
que ésta se estudia a diferentes valores. Para el caso de una IgG de conejo, estudiaron distintas
cantidades de proteína para estabilizar el oro, varios pH de adsorción en función de la
cantidad de IgG de conejo y el punto isoeléctrico de la misma. La medida de la absorbancia,
una vez la proteína adsorbida en el oro coloidal, se realiza a 580 nm, observándose una caída
en la misma cuando las partículas de oro se estabilizan con la adición de la proteína132. La
concentración de proteína se representa frente a la A580 obtenida para cada medida (ver
figura 3.2.3.1.), de modo que los valores de la parte inicial de la curva son los que no
estabilizan al oro y los finales, que forman un plateau, los que si lo hacen.
Una vez determinada la MPC, el paso de la conjugación de proteínas al oro dependerá de

los parámetros determinados, pero también de las condiciones posteriores en el proceso de
pegado. Cuando la proteína se adsorbe a la partícula de oro, ésta no debe inestabilizarse, por
lo que han de añadirse sustancias que actúen de agentes bloqueantes y lo eviten. Chadler et
al.113, Horisberger130, Geoghegan129, Robinson122, Norman127 o Jones108, entre otros muchos
autores, recomiendan la adición de gelatina, caseína, albúmina de suero bovino,
polietilenglicol, polivinilpirrolidona, o polivinil alcohol, entre otras sustancias, para la
estabilización de los conjugados preparados. En el test desarrollado se ha usado un tampón de
bloqueo de conjugación con albúmina de suero bovino, siguiendo las recomendaciones de la
literatura114, a una concentración de 5 mg/ml. Con este bloqueo no se ha observado reacción
inespecífica de los conjugados de Mab y se han mantenido estables en el proceso de
preparación de los mismos así como posteriormente a 4 ºC.
La conjugación depende, entre otros factores, de la carga superficial de las sustancias a

conjugar. Hermanson132 explica cómo los anticuerpos se adsorben fuertemente al oro coloidal
por la región Fc de los mismos, dejando la Fab libre para la unión al Ag, así como que el pH
óptimo de unión de la gran mayoría de los anticuerpos se encuentra entre 8 y 9. Robinson122
explicó la necesidad de que las partículas a conjugar tengan suficientes residuos de lisina,
161
6. DISCUSIÓN
triptófano o cisteína. Chandler et al.113 explicaron los posibles mecanismos de unión del
anticuerpo al oro coloidal, como por ejemplo la atracción inicial de cargas del aminoácido
lisina con carga positiva, hacia el oro que posee carga negativa. Otro mecanismo posible es la
interacción hidrofóbica a través de ciertos aminoácidos como el triptófano y la unión por
enlace dativo entre residuos sulfuro (provenientes del aminoácido cisteína) y la partícula de
oro coloidal. Para una correcta conjugación, la composición en los aminoácidos anteriormente
mencionados es muy importante, como Robinson122 comentó en su trabajo, sobre todo en
moléculas de pequeño tamaño, ya que un número elevado de ellos puede afianzar dicha unión.
Por último, Christopher et al.167, pusieron de manifiesto la importancia de la localización de
estos aminoácidos en la región Fc, ya que si se encontrasen en la Fab del anticuerpo, la unión
con éste se vería disminuida debido a un impedimento.
6.4. De los Resultados
6.4.1. De las Placas Inoculadas
Las cepas de Legionella que se inocularon para este estudio se hicieron con un agar
específico para su crecimiento, ya que la bacteria requiere una serie de sustancias que otros
medios no poseen, como L-cisteína, antibióticos o proteínas como la albúmina de suero
bovina (BSA)2, 4, 22. Se denomina agar BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract o Extracto
Tamponado de Levadura y Carbón) con α-cetoglutarato, el cuál tiene la función de estimular
la producción de enzimas bacterianas reductoras de oxígeno8. El color negro del medio se
debe al carbón activo y la levadura es un reservorio de aminoácidos cuyo objeto es ser la
fuente de energía que Legionella necesita para crecer2, 8. Este medio es adecuado para
especímenes de origen no estéril, ya que los aditivos que posee inhiben el crecimiento de otras
bacterias23. El cultivo es el método más sensible dado que crecen tanto legionellas causantes
de la enfermedad como no19, y es válido para muestras de origen ambiental y clínico4.
Dado que las placas de agar-sangre no poseen los requerimientos que demandan para su
crecimiento, las cepas de Legionella no se desarrollan en este medio. Por esta razón, las
muestras ambientales se trabajaron tanto en agar-sangre como en agar Legionella, ya que se
podía controlar en paralelo su crecimiento. Las colonias que al ser analizadas por el test
desarrollado dieron positivas de Legionella, no crecieron en las placas de agar-sangre, lo que
confirmó el resultado de identificación de las mismas.
162
6. DISCUSIÓN
6.4.2. De los Anticuerpos Monoclonales
El objeto del test ha sido desarrollar un método de detección de cultivos de Legionella

basándose en anticuerpos específicos dirigidos a diferentes zonas de la membrana, las cuáles
presentaban diferentes especificidades de género, serogrupo o especie. Para obtener un mejor
resultado se han usado anticuerpos monoclonales (Mab), que proporcionan mayor
especificidad que los policlonales80. El proceso de obtención de Mab es largo, laborioso y
complejo, pero una vez obtenido el clon productor de anticuerpo, este puede multiplicarse
ilimitadamente y posteriormente ser purificado71. El proceso de preparación de los Mab se ha
basado en la técnica desarrollada por Köhler y Milstein en 1975170, los cuáles descubrieron
que era posible la obtención de células híbridas a partir de la fusión de esplenocitos (linfocitos
B) del bazo con células mielomatosas (tumor de las células plasmáticas productoras de
anticuerpos). Demostraron que las células híbridas obtenidas eran inmortales y que de los
híbridos se podían seleccionar los que producían el anticuerpo de interés. Ésta metodología es
hoy ampliamente conocida y puede llevarse a cabo en laboratorios preparados para ello. En el
departamento de Inmunología de Vircell, S.L. se obtuvieron diferentes clones productores de
hibridomas con actividad específica a los antígenos de LPPA o PAL y el de LPS-1 de
Legionella135. Estos hibridomas se han usado para el desarrollo del test inmunocromatográfico
que aquí se describe (ver ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS).
Los Mab específicos para género se obtuvieron a partir de la inoculación en ratones con
antígeno recombinante de LPPA, mientras que los de sg. 1 se L. pneumophila se hicieron con
LPS-1 (LPS de sg. 1 de L. pneumophila). De estas inmunizaciones, finalmente se
consiguieron 6 para LPPA y 9 para LPS-1 y, tras la determinación de la actividad por ELISA,
se dispuso para el test que se pretendía desarrollar de 4 de LPPA (B, C, D y E) y 5 para LPS-
1 (A, E, F, H e I). En función de la subclase de la inmunoglobulina al que pertenecía cada uno
se realizó la purificación del anticuerpo por cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC)171 con una columna de proteína A, ya que esta permite el uso de grandes volúmenes y
Mab altamente purificados172. Las inmunoglobulinas se unen a la proteína A por su región Fc
y se eluyen con variaciones de pH167. Cada inmunoglobulina puede unirse a la columna a un
pH diferente o necesitar de la presencia en distinta medida de sales que aumenten la
conductividad, como la IgG1, que requiere un pH 8.9, NaCl 3M y glicina 1.5 M, ya que la
proteína A tiene poca afinidad por ella y esto favorece su unión172. El resto de
inmunoglobulinas pueden añadirse a la columna de purificación a menor pH173. Para la
163
6. DISCUSIÓN
elución de cada tipo de IgG es necesario un determinado pH, y el tampón citrato 0.1 M, al pH
adecuado, es un medio apropiado, siendo de media en el caso de IgG obtenidas en ratón pH
6.5 (5.5 a 7.5) para IgG1, pH 4.5 (4.5 a 5.5) para IgG2a y pH 3 para IgG2b (3.5 a 4.5) e IgG3 (4
a 7). A continuación hay que neutralizar cada elución, con el fin de preservar su actividad172-
174
, lo que en este trabajo se realizó con TRIS 1 M80. Aunque la producción de Mab
proporciona un único anticuerpo, en el proceso de purificación con columnas con proteína A,
otros materiales, como suplementos del medio o proteínas presentes provenientes de la fase de
fusión, pueden quedarse retenidos en la columna, lo que en un proceso de elución a un único
pH, puede provocar que el anticuerpo purificado se contamine. Debido a esto se recomienda
una elución por gradiente, sobre todo si la IgG tiene poca afinidad por la proteína A174.
En el proceso llevado a cabo en el laboratorio para los Mab con isotipo IgG1 (ver figura
5.2.2.1. Tipo IgG1) se optó por una purificación con gradiente de pH 6→5→4, hallándose
posteriormente que la actividad se encontraba en un solo pico (resultados no mostrados). El
resto de inmunoglobulinas (ver figura 5.2.2.1. Tipos IgG2a, IgG2b e IgG3) se hicieron en un
solo paso, eluyendo a pH 4 para IgG2a y a pH 3 para IgG2b e IgG3. En el caso de los Mab de
LPN (IgG2a) y LPS1 I (IgG3) se eligieron dos fracciones en función de la forma del pico
cromatográfico con las eluciones más concentradas y otro con las menos (ver tablas 5.2.2.1. y
5.2.4.1.) debido a la necesidad de tener dos fracciones (para línea y conjugado), destinando
para línea la de mayor concentración. En el resto de Mab se hizo una única fracción para su
valoración. Los medios de elución fueron por tanto apropiados, ya que en la mayoría de los
casos se encontró actividad en el purificado obtenido. Por este motivo se realizó
posteriormente una prueba de evaluación de actividad por ELISA con placas sensibilizadas
con el Ag para el que se dirigen dichos Mab, eliminándose los que no presentaron actividad
(ver tabla 5.2.3.1.). El criterio usado de mantener el título a 0.1 y 1 µg/ml es puramente
experimental, fruto de los resultados obtenidos en el laboratorio con anteriores proteínas. Si
esta actividad no se mantiene en ambas concentraciones, se ha comprobado que la
funcionalidad de las proteínas no proporcionaba la calidad requerida para diversos ensayos
inmunológicos.
La medida de la A280 se realiza porque es un indicativo del contenido de aminoácidos

aromáticos en la proteína, y por tanto una manera de cuantificarla175, 176
. Los cálculos
realizados son los que se muestran en el apartado 4.2.3.1.3. de la sección Métodos. Los
resultados obtenidos pueden verse en la tabla 5.2.2.1. En cuanto a la determinación de la
164
6. DISCUSIÓN
agregación, la A320 puede considerarse una medida de la misma177, 178. Para poder expresarlo
en porcentaje, la medida de A320 se divide por la A280 y se multiplica por 100.
6.4.3. De la Preparación de Oro Coloidal y la Conjugación de Monoclonales
En el punto 6.3. se han expuesto los parámetros y los estándares que debe cumplir una
solución de oro coloidal para ser considerada de calidad. En el oro preparado para la
realización de los experimentos (ver figura 5.3.1., y tablas 5.3.1. y 5.3.2.), la λmáx está en 520
nm lo que, de acuerdo a los resultados experimentales de Mallick et al.120 y Chaudhuri y
Raychaudhuri124, estaría dentro de los valores apropiados. En cuanto a la relación
A575/A500, es de 0.453, lo que indica que el oro es monodisperso, ya que un valor cercano a
1, muestra más polidispersión al ser un pico mucho más ancho. La A540 es la densidad óptica
(OD) que se toma como valor de concentración del oro y es la base de la OD de los
conjugados que posteriormente se prepararán con él.
Con este oro coloidal preparado y los Mab obtenidos se han realizado las diferentes MPC
a pH 9 como punto de partida (ver tabla 5.4.1. A y figura 5.4.1. A). Geoghegan129 explica
como el pH de pegado al oro para las IgG a valores ácidos provoca una pobre adsorción,
mientras que a valores alcalinos en torno a 10 mejora considerablemente, determinando que el
rango apropiado es entre 7 y 10, mientras que Hermanson132 indica que el mejor pH de
adsorción para anticuerpos es 8 ó 9. Al realizar el estudio de pegado de los Mab al oro
coloidal, pH 9 ha sido ideal en casi todos los casos. En las ocasiones en que así no fue (ver
tabla 5.4.1. B y figura 5.4.1. B), se evaluaron puntos concretos a pH 5 y 7. En los datos
obtenidos se observa como la curva no cae debido a la no estabilización del oro coloidal
(figura 5.4.1. B), encontrándose que a pH 5 y pH 7 los valores no se modifican, por lo que se
consideró que estos Mab no estabilizaban adecuadamente al oro. Aún así, se decidió preparar
los conjugados con estos Mab para su valoración (ver tabla 5.5.1.), tomando como MPC un
valor estándar de 6 µg/ml a pH 9 como el resto de Mab. De estos conjugados sólo pudo
terminarse el de LPS-1 F, ya que para LPS-1 A y LPS-1 E la coagulación fue irreversible.
Para LPS-1 F el conjugado fue muy polidisperso (A575/A500>1). La mala unión podría
deberse a un bajo contenido en los aminoácidos esenciales para la conjugación113, 122, 168, o a
una incapacidad de soportar y estabilizar la doble capa negativa del oro coloidal, provocando
que éste coagule. La MPC para los Mab que pudieron unirse al oro se tomó en general como
165
6. DISCUSIÓN
el segundo valor de estabilización de la curva (ver tabla 5.4.1. A), es decir, cuando la
absorbancia se hizo constante, para asegurar la estabilización del oro coloidal.
6.4.4. De la Determinación del Sistema Óptimo
6.4.4.1. De la Funcionalidad de los Monoclonales
El primer punto a estudiar para todas las líneas que se querían preparar fue valorar la
funcionalidad de los Mab en la membrana y el conjugado, realizándose para ello un ensayo
de cribado que pretendía determinar la reactividad entre ellos.
Se eligió para la línea género (GÉN) el Mab LPPA E en membrana porque fue el que
mostró mejor actividad con el resto de Mab en el conjugado (ver tabla 5.6.1.1. y 5.6.1.2).
Para el caso de la línea con Mab de LPS-1 (SR1), como sólo se disponía de conjugados
de LPS-1 F y H, se valoraron éstos frente al resto de Mab en membrana (ver tabla 5.6.2.1. A y
B). Se obtuvo como resultado que LPS-1 H en línea no funcionaba, mientras que si lo hacía
en el conjugado. Por su parte, el conjugado de LPS-1 F era muy inespecífico, probablemente
debido a su polidispersidad originada por una mala estabilización coloidal, como demostró su
MPC. Esto condujo a la elección de LPS-1 H para el conjugado y el resto de Mab de LPS-1
para la línea.
En cuanto al Mab de la línea de especie (ESP), éste mostró que tanto en conjugado como
en línea funcionaba (ver tabla 5.6.6.1.), pudiéndose así preparar una línea de ESP específica
que permitía por tanto diferenciar el sg. 1 de los serogrupos 2 a 15 en muestras de L.
pneumophila.
6.4.4.2. De la rotura de la Membrana
Tras la determinación de la composición inicial de los sistemas involucrados en el test, se

procedió a la optimización de los mismos. Evidentemente fue necesario un ajuste de las
condiciones de la concentración en línea y de la OD de los conjugados tomados como
iniciales, así como la combinación de los mismos en membrana y conjugado para una óptima
determinación de los antígenos de LPPA, LPS y MOMP de Legionella. En el punto 1.1.3. se
comentaron las características de estos antígenos que se pretendía detectar. Recordando, PAL
o LPPA es un componente soluble de la membrana37, 38, mientras que con el antígeno de LPS-
166
6. DISCUSIÓN
1 ocurre lo contrario, debido a su contenido en lípidos y en enlaces disulfuro44, 50. Por su parte
MOMP requiere de detergentes y EDTA para ser expuesto en la membrana61, 64. La correcta
exposición de dichos antígenos a los Mab conjugados al oro o inmovilizados en la membrana
se convirtió en un punto esencial del desarrollo y optimización del test. Por esta razón se
procedió al estudio de la rotura de la membrana de la bacteria por métodos físicos y
químicos. Scopes179 explica cómo pueden prepararse extractos de bacterias. Entre los
métodos físicos más comunes para producir la rotura de la membrana se encuentran la
sonicación, la prensa de French o el tratamiento con bolas de vidrio180. La rotura física por
sonicación se vio como un método viable para lograr el fraccionamiento de la membrana
celular frente a los demás, debido a la menor manipulación de las muestra y a que el volumen
de las mismas era reducido, ya que el test admitía una determinada cantidad de líquido (~90
µl). Se llevó a cabo la sonicación de las muestras de Escherichia coli y L. pneumophila sg. 1
Philadelphia con el objeto de romper la membrana y exponer mejor los antígenos que en ella
se encuentran. Se estudió primero con la línea de GÉN (ver tabla 5.6.1.3.) y se observó que
mejoraba un poco la señal, pero aumentaba la inespecificidad. Al ser un método que no puede
utilizarse a gran escala por ser tedioso y complejo, así como la necesidad instrumental que su
uso supone, se desestimó y se optó por una rotura química como mejor opción, puesto que
esto permitiría menor manipulación a la hora de la realización del test en el futuro.
La rotura química se vio como una alternativa más fácil a la hora de introducirla en un
procedimiento, pero suponía una tarea compleja debido a que los medios y reactivos tenían
que cumplir la condición de ser estables en el tiempo y no alterar la funcionalidad y
especificidad de las líneas en conjunto. Los métodos químicos incluyen la quelación de
metales con EDTA o EGTA entre 1 y 10 mM, condiciones básicas con baja fuerza iónica,
detergentes no iónicos, disolventes orgánicos parcialmente solubles en agua, altas fuerzas
iónicas o tratamiento con fosfolipasas entre otros179. Normalmente el método final puede
consistir en la combinación de uno o varios de ellos. Se comenzó a estudiar la funcionalidad
de diversos detergentes. Éstos se usan principalmente con proteínas porque permiten su
solubilización. Neugebauer181 explica las diferentes propiedades de los mismos. El hecho de
existir detergentes con distinta carga, hace que sea posible su uso para una gran variedad de
propósitos. La estructura del mismo se ve afectada por el pH, la temperatura, la fuerza iónica
o la presencia de impurezas, lo que por tanto, en función del medio, provocará que tenga un
efecto concreto. Esto indicaba que el medio era importante para el correcto funcionamiento
del detergente en la disolución. Los no iónicos pueden inducir la lisis celular pero son los que
167
6. DISCUSIÓN
mejor mantienen estables las soluciones, mientras que los iónicos son más agresivos y en
ocasiones muy desnaturalizantes179, por lo que era esencial la elección de uno que no
destruyese la proteína y los antígenos de la membrana de forma irreversible. Por todo ello se
estudió una batería de tipos de detergentes y también se probó otro desnaturalizante común, β-
mercaptoetanol, para comprobar si la rotura de la membrana podía realizarse sin tratamiento
con detergentes.
Como puede verse en la tabla 5.6.1.4., diversos detergentes al 1% (p/v o v/v) se

compararon para GÉN frente a la condición no tratada. Se comenzó a trabajar con la muestra
a McFarland 1 (McF1)133, 134 (A600:0.25, ~3x108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml)
para poder normalizar el sistema, y como tiempo de incubación se tomaron 10 minutos a
temperatura ambiente. El resultado puso de manifiesto la acción que el detergente ejercía
sobre la bacteria, ya que al añadirse el tratamiento a la muestra positiva, comenzó a verse algo
más significativamente con Brij® (no iónico), emulfogen (no iónico), Tritón® X100 y X114
(no iónicos), sulfonato de 3-[(3-cholamidopropil) dimetilamonio]-1-propano (CHAPS)
(zwiteriónico), ácido deoxicolato (AD) (aniónico) y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)
(catiónico)181. Mayoritariamente, las mejores señales se obtuvieron con los no iónicos. El β-
mercaptoetanol agregó las partículas de oro de la mezcla de conjugados, por lo que se
descartó su uso. La combinación de algunos detergentes proporcionó una mejora (ver tabla
5.6.1.5.), que dejaba ver una mayor diferencia de intensidad entre la muestra negativa y la
positiva. Una vez comenzado el estudio de la adición de detergentes, se consideró mover otros
factores que también son importantes en la desnaturalización de las proteínas. La temperatura,
el pH o la fuerza iónica, como se ha comentado, fueron algunos de ellos. Se probaron
diferentes temperaturas, ya que esta puede desestabilizar la estructura de la membrana181,
combinándolas con la acción de la mezcla de detergentes sobre el sistema GÉN. El resultado
obtenido mostró que un aumento de la temperatura de incubación con el detergente mejoraba
el efecto del mismo y no hacía que la señal para E. coli fuese inespecífica, como puede verse
en la tabla 5.6.1.6. Esto supuso un avance significativo en el sistema, puesto que la señal se
hizo más visible. En el caso de SR1, la combinación de detergentes y el aumento de la
temperatura de incubación proporcionó un aumento de la señal a 95ºC (ver tabla 5.6.2.2.)
respecto a temperatura ambiente (ver tabla 5.6.2.1.), mientras que los detergentes provocaron
fondos con la muestra de E. coli como se observa en la tabla 5.6.2.2. El análisis de estos por
separado reveló que la falsa señal positiva en la muestra negativa se debía a la combinación
de los mismos (ver tabla 5.6.2.3.). Esto indicaba que lo que mejoraba a GÉN no lo hacía con
168
6. DISCUSIÓN
SR1 en estas condiciones, motivo por el cual con el sistema de Mab para cada línea bastante
definido se comenzó el estudio en paralelo de ambas líneas. Manteniendo como base CTAB,
que había ido mejor para GÉN, se realizaron de nuevo estudios de mezclas con AD, Brij®, N-
laurilsarcosina (NL) (aniónico), Nonidet P-40 (NP40) (no iónico), sodio dodecilsulfato (SDS)
(aniónico) y Tween® 20 (T20) (no iónico), manteniendo la incubación con 95ºC que mejoraba
la señal. Sin embargo la mezcla en el medio de incubación con CTAB de estos detergentes
producía fondos en una u otra línea en función del detergente (ver tabla 5.6.3.1.), aunque la
mejor combinación fue con no iónicos. Esto propició que se estudiasen otras condiciones.
Manteniendo el CTAB y la incubación con temperatura se probó el uso del antibiótico

sulfato de polimixina-B (PMB). Este antibiótico es fuertemente catiónico y produce la
desestabilización de las membranas citoplasmáticas induciendo la formación de poros en las
paredes celulares en bacterias Gram-negativas al unirse al lípido A del LPS148-150. Se pensó en
su utilidad debido a que se habían obtenido resultados bastante positivos con un detergente
catiónico y, por tanto, la posible acción sinérgica de ambos podía ser importante para el
sistema. Por su parte PMB, al ser un antibiótico, serviría para inactivar a Legionella en la
manipulación con muestras vivas, hecho que efectivamente ocurrió ya que tras la inclusión en
las muestras éstas no volvían a crecer en agar Legionella. La adición de altas cantidades de
PMB a la muestra negativa (E. coli) y a la positiva (L. pneumophila sg. 1) a McF1 provocaba
un aumento de los falsos positivos en SR1 como puede verse en la tabla 5.6.3.2., pero la
adición de la misma cantidad de PMB a las muestras con el detergente reducía esta señal
inespecífica (ver tabla 5.6.3.4.) y además, mejoraba la respuesta para GÉN (ver tabla 5.6.3.3.).
Anteriormente se había estudiado para la línea de GÉN el uso de NaCl con el fin de
aumentar la fuerza iónica del medio, así como el cambio del pH, con el objetivo de ver si la
actividad mejoraba181. También se estudió la posibilidad de eliminar el developer que se
añadía para que la muestra pudiese correr por la membrana, ya que éste poseía detergentes
como T20 que, además de permitir fluir la reacción, puede ayudar a evitar reacciones
inespecíficas161. De este estudio se concluyó que el medio a pH 7.2 era mejor para la
sensibilidad que a pH 8, como se observa en la tabla 5.6.1.7., y que una concentración de
NaCl 150 mM no afectaba a las señales y podría incluirse en el medio si fuese necesario
aportarle fuerza iónica (ver tabla 5.6.2.4.). De hecho, como puede verse en la tabla 5.6.3.4., la
señal de la línea GÉN y la línea SR1 mejoró al poner en el medio el detergente no iónico T20
y NaCl, así como el antibiótico PMB, por lo que el CTAB pudo descartarse por ofrecer peores
169
6. DISCUSIÓN
resultados. La combinación de NaCl, T20 y PMB produjo como resultado una señal
equiparable en GÉN y SR1 con 5 y 10 µl de PMB (ver tabla 5.6.3.5. A) y la ausencia de falso
positivo, aún incluso cuando la muestra era el doble de cantidad (McF2, ~6x108 UFC/ml),
como se puede ver en la tabla 5.6.3.5. B. Observando los resultados, se deduce que a mayor
cantidad de PMB añadida al medio, más específico se hace el sistema, hasta lo que parece una
saturación, ya que el cambio de 5 a 10 µl no lo altera, mientras que el paso de 1 a 2.5 o de 2.5
a 5 µl es acusado. El medio NaCl-T20-PMB (NTP) era bastante eficiente. Esto estaría de
acuerdo con la hipótesis inicial del uso de una sustancia catiónica para la mejora del sistema y
el hecho de que PMB se una al LPS148, 150, ya que probablemente lo expone de manera más
apropiada y esta acción, combinada con los detergentes que rompen la membrana, puede
favorecer su reacción con los Mab del conjugado o de la línea.
6.4.4.3. De las Condiciones de Reacción
El aumento del volumen de muestra se estudió previamente para la línea GÉN (ver tabla
5.6.1.7.), tanto a TA como a 95ºC, viéndose que éste correlacionaba con un incremento de la
señal y que a 95ºC era mayor que a TA. El uso de un developer estándar con detergentes,
como ya se ha comentado, se debió a la necesidad de que la muestra pudiese fluir por la
membrana de la tira, ya que debido a la hidrofobicidad de ésta, se ve favorecido el flujo con el
uso de detergentes y surfactantes101, 163. Al incluir T20 al medio, que era el mismo detergente
que llevaba el developer utilizado, podía fluir por la membrana como lo había hecho hasta
ahora. Además, se había demostrado su utilidad en la rotura de la membrana celular. El
developer también llevaba sales en el medio, por lo que tamponar el diluyente de la muestra
era una manera de eliminar definitivamente la solución desarrolladora, haciendo el test mucho
más sencillo de ejecutar. Un volumen de 90 µl correspondía a 40 µl más dos gotas de
developer, por lo que se adoptó este volumen para el test. Se probaron volúmenes superiores
pero excedían la capacidad de retención del pad de muestra. El volumen necesario debe ser al
menos el que permita redisolver los reactivos de los diferentes pads que se rehidratan con la
muestra y luego sea capaz de fluir por la membrana182. En este caso, los 40 µl de muestra
iniciales más 2 gotas de developer con T20 lo permitían, así como el cambio al medio con
T20 y 90 µl totales. El resultado puede verse en la tabla 5.6.3.6. y muestra que efectivamente
el developer podía eliminarse, ya que el resultado era equivalente a 40 µl más 2 gotas como se
observa en la tabla 5.6.3.5. A. El volumen de muestra a añadir también se relaciona con la
configuración del strip y el solapamiento de los componentes inmunocromatográficos. Si
170
6. DISCUSIÓN
estos, como ya se ha comentado anteriormente en el punto 6.3, no se colocan apropiadamente

el flujo no será el adecuado101, 160
aunque se aumente la cantidad de muestra, ya que el
problema se debería a un error en el montaje que impediría la evolución adecuada del frente
de reacción y podría afectar a la sensibilidad.
La nueva cantidad de muestra y la incubación con calor eran factores que a priori
mejoraban el sistema para ambas líneas. El medio común NTP proporcionó resultados
favorables. La adición de más cantidad de PMB con 90 µl de muestra no pareció mejorar ya
que en la línea GÉN aparecían fondos, como se observa en la tabla 5.6.3.7. El estudio entre la
incubación a 5 minutos a TA y 10 minutos (5 minutos a TA + 5 minutos a 95ºC) aseguró que
un mayor tiempo mejoraba la señal (ver tabla 5.6.3.2.).
Con este nuevo medio común NTP se estudió el tiempo de reacción y la procedencia
de la muestra. El tiempo estimado del test fueron 15 minutos, pero aumentarlo por ejemplo
al doble mejoró la señal (ver tabla 5.6.3.8.), por lo que se tendría en cuenta si fuese necesario.
El tiempo de reacción es un factor que dependerá del tamaño de poro de la membrana, de los
detergentes y surfactantes que lleven los reactivos o de la propia configuración del casete101,
por lo que es un parámetro que debe determinarse experimentalmente. Otro factor que se
evaluó fue la procedencia de la colonia, en concreto bacterias procedentes de placas
inoculadas, con el objetivo de comparar los resultados con los de muestras inactivadas por
calor, como hasta ahora se habían usado los cultivos de L. pneumophila sg. 1 analizados en el
diseño del test. Se realizó a diferentes tiempos de lectura y con distintas cantidades de muestra
(1, 2 y 3 col/200 µl). El resultado puede verse en la tabla 5.6.3.9. El análisis de colonias vivas
recogidas de una placa inoculada proporcionaba los mismos resultados que con las
inactivadas por calor, lo que significaba que la rotura de la membrana de la bacteria con el
medio NTP funcionaba con las colonias vivas y era eficaz, además de que la señal obtenida
no se debía a una posible rotura o desestabilización de la membrana por el calentamiento.
Esto permitió el análisis de gran cantidad de muestras y su almacenamiento para poder
evaluarlas en el tiempo.
6.4.4.4. De la Evaluación Inicial del Test
Con las condiciones desarrolladas (medio común NTP para GÉN y SR1, incubación de la
muestra con calor (95ºC) y 15 minutos de desarrollo del test) se evaluaron muestras de L.
pneumophila serogrupos 1 a 15 y Legionella no pneumophila procedentes de colecciones de
171
6. DISCUSIÓN
ATCC, NCTC y DSMZ (grupo I), así como muestras aisladas clínicamente (grupo III). Para
la línea de SR1 todas las muestras salvo L. pneumophila sg. 1 debían ser negativas, mientras
que para GÉN todas excepto los cultivos de muestras no Legionella tendrían que ser positivas.
El resultado fue el que se puede observar en las tablas 5.6.3.10., 5.6.3.12. y 5.6.3.14. Las
muestras de Legionella para GÉN eran positivas excepto para L. bozemanii sg. 1 y 2, y L.
gormanii (ver tabla 5.6.3.14.) y negativas para muestras no Legionella pero con sombras,
mientras que en SR1 había numerosas señales inespecíficas o sombras, como se observa en la
tabla 5.6.3.10. Esto indicaba algún tipo de reacción no específica estaba interfiriendo en el
sistema. Una metodología común en inmunocromatografía es el bloqueo de pads de
muestra, ya que es una forma efectiva de evitar reacciones inespecíficas. De hecho es
preferible el bloqueo del pad de muestra al de la membrana101, que aun siendo en muchos
casos más efectivo, puede provocar la desorción de la línea de captura o un descenso en la
capacidad de flujo de la membrana108. Como explican Mansfield162, Butler161 o Jones163, entre
los medios de bloqueo más comunes se encuentran agentes tamponadores de la disolución,
sales, surfactantes, polímeros o proteínas como BSA, caseína o suero de ternera. De ellos la
caseína ha demostrado que es una de las más eficientes en sistemas de lateral-flow, debido a
que las moléculas de pequeño peso molecular de la misma se introducen entre las grandes
moléculas de los receptores de estos bloqueantes. El bloqueo del pad de muestra es
relativamente fácil respecto a la membrana, y existe el problema de que a largo plazo, la
proteína bloqueante pueda llegar a desplazar a la molécula de interés adsorbida en la
membrana101. Por este motivo se decidió probar a bloquear el pad de muestra con caseína y
NaCl para darle fuerza iónica, lo cual supuso una bajada drástica de los fondos de la reacción
(ver tablas 5.6.3.11.) para SR1 y 5.6.3.13. para GÉN), introduciéndose así este elemento en la
configuración del test.
6.4.4.5. De la Solución de Problemas en Línea Género y Serogrupo 1
Tras la evaluación inicial de las muestras, se observó que la línea GÉN no era capaz de
reconocer a las cepas de colección L. bozemanii sg. 1 y 2 y a L. gormanii, mientras que la
línea SR1 no detectaba al grupo no Pontiac: L. pneumophila sg. 1 Camperdown, L.
pneumophila sg. 1 Heysham, L. pneumophila sg. 1 Oxford, L. pneumophila sg. 1 OLDA y L.
pneumophila sg. 1 Bellingham (CHOOB), como se observa en la tabla 5.6.3.14.
172
6. DISCUSIÓN
Respecto a las muestras problemáticas para GÉN, Moon et al.38 estudiaron la

diversidad antigénica de PAL, obteniendo antígenos solubles de 16 especies de Legionella
diferentes que analizaron con Mab obtenidos con antígeno de PAL recombinante clonado a
partir de L. pneumophila sg. 1. Los resultados mostraron que no todos los Mab eran capaces
de reconocer todas las cepas, ya que cada Mab seleccionado tenía un patrón distinto de
reactividad, debido probablemente a la compleja naturaleza antigénica de PAL. Esto estaría
de acuerdo con los resultados obtenidos, lo que hizo pensar en que quizás los Mab
seleccionados no eran reactivos frente a los epítopos existentes. Para comprobar si esta
hipótesis era cierta o no, se realizaron ensayos de Western-blot, de ELISA y de
inmunofluorescencia. El resultado por Western-blot mostró que el Mab LPPA B no reconocía
a dichas cepas, pero el resto de Mab de LPPA lo hacían en mayor o menor grado (ver figura
5.6.4.1.), luego los Mab del sistema combinados entre sí deberían ser capaces de reconocerlas,
aunque no lo eran en el sistema inmunocromatográfico. Cascales et al.32 comentan que el
antígeno de LPPA (o PAL) pertenece a un sistema de envoltura de la membrana denominado
Tol-Pal, que se encarga de mantener la integridad de la misma39. En dicho trabajo, el
aislamiento de LPPA para su cuantificación in vivo e in vitro muestra que este antígeno forma
dímeros. En el Western-blot llevado a cabo (ver figura 5.6.4.1.) puede comprobarse la
existencia de una banda de aproximadamente el doble de tamaño de la de LPPA original de
19 kDa, pero que sólo es reconocible en L. longbeacheae sg. 1 y prácticamente nada en L.
bozemanii sg. 1 y 2, ni en L. gormanii. Dicha banda es reconocida por los Mab de LPPA
probados: B (en LLs1), C (en LBs2, LG y LLs1), D (en LLs1) y E (LBs1 y LBs2). Esto
podría quizás indicar que estas legionellas problema no formarían este dímero o lo harían en
menor proporción y quizás ello pueda ser uno de los motivos por el cual no son reconocibles
como el resto, aunque es una hipótesis que hubiese necesitado un estudio más en profundidad
en su momento. En el ensayo de ELISA todos los Mab dieron positivo con al menos algunas
de las cepas analizadas, como se observa en la tabla 5.6.4.1., mientras que en el ensayo de
inmunofluorescencia sólo el Mab de LPPA C dio con las cepas problemáticas, como puede
verse en la tabla 5.6.4.2. Por tanto, el método inmunocromatográfico parecía que no era
completamente eficiente.
Se procedió de nuevo al estudio de rotura por métodos físicos. Numerosos autores han
publicado evaluaciones de rotura de membranas por tratamiento con bolas de vidrio con183-185
o sin éxito186. En las cepas de Legionella problemáticas para la línea GÉN probadas, el
resultado obtenido fue nuevamente la ausencia de señal, como puede verse en la tabla 5.6.4.3.
173
6. DISCUSIÓN
Mayor cantidad de bolas de vidrio (ver tabla 5.6.4.4.) o un protocolo con calor (ver tabla
5.6.4.5.), o con una agitación más agresiva o durante un mayor periodo de tiempo (ver tabla
5.6.4.6.), no mejoró los resultados, motivo por el cuál se siguió insistiendo en el método de
rotura químico, que hasta el momento era el que mejor resultados había dado. Se probó de
nuevo el detergente CTAB, que parecía haber mejorado la línea GÉN, pero se vio que a
mayor cantidad del mismo la señal disminuía también en GÉN (ver tabla 5.6.4.7.), como lo
había hecho en SR1 y por este motivo se descartó definitivamente. Se decidió estudiar
entonces de nuevo el pH del medio, ya que anteriormente se había observado que la adición
de NaCl y pH 7.2 habían favorecido la reacción (ver apartado 6.4.4.2. y tabla 5.6.1.7.). El pH
de la mezcla de reactivos NTP era aproximadamente de 4.5, por lo que se preparó NTP con
Borax 50 mM a pH 9 (BNTP) y NTP con fosfato 50 mM a pH 7.2 (FNTP) y se probó en
paralelo a NTP. El resultado puede verse en la tabla 5.6.4.8., dónde se muestra que a pH 9 las
muestras positivas incluso empeoraban mientras que a pH 7.2 eran similares. Con el medio
tamponado se analizaron las legionellas que habían dado problema (tabla 5.6.4.9.) y éstas
resultaron ser positivas. Según los procedimientos generales de preparación de anticuerpos, el
pH ácido no les favorece80, por lo que se neutralizan con TRIS 1 M. La reacción se estaba
produciendo a este pH ácido (~4.5), lo que estaría provocando que estos Mab no estuvieran
funcionales al cien por cien, ya que el cambio ocurrido al modificar el pH tamponando fue
muy importante
En el caso de las muestras problemáticas para SR1, para saber si los Mab tenían la
capacidad de reconocerlas, se prepararon unos porta-objetos para inmunofluorescencia
sensibilizados con E. coli como control de L. pneumophila negativo y L. pneumophila sg. 1
Knoxville como control positivo, y el grupo no Pontiac CHOOB (cada una en un pocillo
diferente). Se analizaron con los Mab de LPS-1 y se observó que con el Mab que iba en el
conjugado, LPS-1 H, daban negativas (ver tabla 5.6.5.1.), por lo que aunque los Mab que se
encontraban en la membrana si lo hubieran hecho, al no hacerlo el Mab del conjugado, el
sistema daba por tanto negativo. El problema estaba en que los Mab de la membrana se
encontraban ahí porque no se pudieron conjugar o eran inespecíficos una vez conjugados (ver
tabla 5.6.2.1. y 5.6.5.2. y 5.6.5.3.). Fue necesario analizar otros Mab disponibles y que no se
habían considerado ni crecido debido al número elevado de Mab inicialmente procesados. Se
analizaron por inmunofluorescencia dos nuevos hibridomas: LPS-1 I y LPS-1 G. Se
sensibilizaron porta-objetos con diferentes cepas positivas de L. pneumophila sg. 1 y
negativas (E. coli y P. mirabilis), y se observó que el Mab de LPS-1 I si daba señal con las
174
6. DISCUSIÓN
cepas positivas, mientras que no lo hacía con las negativas, como se muestra en la tabla
5.6.5.4. En el caso de LPS-1 G no se obtuvo señal positiva para ningún pocillo de las
legionellas problemáticas, descartándose su uso. Este Mab LPS-1 I se procesó como el resto y
se evaluó en membrana y conjugado y, como puede observarse en la tabla 5.6.5.5., daba señal
positiva con las muestras del grupo CHOOB, por lo que se tituló y ajustó para su uso tanto en
membrana y conjugado ya que era necesario en ambos lados. Dado que cada Mab se une a
una región concreta del antígeno y no a la molécula entera del mismo187, el Mab LPS-1 H no
debía de reconocer el epítopo o los epítopos existentes en LPS-1 necesarios y
complementarios a los reconocidos por los Mab LPS-1 A, E y F que se encontraban en la
línea. El Mab de LPS-1 I por tanto sí se unió a los epítopos necesarios para que la señal fuese
positiva. Entre los diferentes isotipos de IgG pueden existir diferencias en la función efectora
de los mismos147, 188-190, por lo que al ser LPS-1 H del subtipo IgG2b y los Mab LPS-1 A, E, F
e I del subtipo IgG3, podría estar indicando que éste último es más reactivo con LPS-1 que el
IgG2b. Una observación acerca del Mab de la ATCC que reconoce L. pneumophila sg. 1
(monoclonal Lp1 MAB 1 CRL-1765TM, http://www.lgcstandards-atcc.org/) del isotipo IgG3,
se produjo al obtener estos resultados. Este Mab de la ATCC está preparado a partir de una de
las legionellas problemáticas pertenecientes al grupo no Pontiac CHOOB y negativas al Mab
3/1 (L. pneumophila sg.1 OLDA) lo que es de gran interés, porque es precisamente el grupo
que no se detectaba con el Mab LPS-1 H (IgG2b) y que si ha sido posible con el Mab LPS-1 I
(IgG3). Esto podría indicar que para la detección del LPS-1 de Legionella serían necesarios
mayoritariamente isotipos IgG3 frente a otros, sobre todo en muestras ambientales o
nosocomiales donde son más frecuentes las legionellas tipo no Pontiac.
6.4.4.6. De la Línea de Especie
El hibridoma que su usó en la preparación de Mab para la línea de especie (ESP) se

67
adquirió a la ATCC (HB8472). Gosting et al. describieron un anticuerpo que reaccionaba
con un antígeno común a todas los aislados de L. pneumophila evaluados, pero que estaba
ausente en el resto de legionellas de otra especie estudiada, resultando ser MOMP, como
Nolte y Conlin64 demostraron. Este Mab se designó como LP3IIG2. Su utilidad por tanto
debía ser para reconocer los serogrupos 1 a 15 de L. pneumophila, permitiendo entonces tener
una línea para diferenciar sg. 1 de serogrupos 2 a 15.
175
6. DISCUSIÓN
Tal y como se había hecho con los anteriores Mab, se conjugó al oro y se dosificó en
membrana. Cuando se recibió dicho Mab ya se habían desarrollado las líneas de GÉN y SR1
por lo que se partió de los métodos y los reactivos desarrollados para éstas. Se comenzó
viendo la funcionalidad del Mab con la muestra tratada y sin tratar y, como se observa en la
tabla 5.6.6.1., con la muestra no tratada el resultado no fue adecuado, mientras que con el
tratamiento mejoraba, aunque no era apropiado para todas las muestras positivas (tabla
5.6.6.2.), ya que por ejemplo con L. pneumophila sg. 6 y sg. 13 la respuesta fue negativa. Se
pasó al estudio de la rotura por métodos químicos. Nolte y Conlin64 o Gosting et al.67 entre
otros33, 60, 151
, comentan que para la total exposición de dicho antígeno de membrana se
recomienda el uso de EDTA y detergentes por lo que se estudió la adición de este compuesto
al medio NTP. González Sosa et al.33 utilizaron concentraciones de 5 y 10 mM de EDTA
mientras de Gosting et al.67 usaron EDTA 100 mM, en sus respectivos experimentos. En
nuestro caso se eligió EDTA 10 mM como punto de partida ya que 100 mM se consideró una
concentración elevada, puesto que con 5 y 10 mM se había demostrado previamente la
extracción33. Con 10 mM de EDTA (tabla 5.6.6.3.) se eliminaban los fondos en la muestra
negativa en el medio sin tamponar NTP, pero la respuesta era mucho menor, aunque la señal
inespecífica de NTP era igual a la de la muestra positiva, por lo que en realidad el valor
obtenido con FNTP era un buen resultado, ya que era negativa para E. coli y daba algo de
señal para L. pneumophila sg. 1. Otro de los factores que recomendaban estos autores era el
uso combinado de detergentes y EDTA, indicándose para ello detergentes aniónicos como el
ácido deoxicolato (AD) o N-laurilsarcosina (NL)60, 67. Se comenzó estudiando la mezcla
EDTA-AD comparando con los componentes por separado, y se comprobó que la mezcla
funcionaba mejor que ambos individualmente (tabla 5.6.6.4.). Se analizó menor cantidad de
EDTA, manteniendo la proporción de AD y también con el medio FNTP, viéndose
nuevamente que la combinación de EDTA-AD era la mejor opción, pero que podía ir
combinada con el medio FNTP, que por su cuenta no aportaba una solución, pero que junto a
estos reactivos no interfería en la reacción (tabla 5.6.6.5.). Por otro lado, la adición de mayor
cantidad de AD a la mezcla EDTA-AD no proporcionaba un aumento de la señal (tabla
5.6.6.6.). El siguiente paso fue ver el otro detergente recomendado. Se probó al mismo tanto
por ciento que se había hecho con AD y superiores y con EDTA 1 mM, que pareció ir bien en
las pruebas anteriores. El detergente NL sólo no funcionó (ver tabla 5.6.6.7.) mientras que
combinado con EDTA dio buenos resultados (ver tabla 5.6.6.8.), mejorando los obtenidos con
AD. Se determinó que entre 2 y 4 % de NL junto con EDTA 1 mM en el medio de reacción
era eficiente para conseguir la exposición de MOMP en la membrana y permitir que el Mab
176
6. DISCUSIÓN
LP3IIG2 reconociese a dicho antígeno. Como ya se había desarrollado el medio común para
las líneas GÉN y SR1, se pensó en la adición de EDTA y NL al pad de muestra para
eliminarlo del medio101, 161, 162, 164
. Se probaron diferentes cantidades de NL manteniendo
EDTA y se analizó con medio FNTP (ver tabla 5.6.6.9.), encontrándose que la cantidad de NL
en el pad podía se mucho menor que en el medio líquido y que además era posible su uso en
el mismo. Esto permitió un contacto directo de la muestra con los agentes bloqueantes. Con
estas condiciones se probaron algunas cepas de L. pneumophila obteniendo un resultado muy
positivo, debido a que las muestras negativas E. coli y Salmonella no daban señal, mientras
que L. pneumophila sg. 1 Oxford y Philadelphia, así como L. pneumophila sg. 5 si lo hacían
claramente, como se observa en la tabla 5.6.6.10.
6.4.4.7. De los Resultados con el Sistema Inmunocromatográfico Final
6.4.4.7.1. De la Unión de las Líneas
Una vez obtenida las condiciones de cada línea, se analizaron diversas muestras de
colección (grupo I) (ver tabla 5.6.7.1.) y se vio que las líneas funcionaban correctamente con
sus pads de muestra bloqueados correspondientes y con el medio FNTP común. El aumento
del tiempo y la temperatura de incubación (ver tablas 5.6.7.2. y 5.6.7.3.) permitieron
eliminar el doble paso de incubación a TA y a 95ºC, lo que simplificó el protocolo a seguir,
quedándose en una única incubación a 95ºC que favorecía el resultado. La optimización del
sistema continuó con el estudio de la unión de líneas en un mismo strip, por lo que se planteó
la posibilidad de juntar las líneas de SR1 y ESP, ya que ambas se referían a L. pneumophila,
mientras que se tendría otra tira para la línea GÉN, que era común para todas las legionellas.
Se combinaron pads de muestra con líneas y conjugados y se vio que la unión de conjugados
y pads para SR1 y ESP era posible (ver tabla 5.6.7.4.) ya que el pad con EDTA y NL no
afectaba a la señal de SR1 y la de ESP se mantenía con la mezcla de ambos conjugados.
De nuevo se estudiaron con el sistema colonias vivas a distintos tiempos (15 y 30

minutos) procedentes de placas inoculadas, tal y como se realizaría el test, obteniendo que con
15 minutos era suficiente para alcanzar una buena señal, ya que con 30 minutos no mejoraba
demasiado, como se observa en la tabla 5.6.7.5. Como las muestras se utilizaron a McF1 en
el desarrollo y las procedentes de las placas presentaban mayor turbidez, se analizaron
muestras negativas a McF4 (A60: 0.6-0.7, ~12x108 UFC/ml). No se produjeron resultados
177
6. DISCUSIÓN
inespecíficos a mayor cantidad de muestra, como puede verse en el tabla 5.6.7.6. El sistema
quedó por tanto como se muestra en la tabla 5.6.7.8.
6.4.4.7.2. Del Sistema Final
Con el sistema inmunocromatográfico puesto a punto se comenzó el análisis de

muestras. Se usó una concentración en las mismas de McF1 (A600:0.25) que era equivalente
a ~3x108 UFC/ml133, 134 con el objetivo de normalizar todas las muestras y forzar al sistema
con máxima sensibilidad, ya que el protocolo a partir de cultivos vivos se realizaba con 2
colonias de entre 1 y 3 mm, que proporcionaba más turbidez al medio, indicando que había
mayor cantidad de UFC/ml en el mismo. El tipo de resultados obtenidos es el que se puede
ver en la figura 5.7.1., que muestra las diferentes bandas que pueden obtenerse. Para todos
ellos se puede observar la línea control en la parte superior del strip en ambos lados, e indica
que el test se ha ejecutado correctamente. Su ausencia en una muestra invalida el resultado de
la misma (ver tabla 5.7.1.). La posición de dichas líneas puede verse en la figura 6.4.4.7.2.1.
Figura 6.4.4.7.2.1. Posición de las bandas en los strips.
Cuando la muestra es una Legionella sp., el resultado es el que se obtiene en el caso A de

la figura 5.7.1., siendo por tanto positiva sólo la línea de GÉN y la línea control. Cuando se
trata de una muestra de L. pneumophila sg. 1 el resultado es el que se observa en la figura
5.7.1. B donde todas las bandas son positivas. Si es L. pneumophila, pero no del sg. 1, el
resultado es el que se muestra en la figura 5.7.1. C, donde las líneas de GÉN y de ESP
muestran color, pero no la de SR1. Finalmente, cuando sólo aparecen las líneas control, es
indicativo de que la muestra no es del género Legionella, y esto es lo que puede verse en la
figura 5.7.1. D. Cuando una muestra es L. pneumophila sg. 1, la línea de ESP es también
positiva debido a que el Mab de la ATCC reconoce a MOMP que se encuentra en todas las L.
60, 64
pneumophila , como ya se ha comentado. Este resultado obtenido se ve confirmado con
178
6. DISCUSIÓN
doble línea de detección para L. pneumophila sg. 1, que es la de mayor interés en el

diagnóstico, ya que el 70-80 % de los casos de neumonía severa causados por L. pneumophila
se deben a este serogrupo2. Como ya se comentó en el apartado 1.2. del capítulo Introducción,
otros serogrupos distintos al sg. 1 de L. pneumophila e incluso otras especies de Legionella
pueden causar enfermedad1, 21, por lo que es interesante poder diferenciar los serogrupos
presentes en una muestra. En algunas zonas geográficas unas especies son más frecuentes y
causantes de LD que en otras4, pero sin embargo la mayoría de los test de detección de
Legionella existentes se dirigen casi exclusivamente al sg. 1 de L. pneumophila o a la
detección de L. pneumophila sin distinguir entre serogrupos. Este es el caso de otras
inmunocromatografías existentes en el mercado que usan Mab específicos contra el gen mip
pero que únicamente pueden diferenciar simultáneamente Legionella sp. y L. pneumophila sin
realizar una distinción del serogrupo. Otros test basados en reacciones de aglutinación con
partículas de látex, como el test usado como referencia para el grupo II, son capaces de hacer
esta distinción de serogrupos pero para ello es necesaria la realización de tres ensayos
diferentes. El test diseñado y evaluado en este trabajo consigue unificar estos requisitos en un
solo ensayo aportando por tanto una ventaja significativa a las opciones similares existentes.
Los diferentes grupos de muestras fueron: I) 42 muestras de colección procedentes de la

ATCC, NCTC y DSMZ; grupo II) 141 muestras ambientales provenientes de 64 muestras de
aguas y III) 28 aislados clínicos. Para el grupo I se inocularon placas con las cepas de
colección por lo que sólo hubo una especie por placas. En el caso del grupo II, de mayor
interés y representativo del trabajo de laboratorio en análisis de aguas, las colonias pueden
verse en el ANEXO RESULTADOS, donde se describen y muestran. Para el grupo III las
muestras fueron aisladas y caracterizadas en el Hospital Neurotraumatológico de Jaén
recibiéndose en Vircell, S.L. las placas con aislamientos, teniendo por tanto sólo una especie
en la misma. Estas muestras preparadas a McF1 fueron analizadas con el test bajo evaluación
siguiendo el protocolo que se había establecido para ello. Las fotos de las muestras positivas
pueden verse en la tabla 5.7.2. y las lecturas en la 5.7.3., donde se muestran las lecturas
visuales y su interpretación, así como los resultados obtenidos con los métodos de referencia.
En la tabla 5.7.2. se observa que todas las líneas control aparecieron, indicando que el flujo y
el término de la reacción se llevaron a cabo de manera adecuada y que las líneas mostraron un
buen rendimiento al no obtenerse formas incompletas o huecas. Esto es importante como
comenta Jones108, 164 y que se ha explicado anteriormente en el apartado 6.3.
179
6. DISCUSIÓN
En la tabla 5.7.3. se puede comprobar que para el grupo I, las 42 muestras de Legionella
fueron correctamente clasificadas, así como para los aislados clínicos del grupo III. En el caso
del grupo II se usó como referencia el Legionella Latex Test (Oxoid, UK). Una muestra
ambiental clasificada por este látex como L. pneumophila sg. 1, para el test
inmunocromatográfico era L. pneumophila serogrupos 2 a 15 (muestra 3187.1 (posición 157
de la tabla 5.7.3.)). Esta muestra fue analizada por un test de ELISA comercial (Bartels
ELISA Legionella Urinary Antigen (Bartels, Ireland)) junto a otras cepas de colección como
controles y el resultado para dicha muestra fue negativo. También se realizó un ensayo de
inmunofluorescencia, en el que las mismas cepas usadas como muestra en el ELISA
comercial, se sensibilizaron en porta-objetos y se analizaron con los Mab de LPS-1 que se
habían usado en el test, el anticuerpo anti L. pneumophila sg. 1 Lp1 MAB 1 de la ATCC
(CRL-1675TM, isotipo IgG3) así como con un anticuerpo policlonal de conejo anti LPS-1
desarrollado en el laboratorio. Por ambos ensayos la muestra problemática fue negativa, como
puede verse en la tabla 5.8.1. Esto podría indicar que el Legionella Latex Test (Oxoid, UK)
pudo proporcionar un resultado erróneo en este caso.
La tabla de doble entrada con el resumen de los resultados por grupos para las
diferentes líneas en función de si la muestra es género Legionella, L. pneumophila sg. 1 o
serogrupos 2 a 15, se presenta en la tabla 5.7.4. En la 5.9.1. se pueden ver las tablas de doble
entrada para todas las líneas por grupos y líneas, y la tabla 5.9.2. lo muestra globalmente. Un
primer análisis de los resultados presenta una clasificación muy acertada de las muestras. En
cuanto al grupo I, en el que las muestras vienen determinadas por la ATCC, NCTC o DSMZ,
lo único que se podía esperar era un resultado coherente a la especie existente en la placa
inoculada con dichas cepas. Los Mab de LPPA funcionaron apropiadamente, indicando con
total seguridad que estos cultivos fueron caracterizados correctamente, siendo por tanto LPPA
un marcador excelente del género de la bacteria, como se comentó anteriormente respecto a
los resultados de Rojas et al.135 (no publicados) o Kim et al.37 (ver apartado 6.1.). En adición,
los Mab de LPS-1 y el Mab de la ATCC que se encuentra en la línea de especie, clasificaron
igualmente bien las muestras demostrando su validez como marcadores de sg. 1 y serogrupos
2 a 15 respectivamente.
En la tabla 5.9.3. se exhiben los diferentes parámetros estadísticos calculados a partir de

las tablas de doble entrada realizadas con los resultados obtenidos. La sensibilidad es
prácticamente del 100 % si no se obvia el resultado negativo obtenido frente al método de
180
6. DISCUSIÓN
referencia. Esta muestra reanalizada con un ensayo de ELISA comercial y con ensayos de
inmunofluorescencia realizados en el laboratorio proporcionó un resultado negativo a L.
pneumophila sg. 1, indicando que quizás el látex de referencia podía haber producido un
resultado erróneo, cómo ya se ha comentado. Si esta muestra se omitiese del cálculo la
sensibilidad estaría en el 100%. En el caso de la especificidad, el rendimiento del test fue muy
bueno debido a que no se obtuvo ningún falso positivo. Este resultado fue apoyado con el
crecimiento en paralelo de las colonias obtenidas en las muestras de aguas en agar-sangre, ya
que se encontró que las colonias que habían crecido en agar Legionella y que daban positivo
para Legionella no crecían en dicho agar sangre. Los valores predictivos representan la
probabilidad de identificar correctamente los casos positivos (valor predictivo positivo, VPP)
o negativos (valor predictivo negativo, VPN)141, 143 y en este caso para VPP esta probabilidad
es del 100% mientras que para VPN es del 100% para género y especie, pero del 99.4% para
la línea de serogrupo 1. Este resultado es muy positivo ya que con casi un 100% de
probabilidad se estarían clasificando correctamente todos los especímenes. Las tasas de
verosimilitud también se relacionan con la probabilidad de la respuesta141, pero en este caso
respecto a la ausencia o presencia de la condición. La tasa de verosimilitud positiva (LRP)
tiende a infinito para todas las líneas, mientras que la tasa de verosimilitud negativa (LRN) es
0 para género y especie y casi 0 para la línea de serogrupo 1, indicando dichos resultados que
tanto la sensibilidad como la especificidad del test son elevadas. Como medidas de exactitud
del test se han calculado la exactitud (AC) y el índice de Youden (γ). El valor ideal para un
clasificador en ambos parámetros es 1. Para el test desarrollado, el valor de AC y de γ es 1
para género y especie, mientras que es casi 1 para la línea de serogrupo 1. Estos valores
indican por tanto que este test clasifica con acertada probabilidad las muestras y que no lo
hace de forma aleatoria.
La representación gráfica para cada línea de la sensibilidad frente a 1-especificidad,

produce las curvas ROC138, 141-144
, como pueden observarse en la figura 5.9.1., y que
representan visualmente el rendimiento del test como clasificador. Cuando la especificidad y
la sensibilidad son del 100%, el valor del área bajo la curva vale 1 o gráficamente es un
ángulo recto. Cualquier desviación de esta situación ideal, muestra la pérdida de idoneidad del
clasificador. En el test desarrollado, para género y especie la curva es ideal mientras que para
la línea de serogrupo 1 hay una pequeña desviación, siendo el área bajo la curva de 0.984,
debido al resultado discrepante que el test produjo frente al método de referencia.
Globalmente, los parámetros calculados para el rendimiento del test (ver tabla 5.9.4.) indican
181
6. DISCUSIÓN
que, al igual que por líneas, la sensibilidad, la especificidad, los valores VPP, VPN, LRP y
LRN, así como la AC y el γ, son elevados y el test no produce clasificaciones aleatorias. En la
figura 5.9.2., se representa la curva ROC obtenida para el test globalmente, obteniendo que es
prácticamente ideal con un área bajo la curva de 0.994.
6.4.4.7.3. Del Límite de Detección del Test
Dado que las muestras se habían analizado a McF1 para normalizar el sistema de
evaluación y que el método desde placa proporciona mayor cantidad de UFC/ml en la
disolución, se estudió la cantidad mínima de UFC/ml que se podía detectar con el test. La
disolución original de la que se partió proporcionó un valor de A600 de 1.0460 que es cuatro
veces mayor que el valor de 0.25 para McF1 y un valor de 1.54x109 UFC/ml. Tras diluir hasta
1/10.000.000 e inocular placas de agar Legionella con dichas diluciones, se pudo detectar por
el test hasta la dilución 1/100 para la línea GÉN y SR1 mientras que fue hasta la dilución 1/10
para la de ESP, como se aprecia en la tabla 5.10.1. Por tanto, los límites de detección
calculados fueron del orden de 107 UFC/ml para la línea GÉN y SR1 y de 108 UFC/ml para la
línea de especie, como se muestra en la tabla 5.10.2. Este límite de detección, comparado con
otras inmunocromatografías similares (Merck, KGaA) o kits de aglutinación con látex
(Oxoid, UK) es similar, debido a que con al menos una colonia el test funcionó
adecuadamente (ver tabla 5.6.3.9.). Evidentemente es bastante menor que el obtenido con
técnicas moleculares de PCR191, 192, aunque el cultivo y la inmunocromatografía no presentan
las limitaciones de esta técnica tan compleja.
6.4.4.7.4. De las Estabilidades de los Strips y el Medio
Tras el análisis de las muestras, los resultados fueron muy prometedores. Sin embargo,
era necesario conocer la estabilidad de los componentes para su uso en un tiempo prolongado.
Para ello se sometieron por separado a pruebas de estrés térmico para estudiar su
comportamiento con la temperatura y extrapolarlo a un largo tiempo, como explica Jones108.
Según este autor la incubación a 37ºC en estudios de estabilidad acelerada tiene un factor en
el tiempo de 10, es decir, 1 semana a 37ºC sería equivalente a 10 semanas a TA. Otros
estudios realizados por Weiss193 sugieren que se pueden realizar estas estabilidades tanto a 37
como a 50ºC y que la equivalencia puede encontrarse en 3 meses a TA por cada mes sometido
a estrés térmico. En este estudio se introdujeron los strips en una estufa con una temperatura
de 50ºC durante 1 semana y por otro lado, se guardaron para analizarlos a TA en el periodo de
182
6. DISCUSIÓN
un año. El resultado que se muestra en la tabla 5.11.1.1. pone de manifiesto que en el periodo
de al menos un año a TA conservados en ausencia de luz y humedad, los strips fueron estables
al igual que tras someterlos a estrés térmico a 50ºC, observando un ligero decaimiento en la
línea de SR1, mientras que en la de ESP aumentaba la señal, quizás debido a un fenómeno de
maduración del Mab en la línea o el conjugado101, 108, 163. En el caso de la línea género se
mantuvo la señal. Estos resultados indicarían por tanto que los strips, en los que los Mab van
adsorbidos en la membrana y en el conjugado, mantendrían su integridad y por tanto, el
sistema podría responder a largo plazo de igual manera que recién preparado, lo que sin duda
era un paso positivo de cara al uso del test en el tiempo o a su posible comercialización.
El medio de rotura diseñado era otro componente esencial del test y no menos
importante que las líneas o el conjugado, ya que es el que provoca la exposición correcta de
los antígenos de la membrana de la bacteria de Legionella que se desean detectar con el test.
El hecho de que PMB fuese estable en disolución por un tiempo determinado
(http://www.sigmaaldrich.com, producto 81334), hizo que se pensara en la liofilización del
mismo194-196 para preservar la estabilidad del medio en el tiempo. Tras su liofilización se
sometió a 50ºC durante 1 y 2 meses y se comparó en paralelo al mismo medio liofilizado pero
conservado a TA. El resultado que se muestra en la tabla 5.11.2.1. A determina que el medio
funcionó perfectamente tras ser sometido a estrés térmico, lo que indicaba su estabilidad en el
tiempo. Por otro lado, como Pearcy194 expone, los liofilizados pueden conservarse a TA y son
estables por largos periodos de tiempo, lo que sin duda era otra ventaja para el interés
comercial del test, porque permitiría su almacenamiento a TA. Para comprobar su posible uso
en líquido, se probó uno de los viales que había sido reconstituido tras la liofilización y
almacenado a TA. Como puede verse en la tabla 5.11.2.1. B funcionó también sin problemas,
por lo que su utilización a TA y en estado líquido también era posible.
183
CONCLUSIONES
7. CONCLUSIONES
7. CONCLUSIONES
La importancia de un diagnóstico reside en una apropiada clasificación del agente

causante de la enfermedad. Para ello se ha estudiado y desarrollado un test para la
identificación de Legionella a partir de muestras de cultivo. Tras el desarrollo y evaluación
del mismo, podemos llegar a las siguientes conclusiones:
- Los métodos de rotura químicos de la membrana de la bacteria han demostrado ser más
eficaces que los físicos, indicando que la acción de detergentes o compuestos que
interaccionan y desestabilizan dicha membrana, son necesarios para la completa exposición a
los monoclonales específicos de los constituyentes de la misma que se desean detectar.
- La conjugación a partículas de oro coloidal de anticuerpos monoclonales, así como la

adsorción de éstos sobre membranas de nitrocelulosa, posibilita el desarrollo de sistemas
inmunocromatográficos capaces de detectar antígeno en muestras procedentes de cultivo.
- Dado que el cultivo para la detección de Legionella es obligatorio en gran número de

países, entre ellos España, el test desarrollado para muestras de cultivo, se presenta como una
opción apropiada como método de confirmación del mismo, con alta sensibilidad y
especificidad, así como un elevado rendimiento de los parámetros estadísticos calculados,
como muestran las gráficas ROC generadas del análisis de los datos.
- Otros métodos de detección, como los basados en el análisis de ácidos nucleicos con
sensibilidad y especificidad variables, usualmente no diferencian entre organismos viables y
no viables, mientras que el cultivo sólo puede realizarse con cepas vivas, que son las
causantes de la enfermedad, siendo así un método más preciso. Aquí reside otra de las
ventajas del método desarrollado en el presente trabajo, donde los especímenes detectados
pertenecerán a legionellas potencialmente patógenas.
- El test está diseñado con anticuerpos monoclonales específicos dirigidos frente a

componentes constantes de la membrana de la bacteria Legionella, como son PAL, LPS-1 o
MOMP. Éste hecho permitiría la detección de cualquier nueva especie que pudiese surgir en
el futuro, haciendo de este test un método de detección muy eficaz.
187
7. CONCLUSIONES
- La inmunocromatografía desarrollada ha sido capaz de identificar las legionellas tipo

Pontiac y no-Pontiac, así como muestras de procedencia ambiental y clínica obtenidas a partir
de cepas de colección o muestras aisladas. Todo esto incluye los casos nosocomiales,
adquiridos en comunidad o asociados al viajero, lo que convierte al test en un método versátil.
-En caso de su aplicación comercial, frente a otras técnicas de confirmación usadas

habitualmente, como son los test de tarjeta con partículas de poliestireno, necesita de un solo
ensayo, mientras que los de tarjeta requieren en la mayoría de los casos de hasta tres. Éstos
suelen estar diseñados con mezclas de policlonales frente a las legionellas más frecuentes,
pero no para todas las especies y géneros existentes. Además en una sola prueba del método
inmunocromatográfico, puede determinarse si es una muestra del género Legionella o
diferenciar entre L. pneumophila serogrupo 1 y L. pneumophila serogrupos 2 a 15, lo que
aporta rapidez y sencillez al diagnóstico. La doble confirmación de L. pneumophila serogrupo
1 implica además, fiabilidad.
188
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March
200
ANEXOS
9. ANEXOS
9. ANEXOS
9.1. ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS
ANEXO 1
Tabla ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS ANEXO1.1. Reactivos usados en el

proceso de fusión
ABREVIATURA TAMPÓN/DISOLUCIÓN COMPOSICIÓN

Emulsión de aceite-agua con
AFC Adyuvante de Freund completo
Mycobacterium tuberculosis muertos
AFI Adyuvante de Freund incompleto Emulsión de aceite-agua
Am Aminopterina 0.04 mM (100x) Aminopterina 0.0176 mg/ml

CaCl2 0.2 g/l, Fe(HNO3)3 0.1 mg/l, KCl
0.4 g/l, MgSO4 97.67 mg/l, NaCl 6.4
g/l, NaHCO3 3.7 g/l, Na3PO4 0.125 g/l,
D-glucosa 4.5 g/l, Rojo Fenol 15 mg/l,
Piruvato sódico 0.11 g/l, L-Arginina-
HCl 84 mg/ml, L-Cisteina-2HCl 63
Dulbecco’s Modified Eagle’s
mg/ml, L-Histidina-HCl-H2O 42 mg/ml,
Medium en polvo (Gibco®, Life
L-Isoleucina y L-Leucina 0.105 g/l, L-
TechnologiesTM Corporation, USA)
DMEM Lisina-HCl 0.146 g/l, L-Metionina 30
con L-glutamina, 4.5 g/l de glucosa,
suplementado mg/l, L-Fenilalanina 66 mg/ml, L-
sin piruvato sódico, sin Na2CO3. Con
Serina 42 mg/l, L-Treonina 95 mg/ml,
NaHCO3, con β-mercaptoetanol (25
L-Triptófano 16 mg/ml, L-Tirosina
µl/10 l, pH 7.2)
2Na2H2O 0.104 g/l, L-Valina 94 mg/l,
D-Ca Pantoténico, Acido Fólico y
Cloruro de Colina 4 mg/ml, I-Inositol
7.2 mg/ml, Niaciamida, Piridoxina-HCl
y Tiamina-HCl 4 mg/ml y Riboflavina
0.4 mg/ml, pH 7.2
Hipoxantina 10 mM + Timidina 1.6 Hipoxantina 1.36 mg/ml, Timidina 0.38
HT
mM (100x) mg/ml
Polietilenglicol (PEG) 4000 al 71 % 0.714 g PEG 4000/ml de DMEM
P4000
(p/v) suplementado
GIBCO®
SFB Suero Fetal Bovino
Life TechnologiesTM, USA
TC 0.1M pH 8.9 Tampón Carbonato 0.1M pH 8.9 Na2CO3 10.6 g/l, pH 8.9
FUSIÓN (Departamento de Inmunología, Vircell, S.L.)
(Ver tabla ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS ANEXO1.1 para las abreviaturas de

los reactivos). Para ello se usó el kit ClonaCell®-HY Hybridoma Clonning Kit
203
9. ANEXOS
(http://www.stemcell.com/~/media/Technical%20Resources/9/3/F/0/1/28411_MAN_2_2_0.p
df).
1) Inmunización de ratones: se comenzó unas 6-10 semanas antes de la fusión. Para ello,
se eligieron del tipo Balb/c. A cada ratón se le inyectó intraperitonealmente 100 µg de
antígeno (Ag) (LPPA o LPS-1 en cada caso) en 250 µl de TC 0.1M pH 8.9 con 250 µl de
adyuvante de Freund completo (AFC). A las dos semanas se repitió la dosis pero en este caso
con adyuvante de Freund incompleto (AFI). El día 35 y el 56 se inyectaron 100 µl de Ag a 10
µg/ml en TC 0.1M pH 8.9. A los dos meses se comenzó la fusión
2) Obtención de suero de ratón: se introdujo la sangre obtenida de los ratones en tubos

estériles con una membrana separadora y se incubaron 60 minutos a 37 ºC. Se centrifugaron
10 minutos a 10000xg y a 4 ºC. El suero así obtenido se retiró con una pipeta, se repartió en
viales y se congeló a -20 ºC. El siguiente paso fue el análisis de los sueros de ratón por ELISA
para conocer la actividad de los mismos y saber si la inmunización había sido correcta.
3) A continuación, se realizó la purificación de esplenocitos de ratón que se localizan en

el bazo. Tras el sacrificio e inmovilización de los ratones seleccionados, éstos se empaparon
en alcohol de 70º en una cabina de flujo laminar. Tras abrir el abdomen, se limpió el peritoneo
con alcohol de 70º y se extrajo el bazo con material estéril. El bazo se lavó con Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium (DMEM, Life TechnologiesTM Corporation, USA) suplementado
(ver tabla ANEXO MATERIALES Y MÉTODOS ANEXO1.1) hasta que cambió a color
blanquecino. Con la ayuda de una jeringa se recogió el medio de lavado donde se encontraban
los esplenocitos y se llevó a un tubo estéril dejando reposar 5 minutos para comprobar que en
el botón no quedasen restos del bazo del ratón. A continuación se centrifugó 5 minutos a
300xg y se resuspendió el pellet en el medio A. Los esplenocitos se cuantificaron tras la lisis
de los hematíes con NH4Cl al 0.9% (p/v) (50 µl esplenocitos con 250 µl NH4Cl).
4) Preparación de las células mielocíticas: para llevar a cabo la fusión se empleó la línea
celular Sp2/0-Ag14 (híbrido entre células de ratones de cepa Balb/c con la línea celular de
mieloma P3X63AG8). Las células mielocíticas conservadas en nitrógeno líquido se
centrifugaron a 400xg 5 minutos y se resuspendieron en el medio de crecimiento DMEM
suplementado con un 15% de suero fetal bovino (SFB) inactivado a 56 ºC, a una razón de
5·106 células/50 ml de medio. Posteriormente se almacenaron en frascos estériles a 37 ºC en
atmósfera de CO2 para impedir la rotura de las células. Tres días después se repitió el proceso
204
9. ANEXOS
con las células en el medio de crecimiento, pero pasándolas a un nuevo frasco (frasco 2) con
las mismas condiciones. Dos días después los 50 ml del frasco 2 se repartieron en dos frascos
nuevos en partes iguales y se completó el volumen de cada uno a 50 ml nuevamente. El día
antes de la fusión, los dos frascos se llevaron a un volumen final de 100 ml.
5) Fusión: la fusión consiste en la unión de los esplenocitos del bazo del ratón con las
células del mieloma (tumor de las células plasmáticas productoras de anticuerpos) de ratón
que se han obtenido. Para ello, los medios se atemperaron a 37 ºC. Uno de ellos consistió en
una mezcla de 2.4 ml de Polietilenglicol-4000 (P4000) con 0.1 ml de dimetilsulfóxido. Los
linfocitos que se cuantificaron, así como el mieloma, se lavaron en el medio A por
centrifugación dos veces durante 10 minutos a 400xg. El sobrenadante del mieloma se guardó
para posteriormente utilizarse como medio de acondicionado (añadiéndole aminopterina (Am)
para 2x). Los pellets de ambos se mezclaron en un frasco estéril y nuevamente con el medio A
se lavaron durante 10 minutos a 400xg. A continuación se realizó el paso de fusión
propiamente dicho, que es una modificación del método desarrollado por Kölher y Milstein en
1975170. Se le añadió 1 ml al pellet de P4000 y se agitó durante 1 minuto de forma intensa.
Tras otro minuto de reposo, se le añadió 1 ml de DMEM suplementado y se dejó otro minuto
sin agitación. Se añadieron 2 ml más de medio (1ml/minuto) y nuevamente se dejó sin
agitación durante 2 minutos. A continuación se añadieron 5 ml de DMEM suplementado y se
dejó en reposo otros 2 minutos y medio. Se añadieron seguidamente 20 ml del mismo medio
pero con 15% de SFB, añadiendo a razón de 5 ml/0.5 minutos agitando suavemente el
contenedor. Finalmente se centrifugó durante 5 minutos a 300xg.
6) Sembrado: las células centrifugadas se resuspendieron en el medio de acondicionado

con aminopterina a 2x y se añadieron en placas de microtitulación de 96 pocillos a una razón
de 100 µl/pocillo, siendo el número de células 1.2·105 por pocillo. A cada pocillo se añadió
100 µl de DMEM suplementado con 15% de SFB con una mezcla de hipoxantina y timidina
(HT) 2x, de forma que ésta mezcla y la aminopterina quedaron a 1x. Las placas obtenidas se
taparon y se guardaron a 37 ºC y atmósfera de CO2.
Se puso como control una siembra de células de mieloma en un medio similar en el que
se hicieron los hibridomas. Tras 72 horas de la fusión se retiraron 100 µl/pocillo y se le añadió
a cada uno DMEM suplementado con 15 % SFB enriquecido con 1x de HT fresco. Las
poblaciones de clones o células híbridas, deben de aparecer a los 10-14 días, observándose un
205
9. ANEXOS
color anaranjado en los pocillos en los que hay crecimiento celular. Una vez finalizado el
proceso de fusión habría tres tipos de células en el cultivo: células mielomatosas, células
esplénicas y células híbridas. Las células que mejor crecen “in vitro” son las mielomatosas, y
pueden eliminar por sobrecrecimiento a las híbridas. Por este motivo se ha usado en el medio
de cultivo hipoxantina, timidina y aminopterina, ya que permiten la supervivencia de las
híbridas y elimina selectivamente las células mielomatosas (las células normales pueden
sintetizar ADN de dos formas: mediante la síntesis de novo o a partir de bases preformadas
que se encuentran en el medio de crecimiento. La aminopterina inhibe al enzima dihidrofolato
reductasa por lo que se bloquea la síntesis de novo de las purinas y de las pirimidinas. En
estas condiciones la célula se torna dependiente de las fuentes exógenas de purinas y
pirimidinas. Las células sp2/0-Ag14 son resistentes a la 8-azaguanina, que es lo mismo que
decir que no poseen la enzima hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). Por lo
tanto, al bloquear la síntesis de novo y al carecer de esta enzima, estas células no podrían
sintetizar ADN y morirían en el cultivo. Por otro lado, las células esplénicas en ausencia de
estímulo morirían ya que no son capaces de mantenerse viables “in vitro” y las únicas que
sobrevivirían serían las células híbridas, ya que poseen la enzima HGPRT procedente del
genoma de la célula esplénica y podrían crecer indefinidamente gracias al genoma del
componente mielomatoso).
El siguiente paso es el análisis por la técnica de ELISA de los pocillos que contenían los
híbridos productores del anticuerpo monoclonal deseado, ya que es preciso aislarlos de los
otros híbridos vecinos no productores, ya que estos últimos por sobrecrecimiento podrían
anular al clon de interés.
7) Clonación: Se llevó a cabo por dilución resembrando las células de cada pocillo
productor de anticuerpos desde 1x a 1/16, de forma que en alguno de los pocillos resembrados
apareciesen clones aislados productores de anticuerpos. El proceso de clonación se repitió
hasta obtener una población de clones puros (células en proporciones cercanas a 1 célula por
pocillo).
8) Crecimiento: una vez se estableció el crecimiento de un clon híbrido productor del

anticuerpo monoclonal deseado, se promovió el crecimiento de este hibridoma a gran escala.
Para ello se realizó un crecimiento estacionario en frascos de plástico. Las células híbridas se
mantuvieron en DMEM suplementado con 5% de SFB a una temperatura de 37 ºC y
206
9. ANEXOS
atmósfera de CO2 y tras 4-6 días el sobrenadante se recogió. En él se encuentra el Mab listo
para purificar. El rendimiento suele ser de 0.1 a 10 µg por ml.
Los hibridomas obtenidos se denominaron con letras: A, B, C, D, etc. y correspondían a

las placas como sigue: LPPA A (2C4C32C6), LPPA B(1D9E32D2), LPPA C (3E9E71E11),
LPPA D (2F4E9), LPPA E (5C7D52F10), LPPA F (3F10D52F62E4), LPS-1 A (4C6E1F2),
LPS-1 B (5F5G8), LPS-1 C (2D2F6), LPS-1 D (2B7A1A4), LPS-1 E (4B10G6), LPS-1 F
(4G7F2), LPS-1 G (3A2E3), LPS-1 H (4E10E6) y LPS-1 I (5B12E2).
Para estudiar la funcionalidad de los sobrenadantes de cultivos de hibridomas se usó la

técnica de ELISA. Se analizaron los sobrenadantes directos y el criterio de positividad fue en
base a la media de las absorbancias de los controles negativos más tres veces su desviación
estándar. Se seleccionaron aquellos clones que fueron interesantes para un posterior uso y se
estudió el isotipo de dichos Mab.
ANEXO 2
ISOTIPAJE DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (Departamento de Inmunología,

Vircell, S.L.)
El isotipaje de Mab de ratón se llevó a cabo para determinar la subclase o isotipo de

forma cualitativa y favorecer una posterior purificación así como su modo de empleo. Los
Mab procedentes de los sobrenadantes de cultivo de células hibridadas pueden ser
identificados mediante inmunodifusión o ELISA.
En este caso fue llevado a cabo mediante un kit de ELISA: Mouse Monoclonal Antibody
Isotyping Reagents (Sigma-Aldrich). El kit se compone de IgG de cabra anti-ratón IgG1, IgG
de cabra anti-ratón IgG2a, IgG de cabra anti-ratón IgG2b, IgG de cabra anti-ratón IgG3, IgG
de cabra anti-ratón IgM e IgG de cabra anti-ratón IgA.
El procedimiento (ELISA de captura) se realizó según las instrucciones del fabricante y

preparando y obteniendo el resto de reactivos no incluidos pero necesarios (consultar página
web del fabricante para ver el procedimiento:
(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/iso2bul.Par.0001.File.tmp/is
o2bul.pdf)). El protocolo realizado fue:
207
9. ANEXOS
1) Los anticuerpos específicos de isotipo fueron diluidos a 1:1000 en tampón fosfato 10

mM, NaCl 150 mM pH 7.4 (PBS) y se depositaron 100 µl por cada pocillo.
2) Se incubó 1 h a 37 ºC.
3) Se lavó tres veces con tampón de lavado (PBS con 0.05 % de Tween® 20).
4) Se añadió al pocillo correspondiente 100 µl de sobrenadante a examinar y se incubó 1
hora a temperatura ambiente.
5) Se repitió el paso 3.
6) Se añadieron 100 µl de IgG de cabra anti-IgG de ratón (Fab específico) diluido a
1:600 en PBS.
7) Se incubó 30 minutos a temperatura ambiente.
8) Se repitió el paso 3.
9) Se preparó el sustrato: se disolvió ácido 5-aminosalicílico a 1mg/ml en tampón de
sustrato (0.02 M fosfato sódico pH 6.8) y se preparó una solución fresca de H2O2 al 1%
(v/v) en agua destilada. A la solución de ácido 5-aminosalicílico preparada se le
añadió 0.1 ml de la solución de H2O2 al 1%.
10) Se añadieron 100 µl del sustrato preparado y se incubó 20-30 minutos a temperatura
ambiente, siendo el resultado positivo color marrón en el pocillo.
11) Se paró la reacción con 50 µl de NaOH 3 N.
12) Se realizó la lectura a una absorbancia de 450 nm.
El resultado obtenido fue el que se muestra en la tabla ANEXO RESULTADOS ANEXO 2.1.
del ANEXO 2 del ANEXO RESULTADOS.
ANEXO 3
CRECIMIENTO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (Departamento de Inmunología,

Vircell, S.L.)
Una vez que se ha conseguido establecer el crecimiento de la clona híbrida productora del
anticuerpo monoclonal deseado, se debe promover el crecimiento de este hibridoma a gran
escala. Para realizarlo se ha llevado a cabo “In vitro”.
Se produce el crecimiento estacionario en frascos de plástico o Roller. Para ello las

células híbridas son mantenidas en DMEM suplementado con 5 % de SFB, a una temperatura
de 37 ºC y atmósfera de CO2, y transcurridos 4-6 días el sobrenadante es recogido. En este se
208
9. ANEXOS
encontrará el anticuerpo monoclonal listo para purificar. El crecimiento del hibridoma “in
vitro” produce de 0.1 a 10 µg por ml.
209
9. ANEXOS
9.2. ANEXO RESULTADOS
ANEXO 1
Se muestra la descripción de las colonias de las placas inoculadas a partir de las muestras del Grupo II y las fotos de dichas placas (apartado 5.1.
de Resultados).
Tabla ANEXO RESULTADOS ANEXO 1.1. Descripción de las colonias de las placas del grupo II
1605.3 A: redonda, amarillenta, bordes flor, rugosa, punto central, 1-1,5 cm.
1605.3 B: lisa, amarillenta, redonda perfecta, anillos en el centro, 0,9-1 cm.
1605.3 C: amarillenta, redonda perfecta, punto central, abombada, centro oscuro, 3-4 mm.
1605.3 D: blanquecina, redonda perfecta, lisa, 1 mm.
1727.1 S1 aislamiento: blanca, redonda.
1728.1 spp A: blanca y amarillenta en centro, punto central, lisa con surcos, borde irregular y en relieve, 1-1.3 cm.
1728.1 spp B grande y pequeña: blanca, punto interior con halo más claro, redondeada, 1-2 y 2-3 mm.
210
9. ANEXOS
1800.8 A: redonda no perfecta, blanca brillante, punto central amarillento con gránulos en relieve, 4-6 mm.
1800.8 B: redonda, blanca, punto central amarillento, 2-3 mm.
1864.1 A: blanca, redonda, borde blanco en relieve, rugosa, punto central y halo más claro alrededor seguido de zona más
intensa en el borde, 7-8 mm.
1864.1 B: blanca, punto central, redonda, lisa, borde fino y en relieve, 4-6 mm.
1920.2 A: forma de triángulo con bordes redondeados, blanca, puntos centrales, reseca, mate, 1-1.2 cm.
1920.2 B: redonda, blanca, punto central exterior rugoso, borde en depresión, centro liso, 5 mm.
1643.1 A: redonda, bordes irregulares, rosa en el centro y verdosa, peluda, borde blanco, 1-2 cm.
1643.1 B: amarillenta, lisa, redonda, brillante, lechosa, 2-5 mm.
1643.1 C: amarillenta, redonda, punto central y borde blancos, 2-3 mm.
1643.1 D: blanquecina, poco rellena, borde blanco y más oscuro y de forma irregular, plana y punteada (surcos), 2-3 cm.
211
9. ANEXOS
1866.1 A: blanca, peluda, abombada, rugosa, bordes irregulares, redonda, 2-3 mm.
1866.1 B: redonda, blanquecina, 1-2 mm.
1866.1 C: peluda, blanquecina, abombada, 2-3 mm.
1866.1 D: forma masa, blanquecina, redonda, lisa, < 1 mm.
1867.1 A: blanquecina, lisa, redonda, centro más oscuro, abombada, 4-5 mm.
1867.1 B: redonda, pequeña, blanquecina, lisa, < 1 mm.
1867.1 C: redonda, surco en el interior, lisa, blanquecina, 4-5 mm.
1866.2 A: redonda, amarillenta, hueco central, rugosa, 4-5 mm.
1866.2 B: blanca amarillenta, redonda, lisa, abombada, 1-2 mm.
1866.2 C: forma masa, blanca amarillenta, redonda, lisa, < 1 mm.
212
9. ANEXOS
1788.2 A: redonda, blanquecina, puntos centrales pequeños, abombada, lisa y alrededor puntos, 2-3 mm.
1788.2 B: redonda, blanca, lisa, < 1 mm.
1788.2 C: blanca oscura, plana, forma masa, 1-2 mm.
1419.1 S2_14: redonda, blanquecina, rugosa, punto central más relleno, 3-4 mm.
1865.1 A: redonda con anillos intercalando más oscuro y más claro. Los anillos más oscuros en relieve, 0.5-1 cm.
1865.1 B: blanca, pequeña, redonda, lisa, parte central más blanca que alrededor, 1-3 mm.
1865.1 C: forma masa, blanquecina, redonda, lisa, 1-2 mm.
1878.9: blanquecina, redonda, lisa, centro más oscuro, 2-3 mm.
1785.1 A: redonda, blanca interior con punto blanco en el centro y halo alrededor casi invisible, rugosa, 7-8 mm.
1785.1 B: pequeña, redonda, punto central resaltado (relieve), halo alrededor, borde más ancho que punto central, 1-3 mm.
213
9. ANEXOS
1971.12 A: redonda, rosa, mate, lisa, abombada, 4-5 mm.
1971.12 B: fondo, incoloro, redondo y alargado, < 1 mm.
1760.1 A: blanca, peluda, centro en relieve, 6-8 mm.
1760.1 B: rosa, redonda, mate, abombada, 1-2 mm.
1760.1 C: blanquecina, interior más oscuro (aspecto de clara de huevo no cuajada), borde exterior más blanco, lisa y centro
abombado, 5-6 mm.
1760.1 D: fondo, incoloro, alargado y redondo, < 1 mm.
1789.2 A: redonda perfecta, lisa, punto central más oscuro, blanquecina, < 1 cm.
1789.2 B: redonda, centro amarillento con puntos y en relieve respecto al resto, lisa alrededor del centro, 1-1.5 cm.
1760.3 A: amarillenta verdosa, redonda, borde exterior en relieve seguido de anillo en depresión y centro en relieve y liso, 8-9
mm.
1760.3 B: fondo, fino, incoloro, < 1 mm.
214
9. ANEXOS
172? A: peluda, amarillenta, semicírculo, 4-5 cm.
172? B: marrón, peluda, semicírculo, 2-3 cm.
172? C: blanca, aspecto seco, quebradiza, redonda con puntas irregulares, 1-1.5 cm.
172? D: redonda, amarillenta, parte central más oscura, lisa, 2-4 mm.
172? E: redonda, punto central y filamentos salientes (parece flor de diente de león), 1-2 cm.
1762.4 A: rosa, redonda perfecta, punto central elevado, mate, lisa, 3-4 mm.
1762.4 B: incoloro, alargada, estrecha, < 1 mm.
1729.2 A: peluda, marrón en el exterior y amarilla en el interior, redonda, 2-3 cm.
1729.2 B: peluda, blanca, redonda rodeada de parte más plana, 2-3 mm.
1729.2 C: amarillenta, redonda, crece en los bordes, lisa, 1-2 mm.
215
9. ANEXOS
1420.3 S2_14: blanquecina, redonda, rugosa, punto central más relleno, 3-4 mm.
1865.2 A: blanquecina, borde en relieve respecto al centro, centro punteado, bordes de flor, 2-4 mm.
1865.2 B: fondo, redonda, incolora, blanca con gránulos, < 1 mm.
1455.3 A: blanca, puntos centrales en masa transparente, borde liso y blanco, 2-3 mm.
1455.3 B: redonda, fondo, blanco y transparente, < 1 mm.
2070.3 spp A: marrón y amarilla en el centro, peluda, 3-4 cm.
2070.3 spp B: peluda, blanca (como flor de diente de león), redonda, 2-3 cm.
2070.3 spp C: redonda perfecta, lisa, blanca y amarillenta, borde más claro, 1-3 mm.
2069.1 S1: ovalada, blanquecina, lisa, bordes de flor, 1-1.2 cm.
1868.1: blanca, redonda, abombada y lisa, 1 mm.
216
9. ANEXOS
1849.2 A: blanca y amarillenta, ovalada irregular, interior con puntos más amarillentos, borde liso en relieve, 1-2 cm.
1849.2 B: alargado, incoloro, < 1 mm.
1171.17 A. rosa, redonda, mate, lisa, abombada, 2-4 cm.
1171.17 B: incoloro, alargado, forma fondo, < 1 mm.
1889.7 A: blanca y amarillenta, redonda, lisa, 1-2 cm.
1889.7 B: fondo, incoloro, alargado, < 1 mm.
1920.1 A: redonda, centro en relieve con anillo y halo punteado, borde en puntas y nervios, centro amarillo y blanco, 0.5-1
cm.
1920.1 B: blanca en relieve, forma amorfa (como granos de sal), 1 mm.
1920.1 C: redonda, lisa, blanca, 2-3 mm.
1920.1 D: aspecto seco, quebradiza, circulo deformado con puntas, en el centro puntos blancos, 0.5-1 cm.
217
9. ANEXOS
2069.2 S1 A: blanca con anillos, punto blanco en el centro con dos circunferencias y borde en relieve, 1-2 cm.
2069.2 S1 B: incoloro, alargado, fino.
1486.1 A: redonda y blanca, centro relleno con puntos en relieve más amarillos, centro más claro y borde más oscuro en
relieve, 3-8 mm.
1486.1 B: redonda, lisa, blanquecina, borde más claro en depresión, 2-3 mm.
1486.1 C: blanca, redonda, punto blanco central, con líneas hacia el exterior como nervios, 4-5 mm.
1516.4 A: blanca, plana, redonda, centro en depresión, 1-2 mm.
1516.4 B: blanca, redonda, lisa, < 1 mm.
1728.6 A: redonda, amarillenta, centro rojizo, lisa, abombada, 1-3 cm.
1728.6 B: blanca, redonda, lisa, abombada, 1 mm.
1728.6 C: blanca, seca, forma irregular, centro más intenso, quebradiza, 5 mm.
218
9. ANEXOS
1727.4: redonda con bordes en flor, borde en depresión (plano) respecto al resto, blanca y transparente, puntos en relieve,
centro en relieve rodeado de depresión que se separa del resto, punto gordo en el centro, 1-3 cm.
1757.1 TT A: redonda, lisa, blanquecina, interior más amarillento y más intenso, lisa, 1.1 cm.
1757.1 TT B: redonda, lisa, blanca, pequeña, punto central más intenso, 1-3 mm.
1757.1 TT C: peluda, blanca, centro más relleno, redonda, 0.3-0.4 cm.
1907.3 6u/c A: blanca, redonda, lisa, brillante (aspecto mojado), 1-3 mm.
1907.3 6u/c B: blanco, cuarteada, brillo metálico, interior con borde, 1-2 mm.
1455.1 pH 8: blanca, redonda, centro en relieve blanco punteado con borde blanco, 2-3 mm.
1727.3 A: blanca y rosada, peluda, punto central oscuro, redonda, 1-2 cm.
1727.3 B: blanca, peluda y carnosa, ovalada, bordes irregulares, 2 cm.
1727.3 C: amarilla verdosa, ovalada, abombada, lisa, 2 mm.
219
9. ANEXOS
1727.3 D: redonda, centro amarillo punteado con borde blanco, 2-3 mm.
1727.3 E: redonda, blanca, lisa, abombada, 1-3 mm.
1419.3 S2_14+otras A: blanquecina, redonda, lisa, punto central blanco, 1-3 mm.
1419.3 S2_14+otras B: blanquecina, redonda, forma masa, < 1 mm.
1867.2 A: redonda, punto central oscuro con zona clara y borde irregular, 0.5-1 cm.
1867.2 B: redonda, hueco central, blanquecina, 1 cm.
1867.2 C: redonda, pequeña, lisa, blanca, 1 mm.
1849.1 A: verde en interior y blanca en el exterior, pelusa, verde en relieve, 1-2 cm.
1849.1 B: punto central blanco con zona clara y zona blanca y borde relieve, 1-2 cm.
1849.1 C: redonda, lisa, blanquecina, 1 cm.
220
9. ANEXOS
1849.1 D: blanca, redonda, lisa, abombada, brillante (aspecto mojado), 2-3 mm.
2871.3 aislamiento: blanca, forma de C doblada, lechosa, brillante, lisa, 1 cm.
2161.3 0.1: blanca, lechosa, punto central, borde liso, redonda, brillante, 3-6 mm.
2739.1: blanca-amarillenta, redonda, punto central blanco, lisa, borde en relieve, brillo, 2-3 mm.
2766.1: punto central blanco, borde ancho blanquecino rugoso, brillo, 0.8-1 cm.
2871.3 aislamiento: blanca, redonda, lisa, brillante, 1-3 mm.
3187.1: punto blanco central, halo rugoso, redonda, 1-2 cm.
3469.3: punto central abombado blanco con zona verdosa y borde blanco, lisa, redonda, 0.5-1 cm.
2739.2: blanca, lisa, redonda, punto central, borde en relieve, 2-4 mm.
2870.2 aislamiento: blanca, redonda, lisa, punto central, 1-2 mm.
221
9. ANEXOS
2925.2: blanca, redonda, punto central y borde claro, redonda, lisa, brillante, 4-7 mm.
2739.4: blanca, redonda, lisa, brillante, 2-3 mm.
3468.2: punto central abombado blanco con zona verdosa y borde blanco, lisa, redonda, 0.5-1 cm.
2337.1: blanca, redonda, punto central blanco gordo con halo transparente, brillante, 2-5 mm.
3469.1 A: blanca, redonda, irregular, 3-4 mm-
3469.1 B: blanca, redonda, lisa, punto central y halo, 1-2 mm.
3156.2 A: punto central blanco con halo, grande, 1-2 cm.
3156.2 B: blanca, pequeña, redonda, lisa, 1-2 mm.
2738.1 A: blanca intensa, redonda, borde de huevo frito, 5-6 mm.
2738.1 B: amarillenta-marrón, lisa, redonda, 5-7 mm.
222
9. ANEXOS
2738.1 C: amarilla, gránulos, bordes en forma de flor, 0.8-1 cm.
2738.1 D: blanca, redonda, punto blanco central, halo, 3-5 mm.
2925.1 A: redonda con anillos, amarillenta, 2-3 cm.
2925.1 B: blanca, punto central, halo, redonda, 0.6-1 cm.
3140.1 A: redonda irregular con anillos, blanca, halo, 1-2 cm.
3140.1 B: redonda, blanca, anillos, lisa, 6-7 mm.
3129.1 PVP A: marrón-dorada, centro con halo claro, forma de flor, punto central, 6-7 mm.
3129.1 PVP B: amarillenta-marrón, no punto central, borde, 1 cm.
3129.1 PVP C: blanca, lisa, redonda, 2-3 mm.
2768.2 A: blanca, punto central con halo claro, redonda, brillante, 3-5 mm.
223
9. ANEXOS
2768.2 B: redonda, mate, anillo exterior e interior hueco, aspecto metálico, dorada, 2-5 mm.
2768.2 C: blanca, pequeña, irregular, bordes estrellados, 3 mm.
2768.2 D: amarillenta, redonda, lisa, pequeña, 1-2 mm.
Figura ANEXO RESULTADOS ANEXO 1.1. Placas inoculadas a partir de muestras ambientales (aguas del Grupo II) de SGS Tecnos,
S.A. Laboratorio de Microbiología de Medio Ambiente y Prevención (Madrid, España).
224
9. ANEXOS
1800.8 1866.1 1419.1 S2_14

1728.1 spp 1643.1 1788.2
225
1727.1S1 aislamiento 1920.2 1866.2
1605.3 1864.1 1867.1
1971.12 172? 1865.2
1785.1 1760.3 1420.3 S2_14
226
1878.9 1789.2 1729.2
9. ANEXOS
1865.1 1760.1 1762.4

9. ANEXOS
1868.1 1920.1 1728.6

2069.1 S1 1889.7 1516.4
227
2070.3 1171.17 1486.1
1455.3 1849.2 2069.2 S1
1455.1 pH 8 1849.1 2766.1
1907.3 6 u/c 1867.2 2739.1
228
1757.1 TT 1429.3 S2_14 + OTRAS 21621.3 0.1
9. ANEXOS
1727.4 1727.3 2871.3 aislamiento

9. ANEXOS
2739.2 3468.2 2738.1

3469.3 2739.4 3156.2
229
3187.1 2925.2 3469.1
2871.3 2870.2 aislamiento 2337.1
2768.2
3129.1 PVP
230
3140.1
9. ANEXOS
2925.1
9. ANEXOS
ANEXO 2
Tabla ANEXO RESULTADOS ANEXO 2.1. Isotipo obtenido para cada Mab analizado.
IgG 1 IgG 2a IgG 2b IgG 3 IgM IgA
LPPA A +
LPPA B +
LPPA C +
LPPA D +
LPPA E +
LPPA F +
LPS-1 A +
LPS-1 B +
LPS-1 C +
LPS-1 D +
LPS-1 E +
LPS-1 F +
LPS-1 G +
LPS-1 H +
LPS-1 I +
ANEXO 3
A continuación se muestran los datos obtenidos con la herramienta Clinical Calculator 1

del sitio web http://vassarstats.net.
Línea GÉNERO
VassarStats Printable Report: From an Observed Sample: Estimates of Population

Prevalence, Sensitivity, Specificity, Predictive Values, and likelihood Ratios Mon Apr 30
2012 21:07:25 GMT+0200 (Hora de verano romance)). Values entered:
Condition
Absent Present Totals
Test Positive 0 78 78
Test Negative 133 0 133
Totals 133 78 211
231
9. ANEXOS
95% Confidence Interval

Estimated
Value Lower Limit Upper Limit
Prevalence 0.369668 0.305167 0.438999
Sensitivity 1 0.941513 1
Specificity 1 0.965013 1
For any particular test result, the probability that it will be:
Positive 0.369668 0.305167 0.438999

Negative 0.630332 0.561001 0.694833
For any particular positive test result, the probability that it is:
True Positive 1 0.941513 1

False Positive 0 0 0.058487
For any particular negative test result, the probability that it is:
True Negative 1 0.965013 1

False Negative 0 0 0.034987
likelihood Ratios:
[C] = conventional
[W] = weighted by prevalence
Positive [C] Infinity NaN Infinity

Negative [C] 0 0 NaN
Positive [W] Infinity NaN Infinity
Negative [W] 0 0 NaN
Línea SEROGRUPO 1

Condition
Totals 180 31 211
232
9. ANEXOS

Estimated
Prevalence 0.146919 0.103457 0.203624
Sensitivity 0.967742 0.814895 0.998314
Positive 0.14218 0.099434 0.198354

Negative 0.85782 0.801646 0.900566

True Negative 0.994475 0.964904 0.999712

False Negative 0.005525 0.000288 0.035096
likelihood Ratios:
[C] = conventional

Negative [C] 0.032258 0.004691 0.221818
Negative [W] 0.005556 0.000787 0.039228
Línea SEROGRUPOS 1 a 15 (ESPECIE)

Condition
Totals 153 58 211
233
9. ANEXOS

Estimated
Prevalence 0.274882 0.216903 0.341224
Sensitivity 1 0.922613 1
Positive 0.274882 0.216903 0.341224

Negative 0.725118 0.658776 0.783097

True Negative 1 0.969473 1

False Negative 0 0 0.030527
likelihood Ratios:
[C] = conventional

Negative [C] 0 0 NaN
Negative [W] 0 0 NaN
Test GLOBAL

Condition
Totals 133 78 211
234
9. ANEXOS

Estimated
Prevalence 0.369668 0.305167 0.438999
Sensitivity 0.987179 0.92086 0.99933
Positive 0.364929 0.300687 0.434176

Negative 0.635071 0.565824 0.699313

True Negative 0.992537 0.952957 0.99961

False Negative 0.007463 0.00039 0.047043
likelihood Ratios:
[C] = conventional

Negative [C] 0.012821 0.001829 0.089873
Negative [W] 0.007519 0.001067 0.052992
ANEXO 4
A continuación se muestran los datos obtenidos con el programa Medcalc®

proporcionado por el sitio web http://www.medcalc.org:
Línea GÉNERO
Variable GLOBAL_GÉN Sample size 211

GLOBAL GÉN Positive group : REAL GÉN = 1 78
Classification variable REAL_GÉN Negative group : REAL GÉN = 0 133
REAL GÉN
Area under the ROC curve (AUC) 1,000 a

DeLong et al., 1988
Standard Errora 0,000 b
Binomial exact
95% Confidence intervalb 0,983 to 1,000
Significance level P (Area=0.5) 0.000
235
9. ANEXOS
Disease prevalence (%) unknown
Criterion Sensitivity 95% CI Specificity 95% CI +LR -LR

>=0 100,00 95,4 - 100,0 0,00 0,0 - 2,7 1,00
>0 * 100,00 95,4 - 100,0 100,00 97,3 - 100,0 0,00
>1 0,00 0,0 - 4,6 100,00 97,3 - 100,0 1,00
* Criterion corresponding with highest Youden index
Línea SEROGRUPO 1
Variable GLOBAL_SR1 Sample size 211

Classification variable REAL_SR1 Positive group : REAL SR1 = 1 31
REAL SR1 Negative group : REAL SR1 = 0 180
Area under the ROC curve (AUC) 0,984

Standard Errora 0,0161
z statistic 30,000
Significance level P (Area=0.5) <0,0001
a
DeLong et al., 1988
b
Binomial exact

>=0 100,00 88,8 - 100,0 0,00 0,0 - 2,0 1,00
>0 * 96,77 83,3 - 99,9 100,00 98,0 - 100,0 0,032
>1 0,00 0,0 - 11,2 100,00 98,0 - 100,0 1,00
Línea SEROGRUPOS 1 a 1(ESPECIE)
GLOBAL_ESP Sample size 211

Variable Positive group : REAL_ESP = 1 58
Classification variable REAL_ESP Negative group : REAL_ESP = 0 153
Significance level P (Area=0.5) 0.000
a
DeLong et al., 1988
b
Binomial exact

>=0 100,00 93,8 - 100,0 0,00 0,0 - 2,4 1,00
>0 * 100,00 93,8 - 100,0 100,00 97,6 - 100,0 0,00
>1 0,00 0,0 - 6,2 100,00 97,6 - 100,0 1,00
236
9. ANEXOS
Test GLOBAL
Variable GLOBAL_TOTAL Sample size 211

Classification variable REAL_TOTAL Positive group : REAL_TOTAL = 1 78
Negative group : REAL_TOTAL = 0 133

z statistic 77,000
Significance level P (Area=0.5) <0,0001
a
DeLong et al., 1988
b
Binomial exact

>=0 100,00 95,4 - 100,0 0,00 0,0 - 2,7 1,00
>0 * 98,72 93,1 - 100,0 100,00 97,3 - 100,0 0,013
>1 0,00 0,0 - 4,6 100,00 97,3 - 100,0 1,00
237

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UNIVERSIDAD DE GRANADA

INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE UN TEST

María Teresa Pardo García

Memoria para la obtención del Grado de Doctor

María Teresa Pardo García

Dirigida por el Doctor José Manuel Delgado Calvo-Flores (Vircell, S.L.),

Granada, Julio de 2013

Director/es de la Tesis Doctorando

Concluido el trabajo experimental y bibliográfico, considero que la doctorando reúne las

Granada, Julio de 2013

Fdo.: José Manuel Delgado Calvo-Flores

Así mismo, parte de los resultados han sido publicados como:

- Pardo-García, MT., Delgado-Calvo-Flores, J. M., Rojas-González, J., Fuertes-Ortiz, A.

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1.1.1. Taxonomía y Descripción de Legionella pneumophila

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De las más de 50 especies de Legionella conocidas21, destaca L. pneumophila por ser la

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1.1.2. Características Biológicas de Legionella pneumophila

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1.1.3. Morfología de la Membrana de Legionella pneumophila. Antígenos

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas, y por tanto de Legionella, está

Figura 1.1.3.1. Estructura esquemática de la membrana de las bacterias Gram-

En estas membranas se encuentran componentes con actividad antigénica que son

peptidoglycan-associated lipoprotein), el lipopolisacárido (LPS, lipopolysaccharide) y la

Otro componente de la superficie de la membrana de Legionella y de gran interés

1.1.3.1. Lipoproteína Asociada al Peptidoglicano (PAL)

El PAL (o LPPA) es un antígeno soluble de superficie de 19 kDa, común y altamente

El peptidoglicano interacciona con numerosas proteínas de la envoltura celular

enlace N-diacilglicerol e interacciona fuertemente con la capa del peptidoglicano a través de

1.1.3.2. Lipopolisacárido (LPS)

El LPS es un constituyente mayoritario de la pared celular de las bacterias Gram-

Figura 1.1.3.2.1. Estructura del LPS-1 de Legionella pneumophila. Adaptado de

Es importante en la sepsis mediada por bacterias Gram-negativas, aunque el papel

El LPS de la mayoría de los serogrupos de L. pneumophila al ser analizado por SDS-

El LPS de L. pneumophila tiene distintos epítopos de reactividad cruzada de serogrupo51,

1.1.3.3. Proteína Mayoritaria de la Membrana Externa (MOMP)

La membrana externa de todos los serogrupos de L. pneumophila contiene una proteína

MOMP se une al complemento C3 y media en la unión de L. pneumophila por la vía de

estar presente en cepas virulentas y avirulentas, por lo que su papel en la patogénesis se

1.2. Epidemiología y Patogénesis de la Infección por Legionella pneumophila

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1.3. Métodos de Detección de Legionella