Universidad Autónoma Metropolitana-

Iztapalapa

Este manual está dirigido a estudiantes de la UEA Microbiología General, que forma parte del plan de
estudio de las carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial impartidas en la
UAM-Iztapalapa.
Como los estudiantes iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, consideramos de
gran importancia incluir al principio las reglas generales del laboratorio.
En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los
mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de
instrucciones numeradas que se complementan con figuras.
En cada práctica se proponen cuadros, para la recopilación de observaciones y resultados. Al final de
cada práctica se incluyen cuestionarios que el estudiante deberá resolver.
La preparación de soluciones y medios de cultivo que se utilizarán en las prácticas se describe en Anexo.

La presente es una adaptación del “Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología General”.

Aquiahuatl M.A., Volke-Sepúlveda T., Prado L.A.J., Shirai K., Ramírez Vives F., Salazar M. A. 2012.
Universidad Autónoma Metropolitana. 75 pp.

CONTENIDO

PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO ............................................2

PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES ...................................6
PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL ......................................................................................10
PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS..................................................................................................15
PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA...................................18
PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: TURBIDIMETRÍA Y RECUENTO DIRECTO ..........................21
ANEXOS .......................................................................................................................................................................25
 REGLAS DE LABORATORIO*
1. Uso obligatorio de cubrebocas y gel antiséptico a la entrada del laboratorio
2. Usar bata de algodón abotonada que deberá retirarse antes de abandonar el laboratorio. No usar
calzado descubierto y llevar el pelo recogido.
3. Evitar la acumulación de material no relacionado con la práctica sobre la mesa de trabajo.
4. Está prohibido beber, comer y aplicarse cosméticos dentro del laboratorio.
5. Lavar las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio, incluso por breves periodos.
6. No pipetear oralmente ninguna solución o cultivo microbiano; para este fin deben usarse pipetas
adecuadas.
7. Evitar visitas personales y el uso de aparatos que distraigan la atención (audífonos) y pongan en
riesgo la seguridad en el trabajo.
8. Trabajar de manera ordenada y en silencio para evitar accidentes.

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
1. Antes y después de cada sesión, limpiar las mesas de trabajo con desinfectante.
2. Lavarse perfectamente las manos con jabón al final de la sesión.
3. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.
4. Cuando se utilice el mechero, colocarlo alejado del microscopio y otros equipos
5. Los cuadernos, mochilas y prendas de vestir deben colocarse en el lugar destinado para ello, NO
sobre las mesas de trabajo.
6. Al concluir cada sesión, asegurarse de colocar materiales de desecho u objetos contaminados en
recipientes específicos para ello.
7. Todos los equipos utilizados deben dejarse perfectamente limpios y reportar al maestro cualquier
irregularidad en el funcionamiento.
8. En caso de producirse un incendio o una herida, el alumno debe notificarlo de inmediato al profesor.
9. En caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, debe conservar la calma
e informar al profesor. Debe seguirse inmediatamente el siguiente procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión
b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas
c. Dejar transcurrir al menos 15 min, retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado para
la eliminación de materiales contaminados.

MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO

1. Cubrebocas y bata.
2. Manual de laboratorio.
3. Franela, cerillos o encendedor, tijeras, cinta de enmascarar (masking-tape), marcador indeleble,
jabón para manos.

* Instructivo de funcionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones de los laboratorios de Docencia.
Aprobado por el Consejo Académico el 9 de noviembre del 2009

1
 PRIMERA SESIÓN DE LABORATORIO. Explicación práctica 1 y preparación de material

Durante esta sesión se organizarán los equipos, se explicarán las actividades a realizar durante la práctica 1 y se pesarán
los medios de cultivo que se prepararán en la siguiente sesión. El material que cada equipo debe traer en cada sesión es
el siguiente:
 Franela
 Tijeras
 Masking tape
 Encendedor o cerillos
 Personal (obligatorio): cubrebocas y bata

El material que se pedirá durante esta sesión será el siguiente:

Por equipo Por grupo
2 espátulas Medios y reactivos
Agar nutritivo (AN)
Agar papa dextrosa (PDA)
Agar eosina azul de metileno (EMB)

Para la siguiente sesión (práctica 1) y para las sesiones correspondientes a las prácticas 2 y 3, deben ver los videos
correspondientes (video 1, 2 y 3), que podrán encontrar en virtu@mi.

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 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN
Un medio de cultivo es una solución nutritiva usada para cultivar microorganismos. Debido a que el cultivo de
microorganismos en el laboratorio es necesario para su estudio, la selección y preparación de un medio de cultivo debe
atenderse cuidadosamente para que el cultivo tenga éxito. El medio de cultivo debe esterilizarse, lo cual implica la
eliminación completa de organismos y la ausencia absoluta de toda forma de vida (Madigan et al. 2015). La esterilización
insuficiente o la manipulación incorrecta de materiales y/o medios de cultivo conduce a contaminación, resultados
erróneos o pérdida del material biológico, por lo que se requieren buenas prácticas de manejo.
Existen varios métodos para esterilizar materiales y medios de cultivo con fines microbiológicos (Tabal 1). Los métodos
físicos incluyen calor, radiación y filtración, mientras que los químicos implican la aplicación de agentes antimicrobianos,
es decir, compuestos químicos que matan o inhiben el crecimiento microbiano (Madigan et al. 2015). La esterilización
por calor es uno de los métodos más usados en el laboratorio de microbiología. El calor seco desnaturaliza enzimas y
destruye microorganismos por oxidación; un ejemplo de tal método es la exposición directa a una flama o la introducción
a un horno a 150-180°C por 2 h. El calor seco se aplica principalmente para esterilizar asas de inoculación, así como
material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo, soluciones y
cultivos bacterianos para desechar. El equipo más común es el autoclave, que utiliza vapor a 121°C con una presión de
15 lb/in2. El material se mantiene en dichas condiciones por 15-20 minutos para asegurar la inactivación de endosporas,
que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Tabla 1. Métodos de esterilización

Húmedo Vapor a presión (autoclave)
Aire caliente (horno)
Calor
Seco Flameado (calor directo)
Métodos físicos Incineración
No ionizante Rayos ultravioleta, rayos infrarrojos
Radiación
Ionizante Rayos X
Filtración Membranas o filtros
Gases Óxido de etileno
Métodos químicos
Líquidos Alcohol, formaldehido

OBJETIVOS
Conocer los principios generales de la preparación y técnicas de esterilización de diversos materiales y medios de cultivo
de uso común en Microbiología. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.

MATERIALES
Por equipo Por grupo
6 cajas Petri de plástico estériles 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL 2 balanzas analíticas
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 incubadora a 30°C, 1 refrigerador
1 probeta de 250 mL 2 pares de guantes de asbesto
2 parrillas de calentamiento con agitación Papel estraza, algodón y gasa
2 agitadores magnéticos
2 espátulas Medios y reactivos
2 mecheros Fisher Agar nutritivo (AN)
1 piseta con agua destilada Agar papa dextrosa (PDA)
1 piseta con alcohol al 70% Agar eosina azul de metileno (EMB)
Material que cada equipo debe traer cada sesión: franela, tijeras, masking tape, encendedor o cerillos.

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PROCEDIMIENTO

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar y enjuagar el material de vidrio. Escurrir el exceso de agua y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir el
material sobre una toalla o papel de envolver.
2. Preparar 160 mL de agar nutritivo (AN, 23 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Calentar el medio en una parrilla
con agitación constante hasta ebullición (cuidar que no se derrame).
3. Preparar 270 mL de medio agar papa dextrosa (PDA, 39 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Colocar un agitador
magnético y calentar hasta ebullición, cuidando que no se derrame.
4. Preparar 140 mL de medio de cultivo EMB (36 g/L) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. Colocar un agitador
magnético y calentar hasta ebullición. NOTA: ¡Cuidar que no se derrame!
5. El profesor hará la demostración para elaborar tapones y capuchones para los matraces.

Esterilización de medios de cultivo

1. Todos los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo con las siguientes instrucciones:
a. Revisar que el agua esté limpia y el nivel coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario cambiar o
añadir agua destilada.
b. Conectar el autoclave y poner en máximo la perilla de control en calentamiento. Acomodar los medios y materiales
en la canastilla del autoclave y colocarlos dentro.
c. Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor por el
orificio de purga, después cerrar la válvula.
d. Dejar que el equipo alcance 121°C o 15 lb/in2 de presión y mantener estas condiciones por 15 min. Revisar
continuamente el manómetro y regular el control de temperatura a medio o mínimo.
e. Apagar el autoclave, desconectar y dejar que la presión baje a CERO. Quitar la válvula y abrir cuidadosamente la
tapa, desde la parte trasera para evitar que el vapor cause quemaduras. Con ayuda de los guantes de asbesto
retirar la canastilla y, con mucho cuidado, los materiales estériles.

Vertido de los medios en cajas Petri y solidificación

1. Limpiar la mesa con solución de etanol al 70% (v/v), encender los mecheros y colocarlos a 50 cm entre sí: área aséptica.
2. Enfriar los medios de cultivo de los matraces hasta una temperatura aproximada de 45-50°C, que coincide con la
posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin quemarse.
3. Abrir las bolsas con cajas Petri estériles, con tijeras, únicamente en área aséptica (cerca del mechero).
4. Verter en cada caja de Petri ~25 mL de cada medio (2 cajas de AN, 2 de EMB, 2 de PDA), dentro del área aséptica.
Dejar que los medios enfríen y solidifiquen. Guardar en refrigeración el resto de los medios hasta su uso.

Prueba de esterilidad de materiales

1. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona aséptica (junto al mechero). Etiquetar.
2. Abrir una caja Petri de cada medio durante 1 minuto en una zona NO aséptica. Etiquetar.
3. Colocar las cajas Petri a 30°C durante 24-48 horas, con la tapa hacia abajo.
4. Revisar las cajas para observar la formación de colonias microbianas en la superficie de los medios.

RESULTADOS
 Reportar crecimiento microbiano en forma cualitativa (Cuadro 1): (-) ausencia de crecimiento, (+) crecimiento regular
y (++) crecimiento abundante.
 Describir la morfología (forma, color, apariencia y características visibles) de las colonias observadas.

4
DISCUSIÓN
 Discutir los resultados con base en la efectividad de la esterilización y manejo de los materiales: ¿fueron efectivos
dichos procesos? ¿por qué? Base su discusión en la bibliografía.
 Discutir acerca de las diferencias observadas en el crecimiento (tipo de microorganismos observados) para cada
medio de cultivo. Base su discusión en la bibliografía.

CUESTIONARIO
1. ¿Cómo funciona la esterilización por calor húmedo? ¿Cuál es la diferencia de la aplicación de calor húmedo por
autoclave y la ebullición?
2. Explique las diferencias entre la esterilización y la pasteurización. ¿Es la pasteurización un método de esterilización?
¿Por qué?
3. Explique los términos contaminación (relativa a la microbiología), asepsia, esterilización y pasteurización.
4. ¿Qué es un medio de cultivo y para qué se utiliza? Con base en su uso ¿qué tipos generales de medios pueden
encontrarse?
5. Mencione tres métodos de esterilización diferentes al calor húmedo, y cite tres ejemplos de materiales para los que
cada uno puede aplicarse.

Cuadro 1. Descripción de colonias en cajas Petri con medios de cultivo.

Abierta al aire Abierta en área aséptica

Medio de cultivo
Crecimiento* Morfología Crecimiento* Morfología

Agar nutritivo (AN)

Agar EMB (EMB)

Agar papa dextrosa

(PDA)

* (-) sin crecimiento; (+) crecimiento regular; (++) crecimiento abundante

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 PRÁCTICA 2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS GENERALES, SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos en la naturaleza se encuentran como poblaciones mixtas. Para estudiarlos de manera individual,
éstos deben separarse (aislarse), obteniendo un cultivo puro o axénico. Un cultivo puro está formado por un solo tipo de
microorganismo y es indispensable para conocer sus características morfológicas y estructurales, actividad bioquímica,
patogenicidad, sensibilidad a antibióticos y para su identificación.
El aislamiento de microorganismos puede realizarse por métodos de dilución y siembra en medios sólidos o líquidos,
considerando que cada célula bacteriana que se separa da origen a una colonia visible a simple vista. Una limitación de las
técnicas de dilución es que no son útiles para aislar un microorganismo a partir de muestras donde éste se encuentra en
pequeñas cantidades; en tal caso, se obtendrán los microorganismos dominantes. Para favorecer el aislamiento de
microorganismos encontrados en baja concentración, se aplican métodos de cultivo especializados, en los que se usan
medios con nutrientes especiales, antibióticos, alta concentración de sales y/o se controlan las condiciones de pH, luz o
temperatura. Estos medios se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
Otro tipo de medios útiles para caracterizar e identificar especies bacterianas, son los conocidos como diferenciales.
Dichos medios contienen componentes como sangre, colorantes e indicadores, y sirven para distinguir entre diferentes
especies bacterianas de acuerdo con la forma en que metabolizan los sustratos. Estas diferencias comúnmente se
manifiestan por cambios en la apariencia del medio.

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda una de las técnicas de aislamiento para la obtención de cultivos microbianos puros y la aplicación
de medios de cultivos diferenciales y selectivos.

MATERIALES
Por equipo Por grupo
Matraces con medio EMB, PDA y AN 1 incubadora a 30°C
18 cajas Petri de plástico estériles 1 refrigerador
2 mecheros Fisher Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
2 asas de inoculación
2 parrillas de calentamiento con agitación
1 piseta con alcohol etílico al 70%
1 espátula

PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará cultivos puros de bacterias Gram positivas (Bacillus sp. y Kocuria rosea) y Gram negativas
(Escherichia coli), y un cultivo de una levadura (Saccharomyces cerevisiae).

Vaciado de medios a cajas estériles

1. Fundir los medios preparados en la práctica 1 (PDA, EMB y AN): cuidado de que no se derramen!!!
2. En área aséptica, vaciar los medios en cajas estériles y dejar que se enfríen: 5 de AN, 4 de EMB, 9 de PDA.

Técnica de estría cruzada (Figura 1)

1. Dividir cada caja Petri en cuatro cuadrantes, por la parte de atrás. Esterilizar el asa con calor en el mechero. Dejar
enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia
2. Inocular cada muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja,
cerrar la caja. Flamear el asa de inoculación y girar la caja Petri un cuarto de vuelta.
3. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fría, tocar el final del primer grupo de estrías y hacer
un segundo grupo igual que el anterior. Repetir el procedimiento en el tercer cuadrante y cuarto cuadrante,
realizando en este último una estría más abierta (simple).

6
4. Las cajas se incuban a 35°C durante 24-48 horas con la tapa hacia abajo.

Figura 1. Técnica de siembra por estría cruzada en cajas Petri

RESULTADOS
 Describir la morfología colonial de cada cultivo microbiano (Cuadros 1-3). Base su descripción en los esquemas de
la Figura 2.
DISCUSIÓN
 Comparar los resultados obtenidos con la literatura, en cuanto a la morfología de cada microorganismo y a su
crecimiento en los diferentes medios (¿corresponden o no?).
 Discutir (explicar) por qué hay diferencias en el crecimiento de cada microorganismo en cada uno de los medios
utilizados.
 Discutir acerca de si se logró el aislamiento de colonias o no y a qué podría deberse.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Qué nutrientes proporciona a los microorganismos?
2. Describa los siguientes tipos de medios y para qué se utilizan: medio definido, medio complejo, medio selectivo y
medio diferencial. Dé un ejemplo de cada tipo
3. ¿Qué son las peptonas y el extracto de levadura? ¿Por qué se utilizan para la preparación de medios de cultivo?
4. Describa brevemente cuál es el propósito de realizar estrías en una placa de agar.
5. Investigue la composición química de los medios AN, EMB y PDA. Con base en su composición, indique: (a) ¿Cómo
se clasifica cada medio (definido, complejo, selectivo, diferencial) ¿por qué?; (b) ¿cuáles son los agentes selectivos
y/o diferenciales en cada uno?

Figura 2. Características de la morfología colonial de bacterias sobre un medio de cultivo sólido

Forma Borde Elevación Superficie

Suave, rugosa, opaca,

brillante, mucosa, seca,
pulverulenta

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 Cuadro 1. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio AN

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

Cuadro 2. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio EMB

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

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 Cuadro 3. Morfología colonial de cultivos microbianos en medio PDA

Microorganismo

Color

Tamaño (mm)

Forma

Borde

Elevación

Superficie

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 PRÁCTICA 3. TÉCNICAS DE TINCIÓN SIMPLE Y DIFERENCIAL

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos vivos generalmente son incoloros (excepto algas y cianobacterias), pero pueden observarse
directamente en una suspensión acuosa con el uso de un microscopio de campo obscuro o de contraste de fases. En un
microscopio óptico de campo claro no se pueden observar los microorganismos debido a la falta de contraste entre las
células y el medio, por lo que deben fijarse y teñirse en un frotis. Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña cantidad
de una suspensión microbiana sobre un portaobjetos, que se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos. Lo anterior
causa la inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de las características celulares.
De acuerdo con los objetivos de estudio y el tipo y número de soluciones colorantes empleadas, existen tres tipos de
tinción: simple, diferencial y selectiva. La tinción simple emplea un solo colorante y la célula se tiñe uniformemente; la
tinción diferencial usa más de un colorante y permite diferenciar microorganismos con base en sus características
superficiales. La técnica más usada en bacteriología es la propuesta por Christian Gram (1884), que clasifica a las bacterias
en dos grupos: Grampositivas (color azul-violeta) y Gramnegativas (color rojo-rosa). Estas diferencias se deben a
diferencias en la estructura y composición de la pared celular de las bacterias. La tinción selectiva permite observar
estructuras especializadas, como endosporas y cápsulas, que son útiles para la clasificación taxonómica de bacterias. Por
ej., la tinción de endosporas permite identificar bacterias productoras de endosporas de los géneros Bacillus y Clostridium.

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más utilizadas en el estudio microscópico
de cultivos microbianos, así como la observación de su morfología microscópica.

MATERIALES
Por equipo Por grupo
2 mecheros Fisher Papel seda
2 asas de siembra Etanol absoluto
10 portaobjetos Acetona
1 piseta con agua destilada Papel estraza
1 piseta con alcohol etílico al 70% 1 frasco gotero con azul de metileno
2 microscopios ópticos Refrigerador
1 frasco gotero con aceite de inmersión Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
1 probeta de 100 mL
Juego de colorantes de Gram

PROCEDIMIENTO
El estudiante preparará frotis, hará tinción simple y tinción de Gram de bacterias Gram (+) y Gram (-), de una levadura
(S. cerevisiae) y de una muestra problema.

Preparación de frotis
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
2. Los frotis de cultivos líquidos o sólidos deben prepararse de manera diferente (Figura 1).
Medio sólido
a) Colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
b) Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar enfriar el asa para evitar
la destrucción de los microorganismos al tomar la muestra.
c) Acercar la caja Petri al mechero, abrirla y tomar una pequeña muestra de la superficie de una colonia, mezclar la
muestra en el agua sobre el portaobjetos, distribuirla suavemente y fijar.

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 Medio líquido
a) Esterilizar el asa, quitarle el tapón al tubo de cultivo y flamear rápidamente la boca del mismo.
b) Introducir el asa en el tubo y tomar la muestra
c) Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir este procedimiento 3 veces más, colocando la muestra en el mismo sitio.

Fijación del frotis

1. Los frotis se fijarán con calor. Para esto, el frotis se pasa rápidamente 2-3 veces por la flama del mechero y se deja
enfriar. Este procedimiento debe repetirse hasta que la muestra esté seca (Figura 1).

Figura 1. Preparación y fijación de frotis.

Tinción simple
1. Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire.

Tinción de Gram
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 60 segundos.
2. Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante
3. Eliminar el exceso de agua y cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. Lavar con agua destilada.
4. Inclinar el portaobjetos y aplicar decolorante gota a gota hasta que no fluya más colorante. Lavar con agua destilada.
5. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos.
6. Lavar nuevamente con agua, quitar el exceso de agua y dejar secar al aire.

Observación al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda
2. Realizar iluminación Kohler al microscopio. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo
las indicaciones del profesor. Abrir el diafragma y hacer observaciones.
3. Colocar el portaobjetos en la platina y localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de
100X, colocando previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. El aumento total de
un objeto se calcula multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo usado (en general los oculares poseen
diez aumentos y los objetivos varían de 10x a 100x).

11
4. Iniciar las observaciones con las muestras de microorganismos conocidos y, al final, observar la muestra problema:
comparar tamaño, forma, agrupación y reacción Gram de las células en la muestra.
5. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite
y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

RESULTADOS
 Reportar, en los cuadros correspondientes, las observaciones microscópicas de la forma, agrupación y tamaño
relativo de cada microorganismo observado. Basar los resultados anteriores en los diagramas de la Figura 2.

DISCUSIÓN
 Para cada microorganismo: comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura y discutir
(explicar) acerca de las similitudes o diferencias encontradas (¿coinciden? ¿por qué?).
 Reportar y concluir acerca de la morfología de los microorganismos que contiene la muestra problema: tipo de
célula (eucariota/procariota), morfología microscópica (cocos, bacilos, etc.).
 Justificar (explicar) cómo se llegó a ese resultado.

Figura 2. Principales tipos de agrupaciones y morfología microscópica de bacterias: cocos y bacilos.

CUESTIONARIO
1. Desde un punto de vista químico ¿qué es un colorante y cuáles son sus principales características?
2. ¿Qué es un microscopio de luz? Mencione tres tipos de microscopios de luz
3. ¿Qué es un frotis? ¿En qué consiste la fijación de un frotis y cuál es el propósito de tal procedimiento?
4. ¿Qué es el aceite de inmersión y para qué se utiliza en la microscopía óptica?
5. ¿La tinción de Gram es útil para la clasificación de levaduras? ¿Por qué?

12
 Cuadro 1. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción simple
Microorganismo
Característica
Problema

Aumento total:

Tamaño (μm):

Forma:

Agrupación:

Endosporas:
 Edad del cultivo
 Tamaño
 Localización

Cuadro 2. Observaciones microscópicas de cultivos con tinción de Gram

Microorganismo
Característica
Problema

Aumento total:

Tamaño (μm):

Forma:

Agrupación:

Gram:

Endosporas:
 Edad del cultivo
 Tamaño
 Localización

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 SESIÓN DE PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA LAS PRÁCTICAS 4 Y 5

Materiales
Por equipo Por grupo
4 cajas Petri con 25 mL de PDA Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
1 asa de siembra 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
15 pipetas de 1 mL y 1 pipeta de 10 mL 2 balanzas analíticas
2 mecheros Fisher 2 pares de guantes de asbesto
1 probeta de 250 mL Incubadora a 30 °C
7 tubos con tapón de rosca de 15 mL Refrigerador
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL Papel estraza, algodón y gasa
1 matraz aforado de 100 mL
1 probeta de 100 mL
Medios y reactivos
1 pipetero metálico
Agua destilada
1 parrilla de calentamiento con agitación
NaCl
1 piseta con agua destilada
Agar nutritivo (AN)
1 piseta con alcohol etílico al 70%
1 agitador magnético
1 gradilla
1 espátula
Propipetas de 5 y 10 mL

ACTIVIDADES PRÁCTICA 4
1. Siembra de hongos filamentosos:
 Separar cuidadosamente una parte de micelio de los hongos proporcionados con el asa de siembra previamente
esterilizada en la flama del mechero.
 Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete).
2. Incubar en forma invertida las cajas inoculadas, colocadas en una bolsa de plástico (sin sellar), a 30°C durante 3-5
días.

ACTIVIDADES PRÁCTICA 5
1. Preparar 250 mL de medio AN en un matraz de 500 mL.
2. Preparar 100 mL de solución isotónica (NaCl 0.9%) en un matraz aforado de 100 mL. Distribuirla en 7 tubos,
adicionando 9 mL por tubo.
3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero.
4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in2 durante 15 min. Guardar en refrigeración.

14
 PRÁCTICA 4. CULTIVO Y MORFOLOGÍA DE HONGOS

INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos eucariotas, por lo que resultan de mayor tamaño y complejidad que las bacterias. Se distinguen
de otros organismos eucariotas por ser inmóviles, y de las algas y las plantas, por carecer de pigmentos fotosintéticos.
Son de nutrición heterótrofa, ya que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono; dichos compuestos son
disueltos extracelularmente por enzimas específicas, y son absorbidos a través de la pared y la membrana celular.
Los hongos pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las levaduras tienen forma esférica u
oval y se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza; con frecuencia forman una cubierta pulverulenta sobre
frutos y hojas. Éstas se reproducen asexualmente por gemación, un proceso por el cual brota una yema de la célula
madre que, posteriormente, se separa como célula individual.
Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica llamada hifa, y el conjunto de hifas
ramificadas forma el micelio. Las hifas de muchos hongos presentan tabiques transversales o septos, excepto las del
grupo Zygomycota, cuyas hifas se conocen como cenocíticas. La principal forma de reproducción de los hongos filamentosos
es asexual, a través de la producción de esporas en estructuras reproductoras llamadas conidióforos y esporangióforos.
La presencia de estructuras reproductoras sexuales es uno de los criterios de clasificación, lo que permite ubicar a los
hongos verdaderos en las divisiones: Chytridiomycota, Zygomycota, Glomeromycota, Basidiomycota y Ascomycota. Otros
criterios importantes para la clasificación de los hongos son las características de las hifas, la formación de esporas
asexuales y las estructuras reproductoras asexuales.

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda las técnicas de cultivo y manipulación de hongos filamentosos. Que conozca las características
morfológicas macroscópicas y microscópicas como criterios de identificación de hongos filamentosos.

MATERIALES
Por equipo Por grupo
4 cajas Petri con 25 mL de PDA Papel seda
2 mecheros Fisher Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
8 portaobjetos Incubadora a 30 °C
1 piseta con alcohol etílico al 70% Refrigerador
1 piseta con agua destilada
1 frasco gotero con azul de lactofenol
2 microscopios ópticos
Aceite de inmersión
*NOTA: cada equipo deberá traer cinta adesiva transparente (Diurex) de 1 pulgada ancho.

PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos de Aspergillus niger, Penicillium sp., Rhizopus oligosporus y Fusarium sp.
El estudiante inoculará cada cepa en cajas de Petri con PDA y hará la descripción macroscópica y microscópica de cada
hongo. Para la observación microscópica se utilizará cinta adhesiva transparente y azul de lactofenol como colorante.

Siembra de hongos filamentosos

1. Para sembrar los hongos filamentosos, se separa cuidadosamente una parte de micelio de los hongos
proporcionados con el asa de siembra previamente esterilizada en la flama del mechero.
2. El micelio se coloca en el centro de una caja de Petri con medio PDA (inoculación por piquete).
3. Las cajas de Petri inoculadas se incuban en forma invertida a 30°C durante 5-7 días.

Descripción macroscópica
Describir las siguientes características de los hongos filamentosos:

15
 a) Forma, tamaño y tipo de colonia
b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio
c) Color del micelio y color de las esporas
d) Cambios en el medio de cultivo

Descripción microscópica por montaje con cinta adhesiva

1. Cortar una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente, con cuidado de tomarla solo por los extremos.
2. Abrir la caja Petri cerca del mechero y presionar suavemente la cinta adhesiva sobre la periferia de la colonia.
3. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos.
4. Colocar suavemente la cinta con la muestra sobre la gota de azul de lactofenol, evitando la formación de burbujas
y sin alterar las estructuras. La cinta funciona como cubreobjetos.
5. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 100X.
Localizar y observar hifas, determinar si presentan septos o no, buscar estructuras especializadas como
esporangióforos, esporangios, conidióforos, conidias y rizoides.

RESULTADOS
 Reportar las observaciones realizadas en el Cuadro 1.
 Investigar en la literatura la clasificación jerárquica de los hongos estudiados y reportarlo en el Cuadro 1.

DISCUSIÓN
 Comparar las observaciones realizadas con la bibliografía: si corresponden o no y a qué se debe el resultado.

CUESTIONARIO
1. Mencione cinco características de los hongos verdaderos
2. ¿Qué son las conidias? ¿En qué se diferencia una conidia de una hifa? ¿En qué se diferencia una conidia del micelio?
3. Explique las principales diferencias entre los Chitridiomycetos y el resto de los hongos verdaderos
4. Mencione tres ejemplos de hongos Ascomycetos comestibles, indicando su nombre común y el científico
5. Describa un ejemplo del uso industrial de tres hongos filamentosos diferentes

16
 Cuadro 1. Descripción morfológica de hongos en medio PDA

Cepa
Característica

Descripción macroscópica (colonias)

Color del micelio

Color de las esporas

Tamaño (cm)

Aspecto

Descripción microscópica con un aumento total de:

Tipo de hifas:
 Septos (si/no)
 Diámetro (μm)

Estructura reproductora:
 Nombre
 Tamaño (μm)

Tipo de esporas:
 Nombre
 Tamaño (μm)

Clasificación jerárquica
completa
(reino, división, clase...)

17
 PRÁCTICA 5. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA

INTRODUCCIÓN
El crecimiento microbiano se puede estimar mediante el número de células o la masa celular. Para ello, existen métodos
directos, como el recuento de células, e indirectos, como la cuantificación de la cantidad de proteína. El método más
utilizado en microbiología para cuantificar células viables (vivas), es el recuento en placa con medios de cultivo
específicos para la población de interés. Para llevar a cabo un recuento en placa pueden emplearse dos técnicas: siembra
en superficie o vertido en placa. En ambos casos, a la muestra a cuantificar se le aplica el método de diluciones sucesivas
y cada dilución se deposita en cajas de Petri estériles. La técnica por vertido en placa es la más utilizada y, generalmente,
se emplea para estimar poblaciones microbianas en aguas, suelos y alimentos, entre otros.
Este método directo se basa en la suposición de que cada célula bacteriana presente en la superficie de un medio con
agar (medio sólido), se multiplica y produce una colonia visible llamada unidad formadora de colonia (UFC). Después de
la incubación, se cuentan las colonias desarrolladas; este número, multiplicado por el inverso de la dilución correspondiente
(factor de dilución), permite estimar el número de microorganismos viables. El resultado de este método debe
considerarse como una estimación aproximada del número total de microorganismos en una muestra, ya que depende
del tipo de medio de cultivo utilizado. También pueden presentarse problemas debidos a la falta de homogeneidad de
las diluciones y durante la inoculación. El número de UFC puede subestimarse si las células no se separan bien, o bien,
puede sobreestimarse si la muestra no se homogeneiza antes de tomarla, pues los microorganismos se concentran en el
fondo del tubo por gravedad.

OBJETIVOS
Que el alumno aprenda la técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables.

MATERIALES
Por equipo (sesión 1: ya lo hicieron) Por grupo (sesión 1)
15 pipetas de 1 mL y 2 pipetas de 10 mL 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
2 mecheros Fisher 2 balanzas analíticas
7 tubos con tapón de rosca de 15 mL 2 pares de guantes de asbesto
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL Incubadora a 30 °C
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL Refrigerador
1 matraz aforado de 100 mL Papel estraza, algodón y gasa
1 parrilla de calentamiento con agitación
1 piseta con agua destilada
Medios y reactivos
1 pipetero metálico
Agua destilada
1 gradilla
NaCl
1 espátula
Agar nutritivo (AN)
Propipetas de 5 y 10 mL
Por equipo (sesión 2) Por grupo (sesión 2)
10 cajas de Petri estériles 1 incubadora a 35 °C
2 vasos de precipitados de 50 mL Refrigerador
1 piseta con alcohol etílico al 70% Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
1 piseta con agua destilada Papel estraza
1 gradilla
2 mecheros Fisher
Propipetas de 1 y 5 mL
1 agitador de tubos tipo Vórtex
1 parrilla de calentamiento con agitación
*NOTA: cada equipo deberá traer una muestra líquida (~10 mL) que puede ser: pulque, agua de alfalfa o fresa, jugo de
zanahoria, agua de charco, etc.

PROCEDIMIENTO
Cada equipo debe traer una muestra líquida en la que se determinarán las UFC, usando diluciones decimales y siembra
en placas con medio de cultivo.

18
Preparación de medios y reactivos (una sesión antes)
1. En un matraz de 500 mL, preparar 250 mL de medio AN.
2. En un matraz aforado de 100 mL, preparar solución isotónica (NaCl 0.9%) y distribuirla en 7 tubos, adicionando 9 mL
por tubo.
3. Colocar algodón a las pipetas y acomodarlas en un pipetero.
4. Esterilizar todo el material preparado en autoclave a 15 lb/in2 durante 15 min. Guardar en refrigeración.

Técnica de dilución y siembra en placa

1. En condiciones asépticas, tomar 1 mL de muestra y depositarlo en un tubo con 9 mL de solución isotónica. Este tubo
corresponde a una dilución 10-1. Hacer diluciones decimales de la muestra hasta 10-7 (Figura 1). Etiquetar los tubos
con la dilución correspondiente.
2. Para inocular por la técnica vertido, por duplicado y bajo condiciones asépticas: tomar 1 mL de las diluciones 10 -2,
10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 y ponerlo en una caja de Petri estéril. Añadir 20 mL de medio AN fundido TIBIO (~50°C) (Figura
2).
3. Homogeneizar el medio con movimientos circulares y suaves para que no salga el medio de la caja (observar las
indicaciones del profesor) y dejar solidificar cerca del mechero.
4. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C durante 72 horas y realizar el conteo de colonias. Se selecciona
únicamente la dilución donde la cuenta de colonias sea entre 30 y 300.
5. La cantidad de microorganismos por gramo o mL de muestra (UFC/mL) se calcula multiplicando el número de
colonias promedio por el factor de dilución (FD) y dividiendo entre la cantidad (g o mL) inicial de muestra:

UFC/mL = (no. colonias promedio x FD)/mL de muestra .

FD = 1/dilución = vol. total de líquido (agua + muestra)/vol. de muestra .

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

…
Tubos con 9 mL de sol. isotónica estéril
Muestra

10-3 10-6 10-7

Dilución 10-1 10-2 10-3 … 10-6 10-7

Factor de dilución 10 100 1000 … 106 107

Figura 1. Técnica de dilución y cuenta en placa por la técnica de vertido

Figura 2. Técnica de cuenta en placa por la técnica de vertido

19
RESULTADOS
 Calcular las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mL de muestra (UFC/mL) y reportar los resultados
en el Cuadro 1. Incluir todos los cálculos realizados para obtener las UFC/mL.

DISCUSIÓN
 Discutir acerca de si los datos obtenidos son congruentes o no y por qué.
 Buscar en la bibliografía cuál es la microflora común de la muestra utilizada y discutir al respecto.

CUESTIONARIO
1. Describa tres métodos para obtener cultivos microbianos axénicos. Compare las ventajas y desventajas de cada uno.
2. Explique por qué razón la cuenta microbiana por el método de dilución y recuento en placa se reporta como UFC
3. Explique por qué razón las pipetas deben cambiarse entre las diferentes diluciones durante la siembra
4. Se quiere conocer la cuenta microbiana de una muestra de agua de una laguna. La muestra se analiza por dos
métodos: cuenta en placa y conteo directo al microscopio. Se encontró que, por el método de recuento en placa, el
número de células fue menor que las encontradas por conteo directo al microscopio. ¿A qué se debe este resultado?
5. Indique el factor de dilución (FD) y determine el número de células/mL para cada uno de los cultivos mostrados en
la tabla, si el número total de colonias y la dilución final fueron los siguientes*:

No. de colonias Dilución final FD UFC/mL

-4
225 10
52 10-3
95 10-6
197 10-5
* Considere que, en cada caso, se inoculó 0.2 mL de suspensión celular.

Cuadro 1. Cuenta viable en placa

UFC/ caja Promedio de Desviación Factor de Cuenta viable en
Muestra analizada
Caja 1 Caja 2 UFC estándar* dilución (FD) placa (UFC/mL)

* Desviación estándar. Calcule la DS de la cuenta viable y reporte los resultados como el promedio de UFC/mL ± la DS
correspondiente

20
 PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: TURBIDIMETRÍA Y RECUENTO DIRECTO
INTRODUCCIÓN
La concentración de la biomasa microbiana es un parámetro importante que debe estimarse en diversos bioprocesos.
Existe una serie de métodos directos e indirectos para estimar la biomasa de un cultivo. Uno de los métodos directos
más comunes para cuantificar la biomasa microbiana en una muestra líquida es la turbidimetría. La turbidez de una
suspensión microbiana resulta de la dispersión de la luz por las células. Como la cantidad de luz dispersada por una
suspensión es directamente proporcional al número de células, el crecimiento microbiano (que implica un aumento en
el número de células) se refleja en un aumento en la turbidez de la suspensión. Estos cambios en la turbidez se cuantifican
en un espectrofotómetro, que mide la cantidad de luz que pasa a través de un medio líquido. El crecimiento medido de
esta manera comúnmente se reporta como un cambio en la densidad óptica (DO), el cual es directamente proporcional
a la concentración celular.
Es posible relacionar la DO de una suspensión microbiana con el número de células o la masa celular de dicha muestra.
Con el uso de una tinción adecuada y una cámara de recuento es posible contar el número de células en un volumen
determinado, determinando así la concentración celular en una suspensión. Las cámaras de recuento sirven para
cuantificar el número de partículas (p.ej. bacterias, esporas fúngicas, polen) por unidad de volumen en un líquido, a
través de su conteo visual bajo un microscopio. A la fecha, el tipo de cámara más utilizado para el recuento directo de
células es la cámara de Neubauer (o hemocitómetro), que es una pieza de cristal grueso con el tamaño de un
portaobjetos, en donde se coloca un pequeño volumen de la suspensión a analizar.

OBJETIVOS
Que el alumno compare las técnicas de turbidimetría y conteo directo al microscopio para cuantificar los
microorganismos totales en una suspensión microbiana.
MATERIALES
Por equipo (sesión 1) Por grupo
3 pipetas Pasteur 2 autoclaves con base, canastilla y válvula
1 cámara de Neubauer 2 pares de guantes de asbesto
5 cubreobjetos Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
1 gradilla Algodón
1 asa microbiológica Bolsas de plástico para esterilizar
3 tubos de ensaye con tapón de rosca de 25 mL
3 tubos de ensaye de 25 mL
2 pipetas de 10 mL
3 pipetas de 1 mL
2 propipetas de 1 y 10 mL
2 mecheros Fisher
1 espectrofotómetro
2 celdas para espectrofotómetro
1 vórtex
2 microscopios ópticos
1 piseta con alcohol etílico al 70%
1 piseta con agua destilada
Frasco gotero con azul de metileno

PROCEDIMIENTO
El profesor proporcionará suspensiones microbianas de dos o tres diferentes microorganismos. Se cuantificará la biomasa
microbiana de cada suspensión, midiendo la densidad óptica (turbidez) y realizando una cuenta directa al microscopio.

21
Tinción y observación de muestras
1. De cada suspensión, tomar una muestra de aproximadamente 5 mL y colocarla en un tubo previamente etiquetado
que identifique la muestra.
2. Preparar frotis de cada muestra (microorganismo).
 Lavar los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
 Preparar los frotis de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3 para cultivos líquidos (Figura 1).
3. Fijar los frotis con calor: pasar el frotis 2-3 veces por la flama del mechero hasta la eliminación total del líquido.
4. Realizar tinción simple con azul de metileno, de acuerdo al procedimiento descrito en la práctica 3.
 Cubrir el frotis con 1 gota de azul de metileno durante 60 segundos.
 Eliminar el exceso de colorante con la piseta de agua destilada y dejar secar al aire.
5. Observación al microscopio:
 Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda y realizar iluminación Kohler.
 Colocar el portaobjetos con el frotis de cada muestra en la platina y localizar la preparación con el objetivo de
10X, posteriormente pasar al de 100X. Antes de usar el objetivo de 100X, es importante colocar una pequeña
gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
NOTA: Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.

Cuantificación de microorganismos
1. Con la muestra de cada suspensión, realizar la medición de densidad óptica y el conteo directo al microscopio como
se indica a continuación.
2. Turbidimetría (DO). Homogeneizar la muestra en vórtex y leer la densidad óptica (DO) de la suspensión a 560 nm
(no desechar la muestra). Calibrar el equipo con agua destilada. Si la DO es mayor a 0.8, deben hacerse diluciones
con agua destilada. La dilución debe considerarse al registrar el dato de la concentración total de células/mL en el
Cuadro 10. Recuerde que:

V total de líquido (agua + muestra)

FD =
V muestra

3. Cuenta directa al microscopio. Homogeneizar la muestra en vórtex, tomar un pequeño volumen con una pipeta
Pasteur y colocar una gota cuidadosamente en la cámara de Neubauer, debajo del cubreobjetos de acuerdo con las
instrucciones del profesor (Figura 1).

Figura 1. Esquema de la observación de células en la cámara de Neubauer

 Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
 Colocar la cámara en la platina del microscopio y ubicar la cuadrícula con el objetivo 10X. Al observar el cuadro
central en el objetivo 40X, éste se encuentra dividido en una cuadrícula de 5X5 cuadros más pequeños.

22
  Las células se cuantifican en el objetivo de 40X, contando en diagonal las células de 9 cuadros (Fig. 1), a su vez
divididos en 16 más pequeños. El conteo se realiza en el área delimitada por tres líneas: las células que tocan el
borde izquierdo y superior (células negras, Fig. 1) se cuentan, mientras que las que tocan el borde derecho e
inferior (células grises, Fig. 1) no se cuentan. Es recomendable que el número de células a contar se encuentre
alrededor de 30 por cuadro.
 En el caso de muestras muy concentradas, será necesario hacer diluciones (1:2, 1:5, 1:10 etc.) y considerar el
factor de dilución (FD) para los cálculos. Para calcular el número de células/mL se utiliza la siguiente ecuación:
Células/mL = Número promedio de células x 25 cuadros x 10 4 x FD
 El número promedio de células por cuadro (de 0.2 mm) se multiplica x25 para obtener el número total de células
en un volumen de 0.1 mm3 (volumen de la cámara = 1 mm por lado x 0.1 mm de profundidad). Este valor debe
multiplicarse por 104 para obtener el número de células/mL.
NOTA: Al finalizar, la cámara debe lavarse con agua destilada y secarse cuidadosamente con papel seda.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 De acuerdo con la morfología microscópica (tamaño, forma) de las células observadas, indique el tipo de
microorganismo (bacteria, hongo, alga, protozoario) que contenía cada muestra y repórtelo en el Cuadro 1.
 Reporte en el Cuadro 2 los datos de la densidad óptica para cada muestra.
 Discusión. (i) comente acerca de la relación entre la DO de una muestra y el número de células que ésta contiene;
(ii) justifique cómo llegó a la conclusión del tipo de microorganismo que contenía cada muestra (Cuadro 1); (iii)
discuta sus resultados con base en la conveniencia de cada método para cuantificar las células microbianas
contenidas en cada muestra: ¿Es posible utilizar ambos métodos para los microorganismos en estudio? ¿Por qué?
De acuerdo con la experiencia de la práctica ¿para qué tipo de células conviene usar cada método?

CUESTIONARIO
1. Explique las ventajas y desventajas del uso de cámaras de recuento para la cuantificación de microorganismos.
2. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara de Neubauer para cuantificar
microorganismos. ¿En qué casos conviene usar uno u otro?
3. Ejemplifique dos aplicaciones de estas metodologías (recuento directo en cámara y turbidimetría) en: (a) alimentos
y (b) microbiología industrial.
4. A partir de los siguientes datos encontrados en una suspensión microbiana después del conteo de células en una
cámara de Neubauer, calcule: (a) el factor de dilución (FD) y (b) el número de células/mL en el cultivo original.

No. promedio de Vol. inicial de Vol. de agua para

Factor de dilución Células/mL
células muestra (mL) dilución (mL)
25 0.5 2
35 1 1
5 2 6

23
 Cuadro 1. Observación morfológica y características generales de los microorganismos.
Muestra
Característica

Morfología
microscópica

Tamaño celular (μm)

Color de las células

Movilidad (si/no)

Agrupación (si/no)

Características de la
suspensión
Tipo de célula
(procariota/eucariota)
Tipo de microorganismo
(hongo, bacteria…)

Cuadro 2. Cuantificación de microorganismos por turbidimetría y conteo directo en cámara de Neubauer*.

Turbidimetría Cámara de Neubauer

Microorganismo Número promedio Número de
DO (560 nm)** DS FD
de células/cuadro células/mL

* DS: desviación estándar; FD: factor de dilución; DO: densidad óptica; ** para este dato, considere el FD aplicado.

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 ANEXOS

A. SOLUCIONES Y COLORANTES

Reactivos de Gram
Cristal violeta. Este colorante se prepara de la siguiente manera:
a. Solución A: en un vaso de precipitados de 50 mL, colocar 1 g de cristal violeta y disolver con 10 mL de etanol.
b. Solución B: en otro vaso de precipitados, disolver 0.4 g de oxalato de amonio en 40 mL de agua destilada
c. Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en la oscuridad durante 24 h.
d. Filtrar con papel Whatman No. 1 o 4 y guardar la solución en frascos goteros.
Solución de lugol. En un matraz aforado de 50 mL colocar 20 mL de agua destilada y disolver 0.2 g de yoduro de potasio.
A continuación agregar, poco a poco, 0.1 g de yodo, mezclar completamente y aforar con agua destilada. Guardar la
solución en un frasco gotero
Solución decolorante alcohol-acetona. Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alcohol etílico y 20 mL de acetona,
mezclar perfectamente. Poner esta solución en un frasco gotero. Puede emplearse solamente alcohol.
Safranina. En un matraz aforado de 50 mL, colocar 5 mL de alcohol etílico y disolver 0.125 g de safranina. Aforar con
agua destilada, filtrar y guardar la solución en un frasco gotero.

Colorantes y reactivos
Azul de metileno. Pesar 0.25 g de azul de metileno y disolverlo en 50 mL de agua destilada. Guardar la solución en un
frasco gotero.
Azul de metileno alcalino. Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mL
de una solución de hidróxido de potasio al 0.01%.
Azul de lactofenol. Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales) en 20 mL de agua destilada, agregar lentamente 10
g (16 mL) de ácido láctico y 40 g (31 mL) de glicerol. Mezclar en parrilla de agitación durante 10 minutos y agregar 0.05 g
de azul de metilo o fucsina ácida
Verde de malaquita. Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita en 100 mL de agua destilada.
Solución salina isotónica. Disolver 0.9 g de NaCl en agua destilada y aforar a 100 mL.

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B. MEDIOS DE CULTIVO

1. Caldo nutritivo (CN)

Ingrediente (g/L)
Peptona de caseína 5.0
NaCl 8.0
Extracto de carne 3.0
pH 6.5-7.0

2. Agar de eosina - azul de metileno (EMB-agar)

Ingrediente (g/L)
Peptona de gelatina 10.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
K2HPO4 2.0
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
Agar 15.0

3. Papa-Dextrosa Agar (PDA)

Ingrediente (g/L)
Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Agar 15.0
pH 5.6

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