RIA y Centelleo Líquido - T

ACUERDO REGIONAL DE COOPERACIÓN
AGENCIA INTERNACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA
Programa de Entrenamiento Asistido a Distancia

para
Tecnólogos en Medicina Nuclear
Editado por: Heather E. Patterson y Brian F. Hutton
Traducción al Español: Margarita Núñez
Radioinmunoensayo
Author: Vijay Kumar
Contador de Centelleo Líquido

Author: Stefan Eberl
Module 8 Units 14a & 14b
El material docente de esta publicación ha sido desarrollado a través del Hospital Westmead, Sydney,
bajo los auspicios del OIEA y patrocinado por AusAID (Agencia Australiana para el Desarrollo
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P.O. Box 100
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b
Radioinmunoensayo – 14a
CONTENIDOS
Página
Diagrama de Flujo - Radioinmunoensayo e
Diagrama de Flujo – Contador de Centelleo Líquido f
1. Radioinmunoensayos (RIA). 1
1.1 Introducción
1.2 Definiciones
1.3 Tipos de ensayos
2. Materiales & Métodos usados en RIA 5
3. Principios del RIA 7
3.1 ¿Qué es el inmunoanálisis estructuralmente específico?
3.2 Cómo preparar los ensayos de RIA
3.3 ¿Qué es la curva estándar, cómo medir la concentración del ligando?
4. Ensayos por Unión Competitiva (ensayos de equilibrio) 12
4.1 Ensayos de equilibrio
4.2 Ensayos por desplazamiento
4.3 Ensayos secuenciales
5. Ensayos no competitivos (IRMA o ensayos Sandwich) 15
5.1 Principios
5.2 Métodos y Resultados
5.3 Gráficas y cálculos
6. Métodos de Separación 19
6.1 Método de adsorción del carbono
6.2 Precipitación no específica del complejo antígeno-anticuerpo
6.3 Método de la inmunoprecipitación
6.4 Método del anticuerpo de fase sólida
7. Métodos de Cálculo 23
7.1 Ploteo Lineal
7.2 Ploteo Semi-log
7.3 Ploteo Logit-Log
8. Procedimientos de Control de Calidad 26
8.1 Estadísticas
8.2 Control de calidad interno
8.3 Control de calidad externo
9 Inmunoensayos no radioactivos 30
9.2 Definiciones
Principios de los ensayos
Ventajas / Desventajas
9.3 Enzimoinmunoensayo (EIA)
9.4 Fluoroinmunoensayo (FIA)
9.5 Inmunoensayo quimio-luminiscente
10 Kits de RIA típicos comerciales y de investigación 33
Glosario 35
c
Contador de Centelleo Líquido – 14b
CONTENIDOS
página
Introducción 36
Teoría del conteo por Centelleo Líquido 38
Instrumentación 40
- Conteo por coincidencia
- Analizador multicanal
- Radiación de fondo (background) y reducción de ruido
Cuantificación, “Quench” y preparación de Muestras 47

- correcciones de quench
- estandarización interna
- Relación de canales
- Autoestandarización externa
Glosario 52
d
Radioinmunoensayo (RIA)
Introducción
Definiciones Tipos de ensayos
Materiales y métodos en RIA Principios del RIA

- antígenos - preparación de un ensayo
- anticuerpos - medida de concentración del ligando
- métodos de separación - curva estándar
- buffers, estándares y control
Ensayo de unión competitiva Ensayos no competitivos

- equilibrium
- displacement
- sequential
Separación Cálculos Control de Calidad

- carbón - ploteo linear - interno
- precipitación - ploteo semi-log - externo
- fase sólida - ploteo logit-log
Ensayos no radioactivos Kits de RIA

- definiciones - contenido típico
- enzimoinmunoensayo (EIA)
- fluoroinmunensayo (FIA)
- quimioluminiscente
Glosario
e
Diagrama de flujo
Introducción
Teoría del conteo por centelleo líquido
Instrumentación
Conteo por Analizador Background y

coincidencia multicanal reducción de ruido
Cuantificación, “quench” y preparación de muestras
Correcciones de quench
- Estandarización interna
- Relación de canales
- Autoestandarización externa
f
Radioinmunoensayo (RIA)
Redactor Técnico: Vijay Kumar
Editor de Producción: Heather Patterson
Traducción: Margarita Núñez
Introducción:
A mediados de la década del 50, Solomon Berson y Rosalyn Yalow, del
Hospital de Veteranos del Bronx, en Nueva York, estaban estudiando el
papel de la insulina en los diabéticos cuando notaron que los pacientes
tratados portaban anticuerpos en contra de esta hormona peptídica.
Descubrieron que estos anticuerpos podían unirse a la insulina marcada
con un isótopo, lo cual representó la fundación de un Nuevo enfoque
científico denominado “radioinmunoensayo” (RIA). Por su contribución
a las ciencias médicas con esta importante técnica analítica, Rosalyn
Yalow recibió en 1977 el Premio Nobel de Medicine y Fisiología. Poco
tiempo después, otros investigadores descubrieron que el RIA podía ser
usado para medir otras moléculas además de hormonas peptídicas.
Fueron así desarrollados ensayos para hormonas tiroideas, drogas y
muchos otos compuestos. Su efectividad para medir rápidamente la
concentración de sustancias que antes podía hacerse solamente mediante
técnicas de bioensayo laboriosas y prolongadas, hizo que el RIA
constituyera una verdadera revolución en patología médica.
Una de las características del RIA es su capacidad para medir mínimas
cantidades de sustancias biológicas mediante la ayuda de moléculas
radiomarcadas. Usando métodos de RIA somos capaces de detectar
concentraciones moleculares a nivel de nano (10-9) o femtomoles (10–15).
Estas técnicas han aportado gran caudal de información acerca de los
procesos bioquímicos involucrados en sistemas ligando-receptor y
estimación de niveles de drogas en sangre. Luego de su aceptación
clínica, el campo del RIA alcanzó su máximo a principios de los 70 y
continuó creciendo por dos décadas más. Aún se utiliza ampliamente
pero, a causa de los desechos radioactivos que genera, ha sido en parte
sustituido por ensayos no radioactivos como los enzimáticos, los
fluorescentes y los quimioluminiscentes. Todos los años se agregan
nuevos ensayos pero lo más importante es que la técnica se ha hecho
totalmente automática. Aunque no todas estas metodologías son de
utilidad clínica, las más efectivas han crecido significativamente
impulsando una nueva industria de productos sanitarios a fin de cumplir
con la demanda de reactivos y accesorios.
En esta unidad sobre radioinmunoensayo se intenta informar al
tecnólogo en medicina nuclear acerca de los diferentes métodos de
medida de pequeñas cantidades de ligandos o antígenos usando técnicas
de radioinmunoensayo. Muchos departamentos de medicina nuclear no
realizan RIA y en varios países estos procedimientos se llevan a cabo en
laboratorios generales o de endocrinología. Tanto si usted realiza estos
1
procedimientos o no, deberá estudiar esta unidad y comprender los
fundamentos de una serie de procedimientos.
Objetivos:
Al completar esta unidad usted:
1. Comprenderá el mecanismo de la reacción antígeno-anticuerpo.
2. Aprenderá los varios métodos de Radioinmunoensayo (RIA).
3. Sabrá cómo preparar una “corrida” de RIA.
4. Entenderá los principios del ensayo Inmunoradiométrico (IRMA).
5. Aprenderá 4 diferentes técnicas de separación de la fracción unida y libre.
6. Será capaz de realizar cálculos usando 4 métodos diferentes de graficar.
7. Conocerá los procedimientos internos y externos de control de calidad.
8. Tendrá conocimiento de ensayos no radioactivos (EIA, FIA, CIA, etc).
Tiempo Requerido:
Dedique 12 horas a estudiar esta unidad y completar los ejercicios en su
Cuaderno de Trabajo.
Nota: Como parte del mismo tema y a continuación de esta Unidad 14a sobre
Radioinmunoensayo encontrará la Unidad 14b, Contador de Centelleo
Líquido describiendo sus principios de operación.
2
1. Introducción al Radioinmunoensayo
Introducción:
El RIA se basa principalmente en la reacción entre un anticuerpo y un
antígeno cuya concentración debe ser cuantificada. Antes de describir los
sistemas de ensayo en detalle vale la pena considerar la terminología más
frecuentemente utilizada en el texto a fin de ayudarlo en la comprensión
del tema.
Tiempo Requerido:
Dedique 2 horas a estudiar las secciones 1 y 2 y a completar los ejercicios
en su Cuaderno de Trabajo.
1.1 Definiciones:
Anticuerpo (Ac):
El anticuerpo es una proteína formada por el sistema de defensa del
organismo como parte de una respuesta inmunológica a una sustancia
extraña. El anticuerpo se combina específicamente con la sustancia
extraña y hasta cierto punto con sustancias de estructura similar.
Antígeno (Ag):
El antígeno es una sustancia capaz de inducir la formación de anticuerpos
con los que se combinan específicamente. Los antígenos también son
denominados “ligandos”. Los ligandos son generalmente hormonas,
enzimas u otras sustancias a las que se aplica el ensayo.
Hapteno:
El hapteno es una sustancia que no tiene de por sí propiedades
inmunogénicas pero las adquiere cuando forma un complejo con otra
sustancia. El anticuerpo producido se unirá también al hapteno que no
forma parte del complejo. Por ejemplo: las hormonas esteroideas y
algunas drogas como la digoxina generalmente se unen a la seroalbúmina
bovina para formar haptenos.
Sensibilidad:
La sensibilidad se define como la mínima cantidad detectable de una
sustancia usando un método de RIA en particular. La sensibilidad
depende en parte de la precisión del ensayo.
Especificidad:
La especificidad es la capacidad de un ensayo para detectar una sustancia
determinada dentro de una mezcla de varias diferentes. Para el RIA, es la
capacidad de identificar la molécula de interés discriminando antígenos
de estructura similar.
3
1.2 Tipos de ensayos:
• Ensayo radioligado: Cuando se usa un radionucleido para marcar el
ligando, el ensayo se denomina radioensayo o ensayo radioligado (p.ej.,
el ensayo de la Vitamina B12).
• Radioinmunoensayo (RIA): Cuando se usan un antígeno (no marcado
y/o radiomarcado) y un anticuerpo (unión específica) el ensayo se
denomina RIA.
• Ensayo radiorreceptor (RRA): Cuando se usa como unión una molécula
proteica receptora (aislada de los tejidos) en lugar del anticuerpo, se
denomina RRA.
• Ensayo por competencia de unión proteica (CPBA): En un ensayo de
este tipo, el ligando no marcado compite con un ligando marcado para
acoplarse a un limitado número de sitios de unión (ANTICUERPOS).
• Ensayo inmunoradiométrico (IRMA): Es cuando el anticuerpo se marca
con un radionucleido. También se conoce como técnica sandwich dado
que el antígeno se atrapa entre los anticuerpos marcados y no marcados.
• Enzimoinmunoensayo (EIA): Cuando se utiliza una enzima en lugar de
un radionucleido. Si la técnica de separación utiliza un anticuerpo en fase
sólida, generalmente se conoce como ensayo ligado a enzima
inmunoabsorbente (ELISA).
• Inmunoensayo fluorescente (FIA): Cuando se utiliza un marcador
fluorescente en lugar de un radionucleidos, la técnica se conoce como
fluoroinmunoensayo.
• Inmunoensayo quimioluminiscente (CIA): Cuando se emplean
marcadores quimioluminiscentes como los lanátidos en vez de un
radionucleido.
Los anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos (ligandos),
pueden ser clasificados en 3 categorías principales:
• Anticuerpos proteicos
• Proteínas transportadoras
• Receptores naturales.
En la tabla se resumen los ejemplos más típicos:

ANTICUERPOS PROTEICOS: Tabla 1
LIGANDOS ANTICUERPOS
Hormonas proteicas Anticuerpos específicos antiproteínicos
Hormonas esteroides Conjugados específicos proteíno-esteroideos
Drogas (Digoxina) Conjugados específicos para drogas proteicas
Nucleótidos (AND, ARN, etc) Anticuerpos específicos anti complejos nucleótidos
Virus Anticuerpos antivirales específicos humanos o
animales
4
ANTICUERPOS TRANSPORTADORES Y RECEPTORES:
LIGANDOS RECEPTORES (Proteínas transportadoras)
Tiroxina Globulina de Unión a la Tiroxina (TBG)
Vitamina B12 Transcobalamina
Testosterona Globulina de Unión a la Testosterona
Cortisol Globulina de Unión al Cortisol (Transcortina)
Folato Globulina de Unión al Folato
TARGET RECEPTOR ANTIBODIES:

LIGANDS RECEPTORES (Blanco)
Estrógeno Receptor Uterino de Citosol
ACTH Receptores de Membrana de la Corteza Adrenal
Insulina Receptores de Membrana de Hígado y Placenta
Vitamina B12 Factor Intrínseco como Receptor de Membrana
Gástrico
2. Materiales y Métodos usados en RIA.

Los siguientes materiales y métodos son clave para entender el RIA en
sentido práctico. Todos los materiales son proporcionados por los
proveedores comerciales en forma de kit. A menudo las soluciones que
vienen en el kit son usados como controles internos por lo cual se
recomienda aplicar controles externos a fin de verificar el desempeño del
kit.
2.1 Antígenos radiomarcados
2.2 Anticuerpos
2.3 Métodos de separación
2.4 Soluciones de control y estándares
2.1 Antígenos Radiomarcados (ligandos):

Los antígenos radiomarcados también se conocen como ligandos
marcados con radionucleidos. Existen varios radionucleidos utilizados en
RIA tales como 125I, 57Co, 3H, 14C etc.
Sin embargo, el radioisótopo más comúnmente usado es el 125I debido a
varios méritos que posee, entre otros:
• Elevada actividad específica,
• Vida media apropiada (T1/2 =60 días)
• Facilidad de marcación de ligandos de uso clínico rutinario
(por ejemplo: Hormonas tiroideas, Digoxina, etc).
Más aún, el 125I es predominantemente un emisor gama con muy escasa
radiación beta, lo cual es ideal en el laboratorio y el diseño del contador
gama puede simplificarse mucho. Finalmente, la yodación de muchos
5
ligandos puede ser realizada con facilidad; el producto resultante es
estable y por tanto el yodo no se separa durante los procesos de ensayo.
2.2 Anticuerpos:
Como fue discutido anteriormente, el anticuerpo es producido como
resultante de una respuesta inmune a una presencia antigénica específica
en un animal de experimentación. Si el antígeno es un péptido o una
proteína, la respuesta inmune se obtiene directamente, pero si el antígeno
es una sustancia no proteica como una droga o un esteroide, entonces se
requiere la molécula hapteno para desencadenar la respuesta
inmunitaria. El hapteno se logra formando un complejo con la droga a
analizar y seroalbúmina bovina (BSA). Es importante saber que los
anticuerpos producidos mediante este método son llamados anticuerpos
policlonales, una mezcla de anticuerpos derivados de diferentes
linfocitos B. Por otra parte, los anticuerpos monoclonales (MoAB) son
producidos por células híbridas que son provenientes de una única
familia de linfocitos B sensibilizados (el MoAB es altamente específico
para un antígeno dado y su reactividad cruzada con otros antígenos es
muy baja). La mayoría de los kits de RIA utilizan MoAB para alcanzar
elevada actividad específica y avidez por la reacción antígeno-anticuerpo.
• MoAB – son clonados de un anticuerpo único producido usando la
técnica del hibridoma, que es específica para sólo un antígeno
determinante.
2.3 Método de separación:
Uno de los pre-requisitos en los métodos de RIA es la separación de la
fracción “unida” de la fracción “libre” sin contaminar uno al otro. Las
técnicas de separación serán discutidas más tarde bajo el título “métodos
de separación”.
2.4. Buffers, estándares y controles:
Buffers:
La mayoría de las reacciones en RIA son producidas en soluciones buffer
para prevenir fluctuaciones en el pH y fuerza iónica durante la reacción.
Una solución buffer debe puede ser definida como una solución
conteniendo un ácido débil y/o una base débil para dar lugar a un pH y
fuerza iónica deseados. En general, la solución buffer es proporcionada
como parte del kit.
Estándares:
Los estándares son preparaciones de referencia necesarios para generar
curvas de dosis-respuesta a fin de comparar los datos desconocidos con
los ligandos químicamente idénticos. Los estándares son suministrados
en forma pura, en grupos de cantidades conocidas que varían desde 0 a
un valor máximo, en general 5 a 6 viales. Estos estándares se encuentran
bajo forma desecada y congelada o bien en solución, siempre formando
parte del kit. El otro factor importante es que los estándares son
suministrados en una matriz de suero humano (libre de hormonas) de
modo que es exactamente la misma que las muestras de suero.
6
Analitos de Control:
El suero de control es idéntico a los estándares en todos los aspectos,
excepto que puede ser obtenido o proporcionado en 3 cantidades
conocidas diferentes de manera que pueden servir como controles en
rangos bajos, normales y altos de ligandos. Son tratados de forma
exactamente igual a las muestras desconocidas y los valores son
comparados a fin de validar el desempeño del kit.
Todo esto será discutido en detalle más adelante.
7
3. Principios del RIA
RIAdioinmunoensayo
Tiempo Requerido:
Dedique 2 horas a estudiar esta sección y completar los ejercicios en su
3.1 ¿Qué es el inmunoensayo estructuralmente específico?
El RIA es un ensayo inmunoquímico estructuralmente específico. La
morfología complementaria del antígeno (ligando) y el anticuerpo es
responsable del reconocimiento y la unión específica del complejo
antígeno-anticuerpo y por tanto se denomina “ensayo inmunoquímico
estructuralmente específico”.
Existen dos tipos de radioinmunoensayo usando métodos competitivos y
no competitivos (ensayo inmunoradiométrico, IRMA).
Importante
saber
Es importante saber que “no importa si el antígeno está o no marcado con
un radionucleido, se unirá al anticuerpo con la misma afinidad y
especificidad”. Tanto el antígeno marcado como el no marcado
competirán para unirse con el anticuerpo y formar la fracción unida. La
parte del antígeno marcado que no reacciona se denomina fracción libre.
A fin de estimar la concentración del antígeno, las fracciones unida y libre
deben ser separadas. Existen diferentes métodos disponibles de
separación los cuales serán discutidos en detalle en capítulos sucesivos.
Los valores son graficados y se estima así la cantidad del antígeno.
Ligando radioactivo
Figura 1. Representación diagramática de un Radioinmunoensayo.
El antígeno y el anticuerpo poseen morfología complementaria
y se acoplan para producir un complejo unido.
Recuerde
En suma, existen 3 pasos importantes a ser consideradas para
comprender los fundamentos del RIA:
8
PASO 1: Formación del Complejo Antígeno-Ac resultando en una
fracción unida y una fracción libre.
PASO 2: Separación de las fracciones unida y libre.
PASO 3: Cálculo de la concentración del ligando.
3.2 ¿Cómo preparar un RIA para medir la concentración del ligando?

La tabla 2 describe una típica preparación de un RIA para analizar varias
muestras de suero de pacientes para un ligando en particular. Los
estándares, controles y muestras de suero tienen dos tubos de ensayo
cada uno (duplicados). Se disponen algunos tubos adicionales para
registrar diferentes parámetros del ensayo:
• Tubos de Conteo Total (Tc) – Estos sirven para registrar la actividad
total adicionada.
• Tubos de unión no específica (NSB)- Sirven para registrar la unión
que no es debida al receptor.
• Tubos de unión cero o estándar cero (Bo) – Sirven como registro de la
unión máxima posible en el sistema.
El buffer, antisuero, solución trazadora y solución separadora se agregan
a los tubos como muestra la tabla. Solamente se adiciona a los tubos de
actividad total y de unión no específica (NSB) las soluciones
mencionadas. El procedimiento exacto se describe más adelante.
Tabla 2
Descripción Tubos Buffer Std/Control Antisuero Solución Solución
/desconoc. trazadora separadora
Actividad T1, T2 No No No Sí No
Total
NSB 1,2 Sí Blank (0) No Sí Sí
0 Std (Bo) 3,4 Sí Blank (0) Sí Sí Sí
Curva std. 5,6 Sí Std A Sí Sí Sí
7,8 Sí Std B Sí Sí Sí
9,10 Sí Std C Sí Sí Sí
11,12 Sí Std D Sí Sí Sí
13,14 Sí Std E Sí Sí Sí
15,16 Sí Std F Sí Sí Sí
Controles 17,18 Sí Cont A Sí Sí Sí
(CC) 19,20 Sí Cont B Sí Sí Sí
21,22 Sí Cont C Sí Sí
Sí
Suero 23,24 Sí Paciente 1 Sí Sí Sí
pacientes 25,26 Sí Paciente 2 Sí Sí Sí
(desconoc.) 27,28 Sí Paciente 3 Sí Sí Sí
External 29,30 Sí Ex Con 1 Sí Sí Sí

Controls 31,32 Sí Ex con 2 Sí Sí Sí
33,34 Sí Ex con 3 Sí Sí Sí
9
Referencia: “Radioinmunoensayo”- Principios y Práctica (1998)
Publicado por BARC, Bombay, India.
10
3.3 ¿Cómo medir la concentración de un ligando?
¿Qué es una curva estándar?
La tabla 2 muestra que los tubos 5-16 contienen los estándares A a F.
• El estándar A contiene cero (0) cantidad de ligando.
• El estándar F contiene la mayor cantidad de ligando.
• Se adiciona buffer, antisuero y ligandos marcados a todos los tubos.
• Se incuba durante el tiempo prefijado y al final de la incubación se agrega
la solución separadora.
• Se procede a centrifugar los tubos, a dejar decantar el sobrenadante en un
tubo separado y después a contar el sedimento (“pellet”) y el
sobrenadante.
• Se dibuja una gráfica estándar usando los métodos de cálculo apropiados.
Este gráfico como se muestra más abajo, representa la llamada “curva
estándar”. Los valores desconocidos son estimados a partir de esta curva.
Nota
Debe tomarse en cuenta que las curvas estándar son generadas cada vez
que se realiza un ensayo, sea para un paciente único o para un grupo.
Paso 1: Paso 2: Paso 4: Paso 5:
Agregue STD, Control Agregue Buffer, Agregue sol. Separe el sedimento y

o suero del pte al tubo Ag marcado + Ac separadora el sobrenadante
into the tube
Figura 2. Preparación experimental típica para Radioinmunoensayo.
La radioactividad asociada a las fracciones “libre” y “unida” son

estimadas usando un contador gama. Los valores son graficados según
métodos que se describirán más adelante, para generar la “CURVA
ESTÁNDAR”. En la Figura 3 se presenta una gráfica característica.
11
RADIOIMMUNOASSAY Nota:
1. Las cuentas en la fracción “unida”
120000 se grafican contra la concentración
del ligando (conc).
100000
2. La menor concentración std “0”
tiene el conteo máximo.
80000
3. La mayor concentración std “200”
tiene el conteo mínimo.
60000 4. La relación inversa entre la
CPM
fracción unida y la concentración

40000 del ligando se debe a la
competencia entre el ligando
20000 marcado y no marcado por el
anticuerpo.
0 5. Los desconocidos y controles se
0 50 100 150 200 250
leen de esta curva std. (flechas).
Ligand (conc)
Figura 3. Curva estándar en cpm (vs.) concentración del ligando.
Vaya a su Cuaderno de Trabajo, sección Radioinmunoensayo y responda las

preguntas 1 - 6 a fin de documentar los puntos de importancia y
demostrar su comprensión de las últimas tres secciones.
Puntos Clave:
• La forma complementaria del antígeno (ligando) y el anticuerpo es
responsable del reconocimiento y unión específica del complejo antígeno-
anticuerpo y por tanto se denomina “ensayo inmunoquímico
estructuralmente específico”.
• ¿Qué es un Anticuerpo?
Un anticuerpo es una proteína formada por el sistema defensivo del
organismo como parte de una respuesta inmunológica frente a una
sustancia extraña. El anticuerpo se combina específicamente con la
sustancia extraña y hasta cierto punto, con sustancias de estructura
similar.
• ¿Qué es un Hapteno?
Es una sustancia sin propiedades inmunogénicas propias, pero que se
vuelve inmunogénica cuando forma un complejo con otra sustancia. El
anticuerpo producido se unirá también al hapteno no formando
complejo. Ejemplos: hormonas esteroides y drogas como la digoxina, que
en general son unidas a seroalbúmina bovina para formar complejos
inmunogénicos.
• ¿Qué más puede ser usado como alternativa al anticuerpo?
1. Anticuerpos específicos generados frente al antígeno.
2. RECEPTORES específicos de transporte (ej. TBG–Globulina de unión a la
Tiroxina).
12
3. Receptores blanco (ej. Receptores citosólicos para estrógenos del útero).
Nota: vea la Tabla 1 por detalles.
• Los tres pasos más importantes a considerar para comprender los
fundamentos del RIA son:
1. Formación del Complejo Antígeno-Anticuerpo. La reacción da lugar a
dos productos: un alto porcentaje de fracción Unida y un bajo porcentaje
de fracción Libre.
2: Separación de las Fracciones Unida y Libre. Es muy importante que no
haya contaminación cruzada de una fracción a otra, lo que causará
errores.
3: Cálculo de la concentración del ligando.
13
4. Ensayos de Unión Competitiva:
Introducción:
El RIA se clasifica en 3 categorías diferentes:
1. 4.1 Ensayos de equilibrio, también conocidos como ensayos de unión
competitiva: En este método todos los reactivos (antígenos y anticuerpos
marcados y no marcados) son incorporados al mismo tiempo.
2. 4.2 Ensayos por desplazamiento: Literalmente utiliza el desplazamiento
del trazador-ligando de la proteína de unión por parte del ligando no
marcado.
3. 4.3 Ensayo secuencial: En este método están involucrados tres pasos
diferentes:
i. Primera incubación donde los estándares, controles, suero de los
pacientes y anticuerpos son incubados por un cierto período (usualmente
entre 30 minutos y 2 horas).
ii. Segunda incubación: se incuba la mezcla con el trazador.
iii. Separación del ligando unido y libre por técnica apropiada.
Tiempo Requerido:
Dedique 1 hora a estudiar esta sección y completar los ejercicios en su
4.1.1 Principios del Ensayo de Equilibrio o de Unión Competitiva:
Existen muchas formas de cuantificar la concentración del antígeno pero
el método más usado es el ensayo por unión competitiva.
En este ensayo se mezcla una cantidad conocida de antígeno
radiomarcado, con una serie de antígenos “fríos”. Dado que el antígeno
marcado y no marcado compiten entre sí por los mismos sitios de unión
en el anticuerpo, una elevada concentración de antígeno resultará en una
pequeña cantidad de antígeno radioactivo en la fracción unida, y
viceversa.
Luego de un tiempo prefijado, un Segundo anticuerpo es dirigido contra
el primer anticuerpo, lo cual lleva a la formación de grandes complejos
que sedimentarán luego de la centrifugación. Esta es llamada la “fracción
unida” que es medida en el contador de radioactividad (Por ejemplo:
Wallac: LKB-Contador Gama Automático 1480 con cristal de NaI de 3” o
equivalente).
Esta fracción unida contiene dos componentes:
i. el antígeno “frío” o no marcado, y
ii. el antígeno radioactivo (unido al anticuerpo específico), mientras que el
sobrenadante contiene el antígeno no marcado.
4.1.2 Resultados
Los estándares diluidos en forma seriada dan lugar a puntos de la curva
que relaciona el conteo radioactivo con la concentración del antígeno
estándar: es la llamada curva estándar o de referencia. Usando esta curva
de referencia, una cantidad no conocida de antígeno en una muestra de
14
suero o solución puede ser cuantificada llevando a cabo las mismas
reacciones primero con un anticuerpo específico y luego con uno no
específico y una cantidad fija de antígeno radioactivo. La identificación
de las cuentas radioactivas en el centrifugado y el uso de la curva de
referencia permiten hallar la concentración no conocida del antígeno.
El ensayo de unión competitiva se representa esquemáticamente a
continuación:
Figura 4. Diagrama de flujo mostrando los pasos involucrados en el RIA.
4.1.3 Gráficas:
El porcentaje de captación de fracción libre y unida puede ser calculado
usando uno de los métodos descriptos en la sección Métodos (Refiérase a
la secciones 3.2 y 3.3). El valor no conocido de la muestra puede ser leído
en la curva estándar.
4.2 Ensayo por Desplazamiento
Los principios del ensayo por desplazamiento son los mismos que los
descriptos para el ensayo de unión competitiva. El principio fundamental
es que las cantidades de anticuerpo y de antígeno marcado sean
constantes en el sistema. La única variable es la cantidad de antígeno en
cada tubo de ensayo. Bajo esas condiciones, como puede verse en el
diagrama más abajo, Figura 5, cuando el antígeno es “0” existe una unión
máxima del antígeno marcado con el anticuerpo. Cuando la cantidad de
ligando aumenta, como en el caso de los tubos 2, 3, 4 y 5, entonces la
unión del antígeno marcado disminuye.
15
Nota El estándar mayor posee la menor unión. Esto es llamado unión
competitiva.
Nota: El desplazamiento del antígeno marcado por el antígeno no marcado del
anticuerpo.
Estd 1 2 3 4 5
Figura 5. Representación diagramática de un ensayo por desplazamiento.

4.3 Ensayo secuencial:
Tiene una secuencia de dos reacciones por incubación:
• En la primera incubación el ligando (antígeno) y el anticuerpo
interactúan para formar el complejo Antígeno-Anticuerpo.
• En la segunda incubación, el anticuerpo marcado compite por la unión
con el antígeno no marcado.
ENSAYO SECUENCIAL:
STD / CONTROL / SUERO PACIENTE INCUBACION

+ ANTICUERPO (PRIMERA)
COMPLEJO ANTIGENO-ANTICUERPO
AGREGAR TRAZADOR INCUBACION

ANTIGENO (SEGUNDA)
OCURRE LA UNION COMPETITIVA
ANTIGENO-ANTICUERPO ANTIGENO MARCADO

+
UNIDOS NO REACTIVO
SEPARACION
CONTAR LA FRACCION UNIDA

Figura 6. Diagrama de flujo de un ensayo secuencial típico.
16
5. Ensayo de Unión No-Competitiva (o)
Ensayo Inmunoradiométrico (IRMA)
5.1 Principios:
El IRMA es la estimación cuantitativa de un antígeno (ligando) usando el
principio de inmuno-reacción.
• El anticuerpo marcado se adiciona en exceso, al contrario que en el RIA
donde es el antígeno marcado que se agrega en exceso.
• El IRMA se caracteriza porque se marca el anticuerpo en vez del
antígeno.
• Dos o más anticuerpos son usados con distintas especificidades. Con
frecuencia, uno o ambos anticuerpos son monoclonales.
• La especificidad y sensibilidad a bajas concentraciones de Ag se
incrementa significativamente.
También se le conoce como Ensayo Sandwich, ya que en forma
característica, un antígeno se coloca entre un anticuerpo de fase sólida
(inmovilizado en un tubo u otro recipiente) y un anticuerpo marcado
(usualmente en fase líquida) como se muestra en el diagrama más abajo.
Tiempo Requerido:
Dedique 1 hora a estudiar esta sección y completar los ejercicios en su
5.2 Métodos y Resultados
IRMA - El Ensayo Inmunoradiométrico se lleva a cabo en la secuencia
de pasos descriptos en la sección siguiente. La reacción alcanza el
equilibrio después del período estipulado de incubación (variable entre
30 minutos y 2 horas, dependiendo de la reacción). Las fracciones libre y
unida son separadas como se describe en el Capítulo 6. Los cálculos se
realizan como se indicó en la sección de métodos (refiérase a las secciones
3.2 y 3.3). El valor no conocido de la muestra puede derivarse de la curva
estándar.
17
RADIOIMMUNOASSAY
120000
100000
80000
60000
CPM
40000
20000
0
0 50 100 150 200 250
Ligand (conc)
Figura 7a. Curva estándar graficando cpm vs. concentración del ligando.
IRMA - Ensayo Radioinmunométrico
Ac - 1 ANTIGENO Ac - 2 Ac1-Ag-Ac2
(No marcado) (Ligando) (Marcado) (Complejo)
Ac = ANTICUERPO
Figura 7. Representación diagramática de un IRMA.
18
Paso 1: Paso 2: Paso 4:
Agregar Std, Control o Agregar Buffer + Descartar sobrenadante

Suero paciente al tubo Ac marcado conteniendo la fracción ‘libre’
FRACCION
UNIDA
FRACTION
Tubos recubiertos de Ac
Figura 8. Representación diagramática de un procedimiento IRMA.
5.3 Gráfica (cálculos)

La actividad de las fracciones “libre” y “unida” se mide en un contador
gama. Los valores se grafican construyendo la llamada “CURVA
ESTANDAR”. Los porcentajes de ambas fracciones pueden calcularse
mediante uno de los métodos descriptos en la sección Métodos (ver
secciones 3.2 y 3.3). El valor desconocido de la muestra se deriva de la
curva. Abajo se muestra una gráfica típica (curva linear):
IRMA Method
6000
5000
4000
Counts
3000 cpm
2000
1000
0
0 100 200 300 400 500 600
Ligand Conc
Figura 9. Una típica curva estándar de IRMA.
19
Nota: La actividad unida y la concentración del ligando son directamente
proporcionales entre sí.
Vaya a su Cuaderno de trabajo, sección Radioinmunoensayo y responda las
preguntas 6 - 7 a fin de documentar los puntos importantes y demostrar
su comprensión de esta última sección.
Puntos Clave:
• ¿Qué es un ensayo de equilibrio?
El ensayo de equilibrio también es conocido como ensayo de unión
competitiva. En este método, todos los reactivos (antígenos y anticuerpos
marcados y no marcados) son incorporados al mismo tiempo. Alcanzan
el equilibrio dentro del período de incubación y forman una fracción
unida que depende de la concentración del antígeno y del anticuerpo.
• Ensayos de desplazamiento:
Se trata literalmente del desplazamiento del trazador-ligando del
anticuerpo por parte del ligando no marcado, en general contenido en
tubos recubiertos. Aquí, el desplazamiento es proporcional a la cantidad
de ligandos no marcados.
• Ensayos secuenciales:
En este método se cumplen 3 pasos diferentes:
1. Una primea incubación donde los estándares, controles, suero del
paciente y anticuerpo son incubados durante cierto período
(generalmente 30 minutos a 2 horas).
2. Segunda incubación en que se adiciona el trazador a la mezcla y se
incuba.
3. Separación del ligando unido del libre mediante técnica apropiada.
• ¿Qué es un IRMA (ensayo radioinmunmétrico)?
También se denomina ensayo sándwich, ya que típicamente el antígeno
queda emparedado entre el anticuerpo en fase sólida (inmovilizado en un
tubo o similar) y el anticuerpo marcado (usualmente en fase líquida). El
porcentaje de radioactividad unida es proporcional a la concentración del
ligando.
20
6. Métodos de Separación
Introducción:
Existen diferentes modos de separación de la fracción unida y la libre,
pero en la práctica habitualmente se usa alguno de cuatro métodos:
1. Método del carbón.
2. Método del Polietilen-glicol.
3. Método de inmuno-precipitación usando un segundo anticuerpo.
4. Método de fase sólida incluyendo la separación magnética.
En la siguiente sección discutiremos cada uno de ests métodos, sus
ventajas y limitaciones.
Tiempo Requerido:
Dedique 1 hora a leer y comprender la siguiente sección sobre métodos
de separación.
6.1 Método del carbón (adsorción no específica del antígeno):
La adsorción del antígeno unido en carbón es un ejemplo típico de
adsorción no específica. El carbón está recubierto con dextrán, albúmina
o gelatina. El carbón también se usa en su forma natural ácida tratada sin
ninguna recubierta.
Centrifugar, decantar el
Tubo conteniendo complejo Agregar carbón sobrenadante, contar el
Ant-Ab y fracción libre activado ‘pellet’ / fracción unida
Mezclar,
Incubar 5 min
FRACCION
Figura 10. Método de separación del carbón UNIDA
21
6.2 Precipitación no específica del complejo Ag-Ac:
El PEG (Polietilen-glicol) se liga al agua y hace que el complejo unido se
vuelva insoluble. Usa la propiedad de tamizaje molecular y captura las
macromoléculas (complejo antígeno-anticuerpo).
Definición: Tamiz Molecular:
El PEG actúa como un tamiz molecular. La estructura del PEG puede
definirse como una jaula con diámetros de poros específicos. Cuando se
agrega PEG al producto final de una reacción Ag-Ac, las macromoléculas
(complejos de gran tamaño) son atrapadas dentro de la estructura en
forma de jaula y el componente libre (no reactivo) se escabulle fuera de la
misma. En la centrifugación, el PEG y la fracción unida sedimentan
formando el “pellet” y la fracción libre se decanta.
6.3 Inmunoprecipitación del complejo Ag-Ac:

Un anticuerpo policlonal producido contra el Segundo anticuerpo (o
contra el complejo Ag-Ac) es usado para completar la precipitación del
producto final de la reacción. Este proceso se incrementa más aún al
adicionar PEG. La separación de la fracción unida del antígeno libre se
logra de manera muy satisfactoria usando este método.
¿Qué es un Segundo anticuerpo?
El primer anticuerpo se genera para un antígeno específico en un animal
(p.ej. un conejo). El suero conteniendo IgG del conejo se inyecta a un
animal más grande (oveja, asno, etc.) el cual producirá IgG anti-conejo.
Este es el denominado segundo anticuerpo. Se elige un animal grande
pues se requiere un gran volumen de segundo anticuerpo. El premier
anticuerpo, que se encuentra bajo forma de complejo unido al antígeno,
es precipitado en forma selectiva y cuantitativa por el segundo
anticuerpo y por tanto completa el proceso de separación.
¿Qué es la IgG?
Cuando una molécula proteica es inyectada en un animal, desencadena
una reacción inmune y produce “inmunoglobulina”. La IgG es una
fracción específica o una familia de inmunoglobulinas responsable por la
respuesta del anticuerpo.
Como se muestra en la Figura 11, el Segundo anticuerpo posee varios
sitios de unión para el complejo Ag-Ac y puede producir complejos muy
grandes. Cuando el segundo anticuerpo es suplementado con PEG ,
puede ser fácilmente sedimentado por centrifugación y y precipitar
cuantitativamente el complejo Ag-Ac. En el diagrama siguiente se ilustra
cómo el segundo anticuerpo recubre un recipiente de vidrio y se une al
complejo Ag-Ac, exponiendo varios sitios de unión por cada recipiente.
22
COMPLEJO
Ag-Ac
SEGUNDO
ANTICUERPO
Figura 11. Método de separación por Inmunoprecipitación usando un

segundo anticuerpo.
Nota!
En el caso del método por separación magnética, el núcleo central del
recipiente de vidrio se llena con partículas de hierro ferroso. Cuando es
colocado en una bandeja conteniendo un campo magnético, sedimenta y
por tanto el complejo Ag-Ac es separado del sobrenadante que contiene
la fracción libre.
6.4 Adsorción del antígeno en fase sólida:
El tubo de reacción es recubierto con anticuerpo para unirse al antígeno
(marcado o no marcado). La fase sólida puede usar recipientes o
partículas magnéticas para lograr la adsorción.
Figura 12. Método de separación de fase sólida usando tubos

recubiertos de anticuerpo.
23
preguntas 8-10 a fin de documentar los puntos importantes y demostrar
su comprensión de esta última sección.
Puntos Clave:
Técnicas de separación.
• Existen diferentes maneras de separar la fracción unida de la fracción
libre. Pero los métodos más comunes usados en la práctica son:
1. Método del carbón – es un método de adsorción no específica.
2. Método del Polietilen-glicol (PEG).
El principio subyacente de la separación por PEG es un mecanismo de
tamizaje molecular. Por tanto, la separación de las formas libre y unida es
completa.
3. Método de inmuno-precipitación usando un segundo anticuerpo.
Se utilizan 2 anticuerpos y el complejo resultante es una macromolécula,
que es separada mediante el método PEG para ayudar a completar el
proceso.
4. Método de fase sólida incluyendo la separación magnética. En este
método, un tubo recubierto por el anticuerpo se usa como fase sólida. Es
el método más común. La separación magnética también es utilizada
extensamente.
• Ventajas del IRMA sobre el RIA
1. Evita dificultades vinculadas a la radio-yodación de algunos agentes
como las hormonas peptídicas.
2. El IRMA es de utilidad cuando se dificulta la purificación del antígeno o
cuando el radiomarcado podría alterar las propiedades inmunológicas
del antígeno.
3. El anticuerpo marcado es más estable durante la incubación.
4. Generalmente el IRMA es más sensible que el RIA convencional.
5. Existe una relación lineal entre la cantidad de trazador unido y la
concentración de antígeno.
6. Algunos antígenos como el antígeno Australiano de la hepatitis son muy
contagiosos y es más seguro trabajar con el anticuerpo marcado, que no
es peligroso.
24
7. Métodos de Cálculo:
Introducción:
Analizar los datos crudos para obtener resultados confiables resulta de la
mayor importancia en RIA. Los resultados pueden ser calculados de
varios modos. Sin embargo, ciertos ensayos son calculados mejor usando
algún método en particular, de modo que no existe un procedimiento
general o universal que pueda ser recomendado. Describiremos varios
métodos de cálculo y discutiremos sus ventajas y limitaciones.
Del diseño experimental se desprende que todos los ensayos se realizan
por duplicado. Por tanto, para el cálculo se utiliza un promedio de las
muestras duplicadas (todos los tubos son contados durante un mismo
tiempo, por ejemplo, 60 segundos). Los valores de la unión no específica
(NSB) son restados de la lectura individual de manera que el verdadero
valor de unión es el usado para los cálculos:
Promedio cpm- NSB = Verdadero cpm [cpm medio corregido]
Tiempo Requerido:
7.1 Gráficos Lineales:
Cpm vs. concentración del ligando:
En este método de cálculo, las cuentas verdaderas por minuto (cpm) son
graficadas en el eje Y y la concentración de los estándares en el eje X (ver
Figura 13a).
La curva estándar típica es la RADIOIMMUNOASSAY
mostrada en la gráfica. Si la
120000
concentración del ligando es
razonablemente alta como en el 100000
caso del ensayo de digoxina, es
apropiado el uso de este método. 80000
La sensibilidad es buena en las
porciones media y final de la 60000
CPM
curva. Es poco sensible medir en

los niveles mayores del ligando. 40000
Como puede verse, una pequeña
diferencia de cpm en el eje Y hace 20000
una gran diferencia en la
0
estimación del ligando en el 0 50 100 150 200 250
extremo alto de la curva en el eje LIGAND (CONC)
X. Por tanto, este método no es
apropiado para medir altos Figura 13a: Gráfico linear usando cpm
niveles de ligando. Especialmente (vs) concentración del
si la curva es extrapolada la ligando.
sensibilidad empeora más.
25
Los valores de cpm pueden ser expresados como % U/L (%
Unida/Libre) o como % U /Total.
Nota: La forma de la curva permanece igual. Por tanto, la alta sensibilidad en el
extremo bajo y la baja sensibilidad en el extremo alto son comparables al
método [cpm vs ligando] discutido antes. Vea Figuras 13b y 13c.
%B/Free %B/Total
60 60
50 50
40 40
%B/Total
30
%B/Free
30
20 20
10 10
0 0
0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 250
ligand conc. ligand conc.
Figura 13b. Gráfico linear usando Figura 13c. Gráfico linear usando
%U/L (vs) conc. ligando %U/total (vs) conc. ligando
7.2 Ploteo Semi-log Ploteo Semi-Log:

Los métodos de cálculo
Semi - Log Plot usados más arriba tienen la
limitación seria de
insensibilidad en extremos
altos. Los valores U/Uo
(B/Bo) se usan en el gráfico
semi-log como se muestra
en la gráfica. Se ve que la
%B/Bo
forma no es de una típica

curva ni tampoco una línea
rcta. Por tanto, la
sensibilidad del extreme
alto es mejor que en la
curva pero no puede ser
usada para extrapolar y leer
valores de muestras más
Log [Ligand]
altos.
Figura 14a. Gráfico semi-log usando %U/Uo (vs) log de la conc. del
ligando.
26
7.3 Gráfico Logit vs Log: Logit B/Bo vs log de conc.
de ligando:
Logit - Log Plot
El gráfico es usualmente
generado en computadora
usando los parámetros logit
[B/Bo] y log [ligando]. Aquí,
ln [B/B0]
Logit B/B0 = --------------
Logit [B/Bo]
100-B/Bo
donde ln=log a la base e
(Base Natural o Neperiana)
(Referencia para más detalles:
Pillai & Bhandarkar,
Radioinmunoensayo, Principios y
Práctica. BARC, BOMBAY).
Siendo un recta, los valores
pueden ser leídos a través del
Log [Ligand]
espectro de concentraciones del
ligando con similar confianza.
Figura 14b.
Además, una gráfica recta puede
Gráfico Semi-log usando%B/Bo (vs)
ser fácilmente extrapolada para
log de la conc. De ligando
leer valores aún superiores de
modo que el potencial es mayor
que el de otros métodos.
Puntos Clave:
Existen 3 diferentes modos de cálculo:
1. Gráfico Linear:
Los valores en el eje X son los correspondientes a la concentración del
ligando.
Los valores en el eje Y se expresan de 3 modos diferentes:
a. cpm (cuentas radioactivas de la fracción unida).
b. % fracción unida / fracción libre como relación.
c. % fracción unida / cuentas totales como relación.
2. Gráfico Semi-Log:
En este gráfico, en el eje X se expresa el logaritmo de la concentración del
ligando.
El eje Y tiene los vlores B/Bo en gráfico linear.
Nota: Bo (Uo) es la actividad (cpm) asociada a la fracción Unida a concentración
cero del estándar.
B = es la actividad (cpm) asociada a la fracción Unida exceptuando la
concentración cero del estándar o de la muestra no conocida.
3. Gráfico Log-Logit:
En este gráfico, el eje X contiene el Log de la concentración del ligando.
El eje Y contiene el logit de los valores %B/Bo.
27
8. Procedimientos de Control de Calidad
Introducción:
El procedimiento de control de calidad (CC) es un aspecto importante en
el RIA. Es obligatorio incluir muestras de CC cada vez que se hace un
RIA ya que es la única manera de verificar el desempeño del kit. Por
ejemplo, los reactivos del kit pueden haber expirado debido a mala
calidad del producto o a condiciones de almacenaje que pueden afectar
los anticuerpos u otros componentes, todo lo cual se reflejará en las
pruebas de CC. Los componentes para CC se proporcionan generalmente
para cubrir rangos bajos, normales y elevados de la curva estándar para
cada ensayo. Los valores de CC deben caer dentro del rango
predeterminado para cada ítem. Si el valor de CC es mayor o menor que
dicho rango, el ensayo debería repetirse. Por tanto, debe hacerse CC cada
vez que se corre un RIA. Es importante y recomendable no validar un
RIA a menos que los valores de CC sean satisfactorios.
8.1 Estadísticas
En estadística se utilizan términos especiales aunque fundamentales,
como “error sistemático” y “error aleatorio”. No se requiere
conocimiento en profundidad sino solamente conceptos básicos
esenciales que se describirán más abajo.
La distribución normal de probabilidades se utiliza muy comúnmente en
estadística debido a una regla denominada el “Teorema del Límite
Central”, la cual afirma que, bajo ciertas condiciones, a medida que los
factores aleatorios que afectan un fenómeno aumentan, la distribución de
la suma (o promedio) de esos factores se aproxima a una distribución
normal.
La Figura 15a muestra varias distribuciones normales con diferentes
medias y desvíos estándar. La media de la distribución es una medida de
su ubicación. Dado que la dispersión es simétrica, el pico máximo en el
centro (el µ medio), coincide con el modo y la mediana de la distribución;
por tanto el µ es el punto donde la función es mayor y también el punto
que divide en dos mitades el área bajo la curva de distribución. El área a
cada lado del µ es igual a 0,5. El desvío estándar de la distribución es una
medida de la dispersión, o variabilidad de la distribución. Cuando el
desvío estándar es grande, la dispersión funcional es ancha; cuando el
desvío estándar es pequeño, la curva es elevada y angosta.
Caracterizaremos la distribución, la media y la varianza de una variable
normal aleatoria mediante una simple notación:
X = N(µ,σ)
Esto significa que la variable aleatoria X posee una distribución normal
(N) con una media µ y un desvío estándar σ (por más información sobre
análisis estadístico, puede referirse al texto “Statistics, Concepts and
Applications” por Amir D. Aczel. Ed. Richard D Irwin (1995). ISBN: 0-
256-11935-X).
28
σ σ
µ
Figura 15a. La Distribución Estándar Normal.
8.2 Control de Calidad Interno

Monitoreo del CC Interno:
Al preparar una corrida de RIA es obligatorio siempre realizar una serie
de controles, generalmente tres por cada corrida, comprendiendo los
rangos alto, normal y bajo.
son
En el gráfico se muestra el rango de
control con los límites superior e
inferior tal como es suministrado por
el fabricante, lo cual está ya
predeterminado y estandarizado. El
valor de cada control es graficado
cada vez. Si el valor de los 3 controles
caen dentro del rango, el ensayo es
validado, pero si caen fuera, no es
aceptado.
Si un valor de control cae
constantemente en la parte baja del
rango y eventualmente sale fuera del
límite, esto puede indicar que el kit
ha expirado. Generalmente indica
que el título del anticuerpo está en
descenso y predice el fallo del kit.
Cuando se establece una tendencia, es
momento de decidir si se cambia el
kit antes de que esa tendencia supere
el límite aceptable.
Figura 15. Control de Calidad Interno

Tabla de monitoreo para controles bajos, normales y altos.
29
8.3 Control de Calidad Externo:
Si muestras idénticas de digoxina se analizan usando diferentes kits de
RIA suministrados por distintos fabricantes, todos los valores obtenidos
pueden ser conjuntados y analizados.
Pueden así calcularse dos parámetros:
1. Valor medio: es el promedio de los valores conjuntados.
2. Desvío estándar: expresa cuánto se separa un valor del promedio.
Recuerde
El punto importante es “cuanto menor la desviación del valor promedio,
mayor el desempeño del kit”.
Si se grafican los valores individuales se consigue una curva en forma de
campana, como se muestra más abajo. Si un valor de control de un kit de
RIA en particular cae dentro de la campana cerca del valor promedio, se
trata de un buen desempeño del kit. Hasta dos desvíos estándar de la
media es aceptable, pero si el valor cae más allá de +2 D.S. se habla de un
sesgo positivo, en tanto que si cae fuera de -2 D.S. es un sesgo negativo.
Los kits de RIA que dan valores por fuera de 2 D.S. no son aceptables
para su uso.
No. of Measurements
Frequency
-4 -2 0 2 4
Standard Deviations
Figura 16. Frecuencia de distribución de medidas repetitivas.

El control de calidad Externo es una parte esencial del RIA, ya que evalúa
la calidad del kit utilizado para un método de ensayo en particular. Por
ejemplo, existen 10 fabricantes diferentes que proveen kits para medir los
niveles de digoxina. Algunos fabricantes pueden usar anticuerpos de
buena calidad pero otros pueden comprometer la calidad beneficiando el
costo. El mensaje es útil para seleccionar el mejor kit de RIA a ser usado
para un ensayo en particular.
30
Precisión, Exactitud y Aleatorio:
Es importante conocer tres términos de interés: “precisión, exactitud y
aleatorio”. Si una muestra es analizada en varios laboratorios usando
diferentes kits, los valores individuales pueden juntarse y calcular el valor
promedio verdadero de la muestra. Si los valores son más altos, se estará en
presencia de un sesgo positivo y si los valores son más bajos, tendremos un
sesgo negativo. La siguiente representación esquemática explica los 3
parámetros: exactitud, precisión y distribución aleatoria (al azar).
EXACTITUD PRECISION ALEATORIO
Figura 17a 17b 17c

CC Externo para evaluar la Exactitud, Precisión y desempeño Aleatorio.
Cada valor es representado mediante los puntos coloreados.
Exactitud:
Si los valores son consistentes y cercanos al “verdadero” estimado, serán
precisos y exactos (estarán en el círculo central en un blanco).
Precisión:
Valores consistentes y reproducibles pero no cercanos al “verdadero”,
caerán por encima o por debajo de éste. Existe precisión pero no
exactitud debido al sesgo positivo o negativo en los resultados.
Aleatorio:
Cuando este comportamiento no es exacto ni preciso. El valor medio de
una distribución aleatoria puede eventualmente caer cerca del verdadero,
pero la distribución de valores es al azar.
Conclusión:
• Lo más deseable es que un kit de RIA posea exactitud y precisión.
• Si el kit es preciso, es utilizable pero debe considerarse el factor de sesgo.
• Si el kit exhibe un comportamiento aleatorio, no es aceptable.
preguntas 11 – 12 a fin de documentar los puntos de importancia y
demostrar su comprensión.
Puntos Clave:
La terminología se encuentra explicada en el texto.
Control de calidad externo
• Valor medio • Exactitud
• Desvío estándar y límites de confianza • Precisión
• Cartilla de desempeño para CC • Aleatorio
31
9. Inmunoensayos No Radioactivos:
Introducción:
El RIA es todavía ampliamente utilizado pero debido a los desechos
radiactivos que resultan, muchos ligandos se analizan actualmente
mediante ensayos no radioactivos usando marcación enzimática,
fluorescente, quimioluminiscente, etc. Continuamente se desarrollan
nuevos tipos de ensayo pero lo importante es que estas técnicas son ahora
totalmente automatizadas.
Tiempo Requerido:
9.1 Ensayo Inmunoenzimático (EIA)
Las enzimas pueden ser usadas como marcadores debido a sus
propiedades catalíticas que permiten la detección de pequeñas cantidades
de antígenos.
La siguiente es una secuencia de eventos característica de un Ensayo
Inmunoenzimático.
I. antígeno + anticuerpo Ag-Ac
(Ag) (Ac-exceso) (complejo)
El complejo se forma como se explicó en RIA.
II. antígeno+ anticuerpo + enzima Ag-Ac-Enzima
(exceso) (complejo)
Nota: La concentración de enzima es proporcional al complejo “anti-Ac”.
III. Reacción enzimática:
antígeno - anticuerpo - enzima
H2 O2 color de
Peroxidasa del rabanito picante sustrato cromogénico
• Como enzima se usa la peroxidasa del rabanito picante (horse-radish

peroxidise, HRP). Una molécula de peroxidasa es capaz de oxidar
millones de moléculas de sustrato por minuto.
• La cinética de la reacción depende de la cantidad de complejo Ag-Ac
presente.
• Como sustrato es usada la Peroxidasa de Hidrógeno en exceso.
Ventajas:
• Las enzimas tienen larga vida media, hasta de 12 meses y sin radiación.
• Los kits comerciales pueden ser usados hasta la fecha de expiración.
• El método es económico aún para ensayos poco frecuentes o tests
esotéricos de bajo volumen.
• En cambio, el RIA está limitado por la vida media del isótopo,
típicamente 6-8 semanas para el 125I más comúnmente usado.
32
Desventajas:
• El procedimiento de laboratorio del EIA es engorroso.
• Involucra gran número de pasos, más que el RIA.
• La posibilidad de contaminación y arrastre por la solución de
amplificación o la solución fluorescente es alta.
• El método está influenciado por factores que afectan las reacciones
enzimáticas, lo cual puede crear artefactos. Por ejemplo: Inhibición de la
reacción enzimática por iones metálicos, interacción de drogas
terapéuticas con la reacción enzimática.
9.2 Ensayo Inmunofluorescente (FIA).
En la fluorescencia o la fotoluminiscencia, luz de una energía (longitud
de onda) adecuada excita la molécula desde su estado basal a un estado
energético mayor. El regreso al estado basal se acompaña por liberación
de energía en forma de luz con una longitud de onda mayor.
Definición: El FIA es un ensayo de unión competitiva que utiliza un fluoróforo o
fluorógeno como marcador, en lugar de una sonda radioisotópica como
en el RIA.
El ensayo se basa en un marcador constituido por un sustrato enzimático
fluorogénico (β Galactosil-umbeliferona). Cuando el marcador es
hidrolizado por una enzima específica da lugar a un producto
fluorescente. La unión del ligando sustrato-marcado con un anticuerpo
específico previene la hidrolización del sustrato marcado por parte de la
enzima. Dado que no se producirá fluorescencia por el anticuerpo unido
marcado, puede distinguirse el unido del no unido.
β Galactosil-umbeliferasa
β Galactosil-umbeliferona Umbeliferona
(sustrato) (producto fluorescente)
El tiempo de emisión de la luz para la mayoría de los compuestos

fluorescentes como la fluoresceína, se encuentra en el rango de los
nanosegundos lo que no es adecuado para ser medido en el laboratorio.
Por tal motivo debe utilizarse una fluorescencia de tiempo mensurable.
Un quelato metálico como la diketona - Europium posee un tiempo de
fluorescencia prolongado (10-1000 µseg) cuando existe mínima
interferencia de luz dispersa.
Ventajas:
• Los productos fluorescentes pueden ser detectados a cantidades 100-1000
veces menores que con los procedimientos colorimétricos del EIA.
• Los tiempos de incubación son menores.
• La sensibilidad es mayor.
Limitaciones:
• El FIA requiere instrumentación especial.
33
• Existe un paso adicional de separación debido a que los quelatos no
pueden ser medidos en fluidos corporales.
9.4 Ensayo Quimioinmunoluminiscente (CIA):

Definición: Una reacción quimioluminiscente es cualquier reacción química en la cual
la luz constituye uno de los productos resultantes.
Una reacción quimioluminiscente típica se expresa como sigue:
2 H2 O2 + LUMINOL + aumentador luz + H2O + hν

peroxidasa(quimioluminiscencia)
La enzima peroxidasa puede reaccionar con moléculas tales como el

luminol para dar lugar a emisión de luz como parte de los productos de
reacción. La emisión fotónica se encuentra en el rango de 400-450 nm. La
reacción da lugar a escasa emisión fotónica por lo cual tiene de por sí baja
sensibilidad y aplicación limitada.
Al incorporar moléculas “aumentadoras” como la luciferina, la emisión
fotónica se incrementa varios miles de veces.
El tiempo de reacción puede tomar hasta 30 minutos o más.
Ventajas:
• Muy sensible; una molécula de peroxidasa puede actuar sobre millones
de moléculas del sustrato por minuto.
• Nuevas sondas quimioluminiscentes como los ésteres de acridinio son
insensibles a los catalizadores séricos (proteínas hem, etc.)
• Nuevos marcadores han mejorado la relación señal/ruido.
• Las señales se han hecho más prolongadas, facilitando las medidas.
Limitaciones:
• Se requiere la etapa de separación debido a que el H2O2 y el luminol
deben estar en un sistema libre de matrices biológicas como el suero.
• La reacción se realiza en un sistema heterogéneo en el cual la peroxidasa
está adherida a una superficie.
34
10. Kits de RIA Comerciales y de Investigación
Un kit de RIA típico se suministra con los siguientes ingredientes:
Cada kit es suficiente para trabajar con 100 tubos de RIA (14 estándares y
86 desconocidos) y contiene los siguientes componentes:
Buffer
Antisuero titulado para 100 tubos
Estándares de referencia y controles internos
Trazador marcado con 125I y empacado con transportador IgG
Segundo anticuerpo precipitado
Folleto de instrucciones y papel para graficar
Cada kit debe ser almacenado a 4o C hasta su utilización. Deben seguirse
las instrucciones específicas de almacenaje para cada uno de los
componentes individuales. Las condiciones estipuladas de envío
(empaque, temperatura) deben haber sido respetadas durante el flete.
Dado que los kits contienen Iodo-125, su transporte, recepción,
adquisición, manipulación y utilización debe estar sujeta a las
regulaciones establecidas por la autoridad competente en cada país.
Puede requerirse demostración de una licencia del usuario antes del
embarque del material.
KITS de RIA para investigación – No para procedimientos
diagnósticos:
b-Endorfina (Humana)
Calcitonina (Salmón)
Ca Protein-quinasa
Dinorfina A[1-13]
Endotelina-1
Factor de Crecimiento Epidermoide (Humano)
Factor de Crecimiento-1 Símil-Insulina
Factor de Crecimiento-2 Símil-Insulina (Humano)
Péptido Natriurético Atrial
Péptido relacionado genéticamente con la Calcitonina
Péptido [1-35] Relacionado a la PTH
Péptido Vasoactivo Intestinal

preguntas 14 - 15 a fin de documentar los puntos importantes y
demostrar su comprensión de las últimas dos secciones.
Puntos Clave:
1. El RIA se basa en un mecanismo de unión antígeno-anticuerpo.
35
2. Es importante saber que, “ya sea que el antígeno esté o no marcado con
un radionucleidos, se unirá al anticuerpo con igual especificidad y
afinidad”.
3. El antígeno marcado y el no marcado competirán para unirse al
anticuerpo para formar la fracción Unida.
4. El antígeno marcado que no ha reaccionado se denomina fracción Libre.
5. El IRMA (ensayo inmunoradiométrico) se basa en los mismos principios
del RIA excepto que se marca el segundo anticuerpo (en lugar del
antígeno como ocurre en RIA).
6. A fin de estimar la concentración del antígeno, las fracciones unida y libre
deben ser separadas.
7. Existen 4 métodos de separación disponibles.
8. Los valores son graficados usando métodos de cálculo apropiados y se
estima así la cantidad de antígeno.
9. Controles de Calidad (CC).
CC Interno – es una guía para verificar el desempeño de un kit durante
cierto período de tiempo.
CC Externo – es una guía para verificar el desempeño de kits
suministrados por distintos fabricantes, para analizar un ligando en
particular.
36
Glosario:
Afinidad Medida de la fuerza de atracción del Ag al Ac.
Avidez Medida de la fuerza de unión Ag-Ac, cuanto
mayor la fuerza, mayor el complejo Ag-Ac
formado.
Bovino Buey, vaca (de origen vacuno).
Esotérico Especializado.
Especificidad Grado al cual el antisuero o Ac reaccionará con la
sustancia analizada y solamente con esa sustancia.
Fluorescencia Tipo de luz con una longitud de onda específica.
Fluorófora Sustancia capaz de emitir fluorescencia.
Fluorógeno Lo mismo que fluorófora.
Fotoluminiscencia Luz emitida en un rango de longitudes de onda
(ej. 400-450 nm).
Hapteno Sustancia que no estimula de por sí una respuesta
inmune pero puede ser antigénica al unirse a otra
de mayor peso molecular, como una proteína.
Inmune Respuesta de una célula inmunológica
Lantánidos Grupo de metales que emiten fluorescencia por
mayor tiempo.
Monoclonal Anticuerpos derivados de una única población de
linfocitos B (células híbridas), específicos para un
único determinante antigénico.
Quelato Unión.
Reactividad cruzada La inversa de especificidad. Interacción con otras
sustancias relacionadas o estructuralmente
similares a la sustancia a analizar.
Sensibilidad Relacionado a la afinidad; cuanto mayor la
sensibilidad del Ac, más rápidamente se alcanza el
equilibrio.
Sustrato Sustancia básica de una reacción (ej. una enzima
actúa sobre un sustrato para dar lugar a un
producto).
Titulación Medida de un anticuerpo.
37
Redactor Técnico: Stefan Eberl
Productor de Edición: Heather Patterson
Traducción al Español : Margarita Núñez -
Introducción:
El contador de centelleo líquido es quizás un instrumento poco
encontrado en laboratorios de Medicina Nuclear en comparación con
otros equipos detectores. Está especialmente diseñado para medir
actividad proveniente de isótopos emisores beta, emisores alfa y emisores
gama de muy baja energía. Por tanto, tiende a ser usado para medir
muestras biológicas marcadas con isótopos como 3H y 14C, monitoreo del
ambiente, o para establecer la edad de ciertas muestras. El centelleo
líquido también es usado para cuantificar muestras de barrido (wipe
tests) para determinar contaminación de áreas donde se utilizan emisores
beta o alfa de baja energía. Aunque el centelleo líquido es de uso limitado
en medicina nuclear, se espera que el personal técnico posea nociones
básicas de sus fundamentos y del funcionamiento del instrumental.
El rango de alcance de las partículas beta y alfa de baja energía en
cualquier material es muy escaso (menor de un mm), de modo que son
muy difíciles de detector y cuantificar mediante los equipos comúnmente
utilizados en medicina nuclear, ya que, entre otras cosas, el propio
material protector del detector causará absorción parcial o total de la
radiación emitida. Para sortear esta dificultad, la muestra se mezcla con
un material centelleador líquido que emite fotones de luz al interactuar
con la partícula, de ahí la denominación de contador de centelleo líquido.
En este módulo, se tratarán los aspectos básicos del conteo por centelleo
líquido y la instrumentación correspondiente.
Prerequisitos:
Asumiremos que usted se encuentra ya familiarizado con el contador de
centelleo y equipos accesorios, y que ya ha completado el módulo
“Instrumentación – Parte 1, Contador de Centelleo”.
Recursos: Si en su institución existe un contador de centelleo, consulte el manual
para ampliar información.
La página web de Perkin Elmer (http://las.perkinelmer.com/) tiene

apuntes útiles sobre teoría y aplicaciones prácticas del contador de
centelleo líquido. Busque en las secciones correspondientes donde
aparecen documentos en formato PDF que le podrán ayudar a completar
el tema.
38
El texto de referencia recomendado es “Physics in Nuclear Medicine”,
Simon R Cherry, James A Sorenson and Michael E Phelps eds, 3rd edition,
páginas 196-203, Saunders, Philadelphia, 2003. Sin embargo, no se
requiere que usted tenga acceso a esta referencia para completar el
módulo.
Objetivos:
Al completar esta unidad usted debería haber adquirido una
comprensión básica de:
1. Principios del conteo con centelleo líquido.
2. Instrumentación para conteo con centelleo líquido.
3. Correcciones y cuantificación en conteo con centelleo líquido.
4. Preparación de muestras para conteo con centelleo líquido.
Debido a que el acceso a un contador de centelleo líquido puede ser
difícil, los ejercicios de este módulo no exigen trabajo con este
instrumental. Sin embargo, si usted tiene disponibilidad del mismo, se
recomienda que en lo posible efectúe algunos ejercicios prácticos.
Tiempo Requerido:
Dedique un total de 4 horas a completar esta unidad y los ejercicios
correspondientes en su Cuaderno de Trabajo.
39
Parte 1
Teoría del Conteo con Centelleo Líquido
Tiempo Requerido:
Esta sección debería tomarle un máximo de 1 hora para completar.
Introducción:
Las partículas alfa y beta de baja energía poseen un escaso rango de
penetración en la mayoría de los materiales (mucho menos de 1 mm). Por
tanto, es difícil la detección precisa de estas partículas mediante los
equipos de medida convencionales. Sin embargo, algunos de estos
emisores beta son de gran importancia en ciencias biológicas y
laboratorios hospitalarios así como en departamentos de inmunología.
Las principales características de los emisores beta de interés en ciencias
médicas se listan en la Tabla 1.
Tabla 1: Radionucleidos emisores beta en ciencias médicas.
Radionucleido Vida media Energía β Máxima
3H 12.3 yr 18 keV
14C 5730 yr 156 keV
35S 87.0 yr 167 keV
32P 14.3 d 1710 keV
Debido al corto alcance de estas partículas, el centelleador, que convierte
la energía de la partícula en fotones de luz, debe estar muy cerca del
punto de emisión radioactiva. Esto se logra mediante un líquido
centelleador que puede ser mezclado con el material radioactivo a medir.
Centelleador Líquido:
El principio básico del centelleo líquido se muestra en la Figura 1.
Figura 1: Principio básico del centelleo líquido.

El átomo radioactivo emite una particular beta (β-), la cual imparte su
energía a la molécula solvente. Ésta luego entrega su energía al
centelleador primario (también llamado a veces fluo-molécula), que
desprende su energía en forma de luz. Sin embargo, la longitud de onda
de la luz emitida λ1 en general no cae dentro del espectro de detección
eficiente de los detectores de luz, como los tubos fotomultiplicadores, por
lo cual se usa un segundo centelleador (o modificador de onda), que
absorbe la luz del centelleador primario y la vuelve a emitir a una
diferente longitud de onda λ2 más apropiada para su detección. La luz
40
del centelleador secundario se detecta externamente mediante un tubo
fotomultiplicador (fototubo).
Las moléculas solventes más comunes son el tolueno y el xileno, las
cuales son apropiadas para el propósito mencionado pero muy tóxicas,
por lo cual están siendo remplazadas por nuevos solventes como el DIN
(di-isopropilnaftaleno) y el PXE (fenilxiletano) que son menos dañinas
para el medio ambiente. Para aplicaciones específicas, y dependiendo de
la muestra, puede usarse una mezcla de otros solventes para asegurar
una disolución adecuada en el cóctel de centelleo líquido. Obviamente,
también es importante que la solución sea transparente a la luz emitida
por el centelleador secundario.
Un centelleador primario común es la PPO (2,5-difeniloxazola) que
frecuentemente se emplea en conjunto con el centelleador secundario
POPOP (1,4-di-[2-5-feniloxazola] benceno).
Vaya a su Cuaderno de Trabajo, sección Centelleo Líquido y responda las

preguntas 1 - 3 para evaluar su comprensión de esta sección.
Resumen:
Las emisiones alfa y beta de baja energía no son detectadas de manera
eficiente por equipos convencionales ya que aún la cubierta protectora
del detector puede absorber la radiación emitida de manera parcial o
completa. En lugar de ello, la muestra se disuelve en una mezcla de
líquido centelleante que permite la transferencia eficiente de energía de
la partícula a una combinación de centelleador y modificador de onda
para producir luz, que es detectada externamente por fototubos.
Puntos Clave:
• La mayoría de las emisiones α y β son de rango energético insuficiente
para ser detectadas por instrumentos convencionales y requieren mezclar
el material radioactivo con un ‘centelleo líquido’, que convierte la energía
de la emisión radioactiva en luz la cual puede ser detectada mediante un
tubo fotomultiplicador.
• En el conteo por centelleo líquido, las muestras radioactivas emisoras β
son disueltas en un líquido centelleante llamado cóctel.
• Los 3 ingredientes principales del cóctel son:
- un solvente orgánico,
- un centelleador primario o fluoromolécula,
- un centelleador secundario o modificador de onda.
• El centelleador primario centellea cuando la energía le es transferida
desde el solvente, pero la longitud de onda de la luz emitida no es
eficientemente detectada por un tubo fotomultiplicador.
• El centelleador secundario o modificador de onda cambia la longitud de
onda de la luz emitida para ser detectada con mayor eficiencia por el tubo
fotomultiplicador.
41
Parte 2
Instrumentación para Conteo por Centelleo Líquido
Introducción:
Como fue detallado en la Parte 1, el centelleador que convierte la
radiación ionizante en luz forma parte de la muestra. Por tanto, no es
requerido un centelleador externo como cristal de NaI(Tl) como parte del
sistema de detección. En efecto, el centelleador líquido reemplaza la
función de un cristal de centelleo, objeto familiar en los sistemas de
detección en medicina nuclear. Sin embargo, la luz emitida por el
centelleo líquido aún debe ser detectada y convertida en una señal
eléctrica para llevar a cabo la medida de actividad de la muestra. Como
es el caso de otros sistemas de detección, incluyendo la gamacámara, la
luz es detectada por tubos fotomultiplicadores (TFM), que son descritos
en detalle en el módulo:
“Módulo 2, Unidad 4a, Instrumentación–Parte 1, Contador de Centelleo”.
Debido a las emisiones de baja energía de las partículas, el número de
fotones de luz emitidos y por tanto el número de fotoelectrones
emanados del fotocátodo del TFM es muy escaso (hasta 25 fotoelectrones
para la máxima energía de una partícula beta 3H). Adicionalmente, en
particular con los isótopos de vida media larga usados en centelleo
líquido (ver Tabla 1), el número de partículas emitidas por unidad de
tiempo es bajo. Por tanto, el ruido en el sistema debe ser mantenido a un
mínimo absoluto para permitir que las muestras sean contadas en un
tiempo razonable.
Las principales fuentes potenciales de ruido son:
• Ruido electrónico en el TFM y sistema de procesamiento como emisiones
térmicas espontáneas de electrones desde el fotocátodo.
• Radiación de fondo ambiental (background).
• Fosforescencia natural (emisión de luz) de la muestra luego de ser
expuesta a una fuente luminosa.
Como se detalla en la Figura 2, debe seguirse cierto número de pasos en
la configuración del instrumento y en la preparación de las muestras para
asegurar una baja radiación de fondo y una máxima sensibilidad de
conteo.
Tiempo Requerido:
Esta sección debería tomarle hasta un máximo de 1 hora para completar.
42
Generalidades del Instrumento:
En la Figura 2 se muestra un diagrama de bloque de un sistema de
centelleo líquido y sus principales componentes.
Figura 2: Diagrama de bloque de un contador de centelleo líquido.

Los componentes básicos del contador de centelleo líquido incluyen los
siguientes, como se demuestra en la figura:
• Una estrecha cámara oscura donde se coloca la muestra. Este
compartimiento evita que la luz exterior no emitida por la muestra,
alcance los TFM. La cámara también incluye un revestimiento reflectivo y
guías ópticas para dirigir la mayor parte de la luz emitida por la muestra
hacia el TFM.
• Dos tubos fotomultiplicadores que convierten la luz emitida en una señal
eléctrica. La amplificación inicial de la señal de salida de los TFM es
realizada por los preamplificadores.
• Un circuito de coincidencia que será descrito en detalle más abajo.
• Un circuito de adición que suma las señales de los dos TFM. Como en la
gamacámara, la suma de las salidas de los TFM es proporcional a la
cantidad total de luz detectada por éstos y por tanto relacionada con la
energía de la partícula emitida. Un amplificador aumenta aún más la
señal sumada para permitir su posterior procesamiento.
• Un analizador multicanal que produce un espectro de energías de las
cuentas detectadas y será discutido en detalle más abajo.
43
Conteo por Coincidencia:
Como lo sugiere el nombre, en el conteo por coincidencia se aceptan
cuentas solamente cuando se registra un evento con ambos detectores
dentro de una ventana de tiempo predefinida, o sea, que ambos eventos
deben coincidir en el tiempo. Este hecho se ilustra abajo en la Figura 3:
Figura 3: Ilustración del conteo por coincidencia.

Como se muestra en la Figura 3, el “gatillo” de coincidencia solamente se
dispara cuando en ambos TFM cae un pulso dentro de la ventana
temporal. Cuando existe un pulso en cualquiera de los TFM no
acompañado de un pulso en el otro tubo, no existirá señal de salida desde
el circuito de coincidencia.
Para la coincidencia debe definirse una estrecha ventana de tiempo para
asegurarse que se detecten las coincidencias verdaderas. Esta ventana
toma en cuenta la imperfecta resolución temporal de la electrónica
involucrada, así como el tiempo requerido para que los fotones de luz
viajen desde el punto de emisión hasta el TFM. De este modo, si los
pulsos provenientes de los dos TFM son detectados dentro de esta
ventana de tiempo, serán considerados coincidentes aunque su llegada
difiera en forma leve. Las ventanas de coincidencia típicas usadas en
contadores de centelleo líquidos se encuentran en el orden de
τ = 15 ns (15 x 10-9 s).
¿Por qué Conteo por Coincidencia?
El conteo por coincidencia es una de las maneras más efectivas de reducir
el ruido y la radiación de fondo en el método de conteo por centelleo
líquido. Debido a que la luz es emitida en todas direcciones cuando las
partículas alfa o beta interactúan con el líquido centelleador, los fotones
serán detectados por ambos TFM simultáneamente, produciendo un
evento de coincidencia. Por el contrario, los pulsos emanados de un TFM
debidos a ruido electrónico ocurrirán al azar en cada tubo, con muy baja
probabilidad de que generen un evento de coincidencia. Por tanto, es un
modo eficaz para eliminar el conteo de fondo por ruido electrónico.
44
Existe, sin embargo, una probabilidad cierta aunque mínima de que dos
pulsos de ruido se produzcan simultáneamente en los 2 TFM generando
un evento coincidente. La probabilidad es función de la ventana de
coincidencia τ y de la tasa de pulsos de ruido (Rn), y está dada por:
Rr = (2τ)Rn2
Donde Rr es la tasa de conteo coincidente debida al ruido, usualmente
denominada como tasa de coincidencia aleatoria o accidental. Como
ejemplo, si:
Tasa de pulsos de ruido Rn = 1000 cps
Ventana de tiempo τ = 15 ns (15 x 10-9 s)
Entonces:
Tasa de coincidencia aleatoria Rr = 0.03 cps
Se reduce así la tasa de ruido electrónico de fondo a 0.003% de lo que se
observaría sin conteo de coincidencia. Esto ilustra claramente el
importante papel que desempeña el conteo de coincidencia para reducir
el ruido de fondo en un sistema de centelleo líquido.
Una tasa de conteo de 1000 cps de cada TFM puede en principio parecer
excesiva. Es que debido al pequeño número de emisiones fotoeléctricas
emanadas del cátodo del TFM como respuesta a las partículas beta de
baja energía, la señal resultante es muy pequeña, requiriendo colocar un
umbral de aceptación bastante bajo. Esto causa un conteo elevado
proveniente de emisiones térmicas espontáneas y otras fuentes de ruido
electrónico. Por tanto, sin la aplicación del sistema de coincidencia, sería
muy difícil el conteo de estos trazadores de de baja actividad y energía.
Analizador Multicanal:
Las emisiones de partículas, como las beta, dan lugar a un continuo
especto de energías hasta el valor máximo correspondiente al isótopo
medido en particular. Por tanto, un simple analizador multicanal como el
usado en las sondas de centelleo que fueron detalladas en el Módulo 2,
Unidad 4a “Instrumentación – Parte 1, Contador de Centelleo” es
insuficiente para la discriminación energética requerida en el contador de
centelleo líquido. Además, como fue discutido en la Parte 3 de esta
unidad, el espectro de energías cambia con las modificaciones de la
eficiencia de transferencia energética al líquido centelleador y de la
detección de luz, debidas a la composición de la muestra, lo cual se
denomina “quenching”. Es por lo tanto importante recolectar el espectro
complete de energías de la muestra en estudio.
El analizador multicanal (AMC) se usa para generar el espectro de
energías. Básicamente, es un conversor análogo-digital con una memoria,
que analiza la altura de la señal entrante sumada que llega de los TFM e
incrementa la ubicación de la señal en proporción a la altura del pulso.
Por ejemplo:
Considere una la llegada de una señal sumada cuya altura puede variar
entre 0V y 10V. El AMC puede producir un valor de salida de 0 a 9, o sea
un voltaje de entrada entre 0 y 1V producirá una salida de 0, entre 1 y 2V
45
una salida de 1 y así sucesivamente. La memoria requerida para
almacenar este espectro es de 10 segmentos o bins (bins 0-9).
Veamos la secuencia de pulsos entrantes, la correspondiente señal de
salida digital, el número de segmentos de incremento y el número total
de cuentas en cada segmento, de la siguiente manera:
Tamaño de Valor de Incremento Ctas. Totales

la señal Salida de la Segmento de Aumentadas
sumada MCA Digital Memoria en el
Segmento
5.2V 5 5 1
0.5V 0 0 1
3.1V 3 3 1
5.6V 5 5 2
7.5V 7 7 1
3.5V 3 3 2
8.3V 8 8 1
4.8V 4 4 1
6.1V 6 6 1
5.4V 5 5 3
Por tanto, al finalizar la recolección de 10 cuentas, el segmento 5
contiene 3 cuentas, el segmento 3 contiene 2 cuentas, los segmentos 0,
4, 6, 7 y 8 contienen una cuenta cada uno y los segmentos restantes (1, 2
y 9) contienen 0 cuentas. Si se grafica el número de cuentas en cada
segmento contra el número del segmento, se genera un simple espectro
de energías como muestra la Figura 4.
Number of
Counts in
3
2
1
Bin Number
Figura 4: Espectro simple producido por el ejemplo del texto.

En la práctica, los analizadores multicanales suelen tener varios cientos o
miles de segmentos (bins) y se recolecta mucho más de 10 cuentas,
generando un espectro de morfología más suavizada similar al ilustrado
en la Figura 5. A fin de recoger solamente las cuentas de coincidencia, la
conversión y almacenaje de cuentas en los segmentos se dispara por la
salida del circuito de coincidencia como muestra la Figura 2.
46
Relative Number
of counts
3H
14 C
Figura 5: Típico espectro de energía producido por MCA para 14C y 3H.
Técnicas de reducción de actividad de fondo y ruido:

Como se mencionó más arriba, el conteo por coincidencia es la principal
técnica usada para reducir el ruido de fondo. Una solución adicional para
bajar el ruido electrónico y mantener estable la salida de los TFM es
refrigerar los detectores llevándolos a una temperatura constante,
típicamente de unos -10o C. Manteniendo los tubos a baja temperatura
reduce las emisiones térmicas espontáneas del fotocátodo. Existen otras
técnicas importantes destinadas a minimizar el ruido electrónico y el
fondo.
Ventana Energética:
Como se muestra en la Figura 5, la energía máxima del 3H es mucho
menor que la del 14C, de manera que se usarán diferentes ventanas
energéticas para contra uno y otro isótopo según el rango esperado de las
mismas. Para el 3H, el nivel superior de la ventana será mucho más bajo
que para el 14C, ya que todas las cuentas registradas por encima de la
energía máxima de este isótopo serán debidas a ruido.
Vial de Conteo:
La selección del vial de conteo también requiere consideración especial.
El vidrio normal contiene potasio (K) incluyendo el potasio radioactivo
natural (40K), el cual puede aumentar la actividad de fondo tanto como
30-40 cpm cuando se analizan muestras con 3H o 14C. Por lo tanto, debe
utilizarse viales de vidrio con bajo contenido de potasio o si el fluido del
centelleo líquido lo permite, viales de polietileno. Estos últimos se
adaptan a los solventes basados en dioxano, pero no deben ser empleados
para soluciones conteniendo tolueno ya que éste interactúa con el
polietileno y produce distorsión del material que puede dañar el
mecanismo cambiador de muestras. Otros materiales apropiados para
viales incluyen el cuarzo, pero son mucho menos usados. Los viales
apropiados para contadores de centelleo líquido están disponibles
comercialmente y cubren todos los rangos para diferentes cócteles. Sus
47
detalles y especificaciones pueden ser consultados para seleccionar el
producto más apropiado en cada aplicación particular.
Efecto fosforescente:
La exposición del vial con la solución de centelleo a la luz brillante,
incluyendo la luz solar, causa absorción de energía que produce emisión
de luz de fondo llamada fosforescencia, la cual puede demorar horas en
decaer. Por tanto, las muestras a menudo se almacenan en ambiente
refrigerado y protegido de la luz antes del conteo para permitir el
decaimiento de la fosforescencia luego de la preparación de la muestra.
Esto se denomina adaptación de las muestras a la oscuridad.

Resumen: Para conteo por centelleo líquido se requiere instrumentación específica

y se aplican técnicas especiales para reducir el ruido de fondo. Usando 2
tubos fotomultiplicadores para detección de la luz, es posible realizar
conteo por coincidencia el cual resulta fundamental para reducir las
cuentas de fondo debidas a ruido electrónico. Los contadores de
centelleo líquido también incorporan un analizador multicanal que
permite generar, almacenar y analizar el espectro de energías de la
muestra, optimizando el proceso de conteo. Mantener al mínimo la
exposición de las muestras a la luz y bajo refrigeración, así como el uso
de viales apropiados también ayuda a minimizar el conteo de fondo.
Puntos Clave:
• Componentes básicos del contador de centelleo líquido:
- Cámara oscura para la muestra radioactiva.
- 2 tubos fotomultiplicadores que convierten luz en señales eléctricas.
- Un circuito de coincidencia que determina si los pulsos ocurren
simultáneamente en ambos TFM para ser admitidos en el conteo
(seleccionando las cuentas que coinciden en una ‘ventana’ de tiempo
reduce las cuentas de fondo debidas a señales de ruido).
- Un analizador multicanal que produce un espectro de energías de las
cuentas detectadas.
• El ruido debe ser mantenido al mínimo para permitir que las muestras
sean medidas dentro de un período de tiempo razonable.
• El tipo de viales necesita consideración especial, prefiriéndose vidrio de
bajo contenido en potasio o polietileno, dependiendo de los ingredientes
del ‘cóctel’.
• Las muestras deben ser almacenadas en lugar oscuro y refrigerado para
evitar la inducción de fosforescencia y las emisiones térmicas.
48
Parte 3
Cuantificación, Corrección de “Quench” y
Preparación de Muestras
Tiempo Requerido:
Dedique cerca de 1 hora a completar la siguiente sección.
Introducción:
A menudo es necesario conocer cuantitativamente la cantidad de
radioactividad en la muestra. En el conteo por centelleo líquido la
actividad de la muestra generalmente es expresada en desintegraciones
por minuto (DPM) debido a la baja concentración de actividad usada. El
término es comparable a desintegraciones por segundo, lo cual está
relacionado con la definición de la unidad de actividad, el Becquerel (Bq).
Un Bq equivale a una desintegración por segundo.
Para que la luz sea detectada por los tubos fotomultiplicadores, deben
tener lugar una serie de procesos como se ilustra en la Figura 6.
Figura 6: Producción de Luz y “Quenching” en el Proceso de

Transferencia de Energía.
La energía de la partícula debe ser transferida al centelleador mediante la

molécula del solvente y la luz debe viajar entonces a través de la muestra
para ser detectada. La eficiencia con que ocurre esta transferencia de
energía depende de la composición de la muestra.
La pérdida de eficiencia se denomina “quenching”.
• El quenching químico se refiere a la pérdida de eficiencia en transferir
la energía desde la particular emitida al centelleador primario.
• El quenching de color se refiere a la absorción de parte de la luz
emitida en la muestra antes de que alcance al TFM.
Los efectos netos del quenching resultan en una eficiencia de conteo
menor, así como en un cambio en el espectro de energía de la muestra,
como se ilustra en la Figura 7. Para obtener resultados cuantitativos
precisos, debe ser estimada y corregida la cantidad de ‘quench’ ocurrida
en una muestra.
49
Counts
Unquenched
Quenched
Energy
Figura 7: Efecto del Quenching sobre el Espectro de Energía.

Correcciones de Quench
Existen varias técnicas que pueden ser usadas para calcular la cantidad
de quench que ocurre en una muestra y por tanto estimar los factores de
corrección a fin de obtener resultados cuantitativos. Estas técnicas
incluyen:
1. El método de estandarización interna.
2. El método de la relación de canales.
3. El método de estandarización externa automática.
Método de Estandarización Interna:
Con este método, la muestra se mide en primer lugar. Cuando se ha
completado el conteo inicial, se agrega una cantidad conocida de
actividad de una solución estándar calibrada y la muestra es medida
nuevamente. Se determina entonces la eficiencia de conteo con y sin la
presencia del estándar (std), de la manera siguiente:
Eficiencia = (cps[std + muestra] - cps[muestra]) / (actividad del std [Bq])
Donde cps(std + muestra) es la tasa de conteo obtenida luego de agregar
el estándar a la muestra, cps(muestra) es la tasa de conteo obtenida de la
muestra aislada, antes de agregar el estándar y (actividad del std [Bq]) es
la cantidad de actividad del estándar agregado.
La actividad de la muestra estará dada por:
Muestra (Bq) = cps (muestra) / Eficiencia.
Las principales desventajas de este método son que la muestra debe ser
medida dos veces (con y sin el estándar), que se necesita una solución
estándar muy precisa y que la adición del estándar puede cambiar la
composición de la muestra y por tanto el quenching. Esto último puede
causar falta de exactitud en la corrección.
50
Método de la Relación de Canales:
Este método toma ventaja del hecho que el espectro de energía cambia al
aumentar el quenching, como se muestra en la Figura 8.
Counts
Channel 1
Channel 2
Unquenched
Quenched
Energy
Figura 8: Ilustración del método de relación de canales.
Se utilizan dos canales y se obtiene el conteo de cada canal. El Canal 1

cubre el rango de energía complete esperado para una muestra sin
quenching, mientras que el Canal 2 cubre una sección más baja del
espectro (Figura 8). Dado que la presencia de quenching cambia el
espectro de energía (lo desplaza), la relación de cuentas entre los dos
canales se modificará, o sea, la relación entre el Canal 2 y el Canal 1
aumentará a medida que el quenching va modificando el espectro
desplazándolo cada vez más hacia abajo. Puede así generarse una curva
de corrección agregando cantidades crecientes de agente quenching a una
muestra de actividad conocida; la relación entre los canales se grafica en
función de la eficiencia para cada cantidad de quenching presente.
Para una muestra desconocida se determina la relación de canales y se lee
la cantidad de quenching y la eficiencia de conteo de la curva de
calibración previamente establecida. Las cuentas de la muestra son
corregidas por la eficiencia determinada a partir de la curva de
calibración de quenching.
La principal desventaja de esta técnica es que a tasas de conteo muy
bajas, los errores estadísticos pueden ser significativos generando
incertidumbre en la relación estimada de canales y por tanto en el factor
de corrección. Además, para emisores beta de muy baja energía como el
3H, el desplazamiento del espectro de energía como función de la
cantidad de quenching puede ser muy sutil, llevando también a

incertidumbre importante en la estimación de factores de corrección
apropiados a partir de la curva de calibración. El método no puede ser
51
usado cuando se cuentan dos radioisótopos simultáneamente en la
misma muestra (p.ej. 3H y 14C).
Método de Estandarización Externa Automático:

Este método incorpora aspectos tanto del de estandarización interna
como del de relación de canales, empleando una fuente externa de
emisión gama. Primero se mide la muestra con la fuente externa bajo
blindaje. Luego es contada nuevamente (generalmente por corto tiempo,
p.ej. un minuto) estando la muestra irradiada por una fuente de radiación
gama externa como 137Cs o 133Ba. Los rayos gama sufren interacción
Compton con la muestra, lo cual produce electrones de retroceso (‘recoil
electrons’), los que a su vez interactúan con el centelleador de modo
similar a como lo hacen las partículas beta emitidas por la muestra que se
analiza. Otra vez, se establece un método de relación entre canales que
relaciona las cuentas registradas provenientes de la fuente externa con la
cantidad de quenching presente en la muestra y por tanto con la
eficiencia de conteo.
La principal ventaja del método del estándar externo es que proporciona
elevada estadística de conteo para el método de relación de canales, pues
no depende de la actividad contenida en la muestra. También se
sobrepone a las limitaciones del método de relación de canales para
emisores beta de muy baja energía como el 3H. Aunque permite corregir
tanto el quenching químico como el colorimétrico, no corrige las pérdidas
por auto-absorción de las partículas beta o por efecto de distribución de
la muestra.
Técnicas de Corrección Disponibles Comercialmente:
Los contadores de centelleo líquido incorporan las técnicas de corrección
de quenching descriptas más arriba y vienen equipados de fábrica con
fuentes de estandarización externa así como con curvas precalibradas de
quenching para los isótopos más usados. La implementación exacta de las
correcciones de quenching es sustancialmente más sofisticada que lo
explicado arriba, para lograr asegurar la máxima exactitud y
confiabilidad. Pueden encontrarse más detalles en la descripción técnica
de los productos recurriendo a sitios de Internet de fabricantes de
contadores de centelleo líquido (p.ej. http://las.perkinelmer.com/, que es
especialmente informativo).
Preparación de Muestras
La preparación adecuada es un aspecto esencial del proceso de conteo
por centelleo líquido. Debe tomarse cuidado en la selección del cóctel de
centelleo:
1. Para asegurar que la muestra radioactiva se disuelva totalmente y se
disperse en el líquido de centelleo.
2. La cantidad de quenching introducida por la muestra también debe ser
minimizada lo cual, por ejemplo, puede requerir decolorar la muestra
para reducir el efecto quenching de color. Debido a la amplia variedad de
52
muestras usadas y las técnicas de preparación disponibles, estas técnicas
no serán discutidas en detalle aquí.
3. Sin embargo, debe ser enfatizado el hecho de que si se intenta medir una
muestra con centelleo líquido, deben ser consultadas las referencias
apropiadas para garantizar la elección de un cóctel y método de
preparación de las muestras adecuadas. Nuevamente, la información
contenida en sitios web de empresas fabricantes provee un buen punto de
comienzo.
Las sustancias utilizadas en algunos cócteles de centelleo, como el
tolueno, son tóxicas y deben tomarse precauciones para no contaminarse
la piel, o que sus vapores no sean inhalados, o que no se produzca
ingestión. Deben usarse ropas protectoras apropiadas y debe existir
buena ventilación, incluyendo si es posible una campana con sistema
extractor de gases.
También debe tomarse cuidado al desechar los viales de conteo después
de usados. En general, la actividad contenida en la muestra es
despreciable y por tanto la preocupación fundamental es la naturaleza
tóxica de algunas de las soluciones utilizadas. En este sentido, las
sustancias químicas deben ser desechadas observando los
procedimientos vigentes en cada institución.

Resumen: Para el conteo por centelleo líquido a menudo se requieren medidas
cuantitativas. La pérdida de eficiencia de conteo, llamada quenching,
debe ser determinada para cada muestra y luego aplicar un factor de
corrección para compensar las pérdidas de cuentas por este fenómeno. El
quenching puede ser medido de varias formas, siendo la más
comúnmente empleado el llamado método de estandarización externa
automática. Este método usa el análisis del espectro de energía obtenido
cuando la muestra es irradiada por una fuente externa emisora de
radiación gama, a fin de cuantificar el quenching.
Puntos Clave:
• El Quenching se refiere a la pérdida de eficiencia durante ciertos procesos
de transferencia de energía.
- quenching químico: pérdida de eficiencia en la transferencia
energética de la partícula al centelleador primario.
- quenching de color: pérdida de eficiencia en la transferencia de luz al
TFM.
• Para cuantificar los resultados, se requiere un factor de corrección para
compensar el quenching.
• Es necesaria una adecuada preparación de la muestra.
1. disolución y dispersión adecuadas.
2. minimización del quenching.
53
3. consultar las referencias para procedimientos adecuados de
selección de cóctel y preparación de muestras.
• Debido a la naturaleza tóxica de algunas soluciones, las sustancias
químicas deben desecharse siguiendo los procedimientos de desecho de
líquidos tóxicos vigentes para cada institución. En general, la
radioactividad contenida en la muestra es despreciable.
54
Glosario
Auto-absorción Parte de las emisiones radioactivas serán absorbidas en el

material de la propia muestra, sin transferir su energía a la
molécula solvente y por tanto sin llegar a producir centelleo.
Centelleo Emisión de luz por parte de una sustancia, en respuesta a la
absorción de energía de, por ejemplo, una partícula beta o un
rayo gama.
Cóctel Mezcla de diferentes líquidos. En centelleo líquido, el cóctel
contiene el solvente para disolver la muestra marcada, el
centelleador primario o fuoro-molécula que convierte la
energía de la particular en fotones de luz, y el centelleador
secundario o modificador de onda, que desplaza la longitud
de onda de la luz hacia un rango más apropiado para su
detección por los tubos fotomultiplicadores.
Conteo por Se refiere a la técnica de conteo donde solamente se acepta una
Coincidencia cuenta cuando el evento es detectado por los 2 TFM dentro de
un rango determinado o ventana de tiempo.
Desplazamiento Una sustancia química puede desplazar la longitud de onda de
de onda la luz. En centelleo líquido esto se usa para cambiar la longitud
de onda de la luz emitida por el centelleador primario hacia
una longitud de onda más apropiada para su detección por los
TFM.
Emisión Es la emisión de electrones desde el fotocátodo en respuesta a
Fotoeléctrica los fotones de luz.
Emisiones Emisiones de electrones del fotocátodo debido a energía
Térmicas térmica (temperatura/calor) en vez de fotones de luz. Puede
referirse también a la emisión de luz por temperatura de la
muestra, lo cual es una forma de fosforescencia.
Fluoro-Molécula También se denomina centelleador primario, convierte la
energía de la emisión radioactiva en fotones de luz.
Fosforescencia Proceso por el cual algunos materiales al ser estimulados por
una fuente luminosa, absorben energía que luego liberan en
forma de fotones de luz.
Fotocátodo Parte del TFM. Cuando es alcanzado por fotones de luz, el
fotocátodo emite electrones que serán amplificados en
sucesivas etapas para producir una señal eléctrica.
Interacción Cuando un rayo gama pierde parte de su energía desplazando
Compton un electrón de su órbita. El rayo gama habrá reducido su
energía y modificará la dirección de su trayectoria. Para
centelleo líquido, la interacción Compton produce electrones
que se comportan en el cóctel de modo similar a las partículas
beta emitidas por la muestra a ser analizada.
55
Molécula Solvente Molécula usada para disolver la sustancia radioactiva y que
permite la transferencia de energía de la emisión radioactiva al
centelleador primario.
Quenching Término usado para describir las pérdidas de eficiencia en la
conversión energética que tienen lugar en el cóctel de
centelleo.
Tolueno Sustancia química tóxica apropiada para actuar como
molécula solvente en centelleo líquido.
Ventana de Estrecho período de tiempo usado para conteo por
Tiempo coincidencia. Si las cuentas son detectadas por 2 TFM en la
misma ventana de tiempo, se dice que están en coincidencia.
Xileno Sustancia química tóxica que se usa como molécula solvente
en centelleo líquido.
56

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ACUERDO REGIONAL DE COOPERACIÓN

AGENCIA INTERNACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA

Programa de Entrenamiento Asistido a Distancia

Contador de Centelleo Líquido

Los materiales estarán normalmente disponibles a través de instituciones educativas reconocidas

Nombre de la persona que recibe los materiales: _____________________________________

Enviar a: Nuclear Medicine Section

Cuantificación, “Quench” y preparación de Muestras 47

Definiciones Tipos de ensayos

Materiales y métodos en RIA Principios del RIA

Ensayo de unión competitiva Ensayos no competitivos

Separación Cálculos Control de Calidad

Ensayos no radioactivos Kits de RIA

Teoría del conteo por centelleo líquido

Conteo por Analizador Background y

Cuantificación, “quench” y preparación de muestras

En la tabla se resumen los ejemplos más típicos:

TARGET RECEPTOR ANTIBODIES:

2. Materiales y Métodos usados en RIA.

2.1 Antígenos Radiomarcados (ligandos):

3.2 ¿Cómo preparar un RIA para medir la concentración del ligando?

External 29,30 Sí Ex Con 1 Sí Sí Sí

Agregue STD, Control Agregue Buffer, Agregue sol. Separe el sedimento y

Figura 2. Preparación experimental típica para Radioinmunoensayo.

La radioactividad asociada a las fracciones “libre” y “unida” son

fracción unida y la concentración

Figura 3. Curva estándar en cpm (vs.) concentración del ligando.

Vaya a su Cuaderno de Trabajo, sección Radioinmunoensayo y responda las

Figura 4. Diagrama de flujo mostrando los pasos involucrados en el RIA.

Figura 5. Representación diagramática de un ensayo por desplazamiento.

STD / CONTROL / SUERO PACIENTE INCUBACION

AGREGAR TRAZADOR INCUBACION

OCURRE LA UNION COMPETITIVA

ANTIGENO-ANTICUERPO ANTIGENO MARCADO

CONTAR LA FRACCION UNIDA

IRMA - Ensayo Radioinmunométrico

Figura 7. Representación diagramática de un IRMA.

Agregar Std, Control o Agregar Buffer + Descartar sobrenadante

5.3 Gráfica (cálculos)

Figura 9. Una típica curva estándar de IRMA.

6.3 Inmunoprecipitación del complejo Ag-Ac:

Figura 11. Método de separación por Inmunoprecipitación usando un

Figura 12. Método de separación de fase sólida usando tubos

curva. Es poco sensible medir en

7.2 Ploteo Semi-log Ploteo Semi-Log:

forma no es de una típica

8.2 Control de Calidad Interno

Figura 15. Control de Calidad Interno

Figura 16. Frecuencia de distribución de medidas repetitivas.

Figura 17a 17b 17c

• Como enzima se usa la peroxidasa del rabanito picante (horse-radish

El tiempo de emisión de la luz para la mayoría de los compuestos

9.4 Ensayo Quimioinmunoluminiscente (CIA):

2 H2 O2 + LUMINOL + aumentador luz + H2O + hν

La enzima peroxidasa puede reaccionar con moléculas tales como el

Vaya a su Cuaderno de Trabajo, sección Radioinmunoensayo y responda las

La página web de Perkin Elmer (http://las.perkinelmer.com/) tiene

Figura 1: Principio básico del centelleo líquido.

Vaya a su Cuaderno de Trabajo, sección Centelleo Líquido y responda las