Procesos Biocatalíticos

Procesos biocatalíticos
Martín Marcial
Biotecnología de microorganismos
Introducción
En conexión con reemplazo de procesos químicos sintéticos por

catálisis enzimática
Biocatálisis
Principalmente por elevada quimio y estereoespecificidad inherente a reacciones
enzimáticas
Catalizadores microbianos (cél. completas) que contienen enzimas específicas
=> Síntesis biocatalítica recibe creciente interés
Producción de moléculas orgánicas ópticamente puras

aplicadas en agroquímica y farmacéutica
Martín Marcial
Introducción
Biocatálisis posee algunas ventajas en comparación con bioprocesos

mediados por enzimas aisladas:
- Ambiente celular protege a la enzima Estabilidad mejorada
del catalizador
- Reacciones que involucran conversiones en múltiples pasos o el
uso de cofactores costosos (Ej: NADH o NADPH) pueden
simplificarse en el formato de célula completa
- Células que participan en biocatálisis no siempre deben

reproducirse células en reposo (“resting cell”)
Martín Marcial
Enzimas aisladas o biocatálisis

Criterios de selección
Selección de la forma del catalizador = paso

fundamental en arquitectura de bioprocesos
Bioprocesos mediados por enzimas aisladas

Requieren mayor inversión y esfuerzo en
procesos upstream
Biocatálisis con
células completas
Bioprocesos biocatalíticos requieren menor

inversión y esfuerzo en procesos
downstream
Martín Marcial
Enzimas aisladas o biocatálisis

Criterios de selección
Enzimas aisladas Biocatálisis con células completas
Ventajas Desventajas Ventajas Desventajas
Mayor control de Adición de cofactores Costos simples y Pueden ocurrir

reacción, sin es usualmente reducidos reacciones colaterales
reacciones colaterales necesaria
No existen Algunas enzimas no Cofactores se Captura de sustrato es
limitaciones en se encuentran regeneran mediante limitada. Depende de
transporte de sustrato comercialmente en metabolismo celular transporte de sustrato
y producto forma pura o se o producto por
requiere purificación membrana
Tolerancia a mayores No se requiere Inhibición de sustrato
concentraciones de aislamiento y o producto es posible
sustrato y producto purificación de
enzimas
Martín Marcial
Clasificación de bioprocesos biocatalíticos

usando cél. completas
Biocatálisis con cél. completas
Fermentación Biotransformación
Productos son sintetizados a partir de Crecimiento celular (fase de

sustratos mediante el metabolismo manufactura de enzimas) y fase de
nativo del microorganismo producción son separadas
- Presencia de intermediarios - Sustratos son convertidos en

metabólicos en el medio de cultivo productos deseados por cél. en reposo
Incrementa complejidad de procesos Células metabólicamente activas pero

downstream no en crecimiento
Martín Marcial
Conversiones adaptadas a biocatálisis microbiana
Algunas reacciones biocatalíticas no pueden ocurrir usando enzimas aisladas.

- Ej: - Enzima es formada por un ensamble multicomponente de proteínas
- Enzima es una proteína ligada a la membrana en inseparable de la célula
Uso de biocatálisis por cél .completas
Martín Marcial
Conversión como parte de una fábrica celular
El uso de catalizadores de cél. completa son particularmente adecuados para algunas reacciones:
- Reacciones en las que se utilizan sustratos naturales significativamente menos costosos que otros
medios para reacciones enzimáticas de tipo industrial.
- Conversiones que requieren múltiples pasos (dos o más reacciones enzimáticas secuenciales)
Vías metabólicas Separación y aislamiento o adición de

reemplazan enzimas individuales
Martín Marcial
Conversión como parte de una fábrica celular
Estereoconversión de
aminoácidos en E. coli
Martín Marcial
Reacciones que requieren cofactores
Algunos procesos biocatalíticos industriales son limitados al uso de enzimas independientes de

cofactores (Ej: hidrolasas) Desempeñan reacciones relativamente simples
 Alternativamente, enzimas dependientes de cofactores (Ej: oxidorreductasas y transferasas)
Catalizan reacciones más complejas
- Algunos cofactores permanecen unidos a enzima (fosfato piridoxal y biotina) => autogenerados
- Otros cofactores actúan como agentes de transferencia de grupos funcionales => deben ser
utilizados en cantidades estequiométricas.
- Costo elevado
=> Regeneración de cofactores involucran cél. microbianas metabólicamente activas (sin
reproducirse)
b) Procesos con células completas no requieren

a) Procesos con enzimas aisladas requieren adición de enzima regeneradora de
enzima regeneradora de NAD(P)H/NAD(P) NAD(P)H/NAD(P)
Martín Marcial
2-feniletanol alcohol aromático con fragancia a rosas usado en industria de perfumes

- Producido por rosas (bajo rendimiento) o síntesis química (contaminante)
- Alternativamente producido por levaduras mediante la vía de Ehrlich (producción limitada 6g/L)
- Cepa de E. coli mejorada mediante ingeniería metabólica (rendimiento 3.8 x mayor)
Alcohol deshidrogenasa o
Transaminasa aldehído reductasa
aromática
Fenilpiruvato decarboxilasa
2- oxoglutarato
Martín Marcial
Uso de células en reposo
Alternativa cuando pH, T° o composición de medio usado en bioconversión difiere de condiciones

óptimas de crecimiento
Células son propagadas hasta alcanzar suficiente biomasa colectadas, lavadas (agua o
solución tampón para eliminar nutrientes y metabolitos) y resuspendidas en solución tampón
para biocatálisis.
- Alto rendimiento de productos en relación a consumo de carbono y energía
- Células pueden ser recicladas
- Células deben tener capacidad de regeneración de cofactores durante periodos

prolongados de tiempo
Martín Marcial
Fenol Catecol Semialdehido 2-hidroximucónico Muconato

Fenol hidroxilasa Catecol-2,3- Catecol-1,2-
dioxigenasa dioxigenas
Martín Marcial
Consideraciones para procesos biocatalíticos microbianos
Requerimientos industriales
- Células de rápido crecimiento evitar contaminación

- Expresión de enzima de interés debe superar 10% de proteínas totales de biomasa
Objetivo en clonación
- Niveles superiores al 40% pueden formar cuerpos de inclusión
Bioprocesos que requieren

solventes
- Sustratos pobremente solubles en agua reacciones ocurren en presencia de

solventes
- Solventes > polaridad dañinos para células
- Solventes < polaridad emulsificación
Martín Marcial
Demanda de O2
- Algunas bioconversiones adaptadas a conversiones mediadas por células completas involucran

inserción de O2 => suplemento de oxígeno molecular
- O2 puede causar daño oxidativo en proteínas
- Considerar requerimiento de O2 no solo para reacción enzimática sino también para
mantenimiento celular.
- Producción de productos volátiles durante bioproceso deben ser tomados en cuenta
Recuperación de productos
- Presencia de enzimas distintas a la(s) involucradas en la bioconversión

- Consecuencias:
- 1ro: Sustrato puede ser degradado por otras enzimas disminuye disponibilidad de
sustrato para conversión y aumenta presencia de productos secundarios
- 2do: Producto puede ser degradado por otras enzimas
Optimización de procesos downstream
Martín Marcial
Ingeniería metabólica de cepas

- Expresión eficiente de enzimas
de interés
- Disminución de expresión de
otras enzimas
Martín Marcial

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Producción de moléculas orgánicas ópticamente puras

Biocatálisis posee algunas ventajas en comparación con bioprocesos

- Células que participan en biocatálisis no siempre deben

Enzimas aisladas o biocatálisis

Selección de la forma del catalizador = paso

Bioprocesos mediados por enzimas aisladas

Bioprocesos biocatalíticos requieren menor

Enzimas aisladas o biocatálisis

Enzimas aisladas Biocatálisis con células completas

Ventajas Desventajas Ventajas Desventajas

Mayor control de Adición de cofactores Costos simples y Pueden ocurrir

Clasificación de bioprocesos biocatalíticos

Biocatálisis con cél. completas

Productos son sintetizados a partir de Crecimiento celular (fase de

- Presencia de intermediarios - Sustratos son convertidos en

Incrementa complejidad de procesos Células metabólicamente activas pero

Conversiones adaptadas a biocatálisis microbiana

Algunas reacciones biocatalíticas no pueden ocurrir usando enzimas aisladas.

Uso de biocatálisis por cél .completas

Conversión como parte de una fábrica celular

Vías metabólicas Separación y aislamiento o adición de

Conversión como parte de una fábrica celular

Reacciones que requieren cofactores

Algunos procesos biocatalíticos industriales son limitados al uso de enzimas independientes de

b) Procesos con células completas no requieren

2-feniletanol alcohol aromático con fragancia a rosas usado en industria de perfumes

Uso de células en reposo

Alternativa cuando pH, T° o composición de medio usado en bioconversión difiere de condiciones

- Alto rendimiento de productos en relación a consumo de carbono y energía

- Células pueden ser recicladas

- Células deben tener capacidad de regeneración de cofactores durante periodos

Fenol Catecol Semialdehido 2-hidroximucónico Muconato

Consideraciones para procesos biocatalíticos microbianos

- Células de rápido crecimiento evitar contaminación

Bioprocesos que requieren

- Sustratos pobremente solubles en agua reacciones ocurren en presencia de

- Algunas bioconversiones adaptadas a conversiones mediadas por células completas involucran

- Presencia de enzimas distintas a la(s) involucradas en la bioconversión

Optimización de procesos downstream

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