UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS CICLO 2017

CIENCIAS BASICAS Y BIOLOGICAS SEGUNDO AÑO
UNIDAD DIDACTICA BIOQUIMICA

PRACTICA DE LABORATORIO No. 8:

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
Lectura Obligatoria: Del texto “Bioquímica” 6ª. Ed. de Harvey, Capítulo 3
y del texto “Bioquímica Médica” 4ª. Ed. de Baynes, Capítulo 5.

Con el estudio y desarrollo de la presente práctica de laboratorio el estudiante adquiere el

conocimiento y desarrolla la habilidad para utilizar los instrumentos de laboratorio que lo capacitan para
demostrar la concentración de Hemoglobina en sangre. Con alcanzar esta competencia el estudiante:
1) Explica la estructura y función de la Hemoglobina.
2) Explica los procesos de oxigenación de la Hemoglobina
3) Explica el Efecto Bohr y la Curva de Disociación de la Hemoglobina.
4) Explica el sistema de transporte de CO2 y O2 por la hemoglobina.
5) Explica la función del 2,3-difosfoglicerato.
6) Explica las diferencias entre la hemoglobina fetal y la del adulto.
7) Explica las causas de la Talasemia, la hemoglobina Falciforme y Metahemoglobinemia.

GENERALIDADES.
La hemoglobina y la mioglobina son hemoproteínas cuya importancia fisiológica se relaciona
principalmente con su capacidad de unirse al oxígeno molecular. La hemoglobina del adulto es una
hemoproteína tetramétrica [α(2):β(2)] que se encuentra en los eritrocitos, donde es la responsable de unirse al
oxígeno en los pulmones y de transportar el oxígeno al cuerpo donde es utilizado en los mecanismos
metabólicos aeróbicos. La hemoglobina (Hb) es una proteína globular, que está presente en altas
concentraciones en lo glóbulos rojos y se encarga del transporte de O2 del aparato respiratorio hacia los tejidos
periféricos; y del transporte de CO2 y protones (H+) de los tejidos periféricos hasta los pulmones para ser
excretados. Los valores normales en sangre son de 13 – 18 g/ dl en el hombre y 12 – 16 g/ dl en la mujer.

ESTRUCTURA.
La hemoglobina es una proteína con estructura cuaternaria, es decir, está constituida por cuatro
cadenas polipeptídicas (fig. 1): dos α y dos β (Hemoglobina Adulta- HbA); dos α y dos δ (forma minoritaria de
Hemoglobina Adulta- HbA2- normal 2%); dos α y dos γ (Hemoglobina Fetal- HbF). En el feto humano, en un
principio, no se sintetizan cadenas alfa ni beta, sino zeta (z ) y epsilon (ε) (Hb Gower I). Al final del primer
trimestre la subunidades α han reemplazado a las subunidades z (Hb Gower II) y las subunidades γ a los
péptidos x.
Por esto, la HbF tiene la composición a α2γ2. Las subunidades β comienzan su síntesis en el tercer
trimestre y no reemplazan a γ en su totalidad hasta algunas semanas después del nacimiento. Las cadenas
polipeptídicas alfa contienen 141 aminoácidos, las no alfa 146 (β, γ, δ) y difieren en la secuencia de
aminoácidos. Se conoce desde hace décadas la estructura primaria de las cuatro cadenas de Hb normales. La
estructura secundaria es muy similar: cada una exhibe 8 segmentos helicoidales designados con las letras A a la
H. Entre ellos se encuentran 7 segmentos no helicoidales. Cada cadena a esta en contacto con las cadenas β,
sin embargo, existen pocas Interacciones entre las dos cadenas α o entre las dos cadenas β entre sí.
 FIGURA 1. Molécula de Hemoglobina.

FIGURA 2. Anillo del Hem.

Las cuatro cadenas polipeptídicas de la Hb contienen cada una un

grupo prostético, el Hem, un tetrapirrol cíclico (Fig. 2), que les
proporciona el color rojo a los hematíes. Un grupo prostético es
una porción no polipeptídica que forma parte de una proteína en
su estado funcional. El átomo de hierro se encuentra en estado
de oxidación ferroso (2+) y puede formar 5 o 6 enlaces de
coordinación dependiendo de la unión del oxigeno a la Hb (oxiHb,
desoxiHb). Cuatro de estos enlaces se producen con los
nitrógenos pirrólicos de la porfirina en un plano horizontal. El quinto enlace de coordinación se realiza con el
nitrógeno del imidazol de una histidina denominada histidina proximal. Finalmente, el sexto enlace del átomo
ferroso es con el O2, que además está unido a un segundo imidazol de una histidina denominada histidina
distal. Tanto el quinto como el sexto enlace se encuentran en un plano perpendicular al plano del anillo de
porfirina. La parte porfirínica del Hem se sitúa dentro de una bolsa hidrofóbica que se forma en cada una de
las cadenas polipeptídicas.

Cuando una proteína esta con su grupo prostético se denomina holoproteina, y cuando esta sin este,
se lo denomina apoproteina. Además por poseer un grupo prostético se dice que la Hb es una proteína
conjugada, es una hemoproteina.

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HEMOGLOBINOPATIAS.

CLASIFICACION:
Existen cinco clases principales de Hemoglobinopatías:
1. Hemoglobinopatías Estructurales: Hb con alteraciones de la secuencia de aminoácidos que causan
alteraciones de la función o de las propiedades físicas o químicas. Pueden presentar:
a) Polimerización anómala de la Hb: HbS. b) Afinidad por el O2 alterada: Alta afinidad, Policitemia; Baja
afinidad: Cianosis, pseudoanemia. c) Hb que se oxidan fácilmente: Hb inestables, Anemia Hemolítica, Ictericia.
Hb M, Metahemoglobinemia, Cianosis.
2. Talasemias:
a) Talasemia alfa. b) Talasemia beta. c) Talasemias delta-beta, gammadelta-beta, alfa-beta.
3. Variantes de la Hb talasémicas: Hb estructuralmente anormal vinculada con la herencia de un
fenotipo talasémico: a) Hb E. b) Hb Constant Spring. c) Hb Lepore.
4. Persistencia hereditaria de la Hb fetal: persistencia en adultos de concentraciones altas de HbF.
5. Hemoglobinopatias adquiridas:
a) Metahemoglobinemia debida a exposición a tóxicos.
b) Sulfohemoglobina debida a exposición a tóxicos.
c) Carboxihemoglobina.
d) Hb H en eritro leucemia.
e) Hb F altas en estado de estrés eritroide y displasia de médula ósea.

Una gran cantidad de mutaciones se han descrito en los genes de globina. Estas mutaciones se pueden
dividir en dos distintos tipos: los que causan anormalidades cualitativas (ej. anemia de células falciformes) y los
que causan anormalidades cuantitativas (ej. las talasemias). En conjunto a estas alteraciones se les conoce
como hemoglobinopatias. Un tercer grupo de desórdenes de la hemoglobina incluye las enfermedades en las
cuales hay una persistente expresión de la hemoglobina fetal. Estas últimas enfermedades se conocen
colectivamente como persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal (HPFH).

De las mutaciones que conducen a las alteraciones cualitativas en la hemoglobina, la mutación sin
sentido en el gen β-globina que causa anemia de células falciformes es la más común. La mutación que causa
anemia de células falciformes es una sola substitución del nucleótido (A a T) en el codon para el aminoácido 6.
El cambio convierte el codon del ácido glutámico (GAG) a un codon de valina (GTG). La forma de hemoglobina
en personas con anemia de la célula falciformes hoz se refiere como HbS (Figura 3).

El problema subyacente en la anemia de las células falciformes es que la sustitución de la valina por el
ácido glutámico da lugar a que los tetrámeros de la hemoglobina se agreguen luego de la desoxigenación en los
tejidos. Esta agregación conduce a la deformación de los glóbulos rojos haciéndolos relativamente inflexibles e
incapaces atravesar los lechos capilares. Los ciclos repetidos de la oxigenación y de la desoxigenación
conducen a una enfermedad irreversible. El resultado final es el bloqueo los tubos capilares. Debido a que los
huesos son particularmente afectados por la reducción del flujo de la sangre, existe un frecuente y severo dolor
óseo.

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 Este es el síntoma típico durante una crisis de células falciformes. Durante largos período el bloqueo
recurrente de los capilares sanguíneos conduce al daño a los órganos internos, particularmente los riñones, el
corazón y los pulmones. La destrucción continua de las células falciformes de la sangre conduce a anemia
crónica y a episodios de hiperbilirrubinemia. Una mutación adicional relativamente común en el codon 6 es la
conversión a un codon del lisina (AAG) que da lugar a la generación de HbC.

FIGURA 3. Anemia Falciforme o Drepanocítica.

Hemoglobina S forma polímeros produciendo un
glóbulo rojo en forma de hoz, cuando han liberado
el oxigeno.

La electroforesis de las proteínas de la hemoglobina de individuos sospechosos de tener anemia de

células falciformes (o varios otros tipos de desórdenes de la hemoglobina) es una herramienta de diagnóstico
eficaz porque las variantes de hemoglobinas tienen diversas cargas. Un ejemplo de esta técnica se demuestra
en la figura abajo (Figura 4).

FIGURA 4. Electroforesis de las proteínas de la

Hemoglobina.
Se observa la migración electroforética de las
Hemoglobinas A, F, S y C.

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FUNDAMENTO DE LA PRACTICA.
El Fe (ΙΙ) de todas las formas de hemoglobina, con excepción de la sulfohemoglobina, es oxidado por el
ferrocianuro a Fe(ΙΙΙ) convirtiéndolas en metahemoglobina que, a la vez, reacciona con cianuro ionizado (CN-)
formándose ciano-metahemoglobina, un derivado muy estable que absorbe a 540 nm. La intensidad del color
formado es proporcional a la concentración de hemoglobina total en la muestra.

pH 7,2
HbFe(ΙΙ) + Fe(ΙΙΙ)(CN)63- HbFe (ΙΙΙ) + Fe(ΙΙΙ)(CN)64-
-
HbFe(ΙΙΙ) + CN HbFe(ΙΙΙ)CN

REACTIVOS (COMPOSICION).

R1: Reactivo Drabkin (50x). Modificado2. Ferricianuro potásico 30 mmol/L, cianuro potásico 38 mmol/L,
fosfato monopotásico 50 mmol/L, tensioactivo 2,5% (p/v). Xn

CAL Patrón o Estándar de Hemoglobina: Hemoglobina 12gr/dl /(7.5 mmol/L).

MATERIALES.

1) Equipo descartable para extracción de sangre (Ligadura, antiséptico, algodón, guantes, jeringas
descartables de 5cc con aguja # 21 o 22).

2) Una centrifuga.

3) Dos tubos de centrifuga (para la muestra con anticoagulante y para contrapeso a la hora de
centrifugar).

4) Dos Pipetas de Pasteur.

5) Dos tubos de ensayo pequeños (para trasladar el suero).

6) Tres micro cubetas ópticas (muestra, estándar y blanco) en su respectiva gradilla.

7) Una pipeta serológica de 1 ml (con 2 puntas descartables).

8) Una micropipeta de 0 a 100 µL con 3 puntas descartables.

9) Un espectrofotómetro calibrado a 540 nm.

10) Anticoagulante

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PROCEDIMIENTO:

1) Rotular las cubetas ópticas con M, E y B respectivamente

2) Extraer de 3 a 5 cc de sangre (un estudiante en ayunas voluntario) y colocar en el tubo de ensayo con
anticoagulante.
3) Centrifugar por 10 minutos para separar las células sanguíneas. El sobrenadante (plasma) servirá para
preparar la muestra.
4) Pasar con la pipeta de Pasteur cuidadosamente el plasma al tubo de ensayo pequeño.
5) Pipetear en tubos rotulados según el cuadro:

CUBETAS/TUBOS BLANCO (B) MUESTRA (M) ESTÁNDAR (E)

REACTIVO R1 2.5ml 2.5ml 2.5ml
SUERO 10 µL
ESTÁNDAR (CAL)Hg 12g/dL 10 µL

OBSERVACIONES:
a) El R1 será pipeteado en los 3 tubos (B, M y E).
b) El suero (Muestra) será pipeteado 10 µL en el tubo rotulado con M.
c) El reactivo CAL (Estándar) será pipeteado 10 µL en el tubo rotulado con E.
d) La hemoglobina es estable 1 semana a 2-8ºC. El color es estable varias horas. Para períodos
superiores a las 6 horas mantener los tubos refrigerados a 2-8°C.

6) Mezclar y reposar los tubos 3 minutos a temperatura ambiente.

7) Calibrar el espectrofotómetro con el Blanco a 540nm.
8) Leer la absorbancia (Abs) de la muestra y del Estándar a esa absorbancia (540 nm frente al
blanco de reactivo).
9) Luego de efectuar las lecturas y anotarlas debidamente, realizar el cálculo para obtener la
concentración de la muestra (M) usando la formula respectiva:

[Muestra] g/dL Hb Total = Abs Muestra x [Estándar]

Abs Estándar

 Una concentración alta de lípidos puede elevar falsamente el valor de la hemoglobina en unos 3 g/dL,
debido a la turbidez.
 Bilirrubina no interfiere.
 Cuando se emplea EDTAK3 líquido como anticoagulante el contenido en hemoglobina puede disminuir
un 0,5% por efecto de la dilución de la muestra.
 Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.

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BIBLIOGRAFÍA:

1) BIOQUÍMICA MÉDICA de Baynes, Cap. 4 y 5.

2) BIOQUÍMICA de Harvey, Cap. 3.

NOTAS IMPORTANTES

Resultado:

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Conclusión:

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HEPS/2017.

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