D3C Senv BENYAMINA Abdelfettah
D3C Senv BENYAMINA Abdelfettah
D3C Senv BENYAMINA Abdelfettah
DE DOCTORAT
MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
THESE DE DOCTORAT
3ème CYCLE LMD
Présentée par :
M. Benyamina Abdelfettah
Soutenue le : 09/04/2019
Devant l’honorable jury composé de :
Président de jury : Pr M. Mehdadi Zoheir ………………........….(Professeur, UDL/SBA)
Examinateur : Pr Benali Mohamed …….. ………...……..... (Professeur, UDL/SBA)
Dr Bensahla Talet Lotfi…………………...… (Maître C. A, UABB/Oran)
Dr Hachem Kadda ………………………… (Maître C. A, UMT/Saïda)
Promoteur : Pr Toumi-Benali Fawzia ……….………...… (Professeur, UDL/SBA)
Co-Promoteur : Pr Koudache Fatiha ……………..……………(Professeur, UDL/SBA)
I
Remerciements
Tout d'abord, je tiens à remercier les membres du jury :
- M. Mehdadi Zoheir, Professeur à l'université de Sidi Bel Abbès qui nous fait l'honneur de présider
le jury de cette thèse. Je lui adresse mes respectueux remerciements.
- M. Benali Mohamed, Professeur à l'université de Sidi Bel Abbès, M. Bensahla Talet Lotfi,
Professeur à l'université d’Oran, M. Hachem Kadda, maitre de conférences « A » à l'université de
Saida, qui ont bien voulu examiner ce travail et d'avoir très aimablement consenti à prendre part au
jury de cette thèse. Qu'ils trouvent ici l'expression de ma très haute considération.
Je souhaiterais également remercier tous ceux qui m'ont apporté leur aide, leurs conseils et leur
soutien, mais tout particulièrement :
- Madame Toumi fawzia, Professeur à l'université de Sidi Bel Abbès, directrice de ma thèse. Je
suis ravi d’avoir travaillé en sa compagnie, car outre son appui scientifique, elle a toujours été là
pour me soutenir et me conseiller au cours de l’élaboration de cette thèse. J'aimerais également lui
dire à quel point j’ai apprécié sa grande disponibilité et son respect sans faille des délais serrés de
relecture des documents que je lui ai adressés. Enfin, j’étais extrêmement sensible à ses qualités
humaines d'écoute et de compréhension tout au long de ce travail doctoral. Je lui en suis
profondément reconnaissant.
- M. Bouzidi M.Ali, maitre de conférences « A » à l'université de Sidi Bel Abbès, qui m’a aidé et
aussi prodigué de nombreux conseils pour bien commencer le troisième cycle universitaire.
- Ma sœur Soltani Amina, avec laquelle j’ai partagé la paillasse et j'ai pris beaucoup de plaisir à
travailler. Nous avons formé une belle équipe, un grand remerciement donc pour tout ce qu’elle m’a
apporté au cours de ces années, j'ai toujours pu compter sur elle. Je voulais qu’elle sache à quel
point son soutien a été d'une grande aide pour moi. Une chose est sure : je ne l'oublierai jamais.
- Mon ami, Said M.Elamin, qui a mis tous les moyens dont il dispose pour m’aider à finaliser ce
travail.
- Madame Megherbi Aicha, directrice du laboratoire d’écodéveloppement des espaces, qui a mis
tous les moyens du laboratoire à notre disposition.
- Madame Koudache Fatiha, Professeur à l'université de Sidi Bel Abbès, co-directrice de ma thèse,
pour tous ses conseils et ses encouragements. Qu'elle trouve ici l'expression de ma très haute
considération.
- Tous ceux que j’aurais malencontreusement oublié de citer en espérant qu'ils se reconnaîtront.
Et bien sûr, vous, pour le temps que vous allez consacrer en lisant mon manuscrit.
II
Sommaire
Dédicace ……………………………………………………………………………………….I
Remerciement ………………………………………………...……………………………...II
Sommaire ……………………...…………………………………………………………….III
Liste des tableaux ………………………………………………………………..………….VI
Liste des figures ………………………………………...………………………………….VII
Liste des abréviations ……………………………………………………………………..VIII
Résumé ………………………………………………………………………………………IX
………………………………………………………………………………………… ملخص..X
Abstract ……………………………………………………………………………………...XI
Production scientifique ………………………………………………………………...….XII
Chapitre I : Ethnopharmacologie
1 Introduction : ...................................................................................................................... 3
2 Concepts et définitions : ..................................................................................................... 3
3 Ethnopharmacologie en Afrique : ...................................................................................... 5
3.1 Rôle de la médecine traditionnelle en Afrique : .......................................................... 6
3.2 Recherche ethnopharmacologique en Afrique : .......................................................... 7
3.3 Les défis de la médecine traditionnelle en Afrique : ................................................... 8
3.3.1 Préoccupations relatives à l'efficacité, à la toxicologie et à l'innocuité ............... 8
3.3.2 Durée de conservation, physiologie post-récolte et stockage. ............................. 9
3.3.3 Les défis de conservation de la protection des ressources végétales ................... 9
3.4 Perspectives d'avenir.................................................................................................. 10
4 Conclusion :...................................................................................................................... 10
III
Sommaire
2.6 Usage et importance économique : ............................................................................ 16
3 La veille scientifique : ...................................................................................................... 18
3.1 État de l’art de la recherche sur le T.articulata : ....................................................... 19
3.1.1 Recherche de l’information : .............................................................................. 19
3.1.2 Récapitulatif des travaux réalisés sur le T.articulata dans le domaine de
pharmacognosie et de phytochimie en 21e siècle : ........................................................... 21
3.1.3 Les huiles essentielles de T.articulata : ............................................................. 23
3.1.4 Les extraits de T.articulata : .............................................................................. 24
4 Conclusion :...................................................................................................................... 25
IV
Sommaire
5.1.3 Dosage des flavonols :........................................................................................ 47
5.1.4 Dosage des tanins condensés : ........................................................................... 48
5.1.5 Dosage des tanins hydrolysables : ...................................................................... 48
5.2 Analyse chromatographique : .................................................................................... 49
5.2.1 Préparation des extraits : .................................................................................... 49
5.2.2 Conditions de CCM :.......................................................................................... 49
5.2.3 Expression des résultats : ................................................................................... 50
6 Analyse statistique : ......................................................................................................... 50
7 Conclusion :...................................................................................................................... 51
V
Liste des tableaux
VI
Liste des figures
Figure 1: Aire de répartition naturelle de Thuya de berberie (Roloff et al., 2009). ................ 12
Figure 2 : Quelques parties de Tetraclinis articulata. .............................................................. 14
Figure 3: Spicimen de Tetraclinis articulata dans le Jardin botanique Missouri. ................... 15
Figure 4: La stratégie de la collecte d’information. ................................................................ 19
Figure 5: Volume des publications scientifiques sur le T.articulata par décennie. ................. 20
Figure 6: Volume des publications en relation avec le thème de recherche par décennie. ..... 21
Figure 7: Classement des références collectées entre 2000 et 2017 par contenu. ................... 22
Figure 8 : Station d'échantillonnage ........................................................................................ 31
Figure 9: Parties de la plane destinées au calcul de la teneur en eau. ..................................... 32
Figure 10: Injection de la carraghénine. .................................................................................. 37
Figure 11 : Formes de pattes avant et après l’injection de la carraghénine. ........................... 38
Figure 12: Injection sous cutané (a) et mesure de la température rectale (b).......................... 39
Figure 13: Léchage des pattes (a) et saut (b) sur la plaque chauffante.................................... 40
Figure 14: Contorsions abdominales et étirements des pattes postérieurs. ............................. 41
Figure 15: Tranches d’âges des informateurs. ......................................................................... 52
Figure 16 : Quelques données sociales de l'échantillon de population interrogée. ................. 52
Figure 17 : Les informateurs qui connaissent« Arrar, » العرعار. .............................................. 54
Figure 18: Les taux d’informateurs qui connaissent « »العرعار البرهوش. ................................... 55
Figure 19 : domaine d’utilisation d’«Arrar, » العرعار. .............................................................. 56
Figure 20: Coffre fabriqué avec le bois du T.articulata........................................................... 56
Figure 21: les parties des arbres utilisées en médecine. .......................................................... 57
Figure 22: l’état d’utilisation des parties de T.articulata. ........................................................ 57
Figure 23: modes de préparation d’« Arrar, » العرعار............................................................... 58
Figure 24: modes d’administration d’« Arrar, » العرعار. .......................................................... 59
Figure 25: Effet secondaire d’« Arrar, » العرعار. ...................................................................... 62
Figure 26: Teneur en eau des organes de T.articulata ............................................................. 63
Figure 27: Rendement d'extraction par solvant (Éthanol 80%). ............................................. 64
Figure 28: Quelques signes de toxicité. .................................................................................. 65
Figure 29: Pourcentage d'inhibition d'œdème par les extraits de T.articulata......................... 68
Figure 30: Activité antipyrétique des extraits de T.articulata. ................................................ 71
Figure 31: Temps de latence des souris sur la plaque chauffante. .......................................... 74
Figure 32: Pourcentage d'inhibition des contorsions abdominales chez les souris. ................ 76
Figure 33: Pourcentage d’inhibition du DPPH par les extraits et les différents standards...... 77
Figure 34: Les concentrations de Fe++ dans les mélanges en (mmol/g d’extrait). .................. 79
Figure 35: Cinétique de blanchissement du β-carotène en fonction du temps. ....................... 80
Figure 36: pourcentage de chélation des ions ferrique ............................................................ 81
Figure 37: photos des boites de Pétri après incubation ........................................................... 84
Figure 38: Plaque CCM (révélation sous UV 254 nm)………………………………………87
VII
Liste des abréviations
DMSO : DiMéthylSulfOxide.
DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyle.
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid.
Eq: equivalent.
FIC: Ferrous ion chelating
FL: Fidelity level.
FRAP: Ferric Reducing Antioxidant power.
GA: acide gallique.
IC50 : Concentration inhibitrice de 50 %
IL : interleukine.
IP : voie intrapéritonéale.
IV : Importance value.
M : Myricétine.
MTA : médecine traditionnelle africaine.
PG : prostaglandine.
TNF-α : Facteur de nécrose tumorale
TPTZ: Tripyridyl-triazine.
UV: Use value.
VIII
Résumé
Le présent travail a été mené dans le but de réunir, dans un premier temps, les informations
concernant les usages thérapeutiques de Tetraclinis articulata (Vahl), pratiqués dans la région
de Sidi Bel Abbes, puis tester empiriquement quelques propriétés médicinales des organes
aériens de l’arbre (feuilles, rameaux, cônes) en utilisant des modèles expérimentaux In vivo et
In vitro. La démarche expérimentale est achevée par des analyses quantitatives et qualitatives
des composés phénoliques.
L’étude ethnobotanique a été réalisée dans la région de Sidi Bel Abbes auprès de 318 enquêtés.
Les tests pharmacologiques ont été réalisés en utilisant des modèles animaux. La toxicité aigüe
a été déterminée par la méthode de Lorke, l’activité antiinflammatoire a été évaluée en mesurant
l’œdème plantaire des souris induit par la carraghénine, l’analgésique a été mené par le test des
contractions abdominales et celui de la plaque chauffante, et l’activité antipyrétique a été testée
en utilisant le modèle de pyrexie induite par la levure de bière, alors que l’activité antioxydante
a été testée par plusieurs méthodes et l’effet antibactérien a été mesuré par la méthode des
disques. La caractérisation chimique a été réalisée par des dosages spectrophotométriques et
par chromatographie sur couche mince.
L’enquête ethnobotanique a révélé que la quasi-totalité des enquêtés connaît «Arrar, »العرعار.
D’après nos informateurs l’arbre est utilisé principalement dans le domaine de la médecine. Les
valeurs d’utilisations et les niveaux de fidélités révèlent que ses parties aériennes sont utilisées
principalement pour pallier les maladies respiratoires, dermatologiques, gastriques et
inflammatoires. L’investigation pharmacologique a permis de dégager une multitude de
résultats. Les extraits des parties aériennes ne sont pas toxiques dont la DL50 est supérieure à
1000 mg/kg chez les souris. Ces extraits ont révélé ainsi, des propriétés antiinflammatoires,
analgésiques, antipyrétiques et antioxydantes considérables, à des doses qui ne dépassent pas
les 300 mg/kg. Les tests de l’activité antibactérienne ont révélé que les souches testées ne sont
pas sensibles à nos extraits. La caractérisation des composés phénoliques a révélé quelques
différences quantitatives et qualitatives entre les trois extraits. La catéchine a été détectée dans
tous les organes. La quercétine a été détectée dans les feuilles et les rameaux et l'acide tannique
n'a été trouvé que dans les feuilles.
IX
الملخص
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X
Abstract
This work was carried out with the aim of first gathering information on the therapeutic uses of
Tetraclinis articulata (Vahl), practiced in the Sidi Bel Abbes region, and then empirically tested
some medicinal properties of the tree's aerial organs (leaves, twigs, cones) using experimental
In vivo and In vitro models. The experimental process is completed by quantitative and
qualitative analyses of phenolic compounds.
The ethnobotanical study was carried out in the Sidi Bel Abbes region with 318 respondents.
Pharmacological tests were performed using animal models. Acute toxicity was determined by
Lorke's method, anti-inflammatory activity was assessed by measuring carrageenan-induced
plantar edema in mice, analgesia was performed by the abdominal contraction and hot plate
tests, and antipyretic activity was tested using the brewer's yeast induced pyrexia model.
Antioxidant activity was tested by several methods and the antibacterial effect was measured
by the disc method. Chemical characterization was performed by spectrophotometric assays
and thin layer chromatography.
The ethnobotanical survey revealed that almost all respondents know "Arrar, " العرعار.
According to our informants, the tree is used mainly in the field of medicine. The use values
and fidelity levels reveal that its aerial parts are mainly used to treat respiratory, dermatological,
gastric and inflammatory diseases. The pharmacological investigation has made it possible to
identify a multitude of results. Extracts from aerial parts are not toxic with LD50s greater than
1000 mg/kg in mice. The extracts thus revealed considerable anti-inflammatory, analgesic,
antipyretic and antioxidant properties at doses not exceeding 300 mg/kg. Antibacterial activity
tests have revealed that the strains tested are not sensitive to our extracts. The characterization
of phenolic compounds revealed some quantitative and qualitative differences between three
extracts. Catechin was detected in all organs. Quercetin was detected in leaves and twigs and
tannic acid was only found in leaves.
XI
Production scientifique
Publication parue
Publication à venir
➢ Effect of the Tetraclinis articulata (Vahl) Mast. cones in the decrease of the
inflammation signs (oedema, pain and fever).
Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants (Taylor and Francis).
A. BENYAMINA, F. TOUMI, Y. SOLTANI.
➢ Characterisation of phenolic compounds and determination of the antioxidant power
of leaves, twigs and cones of Tetraclinis articulata (Vahl) Mast.
Phytothérapie (Lavoisier).
A. BENYAMINA, F. TOUMI, Y. SOLTANI, M.A. SAID, M.A Bouzidi.
Communications internationales
XII
Production scientifique
Communications nationales
XIII
Introduction générale
Introduction générale
Dans sa quête de nourriture, l'Homme primitif a fait l'essai de toutes sortes de plantes. Certaines
l'ont nourri, d'autres l'ont guéri de ses maux, quelques-unes ont entraîné sa mort. Au cours des
siècles, l’Homme grâce à ses expériences a développé la connaissance et l'utilisation des plantes
dans tous les domaines de sa vie ; y compris la médecine (Fakchich and Elachouri, 2014). À
l'heure actuelle, et malgré les progrès réalisés en médecine, la majorité de la population
mondiale, en particulier dans les pays en voie de développement, se réfère à des pratiques
traditionnelles à base de plantes pour se guérir, dont les connaissances dans ce domaine
appartiennent essentiellement aux personnes âgées et aux praticiens traditionnels, et elles sont
encore transmises oralement (Boudjelal et al., 2013). Par conséquent, ces pratiques ancestrales
à base de plantes risquent de disparaître et tomber dans l’oubli.
L’Algérie par sa position biogéographique, non seulement, offre une très grande diversité
écologique et floristique, et aussi, l’un des pays méditerranéens qui ont une longue tradition
médicale qui s’est accumulée grâce au contact avec de nombreuses civilisations (berbères,
romains, arabes, ottomans et français). Par ailleurs, cette tradition ethno médicinale est encore
vivante dans toutes les régions du pays, mais elle risque de plus en plus de ne plus être
transmise, en cas ou aucune sauvegarde n’est entreprise.
Parmi les plantes médicinales qu’héberge l’Algérie : le Tetraclinis articulata (Vahl) Masters.
C’est un arbre qui fait partie de la famille des cupressacées, dont l’articulata est le seul
représentant du genre Tetraclinis. Cette espèce est endémique à la région méridionale du bassin
méditerranéen occidental à l’exception de deux stations, l’une au sud de Carthagène en
Espagne, et l’autre très restreinte dans l’île de Malte. Cette essence n’atteint son plein
développement que dans le nord-ouest de l’Afrique, c'est-à-dire dans les pays du Maghreb, d’où
son appellation : Thuya de Maghreb (Villar, 1938). En médecine populaire, les feuilles et les
rameaux de Thuya sont utilisés pour arrêter les hémorragies, traiter les maladies vénériennes et
l’hypertrophie prostatique (Baba aissa, 2000). Au Maroc, les populations locales utilisent cette
essence forestière dans la médecine traditionnelle, pour traiter les infections intestinales et
respiratoires (Bellakhdar et al., 1991). Les gens du Moyen-Orient emploient la poudre des
feuilles comme hémostatique en recouvrant la plaie produite par la circoncision. Des propriétés
sudorifiques, diurétiques et antirhumatismales sont accordées aux feuilles et aux rameaux de
l’arbre. Ils sont aussi préconisés pour pallier les maladies cardiovasculaires et le diabète
(Bourkhiss et al., 2016). Les propriétés thérapeutiques multiples de Tetraclinis articulata
(Vahl), lui accordent le nom de l’arbre de vie (Rebahi, 2015).
1
Introduction générale
Dans le cadre de la sauvegarde du savoir traditionnel et la valorisation de nos ressources
naturelles nous avons entrepris une investigation éthnopharmacologique sur le Tetraclinis
articulata (Vahl). Notre étude vise la recherche du savoir ethnomédical sur le Thuya de
Maghreb. Ensuite, l’investigation du potentiel pharmacologique par des tests empiriques des
activités biologiques des organes de l'arbre utilisés en médecine traditionnelle. Enfin, le travail
expérimental sera achevé par une caractérisation chimique des composés phénoliques du fait
que l’explication de l’efficacité supposée de nombreuses plantes médicinales repose, en tout ou
partie, sur leurs présence dans ces plantes (Hennebelle et al., 2004).
La première est consacrée pour les données bibliographiques dont le premier chapitre est
destiné à des notions sur l’ethnopharmacologie et le deuxième est une veille scientifique sur le
Tetraclinis articulata (vahl).
La deuxième partie est consacrée pour la démarche expérimentale. Le premier chapitre présente
le matériel et les méthodes utilisées pour mener à bien l’étude. Dans le deuxième chapitre,
l’ensemble des résultats est présenté et discuté. Enfin, les conclusions essentielles sur
l‘ensemble de ce travail ainsi que les perspectives de sa continuité sont dégagées.
2
Chapitre I
Ethnopharmacologie
Ethnopharmacologie
1 Introduction :
L’ethnopharmacologie est un concept qui fait couler beaucoup d’encre, et le nombre de
chercheurs actifs dans ce domaine augmente exponentiellement ces dernières décennies grâce
à l’importance accordée à la médecine populaire par de nombreuses institutions de recherche
dans le monde entier. Du fait que notre travail de thèse s’inscrit dans ce domaine, nous avons
jugé utile d’entamer la synthèse bibliographique par quelques notions de l’ethnopharmacologie
et son état en Afrique. En fait, ce chapitre est composé de quelques passages qu’on a traduits
en langue française de l’ouvrage "Ethnopharmacology" édité par Heinrich et Jäger en 2015
avec la contribution de plus de 80 chercheurs de différentes nationalités.
2 Concepts et définitions :
L'ethnopharmacologie est un domaine de recherche interdisciplinaire et, à ce titre, elle est
définie par des concepts issus d'un éventail de disciplines et de méthodologies utilisées. Il ne
fait aucun doute qu'il s'agit d'une discipline qui se développe et prospère rapidement. De façon
confuse, un grand nombre de termes sont utilisés pour décrire la recherche, qui utilise souvent
des méthodes et des concepts relativement similaires. Cependant, chacune d'entre elles se
distingue en se situant dans une certaine tradition de recherche. Ces termes comprennent :
• La pharmacognosie, utilisée pour la première fois en 1811 par Johann Adam Schmidt et très
largement utilisée pour décrire le domaine de la recherche sur les plantes médicinales et les
produits naturels.
• Phytomédecine, un terme introduit récemment et moins bien établi sur le plan international.
En outre, il existe un large éventail de termes plus descriptifs, y compris la recherche sur les
plantes médicinales ou la recherche sur les produits naturels, et il existe un chevauchement
considérable entre ces termes. La recherche en phytothérapie, par exemple, se concentre sur les
formes de traitement à base de plantes dans le cadre d'une pratique médicale basée sur la
science. Elle distingue ainsi ce qui est également appelé " phytothérapie rationnelle " d'autres
approches plus traditionnelles comme l'herboristerie médicale, qui s'appuie sur une appréciation
empirique des " herbes médicinales ". La recherche en phytothérapie est mieux décrite comme
une science intégrée dans le domaine médical et pharmaceutique. Contrairement à cela,
3
Ethnopharmacologie
l'ethnopharmacologie incorpore des concepts et des méthodes socioculturels. Au sens large,
l'ethnopharmacologie s'appuie sur des approches issues des sciences socioculturelles et des
sciences naturelles/médecine. Par rapport à la pratique médicale, que ce soit dans le contexte
de son utilisation en biomédecine ou dans l'une des traditions régionales, l'ethnopharmacologie
met davantage l'accent sur une évaluation empirique (p. ex. pharmacologique, phytochimique,
toxicologique) des utilisations thérapeutiques de plantes. En termes très généraux, toute forme
d'utilisation empirique et d'"essais médicaux" d'une plante à des fins nouvelles peut être
considérée comme une approche ethnopharmacologique.
4
Ethnopharmacologie
central. Les questions relatives à la toxicité des médicaments traditionnels sont abordées dans
un certain nombre d'études (environ un quart).
Ces dernières années, on assiste aussi à une prise de conscience croissante des normes
conceptuelles et méthodologiques de base dans le domaine d’ethonopharmacologie. Un aspect
abordé non seulement par de nombreux auteurs, mais aussi dans une série d'études critiques
visant à définir les bonnes pratiques en ce qui concerne les fondements méthodologiques et
conceptuels spécifiques du domaine (Bennett and Balick, 2014; Rivera et al., 2014; Chan et al.,
2012; Sheridan et al., 2012; Uzuner et al., 2012; Cos et al., 2006; Verspohl, 2002)
3 Ethnopharmacologie en Afrique :
L'importance des plantes médicinales dans la médecine traditionnelle africaine (MTA) et leur
contribution aux soins de santé primaires à travers le continent est bien reconnue. La MTA a
complété le système médical occidental orthodoxe dans la lutte contre diverses maladies.
L'importance croissante des plantes médicinales dans les soins de santé primaires est basée sur
les expériences de la médecine populaire et les propriétés prophylactiques (Houghton et al.,
2007). La philosophie thérapeutique de la MTA repose essentiellement sur la prévention, c'est
pourquoi des mélanges d'extraits et de préparations à base de plantes sont parfois consommés
régulièrement en tant que rajeunisseurs, toniques et/ou compléments nutritionnels (Amoo et al.,
2012). Ainsi, les soins de santé traditionnels africains sont généralement caractérisés par une
philosophie de polychimiothérapie, contrairement à l'approche unidrogue dans la médecine
orthodoxe. Au cours des 20 dernières années, la MTA a connu un renouveau et une
transformation remarquables grâce à d'importants investissements dans la recherche, en
particulier en Afrique du Sud, qui est sans doute l'épicentre de l'innovation en
ethnopharmacologie africaine. Plus important encore, l'ethnopharmacologie est devenue une
composante à part entière des programmes universitaires de pharmacie et de sciences médicales
dans de nombreux États membres de la Communauté économique des États de l'Afrique de
l'Ouest (CEDEAO), de la République démocratique du Congo, de l'Afrique du Sud et de la
Tanzanie. La grande richesse et la diversité des plantes médicinales africaines est une ressource
pharmaceutique avec le potentiel de sauver les systèmes de santé en ruines de la plupart des
pays africains (Busia, 2005).
5
Ethnopharmacologie
3.1 Rôle de la médecine traditionnelle en Afrique :
À l'échelle mondiale, on ne saurait trop insister sur l’importance des produits naturels, en
particulier les matières végétales dans la découverte de médicaments (Gurib-Fakim, 2006;
Newman and Cragg, 2012). L'Afrique est dotée de plus de 60 000 taxons, ce qui équivaut à
environ 25 % des espèces végétales les plus cultivées du monde, et une partie importante de ces
plantes ont un potentiel thérapeutique (van Wyk, 2008). Les préparations locales de plantes
médicinales constituent toujours la seule option thérapeutique pour environ 80 % de la
population (Ibrahim et al., 2014), une situation aggravée par un faible ratio médecin-patient
d'environ 1/40 000 dans quelques pays (Abdullahi, 2011). Ceci contraste avec le ratio plus
favorable d'un praticien de médecine traditionnelle pour 500 patients pour l'Afrique
subsaharienne (Albertyn et al., 2014). En plus d'être un aspect fondamental de la culture, la
MTA reste le système de soins le plus économique et le plus accessible pour une grande partie
de la population africaine dans les zones rurales et semi-urbaines (Gurib-Fakim, 2006). De plus,
dans certains endroits, l'inaccessibilité aux soins de santé primaires est aggravée par de longs
temps d'attente à l'hôpital de 6 à 12 heures (Busia, 2005).
Comme l'a documenté Neuwinger (2000), le continent compte environ 5400 taxons de plantes
médicinales avec plus de 16 300 utilisations thérapeutiques. Récemment, les scientifiques ont
identifié plusieurs espèces végétales ayant un potentiel contre les maladies courantes, y compris
les infections microbiennes, le paludisme, le diabète sucré, la tuberculose, la diarrhée,
l’helminthiase, la trypanosomiase, le cancer, la douleur, l'inflammation et les brûlures. La
diversité des plantes médicinales représente une ressource précieuse tant du point de vue du
développement commercial que du point de vue de la science fondamentale.
De plus, les plantes africaines sont une source de matières premières pour les industries
pharmaceutiques, alimentaires, cosmétiques et des huiles essentielles. En particulier, les
industries pharmaceutiques et phytothérapeutiques utilisent des plantes fraîches ou séchées, des
extraits ou des ingrédients actifs isolés pour fabriquer des médicaments. De nombreux pays
africains, notamment le Mali, le Burkina Faso, le Ghana, le Cameroun, l'Afrique du Sud et le
Nigeria, ont connu une augmentation drastique du nombre d'entreprises artisanales enregistrées
et non enregistrées qui participent à la fabrication de formulations à base de plantes médicinales
basées sur la MTA (Ndhlala et al., 2011; Obi et al., 2006). Inévitablement, les études visant à
établir les bases scientifiques au potentiel de ces médicaments à base de plantes sont de plus en
plus nombreuses sur tout le continent.
6
Ethnopharmacologie
3.2 Recherche ethnopharmacologique en Afrique :
La pratique de la MTA a été largement soutenue par la transmission orale des connaissances
autochtones, ce qui la rend très sensible à la perte d'informations d'une génération à l'autre.
Ainsi, ce mode de transfert de connaissances accentue la fragilité de la MTA. Pour freiner la
perte croissante des connaissances ethnopharmacologiques, plusieurs démarches sont
entreprises. Des numéros spéciaux dans les revues scientifiques sur l'ethnobotanique en Afrique
(Journal of Ethnopharmacology, Vol. 119, 2008), la botanique économique (South African
Journal of Botany, Vol. 77, 2011) et le contrôle de la qualité (South African Journal of Botany,
Vol. 82, 2012) ont été publiés, couvrant divers aspects de la recherche ethnopharmacologique.
Un certain nombre de pays, notamment le Bénin, le Burkina Faso, le Cameroun, la Côte
7
Ethnopharmacologie
d'Ivoire, la Guinée, Madagascar, le Mali, le Sénégal et l'Afrique du Sud, ont développé des
monographies sur leurs plantes médicinales et aromatiques. Le nombre de livres entièrement
consacrés à l'ethnopharmacologie en Afrique a également augmenté au cours des deux dernières
décennies pour compléter les ouvrages de référence classiques. Ces publications scientifiques
détaillées et complètes sur les plantes médicinales africaines constituent un matériel de
référence précieux pour guider les recherches futures.
En raison de la dépendance croissante à l'égard des plantes médicinales, les principales parties
prenantes ont intensifié leurs efforts pour surmonter les principaux défis associés à la pratique
de la MTA. Souvent, ces défis sont liés au statut réglementaire, à l'évaluation de la sécurité et
de l'efficacité, au contrôle de la qualité et au manque de connaissances sur la MTA au sein des
autorités nationales de réglementation des médicaments (Fennell et al., 2004; Street et al.,
2008). Afin de mieux comprendre et d'identifier les lacunes existantes en matière de
connaissances, une vue d'ensemble des défis communs affectant la MTA est mise en évidence
ci-dessous.
La plupart des pays africains sont encore en retard dans le développement et le contrôle de leur
industrie des plantes médicinales par rapport à la Chine, réputée pour son excellente médecine
traditionnelle. Les chercheurs africains étudient fréquemment plusieurs aspects nécessaires au
développement de la MTA, en particulier la pharmacologie et la toxicologie des plantes
médicinales (Fennell et al., 2004). Même si l'on ne manque pas de données (préliminaires)
démontrant les effets pharmacologiques de nombreuses plantes contre différentes maladies, la
principale préoccupation reste la fiabilité de la majorité de ces résultats, qui sont souvent des
essais In vitro. Idéalement, les essais In vitro donnant des résultats prometteurs devraient être
suivis d'études In vivo et finalement d'études cliniques (Houghton et al., 2007).
Dans de nombreux pays africains, les effets indésirables et même la mort associée à l'ingestion
de plantes médicinales restent encore largement non déclarés et mal documentés (Steenkamp
et al., 2002) . Malgré l'hypothèse générale selon laquelle les plantes médicinales d'usage courant
sont sûres (Gurib-Fakim, 2006), des recherches scientifiques récentes ont montré que certaines
plantes couramment utilisées comme compléments alimentaires ainsi que dans la MTA sont
potentiellement toxiques, mutagènes et cancérigènes (Verschaeve and Van Staden, 2008). La
8
Ethnopharmacologie
disponibilité d'un nombre relativement faible d'études axées sur la sécurité de la MTA est
associée à l'insuffisance et/ou au manque de ressources pour les enquêtes médico-légales ainsi
qu'à la rareté relative des méthodes de détection des toxines végétales (Kamsu-Foguem and
Foguem, 2014). Souvent, une mauvaise identification, une substitution involontaire ou
délibérée de produits à base de plantes, une préparation incorrecte, une administration
inappropriée et des dosages non normalisés sont les causes principales de la toxicité de la
phytothérapie. En outre, les commerçants de la MTA conservent souvent ces plantes
médicinales dans de vieux conteneurs recyclés utilisés auparavant pour les produits chimiques
dangereux, et ces pratiques posent un grand risque pour la santé des consommateurs en raison
de la contamination croisée (Street et al., 2008).
Bien que la documentation sur la botanique, la bioactivité et la chimie des plantes médicinales
ne soit pas rare, il existe relativement peu d'informations sur d'autres aspects tout aussi
importants comme la durée de conservation, la physiologie post-récolte et le stockage (Street
et al., 2008). Par exemple, la durée de conservation indique essentiellement le point auquel un
produit ne répond plus aux exigences auxquelles il est soumis et peut même être considéré
comme dangereux lorsqu'il est consommé. De plus, la collecte accrue d'espèces végétales à
forte demande entraîne une récolte non durable, ce qui entraîne des périodes de stockage de
matériel végétal plus longues que prévu (Fennell et al., 2004). Cependant, le manque
d'installations de stockage et d'infrastructures commerciales provoque souvent la détérioration
des plantes médicinales, ce qui entraîne un gaspillage et/ou une diminution de la qualité des
produits.
Des pays comme Madagascar, l'Afrique du Sud, la Tanzanie et le Congo font partie des points
chauds reconnus de la biodiversité en Afrique. Ces zones, en particulier Madagascar, qui est
dotée d'un haut niveau d'endémisme (environ 90% des taxons végétaux), fournissent des trésors
inestimables qui nécessitent des lois et des réglementations strictes pour assurer leur protection.
Cependant, ces lois et règlements sont inexistants ou mal appliqués dans de nombreux pays
d'Afrique. Actuellement, un certain nombre d'espèces de plantes médicinales sont gravement
menacées dans la nature et sont souvent difficiles à trouver en dehors des zones protégées
(Williams et al., 2013).
9
Ethnopharmacologie
3.4 Perspectives d'avenir
Parmi les défis complexes liés à l'utilisation de plantes indigènes comme plantes médicinales,
il y a la question des droits de propriété intellectuelle. Dans une étude sur l'utilisation des plantes
médicinales en Afrique de l'Est, Schlage et al. en 2000 ont réitéré que les communautés locales
devraient être financièrement récompensées en termes de redevances pour avoir partagé leurs
connaissances avec des scientifiques et d'autres personnes de l'extérieur. Ces questions peuvent
être abordées par le biais d'une politique globale et d'un cadre juridique sur l'MTA. En fonction
de leur situation particulière, les pays africains doivent également se concentrer sérieusement
sur la conservation des plantes médicinales. La demande commerciale croissante de certaines
plantes pour approvisionner les marchés locaux et internationaux a conduit à une exploitation
localisée incontrôlée, aveugle et parfois illégale des plantes, entraînant même l'extinction de
certains taxons. Que ce soit par ignorance ou par cupidité, les impacts à long terme des pratiques
actuelles de surexploitation et de destruction de l'habitat sont réels et effrayants. Par conséquent,
il y a un besoin urgent de stratégies de conservation et de promotion de l'utilisation durable des
plantes médicinales. A cet égard, les récents appels à la culture systématique de nombreuses
autres espèces de plantes médicinales doivent être sérieusement pris en considération.
4 Conclusion :
L'importance des plantes médicinales et leur contribution à la fourniture de soins de santé
primaires en Afrique est bien reconnue, mais d’ après les travaux de certains auteurs cités ci-
dessus le paradoxe de l'ethnopharmacologie en Afrique est qu'en dépit de la richesse et de la
diversité végétale immensément unique et de son potentiel inhérent pour la découverte de
nouveaux composés pharmaceutiques, la plupart des recherches sont largement basées sur des
modèles In vitro et restent préliminaires et incomplètes.
10
Chapitre II
Tetraclinis articulata : description
et veille scientifique
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
1 Introduction :
La première partie de ce chapitre est une considération générale sur le Thuya de Maghreb, dans
laquelle on décrit la plante sur plusieurs aspects (botanique, biologique, usage…). La seconde
partie est consacrée à l’état de l’art de la recherche sur la plante, et afin d’avoir la bonne
information au lieu de toute l’information qui existe sur le web nous avons opté à une veille
scientifique en utilisant une méthodologie de collecte de données ordonnée. L’objectif de la
veille est non seulement afin de positionnemer notre recherche dans son environnement
scientifique, mais aussi pour rendre compte des travaux de recherches sur le Tetraclinis
articulata vahl) Mast, et plus précisément ceux qui sont proches de notre thématique générale.
2.1 Histoire :
Le Thuya de Maghreb dont le nom scientifique est le Tetraclinis articulata (Vahl) Mast, a été
décrit par Vahl en 1791 sous le nom de Thuya articulata, puis il a été reporté au genre Tetraclinis
par Benth (1883) (Toumi, 2009). Elle est appelée « Thuya de Maghreb » « Thuya de Berberie »
l’arbre de vie mauresque, en arabe on l’appelle « Araar Berhouch » que l’on peut traduire par
« le faux cyprès ».
Les botanistes arabes ont connu et décrit l’arbre bien avant Vahl. Parmi les manuscrits les plus
anciens qu’on a pu consulter c’est celui d’Ibn al-Baitar. Ce médecin botaniste andalou, qui a
vécu en 12ème siècle, a décrit « Araar » et ces propriétés thérapeutiques dans son ouvrage « Kitāb
al-Jāmi'l-Mufradāt al-Adwiya wa-l-Aghdhiya » et il a même annoncé que d’autres médecins
musulmans qui ont vécu avant lui comme Avicenne, connaissaient l’arbre et ces vertus
médicinales.
2.2 Classification :
En ce qui concerne la classification botanique, le T.articulata fait partie de la famille des
cupressacées qui comprend six genres dont l’articulata est le seul représentant du genre
Tetraclinis. Le tableau ci-dessous présente la classification de l’espèce :
11
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
Règne Plantae
Division Pinophyta
Classe Pinopsida
Ordre Pinales
Famille Cupressaceae
Genre Tetraclinis
Espèce Tetraclinis articulata
Le Thuya est une espèce endémique à la région méridionale du bassin méditerranéen occidental
(Afrique du Nord) à l’exception de deux stations, l’une au sud de Carthagène en Espagne, et
l’autre très restreinte dans l’île de Malte (Fig 1). Cette essence n’atteint son plein
développement que dans le nord-ouest de l’Afrique, c'est-à-dire dans les pays du Maghreb, d’où
son appellation : Thuya de Maghreb. Il a une zone naturelle qui couvre l'Afrique du Nord avec
une superficie d'environ 1 million d’hectares (Roloff et al., 2009).
12
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
2.4 Biologie de l’espèce :
La figure 2 ci-dessous représente des photos des différentes parties de l’arbre et la figure 3 est
un spécimen de Thuya récolté au Maroc est déposé dans l’herbier du Jardin botanique Missouri
dans les États-Unis de l’Amérique avec un numéro de référence de MO-2536592.
13
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
14
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
15
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
2.5 Écologie de l’espèce :
Le peuplement de Thuya assure un rôle très important dans la vie économique et sociale des
populations. Dans le secteur artisanal, le bois de T. articulata, par sa rusticité et sa résistance
aux agents de destruction est considéré comme excellente matière de technologie pour
l’ébénisterie dure et moderne qui supporte très bien l’écrasement, et comme un très beau
matériau susceptible à de nombreux usages dans la menuiserie fine. Ce bois est très recherché
par la marqueterie artisanale. Ainsi, les loupes de thuya sont devenues très rares à cause de leur
exploitation abusive dans les vieux peuplements et qui a contribué à la diminution de la densité
de ces forêts. Au Maroc, le travail du bois de Thuya est localisé principalement dans la ville
d’Essaouira, ce secteur emploie environ 1690 ouvriers, dont 25% sont formés au centre de
formation professionnelle, créée en 1984 à Essaouira. Les exploitations des produits artisanaux
sont de l’ordre de 3134776 dH en 1990 (Toumi, 2009).
La gomme sandaraque, de couleur jaunâtre, produite particulièrement par le Thuya est utilisée
dans la fabrication de vernis de luxe, des produits pharmaceutiques et dans d’autres usages
industriels, elle est aussi utilisée sous forme de poudre pour préparer la surface de certain papier.
Le goudron végétal est obtenu par distillation et exploité en faible quantité dans des besoins
locaux. L’écorce de Thuya est riche en extraits de résine qui forme la sandaraque de grande
16
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
valeur. Son tannin est utilisé dans la fabrication de certaines encres. La richesse des
Tetraclinaies en Lamiacées (Thymus, lavande et autres), permets une production et un
rendement élevés en nectar, ce qui donne au miel qui en résulte une excellente qualité (Toumi,
2009).
En médecine populaire, les feuilles et les rameaux de Thuya sont utilisés pour arrêter les
hémorragies, traiter les maladies vénériennes et l’hypertrophie prostatique (Baba aissa,2000).
Au Maroc, les populations locales utilisent cette essence forestière dans la médecine
traditionnelle, pour traiter les infections intestinales et respiratoires (Bellakhdar et al., 1991).
Les gens du Moyen-Orient emploient la poudre des feuilles comme hémostatique en recouvrant
la plaie produite par la circoncision. Des propriétés sudorifiques, diurétiques et
antirhumatismales sont accordées aux feuilles et aux rameaux de l’arbre. Ils sont aussi
préconisés pour pallier les maladies cardiovasculaires et le diabète (Bourkhiss et al., 2016). La
plante est aussi considérée comme un agent aromatisant important, couramment utilisé dans les
tisanes et très apprécié pour son odeur et ainsi pour ses propriétés antiinflammatoires. De plus,
les feuilles de cet arbre sont employées en cataplasmes contre les vertiges, les maux de tête et
les douleurs de cou (El Jemli et al., 2017a). Les propriétés thérapeutiques multiples de
Tetraclinis articulata (Vahl) lui accordent le nom de l’arbre de vie (Rebahi A, 2015).
17
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
3 La veille scientifique :
La veille scientifique est définie comme « une activité mettant en œuvre des techniques
d’acquisition, de stockage et d’analyse d’information, concernant un sujet, un produit ou un
procédé, sur l’état de l’art et l’évolution de son environnement scientifique, technique,
industrielle et commerciale afin de collecter, organiser puis analyser et diffuser les informations
pertinentes qui vont permettre d’anticiper l’évolution et qui vont faciliter l’innovation » (Said,
2016). Notre veille scientifique sur le Tetraclinis articulata (Vahl) Mast couvre une période qui
s’étale de l’année 1900 jusqu’à 2017. Pour ce faire, nous avons suivis l’approche reportée par
Said (2016), et qui consiste à répondre aux questions suivantes : Quoi (What) ? Pour quoi (why)
? Qui (who) ? Quand (When) ? Où (where) ? et comment (How) ? (Tableau 2)
18
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
3.1 État de l’art de la recherche sur le T.articulata :
Références retrouvées
266 réf
Références retenues
216 réf
19
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
120
104
100
Nombre de références 80
60 53
40 38
20 12
0 1 0 0 2 0 4 2
0
Années
Cette équation nous a permis de filtrer que les travaux ayants une relation directe avec nos
objectifs de recherches. Ces travaux qui représentent presque le un tiers (80 réf) des références
retenues ont été classés tout d’abord par décennie (Fig 6) et ensuite par contenus (Fig 7) afin
d’atteindre l’objectif visé par cette veille scientifique.
20
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
60 55
50
Nombre de références 40
30
19
20
10
2
0 0 0 0 1 0 2 0 0
0
Années
Figure 6 : Volume des publications en relation avec le thème de recherche par décennie.
Après les travaux d’ Erdtman qui a traité l’aspect phytochimique du T.articulata aucune
publication dans ce sens n’est apparue jusqu’à l’étude du Ait et al en 1990. Cette équipe de
recherche marocaine a contribué toujours à l’analyse chimique du bois de l’arbre. En 1999, le
T.articulata des iles de Maltes a fait l’objet d’une étude réalisée par Buhagiar et al. Il s’agit
d’un premier test de l'effet cytotoxique de l'huile essentielle de l’arbre sur un certain nombre de
lignées cellulaires cancéreuses humaines. Leurs résultats ont révélé que toutes les lignées
cellulaires testées ont été inhibées de manière dose-dépendante et dans un temps de contact de
moins de huit heures. Alors l’équipe a conclu que l'huile essentielle contient des composants
qui sont efficaces pour induire l'apoptose. Grâce à cette publication, le Thuya a commencé de
susciter plus d’intérêt et les travaux consacrés à l’étude de ses activités biologiques et la
caractérisation notamment de ces huiles essentielles ont exponentiellement augmenté à partir
des années 2000.
Comme il a été déjà indiqué auparavant, les travaux en relation avec notre thème de recherche
(du 2000 au 2017) ont été classés par contenu (Fig 7) :
21
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
Caractérisation chimique
40 réf
Nombre total
74 réf
Caractérisation chimique
3 réf
Extrait bruts
Activité biologique In vitro Antioxydante, antimicrobienne,
12 réf
9 réf antiinflammatoire.
Figure 7: Classement des références collectées entre 2000 et 2017 par contenu.
Le classement des références par contenu a montré que la majorité de ces dernières concernent
l’étude des huiles essentielles. Cette fraction volatile a fait l’objet de nombreuses analyses
chromatographiques. La composition chimique des huiles essentielles de tous les organes de
T.articulata a été identifiée à plusieurs reprises. Leurs activités biologiques ont fait l’objet de
plusieurs tests In vitro, notamment le test de l’activité antioxydante, antimicrobienne et
antiinflammatoire. Un seul travail a été publié sur l’activité antiinflammatoire les huiles
essentielles des feuilles In vivo par El Jemli et al en 2017.
Pour les extraits bruts de l’arbre, douze références uniquement ont été retrouvées. Deux
chercheurs seulement ont tenté de caractériser les composés phénoliques dans les feuilles de
Thuya. Certains travaux ont testé les activités antioxydantes, antimicrobiennes et
antiinflammatoires de quelques extraits In vitro. Les activités biologiques des organes de
l’arbre n’ont été jamais testées In vivo.
22
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
3.1.3 Les huiles essentielles de T.articulata :
• Composition chimique :
En termes de composition chimique, Buhagiar et al. (2000) est parmi les pionniers qui ont fait
une analyse complète de tous les organes de l’arbre et ces travaux sont beaucoup cités par les
chercheurs. Il a évalué le rendement et la composition de l'huile essentielle extraite des
branches feuillues et ligneuses, des cônes et des graines d'un peuplement cultivé de
T.articulata croissant à Malte. Les principaux composants identifiés étaient l α-pinène, le
limonène, le camphre, l'acétate de bornyle, le bornéol et le germacrène D.
En Tunisie, Herzi a adopté une nouvelle approche d’étude de la fraction volatile de Thuya. Elle
a tenté une optimisation d’extraction en variant certains paramètres telque la température, le
temps, la pression et la technique d’extraction. Dans l’un de ses travaux les plus cités, elle a
identifié jusqu’à 86 composés en mettant en évidence quelques différences entre les composés
obtenus par différentes techniques, mais qui ne sont pas significatives (Herzi et al., 2013b).
D’une manière générale, la majorité des travaux de caractérisation des huiles essentielles n’ ont
pas révélé des différences en termes de composés majoritaires. La proportion de ces derniers
varie en fonction des localités géographiques des arbres et aussi l’efficacité des programmes
utilisés lors de l’analyse chromatographique.
• Activités biologiques :
L’activité antioxydante des huiles essentielles de T. articulata a été testé In vitro par plusieurs
chercheurs et par différentes méthodes. Les principaux résultats ont monté que les fractions
volatiles de thuya ne sont pas actives en utilisant les méthodes DPPH, FRAP et ATBS. En
23
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
revanche les tests avec la méthode de β carotène ont révélé un pouvoir antioxydant
considérable. Les auteurs ont expliqué ces résultats par le caractère lipophile des huiles
essentielles (Ben Jemia et al., 2013; Chikhoune et al., 2013; Herzi et al., 2013b).
L’activité antimicrobienne a fait l’objet de quelques publications. Une certaine variabilité a été
constatée entre les résultats de ces travaux et qui peut être due à plusieurs facteurs, notamment
la nature des souches et les conditions opératoires. D’une manière générale, l’effet antibactérien
et antifongique vis-à-vis certaines souches a été démontré à plusieurs reprises ( Bahri et al.,
2016; Ghnaya et al., 2016; Abi-Ayada et al., 2011; Moussaouiti et al., 2010; Bourkhiss et al.,
2007).
L’effet antiinflammatoire des huiles a été testé In vitro par Bourkhiss et al. en 2010 et Djouahri
et al. en 2015. Les deux auteurs ont mis en évidence une inhibition considérable de la
lipooxygenase et de la xanthine oxydase par les huiles essentielles des feuilles de l’arbre. Cette
activité n’a été testée qu’une seule fois In vivo par El Jemli et al. en 2017. Dans son test basé
sur l’induction d’oedème chez les rats par un stimulus chimique et aussi mécanique, l’huile
essentielle de T. articulata a montré une réduction efficace du gonflement après environ 6 h de
son administration par voie orale à la dose de 200 mg / kg. Dans ce même travail, les auteurs
ont aussi démontré que cette fraction volatile des feuilles n’est pas toxique après avoir testé sa
toxicité générale sur les rats.
• Composition chimique :
La composition chimique des extraits bruts de T.articulata demeure mal connue. Il existe 3
références qui rapportent une composition des feuilles de l’arbre. Zidane et al., en 2014 a
analysé des extraits de feuille obtenus par 3 solvants en utilisant la chromatographie sur couche
mince et la chromatographie liquide avec détection par réseau de diodes et parfois par
spectrométrie de masse. Il a pu identifier six composés dans fournir des proportions et qui sont :
la myricitrin, catéchine, quercitrin, afzelin, cupressuflavone et amentoflavone. En 2016 ,
l’analyse de l’extrait métanolique des feuilles par UPLC-MS effectué par Dane et al. a décelé
une composition à moitié différente de celle de Zidane. Les constituants identifiés sont :la
myricetin-rhamnoside (42.76%), quercetin-3-O-rhamnoside (31.05%), catéchine (18.83%),
myricetin-hexose (4.58%), kaempferol-deoxyhexose (2.03%), quercetin-3-O-glucoside (0.5%)
et le kaempferol-hexose (0.20%). En fait, les trois composés majoritaires ont été ainsi identifiés
par Zidane. Djouahri et al. en 2014 a caractérisé quelques composés, mais cette fois-ci dans
24
Tetraclinis articulata : description et veille scientifique
l’extrait des cônes. Son analyse HPLC a révélé la présence de l’acide tannique, acide Caffeique,
Catéchine, acide gallique, rutine et la quercetine.
• Activités biologiques :
Les publications de Djouahri sur les extraits bruts de T.articulata sont les plus citées. Il a testé
à la fois l’activité antioxydante, antibactérienne et antiinflammatoire In vitro. Dans l’un de ces
travaux, il a testé la sensibilité de douze souches microbiennes en utilisant la méthode de
disques. Listeria monocytogenes était le plus sensible vis-à-vis des différents extraits.
Cependant, les autres résultats montrent l'inefficacité des extraits contre Klebsiella pneumoniae,
Fusarium culmorum, Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus et Candida albicans (Djouahri
et al., 2013). Dans un autre travail, il mit en évidence un effet antioxydant considérable des
extraits en utilisant le test de DPPH et de FRAP (Djouahri and Boudarene, 2012). En ce qui
concerne l’activité antiinflammatoire, ces travaux ont révélé que l’extrait hydroalcoolique des
feuilles inhibe la lipooxygénase et la xanthine oxydase In vitro.
4 Conclusion :
Les travaux scientifiques sur le T.articulata restent peu nombreux et leurs quasi-totalités se
focalisent sur l’étude des huiles essentielles de l’arbre. De plus, les études des activités
biologiques de cette fraction volatile sont préliminaires et se limitent généralement à des tests
In vitro. La composition et les activités biologiques des extraits bruts de la plante sont presque
méconnues. En fin, la veille scientifique nous a permis de dégager de nouvelles pistes de
recherches afin de contribuer efficacement dans l’étude de cet arbre qui fait partie de notre
patrimoine national.
25
Chapitre III
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
1 Introduction :
Après avoir positionné notre recherche dans son environnement scientifique grâce à la veille
décrite précédemment, on présentera dans ce chapitre la méthodologie retenue afin de mener à
bien le travail. Notre démarche expérimentale s’inscrit dans le cadre de l’ethnopharmacologie
(chapitre1), ce qui fait que la première étape du travail est une étude ethnobotanique qui
permettra d’apprécier les usages de T.articulata en médecine populaire afin d’orienter, en
quelque sorte, la recherche au laboratoire. La seconde étape correspond à l’échantillonnage et
la préparation de la matière végétale qui va servir aux éventuels tests. L’étape qui suit est l’étude
des activités biologiques des différentes parties de la plante, à savoir les feuilles, les rameaux
et les cônes. Il s’agit d’un ensemble de tests In vivo et In vitro qui permettront de vérifier
empiriquement quelques effets thérapeutiques de l’arbre présumés par la population locale. La
dernière étape consiste à une caractérisation chimique des composés phénoliques par des
analyses quantitatives et qualitatives.
2 Étude ethnobotanique :
2.1 Principe :
L’enquête ethnobotanique vise à collecter les données et réunir les informations considérées
comme étant nécessaires à la résolution d’un problème de recherche particulier. Les données
sont collectées auprès des habitants d’une zone d’étude pour différentes raisons ; notamment :
La méthodologie retenue pour la réalisation de l’enquête est celle décrite par Gary Martin en
1995 avec certaines modifications.
2.2 Protocole :
26
Matériel et méthodes
a. Choisir la région d’étude : dans notre cas il s’agit de la ville de Sidi Bel Abbes (Nord-ouest
d’Algérie) et un certain nombre de ces villages (Lamtar, Ben Badis, Ras El Ma, Chitwane,
Moulay Slissen, Sidi Lahcene, et Tenira).
b. S’approcher des gens et se présenter en expliquant quels sont nos objectifs et les sensibiliser
aussi qu’ils vont contribuer à l’apport de nouvelles informations à la science.
c. Recueillir les informations sur la plante choisie (T.articulata) à travers des entretiens, en
utilisant un questionnaire simple dont les principales questions sont :
d. Donner l’occasion aux informateurs de s’exprimer librement même s’ils donnaient des
détails qui ne sont pas demandés.
e. Identifier les informateurs clés (spécialistes, herboristes, personnes âgées…) pour exploiter
leurs réponses en détail dans la section analyse.
2.3 Questionnaire :
Le questionnaire ci-après contient une partie qui concerne les informations personnelles de
l’informateur et une seconde partie concerne les données sur la plante.
a. partie informateur :
Les individus ayant plus de 20 ans ont été choisis d’une manière aléatoire. Pour chaque enquêté,
on note certaines informations personnelles (Âge, niveau d’étude, situation familiale…) non
seulement pour décrire l’échantillon interrogé, mais aussi afin d’avoir des données qui peuvent
servir pour une éventuelle étude ethnologique.
b. partie plante :
Dans cette partie des questions précises et objectives ont été posées aux enquêtés en se basant
sur nos connaissances bibliographiques sur le T.articulata. La connaissance et l’identification
de la plante, son mode de préparation et d’utilisation ainsi que les types d’affections traitées
sont les principales questions posées aux sujets interrogés.
27
Matériel et méthodes
Fiche d’enquête ethnobotanique
3/ Niveau d’étude : 13/ La plante est utilisée dans quels types d’affection :
Médecine Cosmétique Industrie 16/Quelles sont les préparations et les recettes que vous
connaissez à base de cette plante ?
Autres ………………………………………………...
……………………………………………………………
9/ Quelles sont les parties utilisées en médecine ?
…………………………………………………………….
Feuilles rameaux cône écorce racine
…………………………………………………………….
10/ En quel état sont-elles utilisées ?
…………………………………………….……………….
Fraiche ……………. Sèche ………………..
Vous pouvez utiliser le verso
11/ Quel est leur mode de préparation :
28
Matériel et méthodes
Les résultats sont exprimés en pourcentage et représentés graphiquement par des diagrammes
en portions ou en bâtons. Logiciel utilisé dans l’analyse des résultats est le Microsoft Excel
2016. Toutes les données qui concernent les utilisations et les remèdes traditionnels cités par
les informateurs clés sont rédigées et rapportées telles qu’elles sont dans le chapitre « résultats
et discussion ».
Afin de décrire davantage nos résultats ; nous avons calculé certains indices quantitatifs utilisés
en ethnobotanique. Depuis les années 1990, ces indices sont devenus de plus en plus communs
chez les ethnobiologues et les ethnobotanistes en particulier. Ils étaient proposés par quelques
auteurs et par la suite de nombreux chercheurs les ont adoptés dans leurs recherches parce qu’ils
ont permis d’uniformiser, plus ou moins, les résultats des enquêtes et ce qui facilite par
conséquent la comparaison entre les différentes études. Parmi les indices les plus communs,
nous avons choisi ceux qui sont adaptés à notre étude :
L'importance relative de chaque espèce végétale connue localement comme remède est appelée
UV, et elle est calculée à l'aide de la formule suivante : (Barnert and Messmann, 2008)
UV= ƩU / n
D’où UV est la valeur d'usage d'une espèce, U est le nombre de rapports d'utilisation cités par
chaque informateur pour une espèce végétale donnée et n est le nombre total d'informateurs
interrogés.
L'UV est utile pour déterminer les plantes ayant l'utilisation la plus élevée (le plus souvent
indiqué) dans le traitement d'une affection. Les UV sont élevés quand il y a de nombreux
rapports d'utilisation pour une plante.
Le niveau de fidélité est utilisé pour déterminer la fréquence d’utilisation d’une plante dans le
traitement d'une catégorie particulière de maladies. Le FL est calculé en utilisant la formule
suivante (Martin, 1995):
29
Matériel et méthodes
D’où NP est le nombre de rapports d'utilisation de la plante pour une catégorie particulière de
maladie et N est le nombre total de rapports d'utilisation cités. En général, on obtient des FLs
élevées pour les plantes pour lesquelles pratiquement tous les rapports d'utilisation se réfèrent
à la même catégorie d’affection, alors que les FLs faibles sont obtenus pour des plantes utilisées
à de nombreuses fins différentes.
L’IV mesure l’efficacité et l’importance de la plante au sein d’une population. Elle est calculée
par la formule suivante (Byg and Balslev, 2001).
IV= ni /n
D’où ni est le nombre d’informateurs qui considèrent que la plante est importante et efficace et
n’est le nombre total des informateurs.
30
Matériel et méthodes
3 Échantillonnage et préparation de la matière végétale :
3.1 Récolte :
La matière végétale a été récoltée pendant la matinée du 17/11/2016 dans un temps ensoleillé
sur le flanc nord de la montagne des lions (près de la ville d’Oran, Algérie occidentale). Cette
dernière s’élève brusquement au-dessus de la mer atteignant une altitude estimée à 611 m. Sur
cette montagne existe un petit peuplement naturel de T.articulata dans une station située à une
altitude d’environ 80 m et elle est comprise entre les longitudes 0º 29´ 58´´ W / 0º 30´ 01´´ W
et les deux latitudes 35º 47´ 11´´N / 35º 47´ 23´´ N (Fig 8). Des arbres sains ont été choisis
d’une manière aléatoire et les parties terminales des rameaux feuillus et qui portent des cônes
ont été coupées à l’aide d’un sécateur.
Au niveau du laboratoire les trois organes (feuilles, rameaux et cônes) ont été lavés et séparés.
Le matériel végétal a été séché à l’abri de la lumière à l’air libre dans la température de
31
Matériel et méthodes
laboratoire (18 à 20°C). Pour déterminer la teneur en eau, 100 g de matière fraiche de chaque
organe a été pesé à part (Fig 9), en suite, une série de pesés a été effectuée dans un intervalle
de temps précis (chaque 3 jours) de la même quantité jusqu’à la stabilisation du poids de cette
dernière.
3.3 Broyage :
Les parties séchées ont été broyées à l’aide d’un broyeur de type (IKA A 11) jusqu’à l’obtention
de particules dont la granulométrie varie entre 0.8 mm et 2 mm ; cette taille des particules
favorise l’obtention des meilleurs rendements comme a précisé Herzi et al., 2013a.
32
Matériel et méthodes
3.4 Extraction :
Les extraits des différents organes (feuilles, rameaux, cônes) ont été préparés par la macération
de la poudre végétale dans l’éthanol 80 % en utilisant un ratio poudre/solvant de 10 %. Le
solvant a été renouvelé chaque 24 h pendant 3 jours. Les phases organiques obtenues ont été
concentrées à sec sous pression réduite et ensuite conservée à 4 °C pour être utilisées dans les
différentes analyses décrites ci-dessous. Le rendement (R%) d’extraction a été calculé par la
formule suivante :
R%= (masse de résidu sec /masse de la poudre végétale) x 100
33
Matériel et méthodes
4 Activités biologiques :
Certaines activités biologiques ont été testées In vivo et d’autres In vitro selon nos moyens et
les modèles expérimentaux qui existes.
Avant de décrire les méthodes et les protocoles utilisés dans les tests biologiques In vivo voici
quelques considérations générales :
• Les animaux utilisés sont des souris albinos (BALB/c) élevés par nous-mêmes dans la
faculté des sciences de la nature et de la vie de Sidi Bel Abbes. L’élevage a été effectué
dans des cages en plexiglas avec une grille en aluminium (58 x 38 x 20 cm) munis
d’abreuvoirs et de mangeoires. Le nombre maximal d’animaux à l’âge adulte, par cage,
est de 25 individus. Les animaux étaient nourris avec un aliment en granule destiné à
l’alimentation des rongeurs et ils avaient un accès libre à l’eau 24h/24h.
• Les animaux destinés aux expériences avaient un poids de 23 à 30 g. Ils étaient
transportés au laboratoire un jour avant l’expérimentation pour les acclimater aux
nouvelles conditions.
• Les extraits secs de T.articulata destinés aux traitements des animaux ont été préparés
en suspension aux doses souhaitées dans l’eau physiologique (NaCl 0.9 %). En ce qui
concerne la voie d’administration de nos produits, certains chercheurs suggèrent que les
études pharmacologiques devraient être effectuées en utilisant la même voie
d'administration que celle prévue chez l'homme. Étant donné que dans la plupart des
cas, les plantes sont administrées par voie orale, cette dernière est utilisée fréquemment
dans les études sur les animaux. D'autre part, il n'y a aucune garantie que les souris ont
une absorption et un métabolisme similaires à ceux de l'homme par voie orale. En effet,
certains médicaments, par exemple les neuroleptiques, halopéridol ou sulpiride, sont
très mal absorbés chez les rongeurs après administration orale, ce qui n’est pas le cas
chez l'homme. Le risque d'une mauvaise absorption chez les souris pourrait en effet
justifier l'utilisation d'une voie plus efficace comme l’intrapéritonéale ou la sous-
cutanée pour les études pharmacologiques d'innocuité (Vogel et al., 2006). En se basant
sur cet ordre d’idées, nous avons décidé d’administrer nos extraits par voie
intrapéritonéale du fait qu’il s’agit dans la majorité des cas des tests aigus. Le volume
d’administration par cette voie est de 10 ml/kg du poids corporel de l’animal, comme il
34
Matériel et méthodes
est recommandé par l’association américaine pour la science des animaux de laboratoire
« American Association for Laboratory Animal Science » (Turner et al., 2011).
• Comme pour toutes les procédures impliquant des animaux vivants, les considérations
importantes dans le choix de la méthode sont les questions éthiques qui l'entourent. La
plupart des organismes de réglementation se sont prononcés à ce sujet. Cependant, les
principes directeurs sont d'utiliser aussi peu d'animaux que nécessaires et d'éviter autant
que possible de les faire souffrir.
Dans la phase exploratoire des études pharmacologiques, c'est souvent le premier test utilisé In
vivo. Au cours de cette phase, le but du test est de fournir une détection rapide de la toxicité de
la substance d'essai, de la gamme de doses actives et ces principaux effets sur le comportement
et les fonctions physiologiques.
La toxicité de nos extraits a été déterminée selon l’approche décrite par Lorke en 1983. Dans la
première étape de cette méthode, il est nécessaire de déterminer l’étendue approximative de la
toxicité. Ceci a été obtenu en formant trois groupes de trois souris dont chaque groupe reçoit
par voie intrapéritonéale (IP) des doses de 10, 100 et 1000 mg/kg du poids corporel
respectivement. Les animaux ont été observés durant les deux heures qui suivent
l’administration des extraits, afin de noter tous les symptômes de toxicité. Le nombre de
mortalités a été noté après 24 h et ce dernier va servir pour compléter la seconde étape du test.
Cette dernière consiste à administrer des doses spécifiques en se basant sur les résultats de la
première étape (Tableau 3). Dans cette deuxième étape, on n’utilise qu’un seul animal par
groupe et les mortalités sont notées après 24h. Le test est achevé par la détermination de la dose
létale pour 50% des animaux (DL50) en calculant la moyenne géométrique entre la dose non
létale (0/1) et la dose létale qui la suit (1/1) comme c’est indiqué dans le Tableu 3.
35
Matériel et méthodes
Tableau 3: Nombres de mortalités de l'étape 1 et doses correspondantes pour l'étape 2 (Lorke,
1983).
Doses en mg/kg de poids corporel Doses choisies pour la deuxième étape du test
avec tous les résultats possibles de en fonction des résultats de la première étape
la première étape du test
10 100 1000
0/3* 0/3 0/3 / 1600 2900 5000
0/3 0/3 1/3 600 1000 1600 2900
0/3 0/3 2/3 200 400 800 1600
0/3 0/3 3/3 140 225 370 600
0/3 1/3 3/3 50 100 200 400
0/3 2/3 3/3 20 40 80 160
0/3 3/3 3/3 15 25 40 60
1/3 3/3 3/3 5 10 20 40
2/3 3/3 3/3 2 4 8 16
3/3 3/3 3/3 1 2 4 8
*Nombre d'animaux morts / nombre d'animaux utilisés.
L'œdème de la patte de rat ou de souris induit par la carraghénine est un test largement utilisé
pour déterminer l'activité antiinflammatoire. Il constitue un modèle animal simple et courant
pour l'évaluation de cette activité sans blessure ou dommage à la patte enflammée ( Sugishita
et al., 1981; Henriques et al., 1987; Jain et al., 2001; Petersson et al., 2001; Paschapur et al.,
2009; Sini et al., 2010). Il est aussi, de plus en plus utilisé pour tester de nouveaux médicaments
antiinflammatoires ainsi que d'étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation. En 2004,
Posadas et al. estiment environ 400 articles dans la littérature dérivants des activités
antiinflammatoire en utilisant ce modèle.
• Mise en œuvre :
Les animaux ont été randomisés par groupe de cinq. Le groupe I (témoin) a été traité avec du
sérum physiologique, le groupe II avec du diclofénac sodique (10 mg/kg), le reste des groupes
III, IV et V ont été traités avec l’extrait de la plante aux doses de 100, 200 et 300 mg/kg
respectivement. Après 30 minutes de l’administration intrapéritonéale des traitements, 50 µl de
36
Matériel et méthodes
carraghénine (1 % dans du NaCl 0.9%) a été injecté par voie sous-cutanée dans le tissu sous-
plantaire de la patte postérieure droite de chaque souris. Le site d'injection se trouve près du
centre de la région plantaire, un point important par rapport à la souris qui n'a pas de région de
coussinet bien définie sur la face inférieure de la patte postérieure (Fig 10).
Les diamètres des pattes ont été mesurés avant l’injection de carraghénine puis à 1, 2, 3,4 et 5
heures après. La mesure de l'épaisseur des pattes a été faite dans l'axe dorsal-plantaire au niveau
du métatarse à l'aide d'un pied à coulisse. Le point de mesure a été marqué sur le dessus du pied
à l'aide d'un stylo indélébile pour servir de repère pour les mesures subséquentes (Fig 11)
Le gonflement moyen des pattes chez les animaux traités a été comparé à celui du témoin, et
le pourcentage d’inhibition (activité antiinflammatoire) de l’œdème a été déterminé en utilisant
la formule suivante (Muhammad et al., 2012):
dont A représente le volume d’œdème de groupe témoin et B l’œdème de la patte des groupes
traités.
37
Matériel et méthodes
Les méthodes disponibles pour déterminer l'activité antipyrétique consistent à injecter un agent
pyrogène aux animaux et les traités en suite par le produit que l’on veut tester son activité
antipyrétique. Depuis 1935, les chercheurs ont proposé certains agents pour induire la pyrexie
chez les animaux, y compris la levure de bière (Saccharomyces cerevisiae) qui était souvent
utilisée chez les rats, les souris et les cobayes. Loux et al. en 1972 ont porté plus d’attention à
cette dernière technique et ils ont mis au point une méthode précise et reproductible pour évaluer
les effets antipyrétiques des composés à des niveaux de dose qui se rapprochent de ceux utilisés
en traitements cliniques. De nos jours, la méthode de Loux demeure la technique la plus utilisée
par les chercheurs dans les tests préliminaires de pharmacologie.
• Mise en œuvre :
La fièvre a été induite par l’injection sous-cutanée d'une suspension aqueuse à 20 % de levure
de bière à raison de 20 ml/kg. L’injection a été faite dans la région dorsale et plus précisément
sous la nuque de l’animal (Fig 12 a). Les animaux ont été ensuite jeûnés pendant toute la durée
de l'expérience (environ 24 heures). L'eau était disponible à volonté.
La température rectale de chaque animal a été prise avant et 18 h après l'injection de la levure
à l'aide d'un thermomètre numérique (Fig 12 b). Les animaux qui ne présentaient pas une
augmentation minimale de 1°C après les injections de la levure ont été éliminés. Les animaux
sélectionnés ont été par la suite randomisés par groupe de cinq. Le groupe I (témoin) a été traité
avec du sérum physiologique, le groupe II avec du paracétamol (100 mg / kg, IP). Les groupes
38
Matériel et méthodes
III, IV et V ont été traités (IP) avec 100, 200 et 300 mg/kg d’extraits de T.articulata
respectivement. Les températures rectales des animaux ont été de nouveau prise à 1, 2, 3 et à 4
h après les traitements. L'effet antipyrétique a été évalué comme la capacité des traitements à
inverser la pyrexie induite. (Loux et al., 1972).
a b
Figure 12: Injection sous cutané (a) et mesure de la température rectale (b).
L’activité antinociceptive est souvent associée dans les articles scientifiques à l’activité
analgésique et elle est décrite comme une analgésie centrale. Les méthodes décrites pour tester
cette activité chez les animaux, utilisent un stimulus généralement thermique afin de déclencher
une réaction douloureuse. Le test de la plaque chauffante (Hot Plate Test) (Eddy and Leimbach,
1953) est une technique simple permettant d'estimer les effets des substances d'essai sur le seuil
de sensibilité à la douleur. Il est basé sur le principe que les rongeurs, placés sur une surface
chaude, démontreront les effets aversifs de la stimulation d'abord en léchant leurs pattes et
ensuite en tentant clairement d'échapper à la situation (sauter). Les substances qui modifient le
seuil nociceptif augmentent le temps de latence pour lécher/sauter (effet analgésique) ou le
diminuent (effet hyperalgésique). La procédure de la plaque chauffante présente un avantage
par rapport à d'autres méthodes de stimulation thermique, par exemple la procédure de la queue
(Tail flick test) (D’amour and Smith, 1941), en ce qu'elle peut être appliquée de façon répétée
chez les mêmes animaux dans une courte durée (2-3 heures) sans causer de lésions tissulaires,
en particulier si la durée maximale d'observation est de 30 secondes. Cela pourrait être
particulièrement utile pour estimer les effets du court temps. La procédure de la plaque
chauffante constitue également une estimation plus globale de la réactivité nociceptive parce
39
Matériel et méthodes
qu'elle représente un comportement volontaire complexe plutôt qu'un simple réflexe comme
celui de la queue (Vogel et al., 2006).
• Mise en œuvre :
Les animaux ont été soumis à un pré-essai sur la plaque chauffante maintenu à 55 ± 1 °C. Les
animaux ayant un temps de latence supérieur à 15 (s) sur plaque chauffante pendant le prétest
ont été éliminés. Ensuite, les animaux ont été randomisés par groupe de cinq. Le groupe I a été
traité avec une solution saline, le groupe II a été traité avec du Tramadol (30 mg/kg, IP). Les
groupes III, IV et V ont été traités (IP) avec 100, 200 et 300 mg/kg de l’extrait de la plante
respectivement. Après 30 min de traitement, les animaux ont été placés sur la plaque chaude
et le temps de latence a été mesuré en secondes. Le temps de latence est défini par la durée
pendant laquelle la souris reste sur la plaque sans léchage des pattes postérieures ou saut (Fig
13 a et b) (Muhammad et al., 2012).
a b
Figure 13: Léchage des pattes (a) et saut (b) sur la plaque chauffante.
Les tests de l’activité analgésique se font généralement par l’induction des douleurs dans la
région ventrale de l’animal. L’injection d’agent chimique irritant (acide acétique ou
phénylbenzoquinone) au niveau la cavité péritonéale se traduit par des contractions
abdominales, des contorsions et des étirements des pattes arrière de l’animal (Fig…) d’où
l’appellation de ce test en anglais : writhing test.
40
Matériel et méthodes
• Mise en œuvre :
Pour mettre en œuvre ce test, des groupes de cinq souris étaient constitués. Le groupe I (témoin)
a reçu par voie IP du sérum physiologique. Le deuxième groupe a reçu le médicament standard
: diclofénac sodique (10 mg/kg, IP), tandis que les autres groupes III, IV et V ont été injectés
avec 100, 200 et 300 mg/kg (IP) de l’extrait de la plante respectivement. Après 30 minutes, les
animaux ont reçu par voie IP une solution d’acide acétique à 1 %. Le nombre de constrictions
abdominales (contorsions) (Fig 14) a été compté après 5 min de l’injection d’acide acétique
pendant une période de 10 min. L’effet analgésique a été évalué selon la formule suivante
(Muhammad et al., 2012):
Les tests biologiques In vitro réalisés sont l’activité antioxydante et l’activité antibactérienne.
41
Matériel et méthodes
4.2.1 Activité antioxydante :
La nature diversifiée des antioxydants et aussi des radicaux libres, avec des composants
hydrophiles et hydrophobes et la complexité des processus d’oxydation impliquent qu’aucune
méthode n’est universelle pour l’évaluation de l’activité antioxydante d’une manière précise,
et c’est la raison pour laquelle on a opté dans ce présent travail à une combinaison de quatre
méthodes différentes pour mesurer In vitro le pouvoir antioxydant des extraits d’organes de
T.articulata.
Dans cette méthode le radical libre chromogène pourpre DPPH est réduit par les antioxydants
à l'hydrazine correspondante de couleur jaune pâle. Ce test est mis en œuvre par la préparation
des concentrations de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 et 15.62 µg/ml à partir des extraits
hydroalcooliques de la plante et des contrôles positifs (acide ascorbique, acide gallique,
catéchine) ; en suite 50 µl de chaque concentration a été ajouté à 1950 µl de la solution
méthanolique du DPPH (25 mg/l). Le mélange a été incubé à l’obscurité pendant 30 min à
température ambiante avant de lire son absorbance à 515 nm par le spectrophotomètre
(Benhammou et al., 2009). Le pourcentage d’inhibition de DPPH a été calculé par la formule
suivante :
Les résultats sont exprimés en IC50 (concentration inhibitrice de 50% du radical DPPH)
calculée graphiquement à travers la partie linéaire de la courbe des pourcentages inhibitions du
DPPH en fonction des différentes concentrations.
La méthode de FRAP est basée sur la capacité des antioxydants à réduire le complexe ferrique
tripyridyltriazine (Fe+++ -TPTZ) de couleur jaune en complexe ferreux (Fe++ -TPTZ) de couleur
bleue dans un milieu acide. Le réactif de FRAP est préparé par le mélange de 25 ml de tampon
acétate (300 mmol, pH 3,6), 2,5 ml d’une solution de TPTZ (10 mmol/l de 2,4,6-tripyridyl-s-
triazine dans 40 mmol/l de HCL) et 2,5 ml de FeCl3.6H2O (20 mmol/l) (Benzie and Strain,
1996).
42
Matériel et méthodes
Le milieu réactionnel dans ce test contient 100 µl de l’extrait végétal, 300 µl d’eau distillée et
3 ml de réactif de FRAP fraichement préparé. Le mélange est incubé pendant 30 min à 37°C
avant de lire son absorbance à 593 nm. L’acide ascorbique, acide gallique et la catéchine ont
été utilisés comme contrôles positifs. Les concentrations de Fe++ dans le mélange ont été
calculées graphiquement au moyen d’une courbe d’étalonnage réalisé par le FeSO4 (0,2 - 2
mmol/l) (Benzie and Strain, 1996). Les résultats sont exprimés en mol de Fe++/ gramme
d’extrait (Cheurfa and Allem, 2016; Thangaraj, 2015).
Cette méthode est basée sur l'oxydation couplée de β-carotène et l'acide linoléique développée
par Marco en 1968. Elle consiste à mesurer le blanchiment de β-carotène résultant de son
oxydation par les produits de dégradation de l'acide linoléique.
Ce test débute par la préparation d’une émulsion contenant 1 ml d’une solution chloroformique
de β-carotène (200 µg/ml), 20 µl d’acide linoléique et 200 mg de Tween 40. Le chloroforme a
été éliminé par évaporation sous vide. Le résidu ainsi obtenu a été repris dans 50 ml d’eau
distillée chargée d’oxygène et en suite le mélange a été agité vigoureusement. Cinq millilitres
de l’émulsion a été mélangé avec 200 µl de chaque extrait de la plante (2 mg/ml) et incubé à
50°C dans un bain-marie pendant 120 min. l’eau distillée a été utilisée comme contrôle négatif
et des solutions de l’acide ascorbique, acide gallique et catéchine (2 mg/ml) comme contrôles
positifs (Sun and Ho, 2005)
Le test de chélation des ions ferreux a été réalisé selon la méthode décrite par Chew et al. en
2009. Il s’agit de mélanger 1 ml de FeSO4 (0,1 mmol/l) avec 1 ml d’extrait de plante suivi de 1
ml de ferrozine (0,25 mmol/l). L’extrait a été utilisé à 3 concentrations différentes (1.75, 2.50
43
Matériel et méthodes
et 5.00 mg/ml). Ensuite, les mélanges réactionnels ont été incubés à température ambiante
pendant 10 minutes avant de prendre les mesures d'absorbance à 562 nm. En fait, la ferrozine
réagit avec les ions ferreux en solution, et l’absence de réaction implique un effet chélateur des
métaux important. L'acide ascorbique, la Catéchine, l'acide gallique et l'EDTA ont été utilisés
comme témoins positifs. La propriété de chélation des ions ferreux des extraits a été calculée
en pourcentage à l'aide de la formule suivante :
La méthode d'antibiogramme par diffusion sur milieu gélosé permet de classer la plupart des
isolats bactériens comme sensibles ou résistants à une variété d'agents antimicrobiens. Pour
effectuer l'essai, des disques de papier filtre imprégnés d'une concentration spécifiée d'un agent
antimicrobien sont appliqués sur la surface d'un milieu gélosé qui a été inoculé avec l'organisme
d'essai. Le médicament dans le disque diffuse à travers la gélose. Lorsque la distance par rapport
au disque augmente, la concentration de l'agent antimicrobien diminue de façon logarithmique,
ce qui crée un gradient de médicament dans le milieu gélosé entourant chaque disque. En même
temps que la diffusion du médicament, les bactéries qui ont été inoculées sur la surface et qui
n'ont pas été inhibées par la concentration de l'agent antimicrobien dans la gélose continuent de
se multiplier jusqu'à ce qu'une pelouse de croissance soit visible. Dans les zones où la
concentration du médicament est inhibitrice, il n'y a pas de croissance, formant une zone
d'inhibition autour de chaque disque (Jorgensen and Pfaller, 2015).
La mise en œuvre du test a été réalisée selon la procédure décrite par Jorgensen et Turnidge en
2015 dans le grand ouvrage « Manual of Clinical Microbiology » édité par l’association
américaine de microbiologie.
• Préparation des cultures jeunes : dans notre étude, nous avons testé la sensibilité de 4
souches bactériennes référencées, à savoir l’Escherichia coli (ATCC 25922),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 23235),
Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 43300). Les souches ont été ensemencées
en stries sur une gélose nutritive et incubées à 37 °C pendant une nuit avant le jour de
test afin d’avoir des cultures jeunes.
44
Matériel et méthodes
• Préparation de l’inoculum bactérien : il s’agit de choisir 4 à 5 colonies bien isolées avec
une anse de platine et les transférer dans un tube de solution salée stérile (NaCl 0.9%).
Ensuite, émulsionner pour que la turbidité avoisine celle du standard McFarland 0,5.
• Ensemencement : Les plaques de gélose Mueller-Hinton (milieu recommandé pour les
essais de diffusion gélose aux États-Unis) doivent être inoculées dans les 15 minutes
qui suivent la suspension d'inoculum. Un écouvillon stérile a été plongé dans la
suspension, tourné plusieurs fois et pressé doucement sur la paroi intérieure du tube au-
dessus du niveau du liquide pour enlever l'excès d'inoculum. L'écouvillon a été ensuite
étalé trois fois sur toute la surface de la plaque de gélose, la plaque étant tournée
d'environ 60° à chaque fois pour assurer une distribution uniforme de l'inoculum. Un
dernier balayage de l'écouvillon a été effectué autour du bord de la gélose.
• Dépôt des disques : quatre disques stériles en papier Whatman N°1 de 6 mm de diamètre
ont été imprégné avec l’extrait de T.articulata préparé dans le DMSO aux
concentrations 50, 100, 150 et 200 mg/ml respectivement (les concentrations ont été
choisies après avoir faire des prétests de sensibilité). Dans les 15 minutes qui suivent
l'inoculation des plaques d’Agar, les disques ont été uniformément répartis sur la
surface, avec au moins 24 mm entre eux. Ils ont été placés individuellement avec des
pinces stériles, puis pressés doucement sur la surface de la gélose pour assurer un
contact uniforme. Les disques d’antibiotique commercialisés ont été utilisés comme
contrôle positif. Ces derniers sont la Pénicilline 10 µg (P), Gentamycine 10 µg (CN),
Sulfaméthoxazole 23,75 µg et Triméthoprime 1.25µg (SxT) et le Chloramphénicol 30
µg (C). En fin, un disque imprégné dans du DMSO pur a été utilisé comme contrôle
négatif.
• Lecture et interprétation des résultats : Une fois que les disques sont placés sur la gélose,
les boîtes ont été incubées à 37°C pendant 16 à 18 heures. Après une nuit d’incubation,
le diamètre de chaque zone d’inhibition (diamètre du disque compris) a été mesuré en
mm et noté.
45
Matériel et méthodes
5 Caractérisation de composés phénoliques :
Dans cette partie de caractérisation chimique, on opte à des tests quantitatifs par le dosage de
certaines classes de composés phénoliques et aussi qualitatifs par une analyse
chromatographique sur couche mince.
Le dosage des phénols totaux par le réactif de Folin-Ciocalteu a été décrit dès 1965 par
Singleton et Rossi. Le réactif est constitué par un mélange d’acide phosphotungstique
(H3PW12O40) et d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40). Il est réduit, lors de l’oxydation
des phénols, en un mélange d’oxydes bleus de tungstène et de molybdène. La coloration
produite, dont l’absorption maximum comprise entre 725 et 770 nm est proportionnelle à la
quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux ( Boizot et Charpentier, 2006).
• Mise en œuvre
Un volume de 200 μl des extraits a été introduit dans des tubes à essai, le mélange de 1000 µl
du réactif de Folin-Ciocalteu dilué 10 fois et 800 µl de carbonate de sodium (75g/l) a été
additionné. Les tubes ont été agités et conservés durant 30 minutes à la température ambiante.
L’absorbance a été mesurée à 765 nm à l’aide d’un spectrophotomètre contre un blanc qui ne
contient pas l’extrait.
Une courbe d’étalonnage a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant l’acide gallique (0- 200µg/ml) comme contrôle positif.
Les résultats sont exprimés en milligramme (mg) équivalent d’acide gallique par gramme
d’extrait. (mg eq AG/g).
46
Matériel et méthodes
5.1.2 Dosage des flavonoïdes totaux :
La quantification des flavonoïdes a été effectuée par une méthode adaptée par Zhishen et al,
(1999). Le principe de base de cette méthode colorimétrique est que le chlorure d'aluminium
forme des complexes acides stables soit avec le carbonyle (C=O) en position C-4, soit avec le
groupe hydroxyle en C-3 ou C-5 des flavones et des flavonols. En outre, il forme également des
complexes acides labiles avec les groupements orthodihydroxyles éventuellement présents sur
le noyau A et/ou B des flavonoïdes, ce qui entraîne la formation d'une couleur rose, et elle est
mesurée à 510 nm (Thangaraj, 2015).
• Mise en œuvre :
500 μl des extraits ont été mélangés avec 1500 μl d’eau distillée, suivis de 150 μl de nitrite de
sodium à 5%. Après 5 min, 150 μl de trichlorure d’aluminium à 10% a été rajouté au mélange.
Après 6 min d’incubation à la température ambiante, 500 μl d’hydroxyde de sodium à 4% ont
été additionnés. Immédiatement, le mélange a été complètement agité afin d’homogénéiser le
contenu. L’absorbance de la solution de couleur rosâtre a été déterminée à 510 nm contre un
blanc (Zhishen et al., 1999).
Une courbe d’étalonnage a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant de la catéchine (0- 200µg/ml) comme contrôle positif.
La teneur en flavonoïdes totaux des extraits de plante étudiée est exprimée en milligramme
(mg) équivalent de la catéchine par gramme d’extrait (mg eq C/g).
L'échantillon contenant du flavonol donne une couleur verte lorsqu'il réagit avec le chlorure
d'aluminium et l'acétate de sodium, et les échantillons sont lus à 440 nm dans le
spectrophotomètre UV-Vis (Thangaraj, 2015).
• Mise en œuvre :
La teneur en flavonols a été déterminée par la méthode reportée par Miliauskas et al. en 2004.
Il s’agit de mélanger 2 ml des extraits avec 2 ml de trichlorure d’aluminium (20g/l) et 6 ml
d’acétate de sodium (50g/l). Le mélange a été incubé pendant 2.5h à 20 °C avant de lire sans
absorbance à 440nm (Miliauskas et al., 2004).
47
Matériel et méthodes
Une courbe d’étalonnage a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant la myricétine (0- 200µg/ml) comme contrôle positif.
Les résultats de la plante étudiée sont exprimés en milligramme (mg) équivalent de myricétine
par gramme d’extrait (mg eq M/g).
Les tanins condensés ont été déterminés par la méthode à la vanilline en milieu acide (Price et
al, 1978). Cette méthode est basée sur la capacité de la vanilline à réagir avec les unités des
tanins condensés dans un milieu acide, pour produire un complexe coloré mesuré à 550 nm. La
réactivité de la vanilline avec les tanins n’implique que la première unité du polymère.
• Mise en œuvre :
Une courbe d’étalonnage a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant de la catéchine (0- 200µg/ml) comme contrôle positif.
Les résultats de la plante étudiée sont exprimés en milligramme (mg) équivalent de la catéchine
par gramme d’extrait. (mg eq C/g).
Le dosage des tanins hydrolysables est basé sur la réaction de ces derniers avec les chlorures
ferriques en donnant des complexes de couleur brune.
• Mise en œuvre :
500 µl des extraits ont été mélangés avec 3.5 ml d’une solution des chlorures ferriques (0.01M
de FeCl3 dans 0.001 M de HCl). L’absorbance des mélanges a été mesurée immédiatement à
660 nm (Mole and Waterman, 1987).
48
Matériel et méthodes
Une courbe d’étalonnage a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant de l’acide tannique (0- 200µg/ml) comme contrôle positif.
Les résultats de la plante étudiée sont exprimés en milligramme (mg) équivalent d’acide
tannique par gramme d’extrait (mg eq C/g).
Les analyses qualitatives des composés phénoliques ont été réalisées par chromatographie sur
couche mince (CCM).
Dans les analyses chromatographiques, il est souvent recommandé d’utiliser des extraits
partiellement purifiés afin de faciliter la détection des composés. Les composés phénoliques
contenus dans les extraits hydroalcooliques de T.articulata ont été extraits par affrontement
liquide-liquide selon la procédure décrite par Macheix et al. en 2005 dans son ouvrage
« composés phénoliques des végétaux » et aussi Bruneton, en 2016 dans la 5ème édition de
l’ouvrage « pharmacognosie ». Cinq grammes d’extrait sec de T.articulata a été pris dans 100
ml d’eau distillée et versée dans une ampoule à décanter. Cette phase a été rincée trois fois avec
20 ml d’éther de pétrole afin d’éliminer la chlorophylle et quelques composés lipophiles. La
phase aqueuse ainsi obtenue a été encore rincée trois avec 20 ml d’acétate d’éthyle. Selon
Macheix et al., cette dernière fraction renferme 80% des composés phénolique de l’extrait brut
de la plante. Les fractions d’acétate d’éthyle ont été concentrées et destinées aux analyses
chromatographiques.
• La phase stationnaire est une couche mince de gel de silice 60 avec un indicateur de
fluorescence F254 fixée sur des plaques en aluminium (20x20 cm). Les plaques sont
produites par la compagnie allemande Merck et elles sont commercialement
disponibles.
• La phase mobile a été déterminée après avoir testé plusieurs combinaisons de solvants.
Elle est composée de chloroforme/acétate d’éthyle/acide acétique aux ratios de 9/8/3
respectivement.
49
Matériel et méthodes
• Les plaques ont été coupées en morceaux de 10x5 cm. Un trait a été tracé légèrement
au crayon à 1 cm du bord inférieur pour servir comme une ligne de départ, et un
deuxième trait a été tracé à 1 cm du bord supérieur, mais cette fois-ci en grattant la silice
afin de bloquer l’avancement du solvant dans la phase d’élution. À l’aide des capillaires,
les échantillons ont été déposés sur le trait inférieur sous forme de spots circulaires
espacés d’environ 0.5 cm. Les standards phénoliques (catéchine, quercétine, myricétine
et acide tannique) ont été déposés sur les mêmes plaques avec les extraits de
T.articulata.
• L’élution a été effectuée dans des béchers propres après avoir ajusté la phase mobile au
fond à moins d’un cm de hauteur. Les béchers ont été recouverts après le dépôt des
plaques à l’intérieur pour permettre la saturation de la cuve. Lorsque le solvant atteint
les traits supérieurs, les plaques ont été retirées et séchées avec un séchoir.
• La révélation des plaques a été effectuée sous lampe UV 254 nm. La présence des
molécules cache la fluorescence de la silice et ces dernières apparaissent comme des
spots noirs sous lumière UV.
À l’aide d’une règle graduée, la hauteur du front de solvant a été mesurée. Les molécules
séparées et visibles sous forme de taches ont été cernés à l’aide d’un crayon, et à partir du centre
de chaque tâche, la hauteur de migration a été mesurée. Ces mesures sont notées pour servir à
calculer les rapports frontaux ou Rf. Le Rf est caractéristique d’un produit dans un éluant donné
et pour une phase stationnaire donnée.
6 Analyse statistique :
Tous les tests biologiques et chimiques ont été effectués avec trois répétitions au moins, ce qui
implique que les résultats seront présentés en moyenne ± écart type. La comparaison des
moyennes a été réalisée par l’analyse de la variance à un seul facteur (ANOVA) suivi d’une
comparaison multiple par le test de Tukey. Les différences ont été considérées significatives à
partir d’une valeur de P inférieur ou égale à 0,05. Les analyses statistiques ont été effectuées
avec logiciel Minitab 17.
50
Matériel et méthodes
Toutes les représentations graphiques (courbes, diagrammes) ont été générées avec le Microsoft
Excel 2016.
7 Conclusion :
Le choix des méthodes expérimentales pour mener à bien notre étude a été basé en premier lieu
sur la crédibilité de leurs sources bibliographiques. Ces dernières sont constituées
principalement par des ouvrages scientifiques, des articles de revues savantes et des guides et
des manuels de grandes institutions internationales de recherches expérimentales. Les
protocoles ont été représentés en intégralité dans ce chapitre avec quelques illustrations prises
par nous-mêmes lors des expériences.
51
Chapitre IV
Résultats et discussion
Résultats et discussion
1 Introduction :
Ce chapitre est consacré à la présentation des différents résultats expérimentaux et les conversés
avec la problématique et le cadre théorique. L’ordre de présentation des résultats suie celui du
chapitre précédent (matériel et méthodes).
2 Étude ethnobotanique :
Dans les résultats de l’étude ethnobotanique, on décrit, en premier lieu, l’échantillon de la
population interrogé, ensuite les réponses de chaque question sont exploitées à part.
Notre enquête ethnobotanique sur le T.articulata a duré deux mois, durant lesquels on s’est
approché des gens dans les endroits publics, hôpitaux, universités, boutiques, magasins, chez
les herboristes...etc. La famille et nos proches font aussi partie des sujets interrogés. Ces
personnes ont constitué un échantillon de 318 individus de différentes tranches d’âges (Fig 15) ;
leurs sexes, niveaux d’études, situations familiales et habitats sont représentés dans la (Fig 16).
30
25 27
POURCENTAGE
20
21
18 19
15
14
10
0
20-30 30-40 40-50 50-60 plus de 60
AGE PAR ANS
52
Résultats et discussion
L’échantillon de la population interrogé est équilibré en termes d’âgé et sexe. Le niveau d’étude
des informateurs est considérable, dont la moitié de l’échantillon sont des universitaires et le
un tiers ont un niveau secondaire. Les gens ayant un niveau primaire et les analphabètes ne
représentent que 15 % de l’échantillon dans l’ensemble. 74% des sujets interrogés habitent dans
la ville de Sidi Bel Abbes et le reste habitent dans les villages visités. En ce qui concerne la
situation familiale de nos informateurs ; 64 % sont des mariés et le reste sont des célibataires.
53
Résultats et discussion
2.2 Exploitation des réponses du questionnaire :
Les questions étaient posées aux informateurs d’une manière simple, précise et
systématique, en tenant compte de leurs niveaux d’étude et en les donnant aussi la liberté de
s’exprimer librement. Les réponses de nos informateurs sont les suivantes :
Notre premier objectif était de savoir si le nom vernaculaire « Arrar, » العرعارdit quelque
chose aux gens. Les réponses de la quasi-totalité de ces derniers étaient positives (Fig 17).
45 % 50 %
54
Résultats et discussion
déterminer le taux de confusion, nous avons demandé à nos informateurs s’ils distinguent
« »العرعار البرهوشdes autres espèces ayant le même nom vernaculaire «Arrar, »العرعار. Le
résultat est illustré dans la (Fig 18).
15%
85%
OUI NON
Les réponses des informateurs sur le domaine d’utilisation du T.articulata sont présentées dans
la figure 19. La grande proportion de nos enquêtés affirme qu’« Arrar, » العرعارest utilisé dans
la médecine populaire.
On remarque ainsi qu’il est utilisé en deuxième lieu dans le domaine de cosmétique. Les
réponses de nos informateurs sont en accord avec les données bibliographiques qui affirment
que le mélange des feuilles de Thuya et le Henné (Lawsonia inermis) est efficace pour fortifier
les cheveux et les rendre lisses (Centre for Mediterranean Cooperation, 2005).
D’après nos informateurs, la plante n’est pas très utilisée en industrie ou bien dans autres
secteurs. Par contre au Maroc, le bois de T.articulata est très apprécié en ébénisterie et la
fabrication de certains produits artisanale (Fig 20) (Bellakhdar et al., 1991; Seigue, 1985)
55
Résultats et discussion
80
68
70
60
POURCENTAGE
50
40
30
22
20
10 6 4
0
Médecine Cosmétique Industrie Autres
Selon nos informateurs, les feuilles sont la partie la plus utilisée en médecine suivie par les
cônes (Fig 21). Ces informations sont similaires à celles obtenues par d’autres ethnobotanistes
au Maroc (Hassani et al., 2013; Tahraoui et al., 2007). Les rameaux sont aussi utilisés, mais ils
sont souvent en mélange avec les feuilles et c’est la raison pour laquelle ils ne sont pas cités par
les individus interrogés. Le nombre très réduit des informateurs qui ont cité l’utilisation des
racines et des écorces peuvent avoir des informations erronées du fait qu’ils n’ont pas expliqué
comment ces parties sont utilisées, et aussi, il n’existe aucun rapport sur l’utilisation de ces
partis dans la bibliographie.
56
Résultats et discussion
70
60
60
50
POURCENTAGE 40
30 26
20
10 5 5
3
0
Feuille Rameaux Cône Ecorce Racine
Les parties des plantes sont utilisées beaucoup plus, selon nos informateurs, sous forme
sèche (Fig 22).
25 %
75 %
Fraiche Sèche
57
Résultats et discussion
• Quel est le mode de préparation de la plante ?
70 64
60
50
POURCENTAGE
40
30
20
20
10 8
4 5
0
Infusion Décoction Macération Cataplasme Autres
Les parties utilisées de T.articulata sont administrées principalement par voie orale ou bien par
inhalation des vapeurs (Figure n°24).
58
Résultats et discussion
50 47
45
40 37
35
POURCENTAGE 30
25
20
15 12
10
5
5
0
Oral Inhalation Badigeonnge Autres
Dans cette section, on calcule la valeur d’utilisation (UV) afin d’estimer l'importance de notre
plante au sein de la population, et on calcule ainsi le niveau de fidélité (FL) pour déterminer
quelles sont les principales affections dont le T.articulta est utilisé pour les traiter. En fin, on
présente les préparations des remèdes préconisés par nos informateurs clés.
On rappelle que la valeur d’utilisation est le rapport de la somme des rapports d'utilisation sur
le nombre total des informateurs. Le T.articulata (Vahl) présente un indice UV de 2.13, ce qui
signifie statistiquement qu’au moins chaque informateur a cité deux rapports d’utilisation. Ce
taux de connaissance, relativement important, chez la population montre que l’arbre occupe une
place primordiale dans la médecine populaire de la région. D’autres parts (Amine et al., 2015;
Lahsissene and Kahouadji, 2010; Ziyyat et al., 1997) indiquent que le Thuya a aussi une
utilisation fréquente au Maroc, ce qui montre que les peuples partagent, en quelque sorte, les
mêmes traditions médicales.
59
Résultats et discussion
Fidelity level (FL) :
Les niveaux de fidélités liés à l’utilisation de T.articulata dans chaque catégorie d’affection
sont présentés dans le Tableau 4.
Les résultats révèlent que le T.articulata est utilisé dans le traitement de plusieurs types
d’affections. Les maladies respiratoires occupent le premier rang, et se représentent
principalement par la toux saisonnière. Selon nos enquêtés les cônes et les feuilles de l’arbre
ont un effet sédatif et permis de soulager notamment la toux nocturne. En deuxième rang
viennent les maladies gastriques, et elles sont représentées principalement par les troubles de
digestions suite à des repas lourds et aussi l’acidité d’estomac. Les eczémas sont les principales
affections dermatologiques traitées par les feuilles de l’arbre ainsi que certaines maladies
fongiques qui affectent la peau. Selon nos informateurs, certaines maladies génito-urinaires et
ostéo-articulaires sont aussi traitées avec cette espèce. Au Maroc, le Thuya est aussi bien utilisé
dans la pharmacopée traditionnelle, dans le traitement des maladies cardio-vasculaires et
métaboliques tel que le diabète, ce qui n’est pas le cas dans notre région (Bellakhdar, 1997;
Bourkhiss et al., 2016). D’après nos informateurs, les parties de l’arbre sont utilisées avec
d’autres plantes pour préparer de nombreux remèdes de consistance solide ( )عقدةpour traiter
différents types de maladies.
60
Résultats et discussion
Rapports des informateurs clés :
« Faire cuire les cônes dans l’eau avec du sucre jusqu’au obtenir un sirop, et prendre une tasse
chaque soir pour soulager la toux. »
« La consommation du décocté des feuilles cible principalement de calmer et apaiser les maux
de tête et les troubles nerveux, et les Insomnies. »
« La poudre des feuilles agit efficacement sur les saignements, et freine les hémorragies »
« Les feuilles du thuya sont très utilisées comme un remède contre les maladies respiratoires
(rhume, grippe, bronchites) »
« Le mélange des feuilles en poudre avec du henné est appliqué pour traiter les maladies
dermatologiques (cas d’eczéma) »
« Infuser les feuilles sèches et les prendre comme une tisane est efficace contre les douleurs de
colon. »
« Certaines femmes témoignent qu’elles ont eu des résultats efficaces dans le soulagement de
certains troubles de la sphère uro-génitale en utilisant le thuya »
Un grand nombre de personnes suggèrent que la plante n’a aucun effet secondaire ou indésirable
(Fig 25). Nos informateurs clés ont indiqué certaines précautions d’emploi. La grossesse et
l’allaitement sont les principales contre-indications de Thuya du Maghreb, car il est abortif.
61
Résultats et discussion
16 %
84 %
OUI NON
Dans cette section on calcule la valeur d’importante (IV). Cet indice est compris entre 0 et 1 et
il donne une idée sur l’efficacité de la plante étudiée selon les expériences des interrogés. La
valeur d’IV obtenue est de 0.74, ce qui signifie que les trois tiers de la population pensent que
notre plante est efficace dans le traitement de certains types de pathologie.
62
Résultats et discussion
3 Teneur en eau et rendement d’extraction :
La teneur en eaux des organes de T.articulata est calculée est présentée dans les diagrammes
ci-dessous (Fig 26) :
45,00
39,99
40,00
34,89
35,00
POURCENTAGE
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00 8,55
5,00
0,00
Feuilles Rameaux Cône
Au regard des résultats obtenus, il ressort de cela que les feuilles et les rameaux sont constitués
de plus d’un tiers d’eau. Par contre, l’eau ne représente que 8.55 % du poids global des cônes.
Ces dernières ont été récoltées pendant la saison de dissémination des graines ; durant cette
dernière, les cônes se lignifient pour favoriser l’ouverture des écailles et la libération des
graines; ce qui explique la faible teneur en eau dans cet organe. Les feuilles et les rameaux
renferment presque la même quantité d’eau, et cela est dû à la morphologie de l’appareil
végétatif de la plante, notamment la surface foliaire réduite ce qui n’est pas le cas chez beaucoup
d’angiospermes dont les feuilles contiennent plus d’eau que les rameaux.
Les rendements de l’extraction obtenus par la macération des organes dans l’éthanol 80% sont
illustrés dans l’histogramme ci-après (Fig 27). Le meilleur rendement obtenu est celui des
feuilles, suivi par les rameaux et enfin les cônes. On pense que le rendement important
enregistré au niveau des feuilles est dû à la nature des tissues qui les forment et qui facilitent la
pénétration et le contacte des solvants avec les cellules par rapport aux autres organes qui sont
riches en tissues ligneux de soutiens. Il est souvent difficile de comparer ce genre de résultats
avec ceux de la bibliographie, car le rendement n’est que relatif et dépend de la méthode et les
conditions dans lesquelles l’extraction a été effectuée.
63
Résultats et discussion
60,00 56,40
50,00
POURCENTAGE 40,00
33,60
30,00
18,60
20,00
10,00
0,00
Feuilles Rameaux Cône
4 Activités biologiques :
Les résultats de la première étape du test de Lorke, qui consiste à déterminer l’étendue
approximative de la toxicité par l’administration des doses 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1000 mg/kg,
sont présentés dans le tableau ci-après.
L’administration IP des extraits de T.articulata aux doses 10 et 100 mg/kg n’a provoqué ni un
effet apparent sur le comportement des animaux ni la mort de ces derniers après 24 h, ce qui
signifie que ces doses ne sont vraisemblablement pas toxiques pour les animaux.
64
Résultats et discussion
En revanche, l’administration de la dose 1000 mg/kg a induit un changement du comportement
et aussi l’apparition de quelques signes de toxicité. Ces derniers ont débuté après environ 15
min de l’injection. La première constatation était l’étirement des pattes postérieures et
contorsions abdominales ; un comportement qui est généralement observé suite à l’injection IP
des produits irritants. Ensuite, la mobilité des animaux a diminué progressivement jusqu’à un
point où ils sont restés presque figés pendant une longue durée de test (environ 18h). Cette
immobilité a été accompagnée par un abaissement du rythme cardiaque. De plus, les animaux
ont perdu leurs appétits vis-à-vis la nourriture et ils ont eu une constipation qui s’est traduite
par des excréments très secs et de forme inhabituelle (Fig 28 a). Dans les lots traités par les
feuilles et les rameaux, un animal sur trois a eu un paralyse des membres postérieurs et finis par
mourir après environ 22h (Fig 28 b). Nous n’avons enregistré aucune mortalité dans le lot traité
par les cônes. Les survivants ont commencé à reprendre progressivement leurs comportements
normaux et tous les signes ont disparu à partir de 48h.
a b
A l’issu de la première phase du test, nous avons pu déterminer les doses à administrer dans la
seconde étape grâce au tableau établi par Lorke (Tableau 3, chapitre matériel et méthodes).
Les résultats de la seconde étape sont présentés dans le tableau ci-après.
65
Résultats et discussion
Tableau 6 : Résultats de la deuxième étape du test de Lork
Étape 2
Dose (mg/kg) 600 1000 1600 2900
Nombre de mortalité après 24 h DL50 (mg/kg)
Feuilles 0/1 0/1 1/1 1/1 1264.91
Rameaux 0/1 0/1 1/1 1/1 1264.91
Dose (mg/kg) / 1600 2900 5000
Nombre de mortalité après 24 h
Cônes / 0/1 1/1 1/1 2154.07
Les résultats de la deuxième étape sont similaires pour les feuilles et les rameaux, ce qui
explique l’obtention de la même valeur de DL50 (1264.91 mg/kg) résultante du calcul de la
moyenne géométrique entre la dose 1000 et 1600 mg/kg. Le test de toxicité a révélé ainsi que
les cônes sont moins toxiques que les autres organes avec une DL50 de 2154.07 mg/kg. Selon l’
échelle de toxicité établie par Hodge et Sterner, les DL50 de nos extraits sont classées au niveau
quatre, ce que correspond à des substances faiblement toxiques. On se basant sur les données
de la veille scientifique (chapitre 2), il n’existe aucun rapport scientifique sur la toxicité des
extraits de T.articulata dans la bibliographie. (El Jemli et al., 2017b) a étudié la toxicité aigüe
de l’huile essentielle des feuilles de l’arbre, et elle suggère que cette huile n’est pratiquement
pas toxique avec une DL50 supérieure à 5000 mg/kg.
D’autre part, l’administration de la dose 600 mg/kg dans la seconde étape du test a induit une
apparition des mêmes signes de toxicité, mais avec une faible sévérité. Ce constat nous a
conduit à l’utilisation de la dose 300 mg/kg comme une dose curative maximale dans les tests
d’activités biologiques grâce à l’innocuité qu’elle présente.
66
Résultats et discussion
Tableau 7: Effet des traitements sur l’évolution du diamètre (mm) de l’œdème plantaire chez
les souris.
L’injection sous plantaire de la carraghénine au lot témoin a entrainé une augmentation du diamètre
moyen des pattes avec maximum d’œdème de 0.953 mm enregistré à la cinquième heure.
L’administration IP du Diclofénac (médicament de référence) à la dose de 10 mg/kg a réduit de
façon significative l’augmentation d’œdème, à partir de la première heure jusqu’à la fin du test. Le
même constat a été noté suite aux traitements des souris avec les extraits de notre plante. La
réduction maximale a été enregistrée généralement à la troisième heure à l’exception du lot traité
avec les feuilles qui a révélé une réduction maximale d’œdème à la deuxième heure. Ces résultats
suggèrent que les extraits des différentes parties de T.articulata ont un effet antiinflammatoire.
Afin de bien apprécier cet effet, on a calculé le pourcentage d’inhibition d’œdèmes. Les
résultats sont illustrés dans la figure ci-après.
67
Résultats et discussion
Les résultats révèlent certaines similitudes et aussi quelques différences entre les effets
antiinflammatoires des organes de T.articulata. Parmi les points en commun, l’effet inhibiteur
d’œdème qui a été dose-dépendant en utilisant les trois extraits. En outre, l’évolution
d’inhibition avec les différents traitements (extraits et standard) a été similaire, avec une
prévention de l’œdème dès la première heure, ensuite une inhibition maximale au bout de 2 à 3
heures et enfin un léger déclin vers la 5ème heure. En ce qui concerne les différences
enregistrées, elles sont par rapport à l’efficacité des traitements. L’effet de l’extrait des rameaux
a été supérieur à celui du Diclofénac à partir de la plus faible dose (100 mg/kg). Par contre, les
autres extraits n’ont eu un effet supérieur à celui du standard qu’avec la dose 300 mg/kg.
L’inhibition maximale est procurée par la dose 300 mg/kg de l’extrait des feuilles à la 2ème heure
et qui est de 88.57 %. Enfin, l’extrait des cônes a été moins actif que les extraits des deux autres
organes d’un point de vue global.
68
Résultats et discussion
L’explication physiologique de l’effet antiinflammatoire de T.articulata d’une manière précise
est difficile, notamment dans le cas de notre étude qui ne repose que sur l’observation
macroscopique d’un seul symptôme de la réaction inflammatoire et qui est l’œdème. D’ailleurs,
même dans le cas des travaux qui disposent de moyens d’études histologiques et biochimiques,
ce n’est pas toujours évident de concevoir l’effet des extraits de plantes, du fait qu’il ne s’agit
pas d’une seule molécule, mais un ensemble de métabolites qui agissent au niveau de plusieurs
cibles et d’une manière synergique. Ce qu’on vient d’avancer, nous a conduits à construire une
discussion sur la base de certaines notions fondamentales et aussi les données expérimentales
des travaux préexistants dans la bibliographie dans le but d’éclaircir nos résultats. Au début, on
rappelle que l’inflammation est définie comme une réaction de défense de l'organisme face à
une agression physique (coup, chaleur ...), chimique ou biologique, exogène (allergènes, agents
pathogènes) ou endogène (dysfonctionnements variés), avec une composante immunologique
plus ou moins intense. Elle peut être aiguë ou superficielle, limitée à la peau, ou plus souvent
profonde et pouvant atteindre tous les tissus ou organes. Les symptômes, ou signes cardinaux
de l'inflammation ont été décrits dès l’Antiquité : rougeur (par vasodilatation), œdème (par
extravasion des fluides sanguins dans l'épaisseur des tissus), chaleur (secondaire à la
vasodilatation) et douleur par stimulation locale des fibres sensitives. Un cinquième signe a été
ajouté au XIX siècle, la perte de fonction, par exemple au niveau articulaire (Landry and Gies,
2014). Comme réaction de défense, l'inflammation a un aspect favorable à ne pas combattre.
Mais lorsqu'elle est gênante ou devient chronique avec perte de fonction, le recours à la
thérapeutique s'impose. Le déclenchement de la réaction, à cause de l’un des agents cités ci-
dessus, est associé à un niveau accru de médiateurs pro-inflammatoires appelés cytokines, et
qui sont à la fois responsable de l’activation et l’attraction (chimiokines) des différents acteurs
cellulaires qui contribuent à la réponse inflammatoire. Ces médiateurs constituent la cible de la
quasi-totalité des traitements antiinflammatoires et les scientifiques supposent qu’ils le sont
aussi même pour nos extraits de plantes. Une description détaillée de tous les médiateurs et
leurs mécanismes d’action dépasse la portée de cet aperçu parce qu’ils sont non seulement
nombreux, mais dépendent aussi du type de l’inflammation. Alors on va mettre la lumière sur
quelques travaux qui ont étudié l’inflammation induite par la carraghénine chez les rongeurs.
D’après ce qui a été reporté dans la revue Veterinarni medicina par J. Necas et L. Bartosikova
en 2013, le développement de l'œdème dans la patte postérieur de la souris après l'injection de
la carraghénine est décrit comme un événement biphasique, dans lequel divers médiateurs
agissent en séquence pour produire la réponse inflammatoire. TNF-α , IL-1, IL-6 et l'histamine
sont les premiers médiateurs détectables dans la phase initiale, et l’œdème de la patte a été
69
Résultats et discussion
attribué principalement à la libération d'histamine qui est impliquée dans la vasodilatation et
l’augmentation de la perméabilité vasculaire. La deuxième phase d'accélération du gonflement
a été corrélée avec la production élevée de prostaglandines (PG) à cause de l’enzyme
cyclooxygénase inductible (COX-2) qui a été aussi détecté dans la patte postérieure des
animaux. Les PG sont des amplificateurs de l’inflammation parce qu’elles sont aussi impliquées
dans l’augmentation de la vasodilatation et perméabilité vasculaire ainsi que la stimulation des
terminaisons nerveuses. Un autre médiateur a été mis en évidence au niveau de la patte et qui
est le monoxyde d’azote (NO), mais l’activité de l’enzyme responsable de sa synthèse (oxyde
nitrique synthase) n’a été détectée qu’après 6 h de l’injection de la carraghénine (Handy and
Moore, 1998), ce qui est au-delà de notre période de test.
70
Résultats et discussion
des pourcentages d’inhibition d’œdème supérieurs à celle de l’Indométacine (traitement de
référence) avec des taux qui atteignent les 84% à la dose de 200 mg/kg.
Comme il a été déjà décrit dans le chapitre précédent, la fièvre a été induite par l’injection de
la levure de bière, et l'effet antipyrétique a été évalué comme la capacité des traitements à
inverser la pyrexie induite. Les résultats obtenus sont présentés ci-après (Fig 30).
Les souris sont des animaux à sang chaux dont la température corporelle normale est de
37±0.5°C (Hankenson, 2013). L’injection des champignons (Saccharomyces cerevisiae) a
induit une pyrexie chez les animaux qui atteint les 39°C. Ces derniers ont été traités avec les
71
Résultats et discussion
extraits de notre plante et aussi le paracétamol (référence). Les résultats obtenus ont révélé que
les extraits de T.articulata ont réduit significativement la température des animaux par rapport
au lot témoin (p≤ 0.005). L’effet observé a été dose-dépendant avec une efficacité maximale
enregistrée à la première et la deuxième heure. On constate ainsi que les doses 200 et 300 mg/kg
des feuilles et des cônes ainsi que la dose 300 mg/kg des rameaux ont provoqué une
hypothermie, car les températures corporelles ont descendu au-dessous de 36.5°C. D’un point
de vue global, la cinétique d’évolution des températures rectales dans les lots traités par nos
extraits à celle similaire à celle du paracétamol.
Afin de comprendre ce qu'on a obtenu comme résultats de tests, nous avons eu recours à
l'ouvrage de pharmacologie de Cohen et al. publié en 2008, pour comprendre comment se
produit la fièvre ainsi que l'action des antipyrétiques. Les auteurs rappellent que le centre de la
thermorégulation se trouve dans l’hypothalamus, sous la dépendance d’une espèce de
thermostat nerveux, sensible aux variations de température. De la périphérie (terminaisons
nerveuses de la peau) partent des afférences nerveuses du chaud et du froid qui vont
conditionner le fonctionnement du centre. Du système circulatoire (gros troncs artériels et
veineux) partent vers ce centre des afférences qui indiquent la température centrale. Le centre,
en fonction des températures ambiantes et de la température centrale des gros troncs, va
commander la réaction nécessaire au maintien de l’homéothermie, soit une augmentation de la
thermogenèse par accélération des processus d’oxydation (mise en jeu de la thyroïde, du foie,
des surrénales), soit par un accroissement de la thermolyse (vasodilatation, transpiration,
vaporisation pulmonaire). Le thermostat hypothalamique est réglé entre 36,5 ° et 37,5 °C. Sous
72
Résultats et discussion
l’influence des substances hyperthermisantes, le taux de réglage s’élève anormalement. Les
antipyrétiques ont pour effet d’abaisser le taux de réglage anormalement élevé. Il s’ensuit une
réaction de l’organisme conduisant à la thermolyse avec diminution de la température centrale.
L’élimination du médicament annihile cet effet ; le centre est à nouveau déréglé vers les hautes
températures. L’organisme réagit par une diminution de la thermolyse : vasoconstriction
cutanée, frissons. L’alternance d’augmentation et de diminution de la température corporelle
demeure jusqu’à ce que la cause de la fièvre ait disparu. Les antipyrétiques n’ont qu’un effet
symptomatique. Ils diminuent la température du corps enfiévré. Ils sont à distinguer des
antithermiques (neuroleptiques) capables d’abaisser la température normale.
Selon les données de la bibliographie, Il est admis que les antipyrétiques n'agissent pas lorsque
la température est normale, ce qui veut dire qu’ils ne provoquent pas l’hypothermie (Cohen et
al., 2008; Milton, 1982; Vane and Ferreira, 1978). En ce qui concerne le fameux paracétamol
qu’on a utilisé comme témoin ; son mécanisme d'action est resté pendant longtemps inconnu.
Cohen et al. suggèrent qu’il est actif sur la prostaglandine-synthétase du cerveau, mais inactif
sur la prostaglandine-synthétase périphérique. En outre, il n’agit pas sur la formation du
pyrogène leucocytaire. L'effet du paracétamol observé lors de nos expériences s'accorde avec
les données de la bibliographie, malgré la dose élevée utilisée le médicament n'a pas abaissé la
température au-dessous de la normale. En revanche, les extraits de T.articulata à doses élevées
ont provoqué des hypothermies ce qui suggère qu’ils ont un mécanisme d’action différent. Ce
constat nous a conduits à tester l’effet de nos extraits sur des animaux en normothermie, et il
s’est avéré que la température corporelle a baissé. L’effet hypothermique provoqué par les
plantes a été observé par d’autres chercheurs, et cela dépend de la nature des composés actifs
et leurs mécanismes d’action (Delporte et al., 1998; Effo et al., 2013; Morán et al., 1989; Taïwe
et al., 2011).
Le temps de latence des animaux sur la plaque chauffante, maintenu à 55 ± 1 °C, a été mesuré
en seconde. Les résultats obtenus sont présentés dans les diagrammes en bâton ci-dessous (Fig
31).
73
Résultats et discussion
30
25 ** **
** **
20
TEMPS EN (S)
**
15 **
**
**
*
10
0
30 100 200 300 100 200 300 100 200 300
Témoin Tramadol Feuille Rameaux Cônes
DOSE EN (mg/kg)
Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives par rapport au témoin. * P <0,05, ** P <0,01.
Ce test qu’on vient de mener concerne uniquement l’étude de la douleur nociceptive et n’a
aucune relation avec les autres types de douleurs neuropathiques ou psychogènes. La
nociception par définition est une perception de la douleur par le codage et le traitement des
stimuli nocifs dans le système nerveux. Les neurones impliqués dans la nociception forment le
système nociceptif. Les stimuli nocifs, tels que la chaleur dans notre cas, activent les fibres
afférentes primaires grâce aux terminaisons nerveuses libres présentes dans les tissus (Aδ et
fibres C). Les nocicepteurs, qui conduisent le message se projettent sur la moelle épinière et
forment des synapses avec les neurones de deuxième ordre dans la matière grise de la corne
dorsale. Une partie des neurones du deuxième ordre ont des axones ascendants et se projettent
dans le tronc cérébral ou dans le système thalamo-corticale qui produit la réponse de la douleur
consciente lors d'une exposition nocive (Stein, 2006).
74
Résultats et discussion
anesthésiques locaux), interruption de la conduction dans les nerfs sensitifs (anesthésiques
locaux), suppression du relais des influx douloureux dans la moelle épinière (opioïdes),
inhibition de la perception de la douleur (opioïdes, narcotiques) et modulation de l'assimilation
de la douleur (antidépresseurs comme coanalgésiques) (Lüllmann et al., 1998). Selon ces modes
d’action, les pharmacologues classent les médicaments antidouleur en deux catégories : les
analgésiques narcotiques ou opioïdes qui agissent sur le système nerveux central et les
analgésiques antipyrétiques qui ont une action périphérique et ils ont aussi, le plus souvent, des
effets antiinflammatoires (Cohen et al., 2008). Dans notre modèle expérimental, l'augmentation
du temps de latence des souris sur la plaque chauffante est expliquée par l'inhibition de la
perception de la douleur qui est favorisée par les analgésiques opioïdes tels que la morphine ou
bien d'autres analgésiques opioïdes faibles tels que le tramadol. Ce dernier a été utilisé dans nos
tests comme un médicament de référence. C’est un analgésique central par action sur les
récepteurs mû et sur le système aminergique, il empêche le recaptage de la noradrénaline et de
la sérotonine par les neurones. Son efficacité est comparable à celle de la codéine et du
dextropropoxyphène (Cohen et al., 2008). On ce qui concerne l’effet de notre plante dans
l’augmentation du temps de latence des souris sur la plaque chauffante, il n’est toujours pas
évident d’expliquer le mécanisme d’action de nos extraits du fait que l’étude qui a été menée
ne repose que sur des aspects comportementaux des animaux, mais les résultats sont en accord
avec les données ethnobotaniques que ce soit celles obtenues par notre enquête ou bien celles
reportées par Bellakhdar et al., 1991. L’utilisation traditionnelle des feuilles d’El Arrar pour
soulager les maux de tête ou bien contre l’insomnie montre que ces parties sont actives sur le
système nerveux central humain. Les feuilles ont été aussi employées par la population locale
dans les cataplasmes des deux côtés ou sur le dessus de la tête contre les vertiges, les maux de
tête et les douleurs du cou (Centre for Mediterranean Cooperation, 2005)
Dans ce test, la douleur a été induite par un stimulus chimique. L’injection IP de la solution
d’acide acétique à 1 % provoque des irritations au niveau de la cavité péritonéale. L’animal
présente un phénomène de torsion de son corps. La paroi abdominale est parcourue de
contractures. Sur des groupes d’animaux, on a testé les doses d’extraits empêchant le
phénomène de torsion à la douleur. Les pourcentages d’inhibitions ont été calculés et présentés
dans les diagrammes en bâton ci-dessous (Fig 32).
75
Résultats et discussion
100
90
80
70
60
POURCENTAGE
50
40
30
20
10
0
10 100 200 300 100 200 300 100 200 300
Diclofénac Feuille Rameaux Cônes
DOSE EN (mg/kg)
Figure 32: Pourcentage d'inhibition des contorsions abdominales chez les souris.
Les extraits de T.articulata ont inhibé les contorsions abdominales chez les souris d’une
manière doses dépendantes. L’effet maximal enregistré a atteint les 88% aux doses 300 mg/kg.
Cette inhibition est supérieure à celle du Diclofénac.
La douleur, dans ce test, est produite à cause d'une réaction inflammatoire au niveau de la cavité
péritonéale. Cette dernière a été provoquée par des lésions tissulaires suite à l'injection de l'acide
acétique. On rappelle que même dans le test de l'activité anti-inflammatoire par la carraghénine,
on a constaté qu'il y avait des douleurs au niveau de la pâte enflammée parce que les souris du
lot témoin ne marchaient pas sur les pattes malades et crient lorsqu’on les touche, mais cette
douleur n'était pas mesurable. Le test des contorsions abdominales a été développé, car les
sensations douloureuses, qui sont dues à l’inflammation, se traduisent par des gestes qui permet
de mesurer, en quelque sorte, la douleur. Dans ce genre de test d’activité analgésique, les
chercheurs utilisent les antiinflammatoires non stéroïdiens comme traitement de référence parce
qu’ils sont aussi actifs sur la douleur grâce à leur effet inhibiteur de la synthèse des
prostaglandines. Ces dernières sont considérées comme des médiateurs de la douleur en plus
de l’histamine, la sérotonine et la bradykinine. En effet, l’histamine ou la sérotonine sont
libérées lors de réactions inflammatoires douloureuses ; la bradykinine injectée sous le derme
ou par voie IV provoque une sensation douloureuse. La douleur apparaît lors d’une perfusion
de prostaglandine puis subsiste une hyperesthésie (Stein, 2006).
76
Résultats et discussion
Nos extraits de T.articulata ont limité toutes les conséquences négatives liées à la formation
pathologique de ces substances, mais leur mécanisme d’action demeure inconnu. En médecine
populaire, les feuilles et les rameaux de l’arbre ont été employés pour pallier les douleurs de
certaines inflammations chroniques comme le rhumatisme ( Akhmisse, 2006).
L’activité antioxydante a été testée par quatre méthodes différentes afin d’apprécier l’efficacité
de nos extraits vis-à-vis plusieurs types de radicaux libres.
Le graphe suivant représente les résultats des pourcentages d’inhibition du radical DPPH en
fonction des différentes concentrations utilisées des extraits hydroalcooliques de T.articulata
et les différents standards de référence (acide ascorbique, acide gallique et catéchine).
100
90
80
70
POURCENTAGE
60
50
40
30
20
10
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
CONCENTRATION (mg/ml)
Figure 33: Pourcentage d’inhibition du DPPH par les extraits et les différents standards.
Nous dénotons que les antioxydants de référence ont presque le même pouvoir antioxydant,
comparativement aux extraits de la plante qui sont un peu moins actifs. L’effet de nos extraits
est positivement corrélé à la concentration avec un pourcentage d’inhibition maximal à la
77
Résultats et discussion
concentration 2mg/ml de 93%, 91% et 85 % pour les feuilles, les rameaux et les cônes
respectivement. Nous constatons ainsi que l’acide gallique donne un pourcentage d’inhibition
de 92 % à partir de la plus faible concentration, par contre l’effet des extraits n’est observé qu’à
partir des concentrations relativement grandes.
Afin de décrire davantage nos résultats, on a calculé les valeurs IC50 à partir des graphes
précédents. Les résultats sont représentés dans le tableau suivant :
Tableau 8: Valeurs des IC50 des extraits de T.articulata et des standards de références
Les composés de référence ont une activité antiradicalaire très puissante qui s'exprime avec des
faibles valeurs d’IC50 parce qu’il s’agit des composés purs ; et leur pouvoir antioxydant est
expliqué par le caractère neutrophile fort des composés phénoliques. Les extraits bruts des
plantes peuvent contenir plusieurs composés antioxydants, mais leurs proportions sont
généralement faibles dans le mélange ce qui explique vraisemblablement les valeurs IC50 un
peu plus grandes de nos extraits, mais ces dernières restent très considérables et prometteuses
du fait qu’il s’agit des extraits bruts.
• Test de FRAP :
Le test de FRAP mesure la capacité des antioxydants contenus dans les extraits à réduire les
ions Fe+++ en Fe++. Les résultats sont exprimés en mmol Fe++ /g d’extrait et présentés dans la
figure n° 34. (La courbe d’étalonnage DO = f ([FeSO4]) est présentée en annexe)
78
Résultats et discussion
6,00
5,00
mmol Fe++ /g d’extrait
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Feuilles Rameaux Cônes A. ascorbique A. gallique Catéchine
Série1 2,47 2,38 2,14 4,82 4,63 4,38
Figure 34: Les concentrations de Fe++ dans les mélanges en (mmol/g d’extrait).
Les pouvoirs réducteurs des organes de l’arbre sont similaires, mais ils sont en revanche
significativement différents des standards de référence utilisés. Ces derniers ont réduit
beaucoup plus d’ions Fe+++ que les extraits de notre plante. Ces résultats viennent pratiquement
de confirmer ceux du test précédent (DPPH) parce qu’ils dépendent toujours des caractères
neutrophiles des composés testés.
79
Résultats et discussion
1,2
0,8
Feuilles
ABSORBANCE
Control
0,6 Rameaux
Cônes
Catéchine
0,4 ac galique
ac Ascorbique
0,2
0
0 min 20 min 40 min 60 min 80 min 100 min 120 min
TEMPS (min)
Ces constatations sont complétées par le calcul des pourcentages de l’activité antioxydante
reportés dans le tableau 9. Les résultats obtenus révèlent que les feuilles et les rameaux ont des
pourcentages d’activité de 11% et 12% respectivement. L’activité des cônes est faible par
rapport aux autres organes. Au regard de ces résultats, les extraits de T.articulata sont peu actifs
dans ce test en comparaison avec l’acide ascorbique.
La présence d'ions de métaux de transition dans un système biologique pourrait catalyser les
réactions de type Haber-Weiss et Fenton, entraînant la formation de radicaux hydroxyles (OH).
Cependant, ces ions de métaux de transition pourraient former des chélates avec les
antioxydants, ce qui entraînerait la suppression de la production d'OH et inhiberait les processus
80
Résultats et discussion
de peroxydation des molécules biologiques. L'ion ferreux a été utilisé comme ion de métal de
transition dans cet essai FIC.
L'analyse de l'activité chélatante des ions ferreux de nos extraits montre une activité FIC dose
dépendante. Comme le montre la figure 36, à la concentration la plus élevée (7 mg/ml), les
extraits de T.articulata présentaient la plus forte activité FIC qui est autour des 45 % pour les
trois organes. Nos extraits ont révélé un effet chélateur supérieur à celui des standards de
référence utilisés à l’exception de l’EDTA qui est connu par sa forte activité chélatante et qui
est 98% à partir de la plus faible concentration.
120
100
80
POURCENTAGE
60
40
20
0
1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00 1.75 2.50 5.00
Feuilles Rameaux Cônes EDTA Catéchine A gallique A ascorbique
CONCENTRATION (mg/ml)
• Récapitulatif :
Le stress oxydatif et ses effets néfastes sur la santé humaine font couler beaucoup d’encre ces
dernières décennies. Dans un ouvrage récent intitulé « Oxidative Stress and Antioxidant
Protection » édité par Armstrong et Stratton en 2016 : ‘les auteurs déclarent que le stress
oxydatif joue un rôle majeur dans de nombreuses maladies humaines et pourrait bien devenir
la caractéristique dominante de la plupart de ces maladies. Ainsi, son implication a été
confirmée dans plus de 100 états pathologiques’. Cela explique le nombre important des
publications scientifiques qui aborde l'effet antioxydant, quel que soit, des composés naturels
ou bien synthétiques, en utilisant des méthodes notamment In vitro qui testent l'inhibition de
certaines espèces chimiques impliquées dans le stress oxydatif (radicaux libres, métaux
81
Résultats et discussion
lourds...), ou bien qui simulent des réactions d'oxydation qui peuvent se dérouler In vivo
(peroxydation lipidique…).
D’après ce qui a été rapporté aussi dans l’ouvrage cité ci-dessus, les radicaux libres les plus
nocifs sont les radicaux hydroxyles (HO.) et hydrogène produit lors des réactions de radiation
ionisante ou de toxicologie environnementale, ainsi que les radicaux superoxydes (O2-) qui sont
produits dans les réactions de transport d'électrons mitochondriaux. Naturellement, La
superoxyde dismutase forme rapidement du peroxyde d'hydrogène (H2O2) à partir de (O2-). Le
fer ferreux libre (Fe2+) et le cuivre (Cu+) participent aux réactions de Fenton avec H2O2 pour
produire des radicaux hydroxyles et des anions hydroxyde, oxydant les métaux en Fe3+ et Cu2+.
Le fer ou le cuivre libre oxydé peut alors oxyder à son tour le H2O2 pour former des radicaux
hydroperoxyle (HOO-) et des protons (H+), réduisant les métaux en Fe2+ et Cu+, de sorte que de
nouvelles réactions de peroxydation peuvent survenir de manière cyclique et cela engendre pas
mal de dysfonctionnements cellulaires, enzymatiques, vasculaires …etc. (Armstrong and
Stratton, 2016).
Dans notre étude, nous avons utilisé des techniques qui testent l’effet réducteur général (test de
DPPH) et celui des ions Fe3+ (test de FRAP) ainsi que l’effet chélateur des métaux (test de FIC).
Les résultats obtenus ont révélé un potentiel antioxydant considérable, et ce dernier peut être
responsable en partie des propriétés médicinales des organes de l’arbre. L’effet réducteur des
extraits de T.articulata a été aussi mis en évidence par d’autres auteurs comme Djouahri et
Boudarene en 2012 et plus récemment par Sliti et al. en 2016.
Le test du β-carotène est une technique complémentaire qui simule, en quelque sorte, la réaction
de peroxydation lipidique In vitro. Elle consiste à mesurer le blanchiment du β-carotène
résultant de son oxydation par les produits de dégradation de l'acide linoléique. L'oxydation de
ce dernier est catalysée par la chaleur (50 °C)(Laguerre et al., 2007). L'ajout d'extraits de la
plante et des standards a pour effet de retarder la propagation de la réaction. L’activité des
parties de Thuya a été intermédiaire voire faible avec l’extrait des cônes, en comparaison avec
les molécules de références. La comparaison avec d’autres travaux est une tâche délicate à cause
de certaines limites de la technique, comme les différentes concentrations d’extraits utilisés par
les chercheurs et aussi l’oxydation de l’acide linoléique induite thermiquement qui n'est pas
contrôlée, ce qui induit souvent une variabilité des données (Laguerre et al., 2007). Malgré cela,
on cite les travaux de Ben Jemia et al. en 2013 qui a mis en évidence une activité considérable
des extraits des feuilles on utilisant la même technique et aussi les travaux de Sliti et al. (2016)
82
Résultats et discussion
qui ont révélé une inhibition de la peroxydation lipidique par les extraits de Thuya en utilisant
la technique de consommation d’oxygène.
Les résultats du test de sensibilité microbienne aux extraits sont regroupés dans le Tableau 10.
L’action bactériostatique se traduit par l’apparition d’une zone d’inhibition autour du disque de
papier imprégné d’extraits bruts étudiés comme le montrent les photos de nos boites de test
après incubation (Fig 37).
Les extraits de T.articulata n’ont révélé aucune activité inhibitrice vis-à-vis les deux souches
de Gram négatif. Escherichia coli et la Pseudomonas aeruginosa se sont montrés parfaitement
résistants à tous les niveaux de concentration des extraits. En revanche, elles étaient sensibles à
certains antibiotiques de références. D’autre part, les deux souches de staphylocoques ont révélé
une sensibilité intermédiaire aux différentes concentrations d’extraits de feuilles et de rameaux,
83
Résultats et discussion
et elles étaient moins sensibles aux extraits des cônes. Nos résultats montrent donc une
variabilité des qualités bactériostatiques des extraits vis-à-vis des différentes souches. Les deux
souches de Staphylococcus aureus à Gram positif sont plus sensibles que les autres souches
bactériennes testées à Gram négatif.
1: 200 mg/ml, 2: 150 mg/ml, 3: 100 mg/ml, 4 : 50 mg/ml, C : Chloramphénicol 30 mg, CN : Gentamycine 10 mg, SXT : Sulfaméthoxazole
et Triméthoprime 23.75 mg, P : Pénicilline 10 mg.
84
Résultats et discussion
Les mécanismes d’actions des composés antibactériens sont très divers. La 11 ème édition de
l’ouvrage « Manual of Clinical Microbiology » contient toute un chapitre intitulé
« Antibacterial Agents » consacré à l’explication des principes d’actions des molécules à effet
antibactérien. Il parait que la majorité de ces derniers sont des inhibiteurs de certains enzymes
bactériens catalysant des réactions vitales. Par exemple, l’action antibactérienne majeure des
pénicillines provient de leur capacité à inhiber de multiples enzymes, à savoir les protéines de
liaison à la pénicilline « penicillin-binding proteins (PBPs) », qui catalysent les dernières étapes
de la synthèse des peptidoglycanes de la paroi. Pour la gentamicine, c’est un agent bactéricide
qui inhibe la synthèse des protéines bactériennes en se liant de façon irréversible à la sous-unité
ribosomale 30S de la bactérie. Les ribosomes bactériens liés à l’antibiotique deviennent alors
indisponibles pour la traduction de l'ARNm pendant la synthèse des protéines, entraînant ainsi
la mort cellulaire. Les autres antibiotiques sont dotés aussi d’autres mécanismes d’actions qui
dépendent principalement de leurs propriétés physicochimiques (Lewis and Bush, 2015). On
ce qui concerne l’effet du T.articulata, ou bien des plantes d’une manière générale, il obéit
vraisemblablement aux mêmes principes, mais les cibles peuvent être différentes, ce qui
nécessite des études plus poussées à l’échelle moléculaire afin de cerner le mécanisme d’action
des drogues végétale.
Djouahri et al. en 2013 a testé l'activité antibactérienne de l’extrait méthanolique des feuilles
de T.articulata sur les mêmes espèces qu'on a utilisé dans notre étude, mais de souches
différentes. Ses résultats ont révélé la sensibilité de ces souches aux extraits de l’arbre à une
concentration de 50 mg/ml. Dans une autre publication, l’auteur a mis aussi en évidence leurs
sensibilités à l’extrait hydroalcoolique des cônes, toujours à une concentration de 50 mg/ml. On
suggère que ces différences sont dues en premier lieu à la nature des souches utilisées, ensuite
aux conditions expérimentales, et enfin la provenance des échantillons de l'arbre.
85
Résultats et discussion
5 Caractérisation de composés phénoliques :
L’étude quantitative des extraits bruts au moyen des dosages spectrophotométriques avait pour
objectif la détermination de la teneur en composés phénoliques. La raison principale pour le
choix de ces substances réside dans le fait que la majorité des effets pharmacologiques des
plantes leur sont attribués. Les résultats du dosage des composés phénoliques sont groupés dans
le tableau ci-dessous (les courbes d’étalonnage sont présentées en annexe) :
Tableau 11: concentration des composés phénoliques dans les extraits de T. articulata.
Phénols Flavonoïdes Flavonols Tannins Tannins
totaux (mg totaux (mg eq (mg eq M/g) condensés hydrolysables
eq GA/g) C/g) (mg eq C/g) (mg eq AT/g)
Feuilles 156.4 ± 6.7 69.5 ± 2.6 31.0 ± 1.0 241.3 ± 5.0 189.5± 1.0
Rameaux 161.0 ± 4.9 107.3 ± 0.9 10.1 ± 0.5 284.2 ± 6.9 283.2± 4.7
Cônes 162.4 ± 5.8 99.1 ± 1.8 2.0 ± 0.2 285.0 ± 6.6 191.5± 1.0
Les estimations des phénols totaux, des flavonoïdes totaux et des tanins condensés (tableau 11)
dans les organes de T. articulata révèlent une forte présence avec des teneurs supérieures à 100
mg / g d’extrait, ce qui suggère qu'ils sont largement responsables des propriétés thérapeutiques
attribuées à cet arbre. La grande quantité de tanins explique aussi l’utilisation des parties de
l’arbre dans le tannage des peaux.
La chromatographie sur couche mince est la technique qu’on a adoptée dans l’approche
qualitative pour la séparation des composés phénoliques des extraits de T.articulata. La
séparation des molécules résulte de la combinaison de trois paramètres ; d’abord la nature du
support chromatographique, ensuite celle des solvants d’élution, et enfin les propriétés
chimiques des composés phénoliques. De ces paramètres il ressort que certains éluants sont
plus efficaces que d’autres, d’où le choix porté sur le système : chloroforme/acétate
d’éthyle/acide acétique : (9/8/3 : V/V/V), et qui a donné les meilleurs résultats. Pour la
révélation des chromatogrammes, nous avons opté pour l’observation sous UV, qui est un
procédé simple, grâce au produit fluorescent incorporé à la phase stationnaire.
La photo ci-dessous représente la plaque CCM de test révélé sous UV à 254 nm.
86
Résultats et discussion
Légende :
F : feuille
R : rameaux
Cô : cône
C : catéchine
M : myricétine
Q : quercétine
AT : acide tannique
Après détection des spots, nous nous sommes basées sur la comparaison des rapports frontaux
(Tableau 12) des spots obtenus par les extraits avec ceux des témoins afin d’identifier les
molécules qui leurs correspondent.
Le système de solvants utilisé a permis une meilleure séparation des molécules contenues dans
les extraits de T.articulata qui se sont bien solubilisées dans ce mélange de solvants. Nous avons
87
Résultats et discussion
observé jusqu’à six spots dans l’extrait des feuilles indiquant la séparation de molécules
différentes, quatre dans l’extrait des rameaux dont ils ont les mêmes rapports frontaux avec
quelques spots des feuilles, et trois dans l’extrait des cônes, dont deux, sont similaires à d’autres
dans l’extrait des feuilles et des rameaux. Ces résultats suggèrent que l’extrait des feuilles et
des rameaux renferme beaucoup plus de composés identiques. La comparaison avec les
standards phénoliques a révélé la présence de deux flavonoïdes majeurs, la catéchine et la
quercétine (Fig 38). La catéchine a été identifiée dans tous les organes. La quercétine n'a été
identifiée que dans les feuilles et les rameaux. Des recherches antérieures avaient identifié les
mêmes composés dans les feuilles de T. articulata (Dane et al., 2016; Zidane et al., 2014).Alors
que notre CCM avait montré, en plus, la présence d'acide tannique dans les feuilles. D’autres
parts, des analyses chromatographiques d’une étude très récente réalisée par Rached et al., en
2018 ont révélé que les composés flavan-3-ols sont les composés phénoliques prédominants
dans plusieurs extraits des feuilles, représentant en moyenne 71 % de la composition
phénolique.
En ce qui concerne les activités biologiques des composés identifiés, Zidane et al ont commenté
que la quercétine, qui a été identifiée dans les feuilles et les rameaux, avait été décrite comme
un agent antihypertenseur efficace dans plusieurs modèles expérimentaux d'hypertension chez
le rat lorsqu'elle était administrée à la dose de 10 mg/kg de poids corporel. Cependant, la
catéchine identifiée dans nos extraits a également induit une vasorelaxation qui a été étudiée
dans différents modèles expérimentaux (Andriambeloson et al., 1997). D'une manière générale,
Bruneton dans son ouvrage "Pharmacognosie" (2016) a précisé que la principale propriété
initialement reconnus aux flavonoïdes et d'être « véino-actifs ». L'auteur a évoqué aussi l'effet
antiradicalaire des flavonoïdes qui a été mis en évidence dans diverses circonstances.
L’inhibition enzymatique par les flavonoïdes a été aussi mise en relief dans le même ouvrage,
notamment sur les systèmes impliqués dans la réponse immunitaire et l'inflammation. Bruneton
a décrit ces propriétés comme étant non spécifique, et elles sont plus ou moins universelles pour
un grand nombre de molécules de cette famille.
6 Conclusion :
L'étude ethnobotanique a permis de cerner les principaux usages de thuya du Berberie dans la
médecine traditionnelle. Les modèles expérimentaux in vivo et in vitro ont mis en évidence les
activités biologiques de la plante. Les extraits se sont montrés très actifs dans tous les tests à
l'exception du test du pouvoir antibactérien qui a été négatif. Enfin les analyses
88
Résultats et discussion
chromatographiques ont révélé la présence de deux flavonols dans nos extraits à savoir la
catéchine et la quercétine est un acide phénolique qui est l’acide tannique.
89
Conclusion générale
Conclusion générale
Le présent travail a été mené dans le but de réunir, dans un premier temps, les informations
concernant les usages thérapeutiques de Tetraclinis articula (Vahl), pratiqués dans la région de
Sidi Bel Abbes, puis testé empiriquement quelques propriétés médicinales de l’arbre en utilisant
des modèles expérimentaux In vivo et In vitro . L’enquête ethnobotanique a révélé que la quasi-
totalité des enquêtés connaît «Arrar, »العرعار. D’après nos informateurs l’arbre est utilisé
principalement dans le domaine de la médecine. Les valeurs d’utilisations (UVs) et les niveaux
de fidélités (FLs) révèlent que ses parties aériennes sont utilisées principalement pour pallier
les maladies respiratoires, gastriques et dermatologiques. L’investigation pharmacologique a
permet de dégager une multitude de résultats. Les extraits des parties aériennes ne sont pas
toxiques dont la DL50 est supérieure à 1000 mg/kg chez les souris. Les extraits ont révélé ainsi
des propriétés antiinflammatoires, analgésiques, antipyrétiques considérables en comparaison
avec des traitements et des molécules de références. L’inhibition de la synthèse ou de la
libération de médiateurs chimiques responsables de ces affections peut être leurs principaux
mécanismes d’action. Les tests de l’activité antibactérienne ont révélé que les souches testées
ne sont pas sensibles à nos extraits. La caractérisation des composés phénoliques a révélé
quelques différences quantitatives et qualitatives entre les trois extraits. La catéchine a été
détectée dans tous les organes. La quercétine a été détectée dans les feuilles et les rameaux et
l'acide tannique n'a été trouvé que dans les feuilles.
Les résultats de cette étude sont prometteurs et en quelque sorte ils ont vérifié empiriquement
l’efficacité de la plante contre un certain nombre états pathologiques. Afin de compléter ce
travail dans le but d’identifier les composés actifs à partir d’extraits possédant une activité
pharmacologique et élucider leur mécanisme d’action, nous envisageons :
90
Conclusion générale
- L’évaluation de l’innocuité de fractions actives et/ou molécules par des tests de toxicité plus
approfondis et ensuite la validation de l’efficacité par des études cliniques.
Enfin, la validation de l’usage des drogues végétales comme remède traditionnel pourrait
constituer un moyen complémentaire dans le traitement de quelques états pathologiques et
pourrait aussi être introduit dans le système de soin conventionnel.
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105
Annexe
Annexe
Courbes d’étalonnages
3
y = 0,0127x + 0,1405
R² = 0,9952
2,5
2
Absorbance
1,5
0,5
0
0 50 100 150 200 250
Concentration d'acide galique en mg/L
1,8
1,2
absorbance
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200 250
Concetration de catéchine en mg/L
106
Annexe
0,12
y = 0,0004x + 0,008
0,1 R² = 0,9801
0,08
Absorbance
0,06
0,04
0,02
0
0 50 100 150 200 250
Concentration de catéchine en mg/L
0,12
y = 0,0005x + 0,0085
R² = 0,9883
0,1
0,08
Absorbance
0,06
0,04
0,02
0
0 50 100 150 200 250
Concentration d'acide tannique en mg/L
107
Annexe
1,8
1,2
Absorbance
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200 250
Concentration de myricétine en mg/L
0,8
y = 0,3641x - 0,0009
0,7 R² = 0,9986
0,6
0,5
Absorbance
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
-0,1
concentration de FeSO4 en mmol /L
108