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Enrique Durán Páramo

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Práctica 6.- “Efecto de la concentración inicial de sustrato

sobre la actividad enzimática y estimación de constantes
cinéticas con la enzima libre”.

1.- OBJETIVOS.
1.1.- Objetivo general.
Determinar el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la actividad
enzimática y estimar de constantes cinéticas de la enzima libre.
1.2.- Objetivos específicos.
a).- Determinar el efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la
actividad invertasa libre.
b).- Estimar la velocidad máxima de reacción (Vmax) de la invertasa libre.
c).- Estimar la constante de Michaelis (Km) de la invertasa libre.

2.- INTRODUCCIÓN.

El modelo de Michaelis & Menten.

El modelo general de una reacción enzimática fue propuesto por Henri en 1903
y retomado posteriormente por Leonor Michaelis y Maud Leonora Menten en
1913.
El modelo matemático descrito por Michaelis & Menten permite relacionar la
velocidad inicial de una reacción (Vo) catalizada por una enzima, con respecto a
la concentración inicial de sustrato presente en el medio de reacción ([So])
(Figura 1).

Figura 1.- Modelo de Michaelis & Menten.

En donde Vo es la velocidad inicial de reacción; Vmax es la velocidad máxima que
puede alcanzar la reacción enzimática; [So] es la concentración inicial de sustrato
presente en el medio de reacción y Km es la constante de Michaelis, la cual
representa la concentración de sustrato a la cual se obtiene la mitad de la Vmax
de reacción.

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La Figura 2 presenta la relación de la concentración inicial de sustrato en el

medio de reacción ([So]) con respecto a la velocidad inicial de reacción (Vo). De
manera experimental, el modelo de Michaelis & Menten produce una curva
hiperbólica.

Figura 2.- Gráfica del modelo de Michaelis & Menten (Created with BioRender.com).

En la gráfica del modelo de Michaelis & Menten se puede observar claramente

la relación de la concentración inicial de sustrato ([So]) con la velocidad inicial de
reacción (Vo), así como lo que representa la Vmax y la constante de Michaelis
(Km). La Figura 2 permite observar que a mayor concentración inicial de sustrato
en el medio de reacción ([So]) se tendrá una mayor velocidad inicial de reacción
(Vo), hasta llegar a un máximo (Vmax), después del cual la velocidad inicial de
reacción se mantendrá constante y será independiente de la concentración inicial
de sustrato presente en el medio de reacción([So]).
Sin embargo, debido a que la gráfica de Michaelis & Menten representa un
modelo tangencial, resulta difícil estimar con precisión la Vmax y el Km.

Modelos de linealización de la ecuación de Michaelis & Menten.

Debido a que la gráfica de Michaelis & Menten representa un modelo tangencial,
resulta difícil estimar con precisión la Vmax y el Km. Por lo anterior, diversos
modelos de linealización de la ecuación de Michaelis & Menten han sido
propuestos para estimar con mayor precisión la Vmax y el Km.

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a).- Modelo de Lineweaver & Burk.

En 1934 Lineweaver & Burk realizaron un rearreglo del modelo de Michaelis &
Menten (Figura 1) similar a la ecuación de una línea recta (Figura 3), en donde
el inverso de la velocidad inicial de reacción (1/Vo) es graficado en el eje de las
ordenadas (eje “y”) y el inverso de la concentración inicial de sustrato (1/[S o]) en
el eje de las abscisas (eje “x”). El resultado es una línea recta cuya pendiente es
igual a la relación Km/Vmax y la intersección con el eje de las ordenadas (eje “y”)
es igual al inverso de la velocidad máxima de reacción (1/Vmax); la intersección
con el eje de las abscisas (eje “x”) es igual al valor negativo del inverso del Km
(-1/Km) de acuerdo a la Figura 4.

Figura 3.- Modelo de Lineweaver & Burk.

Figura 4.- Gráfica del modelo de Lineweaver & Burk.

Los inconvenientes de la gráfica del modelo de Lineweaver & Burk están

relacionados con el hecho de que la estimación de -1/Km se realiza por
extrapolación de la recta. Además, los valores a bajas concentraciones de
sustrato se aglutinan y modifican, de cierta manera, la pendiente de la recta.

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b).- Modelo de Eadie & Hofstee.

El modelo de Eadie & Hofstee se basó en el modelo de Lineweaver & Burk, el
cual fue transformado a través de multiplicar en ambos lados de la ecuación por
(VoVmax) y rearreglando (Figura 5).

Figura 5.- Modelo de Eadie & Hofstee.

El modelo de Eadie & Hofstee también es conocido como el modelo de Woolf-
Eadie-Augustinsson-Hofstee. El modelo es una representación gráfica de una
cinética enzimática en donde la velocidad inicial de reacción (Vo) es graficada
contra la propia velocidad inicial de reacción dividida por la concentración inicial
de sustrato (Vo/[So]). Los puntos son unidos con una línea recta cuya pendiente
negativa representa el valor negativo de la constante de Michaelis (-Km) (Figura
6).

Figura 6.- Gráfica del modelo de Eadie & Hofstee.

El modelo de Eadie & Hofstee parece estimar con mayor exactitud la Vmax y el
Km de una reacción enzimática, con respecto al modelo de Lineweaver & Burk,
debido a que en el modelo de Eadie & Hofstee otorga el mismo peso a cada valor
en cualquier rango de concentración de sustrato; diferente a lo considerado en
el modelo de Lineweaver & Burk. Por otra parte, el modelo de Eadie & Hofstee
presenta en ambos ejes, variables directamente dependientes de la velocidad
inicial de reacción (Vo). Así en caso de existir errores experimentales en la
medición de la velocidad inicial de reacción (Vo), el error se presentará en ambos
ejes.

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c).- Modelo de Dixon.

El modelo de Dixon también es conocido como el modelo de Hanes & Woolf. El
modelo de Dixon se basó en el modelo de Lineweaver & Burk el cual es
multiplicado en ambos lados de la ecuación por la concentración inicial de
sustrato ([So]); posteriormente se rearregló para llegar al modelo presentado en
la Figura 7.

Figura 7.- Modelo de Dixon (Hanes & Woolf).

El modelo es una representación gráfica de una reacción enzimática, en donde

la concentración inicial de sustrato ([So]) dividida entre la velocidad inicial de
reacción (Vo) es graficada contra la concentración inicial de sustrato ([So]). Los
puntos son unidos con una línea recta cuya pendiente representa el inverso de
la velocidad máxima de reacción (1/Vmax) (Figura 8).

0
Figura 8.- Gráfica del modelo de Dixon (Hanes & Woolf).

Uno de los inconvenientes de la gráfica del modelo de Dixon está relacionado

con el hecho de que la estimación de -Km se realiza por extrapolación de la recta.
Por otra parte, la gráfica del modelo de Dixon presenta en ambos ejes variables
dependientes directamente de la velocidad inicial de reacción (Vo), como lo es la
concentración inicial de sustrato ([So]).

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El efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial

de reacción.
La Figura 2 que representa la gráfica del modelo de Michaelis & Menten describe
claramente el efecto que tiene la concentración inicial de sustrato ([So]) sobre la
velocidad inicial de reacción (Vo) de una reacción catalizada por una enzima a
una cierta concentración ([enzima]). Como se puede observar, la velocidad inicial
de reacción (Vo) se incrementa de manera proporcional al incremento de la
concentración inicial de sustrato ([So]), hasta llegar a un punto máximo que
representa la velocidad máxima de reacción (Vmax), a partir del cual, la velocidad
inicial de reacción es constante e independiente de la concentración inicial de
sustrato ([So]).

Estimación de las constantes cinéticas de la hidrólisis de sacarosa por

invertasa libre.
Por medio de la realización de un conjunto de reacciones enzimáticas a diferente
concentración inicial de sacarosa es posible estimar la Vmax y el Km de una
reacción enzimática, a través de la utilización del modelo de Michaelis & Menten
y de los modelos de linealización de la ecuación de Michaelis & Menten.

En la presente práctica, se evaluará el efecto de concentración inicial de sustrato

sobre la actividad invertasa libre en la reacción de hidrólisis de la sacarosa; así
como la estimación de la Vmax y el Km de la reacción de hidrólisis de la sacarosa
por la invertasa libre. Las reacciones enzimáticas se evaluarán por triplicado a 7
diferentes concentraciones de sacarosa (7.5; 15; 30; 60; 120; 240; 500 g/L), a
25°C y a una [invertasa] de 15 mg/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0.
La estimación de la Vmax y el Km de la reacción de hidrólisis de la sacarosa por la
invertasa libre se realizará utilizando la ecuación de Michaelis & Menten y los 3
modelos de linealización de la ecuación de Michaelis & Menten descritos en la
presente práctica.
La estimación de la velocidad inicial de reacción, de la actividad invertasa y de
la actividad invertasa específica se realizará de acuerdo con lo establecido en la
Práctica 2 y en las Figuras 9 y 10 de la presente práctica.

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Figura 9.- Cinética de hidrólisis de sacarosa por la invertasa libre (Created with BioRender.com).

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Figura 10.- Método para estimar la actividad invertasa y la actividad invertasa específica.

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3.- MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1.- Reactivos, Materiales y Equipos.
Reactivos: Buffer acetatos 0.1M, pH 5.0; solución de invertasa 0.30 g/L en buffer
acetatos 0.1M, pH 5.0; solución de sacarosa 7.5 g/L en buffer acetatos 0.1M, pH
5.0; solución de sacarosa 15 g/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0; solución de
sacarosa 30 g/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0; solución de sacarosa 60 g/L en
buffer acetatos 0.1M, pH 5.0; solución de sacarosa 120 g/L en buffer acetatos
0.1M, pH 5.0; solución de sacarosa 240 g/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0;
solución de sacarosa 500 g/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0; tartrato de sodio
y potasio, hidróxido de sodio, ácido 3,5-dinitrosalicílico, azul brillante de
Coomassie G-250, etanol, ácido fosfórico, albúmina sérica bovina (BSA), agua
destilada.
Materiales: Micropipetas automáticas, tubos Eppendorf, puntas de pipeta,
botellas de vidrio, matraces aforados, papel filtro Whatman No. 1, celdas para
espectrofotómetro, agitadores magnéticos, gradillas para microtubos, espátula.
Equipos: Baño de agua, vórtex, espectrofotómetro UV-Vis, placas de agitación,
balanza, potenciómetro.
3.2.- Métodos.
A continuación, se describen los métodos.
3.2.1.- Método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS) para estimación de la
concentración de azúcares reductores.
La concentración de glucosa se estimará por el método del DNS descrito en la
Práctica 1.
3.2.2.- Método de Bradford para la estimación de la concentración de
proteína.
Se estimará la concentración de proteína en la solución de enzima por el método
de Bradford descrito en la Práctica 1. Para estimar la concentración de proteína
en el biorreactor (mg/L), la concentración de proteína estimada en la solución de
invertasa es dividida entre 20.
[Proteína](mg/L) en el biorreactor = [Proteína](mg/L) en la solución de
invertasa/20.
3.2.3.- Cinética de hidrólisis de sacarosa por la invertasa libre.
Se realizarán cinéticas de hidrólisis de sacarosa por triplicado a 7 diferentes
concentraciones de sacarosa (7.5; 15; 30; 60; 120; 240; 500 g/L), a 25°C y a una
[invertasa libre] de 15 mg/L en buffer acetatos 0.1M, pH 5.0.

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Para la realización de cada cinética enzimática se seguirá el siguiente

procedimiento:
a).- Tomar muestras de 100 μL en los siguientes tiempos: tiempo 0 min (blanco),
tiempo 0.5 min, tiempo 1 min, tiempo 1.5 min, tiempo 2 min, tiempo 3 min y
tiempo 5 min.
b).- Preparar tubos Eppendorf de 1.5 mL para cada uno de las muestras
conteniendo 100 μL de reactivo DNS.
c).- El reactor enzimático es un tubo Eppendorf de 1.5 mL, en donde se agregan
950 μL de la solución de sacarosa a la concentración ensayada, en buffer
acetatos pH 5.0 a 25°C.
d).- Agregar al reactor enzimático 50 μL de la solución de invertasa 0.30 g/L en
buffer acetatos pH 5.0 a 25°C y tomar la primera muestra de 100 μL, la cual se
agrega al tubo Eppendorf To (blanco). El contacto de la muestra con el reactivo
DNS detiene la reacción enzimática inmediatamente.
e).- Tomar las muestras subsecuentes, todas de un volumen de 100 μL, las
cuales se vierten en su respectivo tubo Eppendorf.
f).- Una vez concluida la toma de muestras, se aplica a todas las muestras juntas
el método del DNS, descrito en la Práctica 1 y en la Figura 9 de la presente
práctica.
3.2.4.- Método de estimación de la actividad invertasa libre.
Se utilizará el método de estimación de la actividad invertasa descrito en la
Práctica 2 y en la Figura 10 de la presente práctica.
3.2.5.- Método de estimación de la actividad invertasa libre específica.
Se utilizará el método de estimación de la actividad invertasa específica descrito
en la Práctica 2 y en la Figura 10 de la presente práctica.

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4.- DATOS EXPERIMENTALES.

4.1.- Resultados de las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a diferentes
concentraciones de sacarosa.
Las Tablas 1 a 7 presentan los resultados de absorbancia (λ= 540 nm) obtenidos
en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones de
sacarosa.
Tabla 1.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]
7.5 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.045 0.040 0.050
1.0 0.090 0.087 0.093
1.5 0.135 0.140 0.130
2.0 0.165 0.162 0.168
3.0 0.220 0.216 0.224
5.0 0.244 0.250 0.256

Tabla 2.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

15 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.100 0.096 0.104
1.0 0.191 0.195 0.199
1.5 0.298 0.295 0.292
2.0 0.349 0.361 0.355
3.0 0.404 0.410 0.416
5.0 0.445 0.439 0.451

Tabla 3.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

30 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.157 0.150 0.143
1.0 0.306 0.314 0.310
1.5 0.460 0.458 0.462
2.0 0.546 0.554 0.550
3.0 0.691 0.700 0.709
5.0 0.750 0.753 0.747

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Tabla 4.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

60 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.215 0.211 0.219
1.0 0.415 0.418 0.412
1.5 0.627 0.620 0.613
2.0 0.756 0.744 0.750
3.0 0.900 0.896 0.904
5.0 0.991 1.000 1.009

Tabla 5.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

120 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.259 0.255 0.251
1.0 0.515 0.518 0.512
1.5 0.761 0.770 0.779
2.0 0.936 0.924 0.930
3.0 1.045 1.050 1.055
5.0 1.100 1.096 1.104

Tabla 6.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

240 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.284 0.274 0.280
1.0 0.569 0.570 0.571
1.5 0.854 0.866 0.860
2.0 1.000 0.991 1.009
3.0 1.129 1.121 1.125
5.0 1.192 1.200 1.208

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Tabla 7.- Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a [sacarosa]

500 (g/L).

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

Tiempo
1 2 3
(min)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
0 (Blanco) 0.000 0.000 0.000
0.5 0.300 0.293 0.307
1.0 0.604 0.596 0.600
1.5 0.910 0.908 0.912
2.0 1.045 1.050 1.055
3.0 1.194 1.206 1.200
5.0 1.255 1.261 1.249

4.2.- Resultados de la estimación de la concentración de proteína de la

solución de invertasa.
La Tabla 8 presenta los resultados de absorbancia (λ= 595 nm) obtenidos con el
método de Bradford para la estimación de la concentración de proteína en la
solución de invertasa 0.3 (g/L).
Tabla 8.- Absorbancia obtenida con el método de Bradford para la estimación de la
concentración de proteína en la solución de invertasa 0.3 (g/L).

Solución Absorbancia Absorbancia Absorbancia

[invertasa] 1 2 3
(g/L) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm)
0.3 0.173 0.164 0.180

5.- RESULTADOS ESPERADOS.

a).- Determinar el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la actividad
invertasa libre, en cinéticas de hidrólisis de sacarosa.
- Llenar la siguiente tabla:
Velocidad inicial de
[Sacarosa inicial] reacción (Vo) Actividad invertasa libre
(g/L) (μmol sacarosa/min*L) (unidades invertasa/L)
0 0 0
7.5
15
30
60
120
240
500
- Graficar la concentración inicial de sacarosa (g/L) (eje “x”) contra la velocidad
inicial de reacción (μmol sacarosa/min*L) (eje “y”).
- Graficar la concentración inicial de sacarosa (g/L) (eje “x”) contra la actividad
invertasa libre (unidades invertasa/L) (eje “y”).

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b).- Estimar las constantes cinéticas con invertasa libre.

Llenar la siguiente tabla:

Velocidad máxima de reacción

Modelo cinético (Vmax) Constante de Michaelis (Km)
utilizado (μmol sacarosa/min*L) (g/L)
Michaelis & Menten
Lineweaver & Burk
Eadie & Hofstee
Dixon

- Presentar una gráfica de los resultados obtenidos con el modelo de Michaelis

& Menten para la estimación de las constantes cinéticas.
- Presentar una gráfica de los resultados obtenidos con el modelo de Lineweaver
& Burk para la estimación de las constantes cinéticas.
- Presentar una gráfica de los resultados obtenidos con el modelo de Eadie &
Hofstee para la estimación de las constantes cinéticas.
- Presentar una gráfica de los resultados obtenidos con el modelo de Dixon para
la estimación de las constantes cinéticas.

c).- Estimar la actividad invertasa libre específica (unidades invertasa/mg de

proteína) en cinéticas de hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones de
sustrato.

Llenar la siguiente tabla:

Actividad invertasa [Proteína] Actividad invertasa libre

[Sacarosa inicial]
libre (mg/L) en el específica
(g/L)
(unidades invertasa/L) biorreactor (unidades invertasa/mg proteína)
0 0 0 0
7.5
15
30
60
120
240
500

- Graficar la concentración inicial de sacarosa (g/L) (eje “x”) contra la actividad

invertasa específica (unidades invertasa/mg proteína) (eje “y”).

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6.- BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.

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