UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS

BÁSICAS

GUÍA DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA
SEGUNDO AÑO: 2021-II
SESIÓN III
TECNICAS DE
COLORACION: SIMPLE, DIFERENCIAL Y
ESPECIAL.
 TECNICAS DE COLORACION
SIMPLE, DIFERENCIAL Y ESPECIAL.

I. INTRODUCCION

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para
el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico
de enfermedades infecciosas y en la caracterización de nuevas especies.

Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de
estos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y
del colorante. Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de
iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos
del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de
metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color.

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:

A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes ácidos
Ej. Eosinato de sodio o Eosina.
B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina (ácido).

En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno, cristal
de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la
anilina.
Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de
lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl - Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como
la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.

II. OBJETIVOS

• Identificar la diferencia entre coloración Simples, Diferenciales y especiales.

• Conocer el procedimiento de la coloración simple, Diferenciales y Especiales.
• Explicar el Procedimiento de la coloraciónes.
• Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
III. COLORACIONES:

3.1. SIMPLES

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los
microorganismos.
3.1.1. MATERIALES

• Guantes quirúrgicos estériles

• Hisopos estériles
• Muestra con mezcla bacteriana
• Láminas portaobjetos
• Laminillas cubreobjeto
• Asa bacteriológica de Kolle en aro
• Colorante Azul de metileno
• Colorante Tinta China.
• Azul de Lactofenol.
COLORACIÓN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor.

2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos.

3. Lavar con agua y dejar secar.

4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos

2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo oscuro.
Como la capsula de la levadura Cryptococcus.

COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lámina portaobjetos

2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observarán en un fondo azul – celeste.
3.2. COLORACIONES DIFERENCIALES

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de
Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente.

COLORACION DE GRAM

Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la
mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff.

Diferencia estructural entre bacterias GRAM POSITIVA Y GRAM NEGATIVAS.

MATERIALES

▪ Muestra con mezcla de bacterias

▪ Solución fisiológica al 0.85%
▪ Láminas portaobjetos
▪ Asa bacteriológica de Kolle en aro
▪ Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
• Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
• Bicarbonato de sodio
• Lugol (mordiente)
• Alcohol- acetona (decolorante)
• Fucsina básica (colorante de contraste)
▪ Mechero de Bunsen
▪ Varillas para coloración
▪ Microscopio de luz con objetivo de inmersión
▪ Aceite de cedro
▪ Papel lente

PROCEDIMIENTO

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la
lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparación en
capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama débil
del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.
5. Cubrir el frotis con el colorante cristal violeta, durante un minuto.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta que no
arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste safranina durante 60 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

Coco Gram positivo Coco Gram negativo

Bacilo Gram positivo Bacilo Gram negativo

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION

Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido de lípidos,
como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-resistente. Al teñirse los
microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y
aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.

MATERIAL
▪ Láminas con frotices de bacilo tuberculoso
▪ Set de coloración Ziehl-Neelsen:
• Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
• Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)
• Azul de metileno (colorante de contraste)
▪ Mechero de alcohol

PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el mechero de
alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces, evitando
que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
6. Lavar con agua corriente
7. Secar y observar con lente de inmersión.

RESULTADO

Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y el no ácido alcohol resistentes se tiñen de color
azul.
3.3. COLORACIONES ESPECIALES.

INTRODUCCION

Las coloraciones especiales permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de
anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN

Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de

microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES

▪ Frotis de sangre con Bartonella

▪ Solución de colorante Leishman
▪ Agua destilada tamponada
▪ Microscopio con lentes de 100X
▪ Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de caño y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersión
5. Anotar los resultados en el protocolo.

RESULTADO: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro.

COLORACIÓN DE VAGO

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el método de
Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.

MATERIALES

▪ Lámina portaobjetos
▪ Palito mondadientes
▪ Solución fisiológica al 0.85%
▪ Set de coloración de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
▪ Asa de siembra en aro
▪ Microscopio con lentes de 100X
▪ Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO
1. En una lámina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina
extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercurio cromo durante 3 minutos
5. Lavar con agua corriente
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
7. Lavar con agua corriente
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

RESULTADOS
Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la
flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersión

COLORACION DE WIRTZ CONKLIN (PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos (adicionar
colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersión