Cloranfenicol

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA
PROPUESTA DE VALIDACION DEL METODO DE CROMATOGRAFIA

LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA PARA LA CUANTIFICACION DE
CLORANFENICOL COLIRIO.
TRABAJO DE GRADUACION PRESENTADO POR

JOSE OSCAR LOPEZ IRAHETA
PARA OPTAR AL GRADO DE

LICENCIADO EN QUIMICA Y FARMACIA
SEPTIEMBRE 2017
SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTROAMERICA

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
RECTOR
MAESTRO ROGER ARMANDO ARIAS ALVARADO
SECRETARIO GENERAL
MAESTRO CRISTOBAL HERNÁN RÍOS BENITEZ
FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA
DECANO
LIC. SALVADOR CASTILLO AREVALO
SECRETARIO
MAE. ROBERTO EDUARDO GARCIA ERAZO

COORDINACION DE PROCESOS DE GRADUACION
COORDINADORA GENERAL
MSc. Cecilia Haydeé Gallardo de Velásquez
TRIBUNAL CALIFICADOR
Coordinadora de Área de Control de Calidad de Productos Farmacéuticos

y Cosméticos
MSc. Rocío Ruano de Sandoval
Coordinadora de Área de Industria Farmacéutica, Cosmética y

Veterinarios
Lic. Mercedes Rossana Brito Mendoza
DOCENTE DIRECTOR
MSc. Eliseo Ernesto Ayala Mejía

Agradecimientos
A mi madre, por su paciencia (…vaya que si la necesito…), por sus sabios

consejos, por su amor, por siempre confiar en mí, por siempre darme una razón
para seguir adelante, por hacer de mí una persona de bien, por eso y muchas
cosas más, yo siempre te estaré eternamente agradecido. Te quiero mucho!
A papá, por enseñarme que para tener las manos limpias primero hay que
ensuciárselas, que siempre hay que hacer lo correcto, que la humildad hace
valiosa a una persona y que es mejor ser un buen hombre que un gran hombre.
A mi asesor MSc. Eliseo Ayala, por su valioso apoyo al desarrollo de este

trabajo con su tiempo, paciencia y conocimientos, por su disponibilidad en todo
momento, por ser para mí un ejemplo a seguir como persona y profesional.
Al licenciado Manuel Pineda, por su incondicional apoyo y apertura desde el

inicio, sin el cual no hubiese sido posible llevar a cabo este trabajo.
A mis queridos maestros de la Facultad de Química y Farmacia de la

Universidad de El Salvador, quienes contribuyeron a mi formación profesional
compartiendo día a día sus conocimientos durante toda la carrera.
A todas las personas que de una u otra forma contribuyeron tanto al desarrollo
de este trabajo, como al crecimiento personal y profesional de mi persona, a los
que están y a los que ya no, a mi familia, amigos y compañeros.
A todos y cada uno de ellos infinitas gracias, atentamente:
Oscar López.
Dedicatoria
A mi madre:
Dedico este logro de manera especial a ti mamá, que me ayudaste a construir

un sueño que ahora se vuelve realidad, la de ser un profesional. Sé que jamás
existirá una forma de agradecer toda una vida de lucha, sacrificio y esfuerzo
constante, siempre querías hacer de mí un hombre de bien, ahora lo sé, y te lo
agradezco mucho, finalmente puedo decir que lo hemos logrado, puedes
sentirte orgullosa.
Con mucho cariño:
Oscar.
INDICE
Pág.
RESUMEN
CAPITULO I
1.0 Introduccion 15
CAPITULO II
2.0 Objetivos 18
CAPITULO III
3.0 Marco teórico 20
3.1 Cloranfenicol 20
3.1.1 Definición 20
3.1.2 Obtención 20
3.1.3 Descripción 21
3.1.4 Solubilidad 21
3.1.5 Indicaciones terapéuticas 21
3.1.6 Efectos tóxicos 22
3.2 Preparaciones oftálmicas 23
3.2.2 Isotonicidad de las soluciones oftálmicas 23
3.2.3 Viscosidad de las soluciones oftálmicas 23
3.2.4 Esterilidad 24
3.2.5 pH 24
3.2.6 conservadores 25
3.3 Cromatografía líquida de alto desempeño 25
3.3.2 Fase estacionaria 25
3.3.3 Columna cromatográfica 25
3.3.4 Fase móvil 26
3.3.5 Equipo HPLC 26
3.3.6 Elución en gradiente 27
3.3.7 Procedimiento general de uso 27
3.4 Validación de métodos analíticos 28
3.5 Establecimiento del alcance de la validación 30
3.6 Características de desempeño analítico 32
3.6.1 Exactitud 32
3.6.2 Precisión 33
3.6.3 Especificidad 34
3.6.4 Límite de detección 36
3.6.5 Límite de cuantificación 37
3.6.6 Linealidad e intervalo 38
3.6.7 Robustez 40
3.6.8 Aptitud del sistema 41
3.7 Datos requeridos para la validación 41
3.8 Verificación de procedimientos farmacopéicos 43
3.8.1 Proceso de verificación 44
3.8.2 Requisitos de verificación 45
3.9 Documentación 46
CAPITULO IV
4.0 Diseño metodológico 49
4.1 Tipo de estudio 49
4.2 investigación bibliográfica 49
4.3 Parte experimental 50
4.3.1 Linealidad del sistema 50
4.3.2 Precisión del sistema 52
4.3.3 precisión del método 53
4.3.4 precisión intermedia 54
4.3.5 Exactitud 55
4.3.6 Selectividad ó especificidad 57
CAPITULO V
5.0 Resultados y discusión de resultados 60
5.1 Elaboración de protocolo de validación 60
5.2 Resultados de la evaluación de los parámetros de desempeño 80
5.2.1 Determinación de linealidad del sistema 80
5.2.2 Determinación de la precisión del sistema 83
5.2.3 Determinación de la precisión del método 84
5.2.4 Determinación de la exactitud 86
5.2.5 Determinación de la precisión intermedia 88
5.2.6 Determinación de la selectividad ó especificidad 90
5.3 Elaboración de reporte y certificado de validación 93
CAPITULO VI
6.0 Conclusiones 112
CAPITULO VII
7.0 Recomendaciones 114
Bibliografía
Anexos
INDICE DE ANEXOS
Anexo N° Pág.
1. Preparación de soluciones y reactivos 117
2. Procedimiento de operación HPLC Thermo Scientific Dionex

Ultimate 3000 124
3. Cromatogramas de la determinación de Linealidad del sistema 127
4. Cromatogramas de la determinación de Precisión del sistema 135
5. Cromatogramas de la determinación de Precisión del método 136
6. Cromatogramas de la determinación de Precisión intermedia 141
7. Cromatogramas de la determinación de Exactitud del método 145
8. Cromatogramas de la determinación de Selectividad 150
9. Formulas generales de calculo 152
10. Carta de aceptación de documentación presentada 155

INDICE DE CUADROS
Cuadro N° Pág.
1. Características analíticas típicas utilizadas para la validación

de métodos. 29
2. Alcance de la validación para métodos analíticos 30

normalizados
3. Alcance de la validación para métodos analíticos no
normalizados 31
4. Alcance de la validación para métodos analíticos 31
desarrollados
5. Datos requeridos para la validación 43
6. Niveles de concentración con su respectiva concentración 51,67

final
7. Esquema de validación del método analítico farmacopólico 77,98
8. Resultados de la evaluación del parámetro linealidad del

sistema 80
9. Cuadro resumen de tratamiento de datos para la evaluación

del parámetro linealidad del sistema 81
10. Cuadro resumen de la estadística de la regresión del
parámetro linealidad del sistema 83
11. Áreas y tiempos de retención de la precisión del sistema 84
12. Datos obtenidos en la precisión del método junto a su 85

estadística
13. Cuadro resumen de las respuestas y porcentajes de recobro

obtenidos en la exactitud del método 86
14. Cantidad añadida como concentración final con su respectiva
respuesta en cada nivel de concentración 87
15. Datos obtenidos en la precisión intermedia junto con su
estadística 88
16. Cuadro comparativo de datos entre analista 1 y analista 2 89
17. Cuadro resumen de los coeficientes de variación obtenidos
entre analista 1 y analista 2 89
18. Respuestas obtenidas en la evaluación del parámetro de

validación selectividad 90
19. Cuadro resumen de resultados obtenidos en la evaluación de

los parámetros de validación 92
20. Resultados de la validación del método analítico
cromatográfico para la cuantificación de cloranfenicol colirio
0.25% 100,103
INDICE DE FIGURAS
Figura N° Pág.
1. Estructura de la molécula de cloranfenicol 20
2. Diagrama de flujo de un cromatógrafo líquido de alto

desempeño 27
3. Curva de regresión para los datos obtenidos en la evaluación

del parámetro linealidad del sistema. 82
4. Curva de regresión para los datos obtenidos en la evaluación

del parámetro exactitud del método 87
5. Cromatogramas sobrepuestos de muestra, placebo y estándar

respectivamente en forma descendente 91
RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objeto proponer la validación del método de

cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de cloranfenicol
colirio, para lo cual se utilizó el método analítico descrito en la USP 38.
Se elaboró el protocolo de validación en el cual se estableció el procedimiento,

parámetros a evaluar y sus respectivas especificaciones, equipos y reactivos.
Se evaluaron los parámetros: Linealidad del sistema, precisión del sistema,
precisión del método, precisión intermedia, exactitud, y especificidad.
Posteriormente se elaboró el reporte con los resultados obtenidos y el
certificado de validación.
De acuerdo a los resultados obtenidos, se concluyó que el método es seguro y

fiable para su utilización bajo las condiciones de uso reales del Laboratorio de
Control de Calidad del Laboratorio Farmacéutico Nacional.
Esta investigación se desarrolló en base a lo establecido en el procedimiento

interno de validación del Laboratorio Farmacéutico Nacional, la guía de
validación del Organismo Salvadoreño de Acreditación y la guía de validación
editada por el colegio de Químicos Farmacéuticos Biólogos de México. El
desarrollo completo de la propuesta de validación fue llevada a cabo dentro de
las instalaciones del Laboratorio Farmacéutico Nacional en el periodo de
diciembre de 2016 a enero de 2017.
CAPITULO I
INTRODUCCION
xv
1.0 INTRODUCCION
Los métodos utilizados en un laboratorio de análisis químico deben de ser

evaluados y sometidos a pruebas para asegurarse de que producen unos
resultados válidos y coherentes con el objetivo previsto, por lo que deben ser
validados.
La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas

documentadas, mediante estudios sistemáticos de laboratorios y demostrativos,
que un método de análisis sea lo suficientemente fiable y reproducible para la
obtención del resultado previsto dentro de intervalos definidos. Este proceso
permite el conocimiento de las características de funcionamiento del método y
proporciona un alto grado de confianza en el mismo y en los resultados
obtenidos al aplicarlo; El proceso a seguir debe de estar por escrito como
procedimiento normalizado de trabajo. Actualmente la validación es un requisito
indispensable para los organismos regulatorios del país, como la Dirección
Nacional de Medicamentos, que todos los métodos analíticos para el análisis de
medicamentos estén debidamente validados y correctamente documentados.
La importancia que tiene el evaluar el comportamiento de todos los métodos
analíticos oficiales y con mayor relevancia los no oficiales, es para asegurar la
obtención datos confiables, y por consiguiente asegurar la calidad de todos los
productos farmacéuticos usados por los pacientes.
En el presente trabajo de investigación realizó la propuesta de validación del

método de cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de
cloranfenicol en el producto cloranfenicol colirio 0.25%, el cual es un producto
que actualmente no posee un método analítico validado; Se utilizaron 40
frascos de cloranfenicol colirio 0.25% de 15 mililitros cada uno. Los parámetros
evaluados: Linealidad del sistema, precisión del sistema, precisión del método,
precisión intermedia, exactitud del método, y especificidad del método
xvi
mostraron resultados satisfactorios cumpliendo las especificaciones

establecidas previamente en el protocolo de validación, obteniéndose así los
siguientes resultados: en la precisión del sistema se obtuvo un coeficiente de
variación de 0.18% para los tiempos de retención, y de 0.23% para las áreas
obtenidas; En la linealidad del sistema se obtuvo un coeficiente de
determinación de 0.9998; Para la precisión del método se obtuvo un coeficiente
de variación de las concentraciones de las muestras de 1.37% y en la precisión
intermedia fue de 1.01%, y un coeficiente de variación global entre analista 1 y
analista 2 de 0.04%. En la exactitud del método se obtuvieron los promedios de
recobro para cada uno de los niveles 80%, 100% y 120% son 98.96%, 99.44%
y 99.77 respectivamente. Finalmente en la evaluación del parámetro
selectividad del método, no se encontró ninguna interferencia significativa por
parte de la matriz del producto.
La validación del método analítico fue realizado en las instalaciones del

Laboratorio de Control de Calidad del Laboratorio Farmacéutico Nacional, en el
periodo de diciembre de 2016 a enero de 2017, tomando en cuenta el método
de valoración descrito en la USP 38 para ser utilizado dentro del laboratorio de
control de calidad del Laboratorio Farmacéutico Nacional.
CAPITULO II
OBJETIVOS
2.0 OBJETIVOS.
2.1 OBJETIVO GENERAL
Proponer la validación del método de cromatografía liquida de alta eficiencia para

la cuantificación de cloranfenicol colirio.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
5.2.1 Elaborar el protocolo de validación del método de cromatografía

líquida de alta eficiencia para la cuantificación de cloranfenicol colirio.
5.2.2 Evaluar los parámetros de desempeño del método analítico:

Linealidad del sistema, Precisión del sistema, precisión del método,
precisión intermedia, exactitud y selectividad.
5.2.3 Redactar el reporte y el certificado de validación con sus respectivos

resultados y criterios de aceptación.
5.2.4 Proporcionar toda la documentación al Laboratorio Farmacéutico

Nacional, para que se acredite el proceso de validación ante las
instituciones regulatorias.
CAPITULO III
MARCO TEORICO
20
3.0 MARCO TEORICO
3.1 CLORANFENICOL
3.1.1 Definición (5)
Este antibiótico, originalmente aislado de un actinomiceto de la tierra

(Streptomyces venezuelae), es en la actualidad un producto de síntesis
química, cuya estructura se presenta en la Figura N° 1. Se encuentra disponible
para uso oral y tópico (preparaciones oftalmológicas y dermatológicas).
Figura N° 1: Estructura de la molécula de cloranfenicol.
3.1.2 Obtención (4)
Se conoce que el cloranfenicol es el primer compuesto natural conocido que

contiene un grupo nitro o que deriva del ácido dicloroacético. Su configuración
estereoquímica es análoga a la de la (-)-norseudoefedrina y es el único de los
cuatro estereoisómeros relacionados que poseen actividad antibiótica.
Puede obtenerse del filtrado de cultivos de Streptomyces venezuelae por

extracción con acetato de etilo. Si el extracto de carbón posee abundante
21
contenido de cloranfenicol, el antibiótico puede cristalizarse del acetato de etílo

mediante dilución con muchos volúmenes de querosén. Hay varios métodos
sintéticos para la preparación de cloranfenicol. Uno de los más conocidos
comienza con p-nitroacetofenona y, después de su conversión en p-nitro-2-
aminoacetofenona, continua con los siguientes pasos: a) acetilación del grupo
–NH2: b) reacción con HCHO para introducir el grupo –CH2OH terminal; c)
reducción con isopropóxido de aluminio para obtener una mezcla racémica de
las formas treo y eritro de p-NO2PhCH(OH)CH(NH2)CH2OH; d) aislamiento de
la forma racémica treo con resolución de este compuesto mediante ácido d-
camforsulfónico y e) condensación del (-) enantiomorfo con dicloroacetato de
metilo.
3.1.3 Descripción (4)
Cristales finos en forma de agujas o láminas alargadas de color blanco a blanco

grisáceo o blanco amarillento; inodoro; sabor amargo intenso; pH (solución
saturada) entre 4.5 y 7.5; relativamente estable en soluciones neutras o
moderadamente ácidas pero se descompone con rapidez en soluciones
alcalinas; se funde entre 149 y 153 °C: pKa 5.5.
3.1.4 Solubilidad (4)
Un gramo en alrededor de 400 mL de agua; completamente soluble en alcohol;

ligeramente soluble en éter o cloroformo.
3.1.5 Indicaciones terapéuticas (4)
El cloranfenicol es un antibiótico con un amplio espectro antibacteriano. Este

agente es eficaz para el tratamiento de diferentes infecciones por ricketsias,
como los tifus epidémico, murino y de los matorrales; la fiebre manchada de las
22
montañas rocosas; la rickettosis varioliforme y la fiebre Q; infecciones por

clamidias, como psitacosis y linfogranuloma, y numerosas infecciones
provocadas por bacterias grampositivas y gramnegativas, incluidos
microorganismos anaerobios (sobre todo Bacteroides fragilis). Debido al riesgo
de manifestaciones toxicas severas, la administración de cloranfenicol por vía
sistémica debe limitarse a la terapéutica de infecciones muy graves que no
pueden tratarse con otros agentes. El cloranfenicol aun es el fármaco de
elección para el tratamiento de la fiebre tifoidea. Se utiliza en forma tópica para
el tratamiento de infecciones superficiales de la conjuntiva y la blefaritis
causada por Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Moraxella lacunata,
Staphylococcus aureus y Staphylococcus hemolyticus. El efecto toxico más
temido es la lesión de la medula ósea. Las alteraciones hemáticas más graves
asociadas con el fármaco son trombocitopenia, granulocitopenia y anemia
aplásica, y estos trastornos fueron responsables de varios desenlaces fatales.
3.1.6 Efectos tóxicos (4)
En los neonatos el cloranfenicol puede provocar el síndrome gris, una cianosis

que a veces es fatal (el 40% de los casos) asociada con vómitos distención
abdominal y deposiciones blandas de color verde, que se debe a la incapacidad
de metabolizar la droga por falta de la enzima glucoronil transferasa. En un
pequeño subgrupo de pacientes (sobre todo en niños que reciben tratamiento
prolongado) induce atrofia óptica y ceguera.
El cloranfenicol también se asoció con algunos efectos indeseables de menor
envergadura, como euforia leve transitoria, rash y trastornos gastrointestinales;
Esta contraindicado en pacientes con antecedentes de sensibilización al
fármaco.
23
3.2 PREPARACIONES OFTÁLMICAS (2)
Las soluciones oftálmicas son preparaciones estériles, libres de partículas

extrañas, que contienen uno o más fármacos disueltos generalmente en agua y
cuya finalidad en la aplicación tópica en los ojos, estable química y
biológicamente y no irritante a la córnea. Es importante considerar la toxicidad
del fármaco, la isotonicidad, la elección de los agentes amortiguadores y
conservadores, la esterilización y envase apropiado.
3.2.2 Isotonicidad de las soluciones oftálmicas (2)
Las soluciones oftálmicas deben ser isotónicas, viscosas, estériles y de

preferencia tener un pH cercano al del líquido lagrimal entre 7.0 y 7.4.
La isotonicidad se logra agregando cloruro de sodio u otra sal en caso de existir
compatibilidad. El líquido lagrimal tiene un valor de isotonicidad que
corresponde a una solución al 0.9 por ciento de cloruro de sodio, idealmente
una solución oftálmica deberá tener ese mismo valor de isotonicidad. Los
márgenes considerados como no irritantes para el ojo, van de 0.6 a 0.2 por
ciento de cloruro de sodio.
Algunas soluciones oftálmicas son necesariamente hipertónicas para favorecer

la absorción y proveer una adecuada concentración de ingredientes activos
para una acción terapéutica efectiva.
3.2.3 Viscosidad de las soluciones oftálmicas (2)
El aumentar la viscosidad de las soluciones, reduce la posibilidad de que el

fármaco sea eliminado por el lagrimeo y por lo tanto aumenta el tiempo de
24
contacto del fármaco con la córnea, aumentando el efecto terapéutico del

producto.
Los derivados de la celulosa; metilcelulosa, carboximetilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, en concentraciones que van desde 0.25 a 1.0 por
ciento son los agentes viscosantes comúnmente usados.
Existen otras sustancias que pueden ser adicionadas a las soluciones

oftálmicas como el etilendiaminoacetato disódico, utilizado como secuestrante
de iones y el polisorbato como tensioactivo para favorecer la solubilidad de
ciertos principios activos.
3.2.4 Esterilidad (2)

La esterilidad es primordial para no agregar al ojo enfermo una nueva lesión
como sería una posible infección producida por una solución oftálmica
contaminada. Lo ideal sería elaborar soluciones oftálmicas estériles en frascos
monodosis pero dados los problemas que esto acarrearía en el
acondicionamiento y el elevado costo de elaboración, las preparaciones se
presentan en el mercado como multidosis y en este caso es imprescindible,
para asegurar su esterilidad durante todo el periodo de su vida útil, el agregar
conservadores.
3.2.5 pH (2)
Para lograr un pH adecuado, en algunos casos se agregan algunas sustancias

amortiguadoras como el acetato de sodio y ácido bórico que son soluciones
isotónicas con capacidad amortiguadora mayor que la de los fosfatos y que
además disminuye notablemente la irritación. Las soluciones Sorensen, son
también utilizadas como vehículos en las soluciones oftálmicas, siendo éstas
una combinación de sales de fosfatos monosódico y disódico, que se hacen
isotónicas al agregar cloruro de sodio.
25
3.2.6 Conservadores (2)
Los conservadores no deben ser irritantes, ni toxicas al tejido ocular, a pesar de

un uso prolongado, deben ser compatibles con los demás componentes de la
formula y tener una alta actividad bactericida frente un amplio espectro de
microorganismos, y no deben interferir con los análisis propuestos.
3.3 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTO DESEMPEÑO (3)
El termino cromatografía líquida, según se usa en los compendios, es sinónimo

de cromatografía liquida de alta presión y de cromatografía líquida de alta
resolución. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada
en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida.
3.3.2 Fase estacionaria (3)
Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio

iónico, según el tipo de fase estacionaria usada. Las fases estacionarias más
comúnmente usadas son las de sílice modificada o las microperlas de polímero.
Las microperlas se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo
de relleno especifico necesario para completar un análisis se indica mediante la
designación “L” en la monografía individual. A menudo, el tamaño de las
microperlas también se escribe en la monografía.
3.3.3 Columna cromatográfica (3)
El termino columna incluye columnas de acero inoxidable con recubrimiento

interno y poliméricas, rellenas con una fase estacionaria. La longitud y el
diámetro interno de la columna afectan la separación y por lo tanto, las
dimensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Las
26
monografías farmacopéicas no incluyen el nombre comercial de las columnas

apropiadas; esta omisión evita la interpretación de cualquier tipo de respaldo
para un producto de un proveedor y permite la adaptación a cambios normales
en el mercado.
En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre

que se cumplan los siguientes requisitos, a menos que se indique algo diferente
en la monografía individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no
mayor de 15% de la longitud de la columna analítica, (b) el diámetro interno
debe ser igual o menor que el de la columna analítica y (c) el material de relleno
debe ser el mismo que en la columna analítica (p.ej., sílice) y contener la misma
fase ligada (p.ej., C18). En todo caso se deben cumplir los requisitos de aptitud
del sistema especificados en el procedimiento oficial con la guarda columna
instalada.
3.3.4 Fase móvil (3)
La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la

monografía individual.
3.3.5 Equipo HPLC (3)
Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil,

una bomba para forzar el paso de la fase móvil a través del sistema a alta
presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna
cromatográfica, un detector y un dispositivo de recolección de datos, tal como
se ejemplifica en la Figura N° 2.
27
Figura 2: Diagrama de flujo de un cromatógrafo líquido

de alto desempeño
3.3.6 Elución en gradiente (3)
Se denomina elución en gradiente o programación del disolvente a la técnica de

cambiar continuamente a la composición del disolvente durante la
cromatografía. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monografía
individual como una tabla de gradientes, que se indica el tiempo y la
composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado.
3.3.7 Procedimiento general de uso (3)
a. Equilibrar la columna y el detector con la fase móvil a la velocidad de

flujo especificada hasta obtener una señal constante.
b. Inyectar una muestra a través del inyector o usar un muestreador
automático.
c. Comenzar el programa de gradientes.
d. Registrar el cromatograma.
e. Analizar según se indica en la monografía.
28
3.4 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS (3)
La validación es un procedimiento analítico que establece, mediante estudios

en laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento
cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas. Las
características de desempeño analítico habituales que deben considerarse en la
validación de los tipos de procedimientos descritos, se indican en la tabla 1.
Dado que las opiniones pueden diferir respecto a la terminología y al uso, cada
una de las características de desempeño se definirá posteriormente en el
presente trabajo. Las definiciones hacen referencia a “resultados de las
pruebas”. La descripción del procedimiento analítico debe definir cuáles son los
resultados de las pruebas para el procedimiento. De acuerdo con ISO 5725-1 Y
3534-1, un resultado de una prueba es “el valor de una característica que se
obtiene al llevar a cabo un método de prueba específico. El método de prueba
debería especificar que debe realizarse una o varias mediciones individuales, y
que su promedio, u otra función apropiada (tal como la mediana o la desviación
estándar), debe informarse como el resultado de la prueba. Asimismo, puede
requerir que se apliquen correcciones estándar tales como corrección de los
volúmenes de gas a temperatura y presión estándar. Por consiguiente, un
resultado de una prueba puede ser un resultado calculado a partir de diversos
valores observados. En el caso más simple, el resultado de una prueba es en si
el valor observado. Aunque no necesariamente, un resultado de una prueba
también puede ser el valor final informable que se compararía con los criterios
de aceptación de una especificación. La validación de métodos de propiedades
físicas puede implicar la evaluación de modelos quimiométricos. No obstante,
las características analíticas típicas usadas en la validación de métodos se
pueden aplicar a los métodos derivados del uso de modelos quimiométricos.
29
Cuadro N° 1: Características analíticas típicas utilizadas para la validación de

métodos
Características de desempeño analítico.
Exactitud
Precisión
Especificidad
Límite de detección
Límite de cuantificación
Linealidad
Intervalo
Robustez
Los efectos de las condiciones de procesamiento y el potencial de segregación

de materiales deben considerarse durante la obtención de una muestra
representativa que se usara en la validación de procedimientos.
En el caso de procedimientos farmacopéicos, puede resultar necesaria una

nueva validación en las siguientes circunstancias: una presentación a la USP de
un procedimiento analítico revisado o utilización de un procedimiento general
establecido con un nuevo producto o materia prima (ver más adelante en datos
requeridos para la validación).
Los documentos de ICH aconsejan sobre la necesidad de realizar una nueva

validación en las siguientes circunstancias:
-Cambio en la síntesis del fármaco
-Cambios en la composición del producto farmacéutico
-Cambios en el procedimiento analítico.
La validación de procedimientos farmacopéicos puede involucrar algunas o

todas las características típicas sugeridas que se usan en la validación de
métodos según se especifica en el Cuadro N° 1 y se categorizan más adelante
por tipo de método analítico en el Cuadro N° 5.
30
3.5 ESTABLECIMIENTO DEL ALCANCE DE LA VALIDACIÓN (6)
Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validación aumenta del

primero al tercero:
1. Se trata de un método de ensayo estandarizado y normalizado, que se

aplica exactamente como está descrito en la norma/procedimiento.
2. Se trata de una modificación a un método de ensayo normalizado o cuando
se use un método proporcionado por el proveedor de un equipo o sistema
analítico.
3. Se trata de un método de ensayo desarrollado en el laboratorio y que no se
encuentra en normas u otras colecciones de métodos.
A continuación se describe los requerimientos para cada uno de los casos

descritos anteriormente.
Cuadro N° 2: Alcance de la validación para métodos analíticos normalizados.
Cuantificación
Cuantificación de
Evaluación de
de componentes
Parámetro Identificación características
componentes minoritarios o
establecidas*
mayoritarios impurezas en
trazas
Selectividad/especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la + + + +
muestra
Linealidad del sistema No Sí Sí +
Linealidad del método No + + +
Rango No + + +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de detección + No No No
Límite de cuantificación No + + +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del análisis.
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (Ej.: disolución).
31
Cuadro N° 3: Alcance de la validación para métodos analíticos no normalizados.
Cuantificación
Cuantificación de
Evaluación de
de componentes
establecidas*
trazas
Selectividad/especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la + + + +
muestra
Linealidad del método No Sí Sí +
Rango No Sí Sí +
Límite de detección + No No No
Límite de cuantificación No + Sí +
Robustez + + + +
Cuadro N° 4: Alcance de la validación para métodos analíticos desarrollados.
Cuantificación
Cuantificación de
Evaluación de
de componentes
establecidas*
trazas
Selectividad/especificidad Sí Sí Sí +
Estabilidad analítica de la Sí Sí Sí +
muestra
Linealidad del método No Sí Sí +
Rango No Sí Sí +
Límite de detección Sí No + No
Límite de cuantificación No + Sí +
Robustez + Sí Sí +
32
3.6 CARACTERISTICAS DE DESEMPEÑO ANALITICO (3)
3.6.1 Exactitud (3)
La exactitud es un procedimiento analítico es la proximidad entre los resultados

de la prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor verdadero. La
exactitud de un procedimiento analítico debe establecerse en todo su intervalo.
En la valoración de un fármaco la exactitud puede determinarse mediante la

aplicación del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza
conocido (ej: estándar de referencia), o comparando los resultados del
procedimiento con los de un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya
exactitud se haya comprobado o definido.
En la valoración de un fármaco de un producto formulado la exactitud puede

determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas
sintéticas de los componentes del producto farmacéutico al que se hayan
añadido cantidades conocidas del analíto dentro del intervalo del procedimiento.
Si no resulta posible obtener muestras de todos los componentes del producto
farmacéutico, se pueden aceptar tanto el agregado de cantidades conocidas del
analíto al producto farmacéutico como la comparación de resultados con los de
un segundo procedimiento bien caracterizado cuya exactitud haya sido
comprobada o definida.
La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad

valorada con respecto a la cantidad conocida de analíto añadida a la muestra, o
como la diferencia entre la media de la valoración y el valor verdadero
aceptado, considerando los intervalos de confianza.
Los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH) recomiendan

que se evalué la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones
sobre un mínimo de tres niveles de concentración, cubriendo el intervalo
33
especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de

cada concentración).
La evaluación de la exactitud puede efectuarse de varias maneras, incluyendo

la evaluación de la recuperación del analíto (porcentaje de recuperación) en
todo el intervalo de la valoración, o evaluando la linealidad de la relación entre
las concentraciones estimadas y las reales. El criterio estadístico de preferencia
es que el intervalo de confianza para la pendiente sea cercano a 1. En ambos
casos el intervalo o la definición de cercanía deberá especificarse en el
protocolo de validación. El criterio de aceptación dependerá de la valoración, de
su variabilidad, y del producto. La exactitud de los métodos de propiedades
físicas se puede evaluar a través del análisis de materiales de referencia
estándar o, alternativamente, se puede considerar la aptitud de las
metodologías mencionadas anteriormente para cada caso en particular.
3.6.2 Precisión (3)
La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre

los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento
repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. La precisión
de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la desviación
estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La
precisión puede ser una medida del grado de reproductibilidad o de repetibilidad
del procedimiento analítico en condiciones normales de operación. En este
contexto, la reproducibilidad se refiere al uso del procedimiento analítico en
diferentes laboratorios, como por ejemplo en un estudio en colaboración. La
precisión intermedia (también conocida como tolerancia o fortaleza) expresa la
variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes días, con
diferentes analistas o con equipos diferentes dentro del mismo laboratorio.
34
La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento analítico en un

laboratorio durante un periodo corto por el mismo analista con el mismo equipo.
La precisión de un procedimiento analítico se determina mediante el análisis de

un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea que permita
calcular estadísticamente estimaciones validas de la desviación estándar o de
la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). Los análisis en este
contexto son análisis independientes de muestras que se han llevado a cabo
mediante el procedimiento analítico completo, desde la preparación de las
muestras hasta el resultado final de las pruebas.
Los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH) recomiendan

que se evalué la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones
que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres
concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o
usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de
prueba.
3.6.3 Especificidad (3)
Los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH) definen la

especificidad como la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analíto en
presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, tales
como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. La
falta de especificidad de un procedimiento analítico individual puede
compensarse usando otros procedimientos analíticos complementarios. (Nota:
otras autoridades internacionales de reconocido prestigio como La Unión
Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) y La Asociación de las
Comunidades Analíticas (AOAC) han preferido el término “selectividad”,
reservando “especificidad” para procedimientos que resulten completamente
35
selectivos). Para las pruebas que se indican a continuación, la definición

anterior tiene las siguientes implicancias:
- Pruebas de identificación: garantizan la identidad del analíto.

- Pruebas de pureza: garantizan que todos los procedimientos analíticos
efectuados permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un
analíto (por ejemplo, pruebas de sustancias relacionadas, límite de metales
pesados, impurezas orgánicas volátiles).
- Valoraciones: proporcionan un resultado exacto, que permite una declaración
exacta del contenido o potencia del analíto en una muestra.
En análisis cualitativos (Pruebas de identificación), debe demostrarse la

capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada
cuya presencia resulta probable. Esta capacidad debería confirmarse mediante
la obtención de resultados positivos a partir de muestras que contengan el
analíto (quizás mediante comparación con un material de referencia conocido),
junto con resultados negativos de muestras que no contengan dicho analíto, y
mediante la confirmación de que no se obtiene una respuesta positiva de
materiales con estructura similar o estrechamente relacionada a la del analíto.
En una valoración, la demostración de especificidad requiere evidencia de que

el procedimiento no resulta afectado por la presencia de impurezas o
excipientes. En la práctica, esto no puede hacerse agregando al fármaco o
producto farmacéutico una cantidad conocida de excipientes o de impurezas en
concentraciones adecuadas, y demostrando que el resultado del análisis no
resulta afectado por la presencia de estos materiales extraños.
Los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH) afirman que

cuando se utilizan procedimientos comatográficos, deberán presentarse
cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad y los
picos deberán identificarse adecuadamente. Las pruebas de purezas de picos
36
(ej: utilizando arreglo de diodos o espectrometría de masas) pueden resultar

útiles para demostrar que el pico cromatográfico del analíto no puede atribuirse
a más que un solo componente.
3.6.4 Límite de detección (3)
El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la

cantidad mínima de analíto que puede detectarse en una muestra, aunque no
necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las
pruebas de límite simplemente comprueban que la cantidad de analíto se
encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. El límite de
detección se expresa habitualmente como concentración de analíto (Ej:
porcentaje, partes por billón.) en la muestra.
Para procedimientos no instrumentales, el límite de detección se determina
generalmente mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas
de analíto, estableciendo el nivel mínimo del analíto que puede detectarse
confiablemente.
Para procedimientos instrumentales se puede utilizar el mismo enfoque que

para procedimientos no instrumentales. En el caso de procedimientos
presentados para su consideración como procedimientos farmacopéicos
oficiales, casi nunca es necesario determinar el límite de detección real. Más
bien, debe demostrarse que el límite de detección es lo suficientemente bajo
mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analíto
superiores o inferiores al nivel de detección requerido. Por ejemplo, si se
requiere detectar una impureza con una concentración del 0.1%, debería
demostrarse que el procedimiento detectara de modo confiable la impureza a
esa concentración.
En el caso de procedimientos analíticos instrumentales que presentan un ruido

de fondo, los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH)
37
describen un enfoque usual, que consiste en comparar las señales medidas a

partir de muestras con bajas concentraciones conocidas de analíto las de
muestra blanco. Se establece la concentración mínima a la que puede
detectarse confiablemente un analíto. Las relaciones señal-ruido habitualmente
aceptables son de 2:1 ó 3:1. Otros enfoques dependen de la determinación de
la pendiente de la curva de calibración y la desviación estándar de las
respuestas. Independientemente del método utilizado, el límite de detección
debería validarse posteriormente mediante el análisis de un número adecuado
de muestras preparadas al límite de detección o que se sabe que están cerca
de dicho límite.
3.6.5 Límite de cuantificación (3)
El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones cuantitativas

de compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una
muestra, tales como impurezas de fármacos a granel y productos de
degradación en productos farmacéuticos terminados. Es la mínima cantidad de
analíto en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud
aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El límite de
cuantificación se expresa habitualmente como concentración de analíto (Ej:
porcentaje, partes por billón.) en la muestra.
Para procedimientos no instrumentales, el límite de cuantificación se determina
habitualmente mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas
de analito, estableciendo el nivel mínimo del analito que se puede determinar
con exactitud y precisión aceptables.
Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo enfoque que

para procedimientos no instrumentales. En el caso de procedimientos
presentados para su consideración como procedimientos farmacopeicos
oficiales, casi nunca resulta necesario determinar el límite de cuantificación real.
Más bien debe demostrarse que el límite de cuantificación es lo suficientemente
38
bajo mediante el análisis de muestras con concentraciones conocidas de analito

superiores e inferiores al nivel de cuantificación. Por ejemplo, si se requiere
analizar un analíto a una concentración de 0,1 mg por tableta, debería
demostrarse que el procedimiento cuantificará de modo confiable el analíto a
esa concentración.
En el caso de procedimientos analíticos instrumentales que presentan ruido de

fondo, los documentos del Consejo Internacional de Armonización (ICH)
describen un enfoque común, que consiste en comparar las señales medidas a
partir de muestras con bajas concentraciones conocidas de analíto con las de
muestras blanco. Se establece la concentración mínima a la que pueda
cuantificarse confiablemente un analíto. Una relación señal-ruido habitualmente
aceptable es de 10:1. Otros enfoques dependen de la determinación de la
pendiente de la curva de calibración y la desviación estándar de las
respuestas. Independientemente del enfoque utilizado, el límite de
cuantificación deberá validarse posteriormente mediante el análisis de un
número adecuado de muestras que se sepa que están cerca del límite de
cuantificación o fueron preparadas al límite de cuantificación.
3.6.6 Linealidad e intervalo (3)
La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener

resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por
medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de
analíto en muestras dentro de un intervalo dado. En esta sección, la “linealidad”
se refiere a la linealidad de la relación entre la concentración y la medida de
valoración. En algunos casos, para lograr la linealidad, puede ser necesario
transformar la concentración y/o la medida. (Notar que los factores de
corrección usados en el análisis de regresión puede cambiar cuando se aplica
la transformación.) Las transformaciones posibles pueden incluir el logaritmo, la
raíz cuadrada, o el recíproco, aunque otras transformaciones son aceptables. Si
39
no se puede lograr la linealidad se puede utilizar un modelo no lineal. El

objetivo es obtener un modelo que describa con precisión la relación de
concentración en función de la respuesta, ya sea lineal o no lineal.
El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre las
concentraciones inferior y superior del analíto (incluyendo estos niveles) en la
cual se puede determinar al analíto con un nivel adecuado de precisión,
exactitud y linealidad utilizando el procedimiento según se describe por escrito.
El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados
de la prueba (ej.: porcentaje, partes por millón) obtenidos mediante el
procedimiento analítico.
La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento

analítico. Debería establecerse inicialmente mediante examen visual de un
gráfico de señales en función de la concentración del analíto contenido. Si
parece existir una relación lineal, los resultados de la prueba deberían
establecerse mediante métodos estadísticos adecuados (ej.: mediante el
cálculo de una línea de regresión por el método de los cuadrados mínimos). Los
datos obtenidos a partir de la línea de regresión pueden ser útiles para
proporcionar estimaciones matemáticas del grado de linealidad. Se deberían
presentar el coeficiente de correlación, la intersección con el eje de ordenadas,
la pendiente de la línea de regresión y la suma de los cuadrados residuales.
El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento

analítico proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se
aplica a muestras que contienen el analíto en los extremos del intervalo, al igual
que dentro del intervalo.
El Consejo Internacional de Armonización (ICH) recomienda que, para

establecer la linealidad, se utilicen normalmente un mínimo de cinco
concentraciones. También recomienda que se consideren los intervalos
especificados mínimos que se indican a continuación:
40
- Valoración de un fármaco (o de un producto terminado): de 80% a 120% de

la concentración de prueba.
- Determinación de una impureza: de 50% a 120% del criterio de aceptación.
- Para uniformidad del contenido: un mínimo de 70% a 130% de la
concentración de prueba, a no ser que se justifique un intervalo más amplio o
más apropiado, basándose en la naturaleza de la forma farmacéutica (ej.:
inhaladores de dosis fija).
- Para pruebas de disolución: ±20% por encima del intervalo especificado (ej.:
Si los criterios de aceptación de un producto de liberación controlada cubren
una región de 30% después de una hora, y hasta 90% después de 24 horas,
el intervalo valido sería de 10% a 110% de la cantidad declarada).
La definición tradicional de linealidad, es decir, el establecimiento de una

relación lineal o matemática entre la concentración de la muestra y la respuesta,
no es aplicable al análisis del tamaño de partícula. Para el análisis de tamaño
de partícula, se define un intervalo de concentración (que depende del
instrumento y del tamaño de partícula) tal que la distribución de tamaño de
partícula medida no se vea afectada por cambios en la concentración dentro del
intervalo de concentración definido. Las concentraciones por debajo del
intervalo de concentración definido pueden introducir un error debido a una
pobre relación señal-ruido, mientras que las concentraciones que exceden el
intervalo de concentración definido puede introducir un error debido a
dispersiones múltiples.
3.6.7 Robustez (3)
La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para

no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los
parámetros del procedimiento indicados en la documentación, y provee una
indicación de su aptitud durante condiciones normales de uso. La robustez
puede determinarse durante la etapa de desarrollo del procedimiento analítico.
41
3.6.8 Aptitud del sistema (3)

Si las mediciones son susceptibles a variaciones en las condiciones analíticas,
estas deben controlarse adecuadamente o debe incluirse una advertencia en el
procedimiento. Una consecuencia de la evaluación de la tolerancia y la robustez
debería ser que se establezca una serie de parámetros de aptitud del sistema
para asegurar que la validez del procedimiento analítico se mantiene cada vez
que se usa. Variaciones típicas son la estabilidad de soluciones analíticas,
diferentes equipos y diferentes analistas. En la cromatografía de líquidos, las
variaciones habituales son el pH de la fase móvil, la composición de la fase
móvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad
de flujo. En el caso de cromatografía de gases, son variaciones típicas los
diferentes lotes o proveedores de columnas la temperatura y la velocidad de
flujo. Las pruebas de aptitud del sistema se basan en el concepto de que el
equipo, el sistema electrónico, las operaciones analíticas y las muestras a
analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal. Los
parámetros de prueba de la aptitud del sistema que deben establecerse para un
procedimiento específico dependen del tipo de procedimiento que se está
evaluando. Son especialmente importantes en el caso de procedimientos
cromatográficos.
3.7 DATOS REQUERIDOS PARA LA VALIDACIÓN (3)
Los requisitos de las pruebas farmacopéicas varían desde determinaciones

analíticas muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos.
Considerando esta amplia variedad, es lógico que diferentes procedimientos de
prueba requieran diferentes esquemas de validación.
En el presente trabajo se cubrirán solo las categorías de prueba más habituales

para las que se exigen datos de validación. Estas categorías, según la
Farmacopea de los Estados Unidos son las siguientes:
42
- Categoría I: procedimientos analíticos para la cuantificación de los

componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos
(incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.
- Categoría II: procedimiento analíticos para la determinación de impurezas en

fármacos a granel o productos de degradación de productos farmacéuticos
terminados. Estos procedimientos incluyen análisis cuantitativos y pruebas
límite.
- Categoría III: procedimientos analíticos para la determinación de

características de desempeño (Ej.: disolución, liberación de fármacos).
- Categoría IV: pruebas de identificación
Para cada categoría, se requiere diferente información analítica. En el Cuadro

N° 5 se indican los datos que normalmente se requieren para cada una de las
siguientes categorías.
La validez de un procedimiento analítico puede verificarse solo mediante

estudios de laboratorio. Por lo tanto, la documentación de la conclusión exitosa
de dichos estudios constituye un requisito básico para determinar si un
procedimiento es adecuado para sus aplicaciones previstas. Los
procedimientos farmacopéicos oficiales también están sujetos a reglamentos
que requieren la demostración de aptitud en las condiciones reales de uso.
Cualquier propuesta de procedimientos farmacopéicos analíticos nuevos o
revisados deben ir acompañados de la documentación adecuada.
43
Cuadro N° 5: Datos requeridos para la validación.
Características Categoría II
de desempeño Categoría I Categoría III Categoría IV
Análisis Pruebas
analítico.
cuantitativos límite.
Exactitud Si Si * * No
Precisión Si Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Límite de No No Si * No
detección
Límite de No Si No * No
cuantificación
Linealidad Si Si No * No
Intervalo Si Si * * No
*Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica.
3.8 VERIFICACION DE PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS (3)
La intención de la verificación de procedimientos farmacopéicos es proporcionar

información general sobre la verificación de procedimientos farmacopéicos que
se llevan a cabo por primera vez para lograr resultados aceptables con el
personal, equipo y reactivos disponibles. De acuerdo a la validación de
procedimientos farmacopéicos, tema el cual proporciona información general
sobre las características que deben considerarse para las distintas categorías
de pruebas así como también la documentación que debe acompañar a los
procedimientos analíticos presentados. La verificación consiste en la evaluación
de las características de desempeño analíticas seleccionadas, como las que se
describen en la validación de procedimientos farmacopéicos, para generar
datos relevantes y adecuados en vez de repetir el proceso de validación.
Los usuarios de los procedimientos analíticos farmacopéicos no necesitan

validar estos procedimientos cuando los usan por primera vez en sus
44
laboratorios, aunque deben establecer evidencias documentadas de aptitud en

las condiciones de uso reales. En los Estados Unidos, se estableció este
requisito en las reglamentaciones de buenas prácticas de fabricación vigentes,
que declara que “se verificará la aptitud de todos los métodos de prueba usados
bajo las condiciones de uso reales.”
3.8.1 Proceso de verificación (3)
El proceso de verificación de procedimientos de prueba farmacopéicos es la

evaluación que sirve para determinar si el procedimiento puede ser utilizado
para su propósito previsto, en las condiciones de uso reales para un fármaco
específico y/o matriz de un producto farmacéutico determinado.
Los usuarios deben contar con la experiencia, conocimiento y capacitación
adecuadas para entender y estar en condiciones de llevar a cabo los
procedimientos farmacopéicos, tal como fueron escritos. El usuario debe
realizar la verificación de manera que los resultados proporcionen suficiente
confianza de que el procedimiento farmacopéico será llevado a cabo con la
aptitud requerida.
Si la verificación del procedimiento farmacopéico no es exitosa y la asistencia

del personal de la USP no logra solucionar el problema, se puede concluir que
posiblemente el procedimiento no sea apto para usar con el artículo que se está
evaluando en el laboratorio. Quizás se requiera desarrollar y validar un
procedimiento alternativo, según lo permitan las advertencias generales. Se
puede enviar el procedimiento alternativo a la USP, conjuntamente con los
datos adecuados, en apoyo de una propuesta para la inclusión o reemplazo del
procedimiento farmacopéico vigente.
45
3.8.2 Requisitos de verificación (3)
Los requisitos de verificación deben basarse en la evaluación de la complejidad

tanto del procedimiento como del material al que se aplica el procedimiento. Si
bien para verificar la aptitud de un procedimiento en las condiciones de uso
reales no se requiere la revalidación completa del método farmacopéico, para el
proceso de verificación se pueden usar algunas de las características de
desempeño analítico que se enumeran en el capítulo de validación de
procedimientos farmacopéicos, Cuadro N° 5. Solo hay que evaluar las
características que se consideran adecuadas para la verificación del
procedimiento específico. El proceso mediante el cual se evalúa la aptitud de un
procedimiento de prueba analítico farmacopéico puede requerir o no la
ejecución, en condiciones reales, del procedimiento para cada una de las
características de desempeño analítico. El grado y extensión del proceso de
verificación puede depender del nivel de formación y experiencia del usuario,
del tipo de procedimiento y los equipos o instrumentos asociados, los pasos
específicos del procedimiento y el artículo en análisis.
La verificación debe evaluar si el procedimiento farmacopéico es apto para el

fármaco y/o la matriz del producto farmacéutico, teniendo en cuenta la ruta de
síntesis del fármaco, el método de fabricación del producto farmacéutico o
ambos, cuando corresponda. En la verificación se deben evaluar diversos
elementos, tales como el efecto de la matriz sobre la recuperación de
impurezas y fármacos desde la matriz de producto farmacéutico, la aptitud de
las columnas y condiciones cromatográficas, y la adecuada respuesta de la
señal del detector, entre otros.
Como ejemplo, la evaluación de especificidad es un parámetro clave en la

verificación de que un procedimiento farmacopéico es apto para usar en la
valoración de fármacos y productos farmacéuticos. Por ejemplo se puede
verificar la especificidad aceptable para un método cromatográfico por
46
conformidad con los requisitos de resolución de aptitud del sistema (si se

especifican en el procedimiento). Sin embargo los fármacos de proveedores
distintos pueden tener perfiles de impurezas diferentes que no son
considerados por el procedimiento de prueba farmacopéico. De igual manera,
los excipientes en un producto farmacéutico pueden variar ampliamente entre
los fabricantes y tener el potencial para interferir en forma directa con el
procedimiento o causar la formación de impurezas no consideradas en el
procedimiento farmacopéico. Además, los productos farmacéuticos que
contengan diferentes excipientes, antioxidantes, amortiguadores o material
extraíble del envase, pueden afectar la recuperación del fármaco a partir de la
matriz. En estos casos, puede requerirse una evaluación más profunda de los
efectos de la matriz para demostrar la aptitud del procedimiento para el fármaco
o producto farmacéutico específico. Otras características de desempeño
analítico, como la evaluación del límite de detección o cuantificación y precisión
del procedimiento para impurezas pueden ser muy útiles para demostrar la
aptitud del procedimiento farmacopéico en las condiciones de uso reales.
3.9 DOCUMENTACIÓN (1)
Las actividades de la validación de un método analítico deben ser sustentadas

por los siguientes documentos: Protocolo, reporte y certificado;
a) Protocolo:
1. Titulo
2. Propósito u Objetivo.
3. Responsabilidades.
4. Plan de prueba describiendo los parámetros de desempeño que
permitan verificar la aplicación analítica deseada.
5. Criterios de aceptación para cada parámetro.
6. Formato de registro de resultados.
47
b) Reporte:
1. Título.
2. Resultados.
3. Análisis de resultados.
4. Confrontación contra los criterios de aceptación.
5. Conclusión.
c) Certificado:
1. Resumen del protocolo de validación.
2. Responsables.
3. Resumen de los resultados obtenidos.
4. Conclusiones.
5. Dictamen.
La documentación deberá estar ordenada y disponible, en responsabilidad del

área de calidad.
48
CAPITULO IV
DISEÑO METODOLOGICO
49
IV. DISEÑO METODOLÓGICO.
4.1 TIPO DE ESTUDIO
Prospectivo: Los resultados obtenidos se podrán utilizar para estudios

futuros, podrá servir como una guía para la validación de
métodos analíticos similares o para su adaptación a otros
métodos diferentes (Ultravioleta-visible, infrarrojo etc.)
Exploratorio: Porque se pretende presentar una posible solución a la
problemática presentada.
Experimental: Porque se realizan ensayos en el laboratorio de control de
calidad del Laboratorio Farmacéutico Nacional para la
obtención de datos y posteriormente darles tratamiento
estadístico.
4.2 INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA.
La investigación bibliográfica se llevó a cabo en las siguientes bibliotecas:
- Dr. Benjamín Orozco, Facultad de Química y Farmacia, Universidad de
El Salvador.
- Universidad Salvadoreña Alberto Masferrer.
- Laboratorio Farmacéutico Nacional, San Salvador.
- Internet.
50
4.3 PARTE EXPERIMENTAL
De acuerdo a la investigación bibliográfica realizada, y tomando en cuenta que

el método analítico a validar es farmacopéico y de acuerdo a lo estipulado en el
alcance de la validación para métodos normalizados descrito en este trabajo,
así como también en el apartado de la Farmacopea de los Estados Unidos 38,
verificación de procedimientos farmacopéicos, y considerando que el equipo
HPLC se encuentra calibrado y calificado, se determinó que los parámetros de
validación a evaluar para el método de cromatografía liquida de alta eficiencia
para la cuantificación de cloranfenicol colirio 0.25% son: Linealidad del sistema,
Precisión del sistema, Precisión del método, Precisión intermedia, Exactitud del
método y Selectividad del método; Para lo cual se utilizaron 40 frascos con
capacidad de 15 mL cada uno, los cuales fueron proporcionados por la bodega
de producto terminado del Laboratorio Farmacéutico Nacional.
4.3.1 Linealidad del sistema. (3)
La linealidad se refiere a la relación lineal, entre la concentración y la medida de

la valoración; Se realiza preparando 5 niveles de concentración por triplicado
con sustancia de referencia (Estándar), por dilución a partir de una solución
concentrada. Se Incluye el intervalo de especificación para el producto, que
para el caso es del 90.0% al 110.0%.
Procedimiento:
- Preparar por triplicado una solución madre de estándar de cloranfenicol

base con una concentración de 1.0 mg/mL en fase móvil.
- A partir de esta solución preparar por triplicado 5 niveles de concentración
correspondiente a 80%, 90%, 100%, 110%, y 120% de la concentración
51
teórica, según el siguiente cuadro. Ver anexo N°1, preparación de

soluciones para linealidad.
Cuadro N° 6. Niveles de concentración con su respectiva

concentración final.
Nivel de Concentración final Concentración final
concentración Cloranfenicol (µg/mL) Cloranfenicol(mg/mL)
80% 80 µg/mL 0.08 mg/mL
90% 90 µg/mL 0.09 mg/mL
100% 100 µg/mL 0.10 mg/mL
110% 110 µg/mL 0.11 mg/mL
120% 120 µg/mL 0.12 mg/mL
- Realizar de acuerdo al método de análisis, una determinación de cada

solución de estándar para cada una de las 3 series, de acuerdo a la
siguiente secuencia, solución al 80%, 90%, 100%, 110% y 120%. Ver anexo
N° 3, método de análisis.
Cálculos:
- Calcular el valor de la pendiente (b1), la ordenada en el origen (b0), el
coeficiente de determinación (r2) y el intervalo de confianza para la
pendiente (IC(b1)). Para todos los cálculos se utilizar la herramienta de hoja
de cálculo. Ver anexo N° 11, Formulas generales de cálculo.
Especificación:
- r2 ≥ 0.98
- IC (b1) no debe de incluir el cero.
52
4.3.2 Precisión del sistema. (3)
Evaluar el grado de dispersión obtenida al aplicar el método a una preparación

de una solución de estándar al 100% sin tratamiento adicional y realizar 6
inyecciones consecutivas.
Procedimiento:
- Preparar una solución del estándar de cloranfenicol con una concentración

final de 100 µg/mL equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver
anexo N°1, preparación de estándar al 100%.
- Realizar de acuerdo al método de análisis, 6 inyecciones consecutivas de 10
microlitros, de la misma solución de estándar al 100%. Ver anexo N° 3,
método de análisis.
Cálculos:
- Evaluar su dispersión calculando el coeficiente de variación de los tiempos

de retención y coeficiente de variación de las áreas obtenidas del pico de
cloranfenicol base. Para todos los cálculos utilizar la herramienta de hoja de
cálculo. Ver anexo N° 11, Formulas generales de cálculo.
Especificación:
- CV ≤ 2.0% para respuestas analíticas
- CV ≤ 1.0% para tiempos de retención.
53
4.3.3 Precisión del método. (3)
La precisión de un método analítico es el grado de concordancia de los

resultados de la prueba, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a
múltiples tomas de una muestra homogénea. La precisión de un procedimiento
analítico generalmente se expresa como la desviación estándar relativa
(coeficiente de variación) de una serie de mediciones. Realizar las
determinaciones con 6 soluciones de estándar y 6 soluciones de prueba.
Procedimiento:
- Preparar una serie de 6 soluciones de estándar de cloranfenicol con una

concentración final de 100 µg/mL equivalente al 100% de la concentración
teórica. Ver anexo N°1, preparación de estándar al 100%.
- Preparar una serie de 6 soluciones de prueba a partir del producto de
solución oftálmica de cloranfenicol, con una concentración final de 100
µg/mL de cloranfenicol equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver
anexo N°1, preparación de soluciones de prueba al 100%.
solución alternando estándar y muestra, comenzando con un estándar,
hasta terminar la serie. Ver anexo N° 3, método de análisis.
Cálculos y análisis:
- Determinar el contenido químico de cloranfenicol de cada una de las 6

muestras, con su respectivo estándar.
- Determinar el coeficiente de variación de las respuestas de los estándares.
54
- Determinar el coeficiente de variación de la valoración de las 6 muestras.

Para todos los cálculos utilizar la herramienta de hoja de cálculo. Ver anexo
N° 4, Formulas generales de cálculo.
Especificación:
- CV ≤ 2.0% para respuestas de los estándares.

- CV ≤ 2.0% para las concentraciones de la valoración de las muestras.
4.3.4 Precisión intermedia. (3)
También conocida como tolerancia o fortaleza, expresa la variación de los

resultados dentro de un laboratorio, es decir:
- Días diferentes.
- Diferentes analistas.
- Equipos diferentes dentro del mismo laboratorio.
Esta prueba la realiza un segundo analista, utilizando como muestra el

mismo lote de producto terminado, bajo las condiciones anteriormente
mencionadas. Ver protocolo de validación en cumplimiento de objetivos.
Procedimiento:
- Preparar una serie de 6 soluciones de estándar de cloranfenicol base con

una concentración final de 100 µg/mL equivalente al 100% de la
concentración teórica. Ver anexo N°1, preparación de estándar al 100%.

solución oftálmica de cloranfenicol con una concentración final de 100 µg/mL
55
de cloranfenicol base equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver


- Determinar el contenido químico de cloranfenicol base de cada una de las 6


- Determinar el coeficiente de variación global de los promedios de las
respuestas de las muestras, los miligramos obtenidos y concentraciones de
las muestras, entre analista 1 y analista 2. Para todos los cálculos utilizar la
herramienta de hoja de cálculo. Ver anexo N° 11, Formulas generales de
cálculo.
Especificación:
- CV ≤ 3.0% para promedios globales de las respuestas de las muestras, los

miligramos obtenidos y concentraciones de las muestras, entre analista 1 y
analista 2.
4.3.5 Exactitud. (3)
La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados

obtenidos por ese método y el valor real. Representa el grado en que un
método analítico se ajusta al valor verdadero para todo propósito práctico.
En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la
aplicación del procedimiento analítico a placebos al que se le han añadido
56
pequeñas cantidades de principio activo. A partir de los resultados luego se

calcula como la exactitud como el porcentaje de analíto recuperado por medio
de la valoración.
Procedimiento:

- Preparar por triplicado las siguientes soluciones de prueba a partir del
producto de solución oftálmica de cloranfenicol (9 en total).
Matriz + principio activo al 80%

Ver anexo N°1, preparación de soluciones de prueba para exactitud del

método.

solución, de acuerdo a la siguiente secuencia. Ver anexo N° 3, método de
análisis.
Estándar 1
Muestra al 80%
Muestra al 100%
Muestra al 120%
Hasta terminar las 3 series.
57
- Determinar para cada serie de muestras, con referencia a su estándar

respectivo, el porcentaje de recobro de la cantidad conocida del analíto
agregado a la matriz y se comparó el valor real obtenido con el valor teórico
esperado, tomando en cuenta el nivel de porcentaje utilizado.
- Determinar el coeficiente de correlación de los datos obtenidos en la
regresión. Para todos los cálculos utilizar la herramienta de hoja de cálculo.
Ver anexo N° 11, Formulas generales de cálculo.
Especificación:
- Porcentaje de recobro del 98.0% al 102.0% para métodos cromatográficos.

- Coeficiente de correlación de la regresión ≥ 0.98%.
- CV ≤ 2.0% para cada serie de muestras por nivel de concentración.
4.3.6 Selectividad o especificidad. (3)
La especificidad es una medida del grado (o ausencia) de interferencia de

sustancias debidas a la matriz o placebo y al solvente con respecto al analíto de
interés.
Procedimiento:
- Preparar una solución del estándar de cloranfenicol base con una
- Preparar una solución de prueba a partir del producto de solución oftálmica
de cloranfenicol con una concentración final de 100 µg/mL de cloranfenicol
base equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver anexo N°1,
preparación de solución de prueba al 100%.
58
- Preparar una solución con matriz del producto, con una cantidad equivalente
de matriz a la de la muestra. Ver anexo N°1, preparación de solución con
matriz del producto.
solución. Ver anexo N° 3, método de análisis.
- Evaluar la probable interferencia debido al placebo y obtuvieron los

respectivos cromatográmas de estándar, muestra y placebo.
Especificación:
- No debe de existir interferencia significativa por parte de los componentes

de la matriz.
59
CAPITULO V
RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
60
5.0 RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
5.1 Elaboración de protocolo de validación
Se elaboró un protocolo de validación el que incluye un encabezado en todas

las páginas que contiene el nombre del documento, que para el caso es:
Protocolo de validación de métodos analíticos.
También contiene el número de edición, la fecha de vigencia, y el número

correlativo de página con el total, evitando con esto la modificación no
autorizada del documento. A continuación posee el nombre del producto y un
número genérico codificado de protocolo, llevando un control de todos los
protocolos autorizados dentro del laboratorio.
La portada contiene nombre y firma de quien lo elaboró y autorizó.

Posteriormente contiene un índice, una introducción, el objetivo, el fundamento
de la validación o antecedentes, la evaluación de riesgos y los equipos que se
utilizaron en la validación, incluida la fecha de última calibración de cada uno.
También establece los parámetros de validación a evaluar, con el

procedimiento, cálculos y especificaciones requeridos en cada uno de los
parámetros.
Se incluye además un esquema resumen de los parámetros de validación; Así

como los materiales y reactivos a utilizar, finalmente la bibliografía utilizada para
su redacción.
A continuación se presenta la propuesta del protocolo de validación del método

de cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación de cloranfenicol
colirio.
61
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS

ANALÍTICOS.
Vigente a partir de:
Edición: 01 Noviembre 2016 Página 1 de 19
Nombre del producto: Cloranfenicol colirio 0.25%
Código de protocolo: PT0001-01
Elaborado por:
Firma:
Nombre: Oscar López
Cargo: Químico Analista
Fecha: Noviembre 2016
Autorizado por:
Firma:
Nombre: Lic. Eliseo Ayala
Cargo: Asesor
Fecha: Noviembre 2016
62

ANALÍTICOS.
INDICE:
1. Introducción.
2. Objetivo.
3. Fundamento de validación o antecedentes.
4. Evaluación de riesgos.
5. Equipos a utilizar.
6. Parámetros a evaluar para la validación del método analítico farmacopéico.
7. Esquema de validación del método analítico farmacopéico.
8. Materiales y reactivos.
9. Bibliografía.
63

ANALÍTICOS.
1. INTRODUCCION
De acuerdo a lo descrito en el apartado <1226> de la USP 38, los métodos

analíticos oficiales o farmacopéicos no requieren ser validados
completamente, por ello, debe de realizar una verificación documentada,
para dejar una constancia que el método analítico funciona correctamente en
el laboratorio donde se utilizará. El proceso de verificación de métodos
analíticos farmacopéicos es la evaluación que sirve para determinar si el
método puede ser utilizado para su propósito previsto, en las condiciones de
uso reales; Lo que permite una obtención exhaustiva de pruebas
demostrativas que están debidamente documentadas, en donde, un método
analítico farmacopéico debe ser lo suficientemente fiable como para poder
reproducir el resultado previsto en las condiciones de uso reales.
2. OBJETIVO.
Establecer la evidencia documentada de la verificación del método analítico
farmacopéico para la valoración de contenido de cloranfenicol colirio 0.25%,
el cual debe ser capaz de producir consistentemente los mismos resultados,
demostrando que es apto para el activo y matriz del
64

ANALÍTICOS.
producto farmacéutico, en las condiciones reales de uso.
3. FUNDAMENTO DE VALIDACIÓN O ANTECEDENTES.

Al realizar una verificación de un método analítico farmacopéico, se requiere
el plantear ciertas ventajas que presenta su desarrollo:
- Establecer evidencias documentadas de la aptitud del método de análisis
farmacopéico en las condiciones de uso reales.
- Proporcionar un alto grado de confianza y seguridad en el método analítico
y en la calidad de los resultados.
- Permitir un conocimiento profundo de sus características de
funcionamiento.
4. EVALUACIÓN DE RIESGOS.
En la verificación del método analítico farmacopéico de la valoración de
contenido de cloranfenicol colirio 0.25%, se tomaran en cuenta ciertos
factores como las condiciones de temperatura en el área de análisis y el
efecto de la matriz sobre la recuperación del fármaco.
5. EQUIPOS A UTILIZAR.
Los equipos a utilizar para la verificación del método analítico farmacopéico
para la valoración de cloranfenicol colirio 0.25%, son los siguientes:
65

ANALÍTICOS.
-Balanza analítica.
Marca: Sartorius
Modelo: Quintix 224-1S
Fecha de última calibración: 08/01/16
Marca: Mettler Toledo
Modelo: AG204-S
-Cromatógrafo líquido de alto desempeño (HPLC).

Marca: Thermo Scientific
Modelo: Dionex ultimate 3000
-Cromatógrafo líquido de alto desempeño (HPCL).

Marca: Shimadzu
Modelo: Prominence 20A
66

ANALÍTICOS.
6. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO

ANALÍTICO FARMACOPÉICO.
Linealidad del sistema.
La linealidad se refiere a la relación lineal, entre la concentración y la medida

de la valoración; Se realiza Preparando 5 niveles de concentración por
triplicado con sustancia de referencia (Estándar), ya sea por dilución a partir
de una solución concentrada, ó por pesadas independientes cuando no sea
posible por dilución. Incluir el intervalo de especificación, que para el caso
será del 90.0% al 110.0%.
Procedimiento:
- Preparar por triplicado una solución madre de estándar de cloranfenicol

base con una concentración de 1.0mg/mL en fase móvil.
- A partir de esta solución preparar por triplicado 5 niveles de concentración
correspondiente a 80%, 90%, 100%, 110%, y 120% de la concentración
teórica, según el Cuadro N° 2. Ver anexo N°1, preparación de soluciones
para linealidad.
67

ANALÍTICOS.
Cuadro N° 6. Niveles de concentración con su respectiva

concentración final.
Nivel de Concentración final Concentración final

concentración Cloranfenicol (µg/mL) Cloranfenicol(mg/mL)
80% 80 µg/mL 0.08 mg/mL
90% 90 µg/mL 0.09 mg/mL
100% 100 µg/mL 0.10 mg/mL
110% 110 µg/mL 0.11 mg/mL
120% 120 µg/mL 0.12 mg/mL

solución de estándar para cada una de las 3 series, de acuerdo a la
siguiente secuencia. Ver anexo N° 3, método de análisis.
1) Solución al 80%
2) Solución al 90%
3) Solución al 100%
68

ANALÍTICOS.
Cálculos:
- Calcular el valor de la pendiente (b1), la ordenada en el origen (b0), el
coeficiente de determinación (r2) y el intervalo de confianza para la
pendiente (IC(b1)). Si el método presenta un ajuste distinto a la línea recta,
utilizar la estadística apropiada y justificarla. Ver anexo N° 11, fórmulas
generales de cálculo.
Especificación:
r2 ≥ 0.98
IC (b1) no debe de incluir el cero.
Precisión del sistema.

Evaluar el grado de dispersión obtenida al aplicar el método a una
preparación de una solución de estándar al 100% sin tratamiento adicional y
realizar 6 inyecciones consecutivas.
69

ANALÍTICOS.
Procedimiento:
- Preparar una solución del estándar de cloranfenicol con una concentración
final de 100 µg/mL equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver
anexo N°1, preparación de estándar al 100%.
- Realizar de acuerdo al método de análisis, (Ver anexo N°3, método de
análisis), 6 inyecciones consecutivas de 10 microlitros, de la misma
solución de estándar al 100%. Ver anexo N° 3, método de análisis.
Cálculos:
- Evaluar su dispersión calculando el coeficiente de variación de los tiempos
de retención y coeficiente de variación de las áreas obtenidas del pico de
cloranfenicol base. Ver anexo N° 11, fórmulas de cálculo.
Especificación:
CV ≤ 2.0% para respuestas analíticas
CV ≤ 1.0% para tiempos de retención.
Precisión del método.

La precisión de un método analítico es el grado de concordancia de los
resultados de la prueba, cuando el procedimiento se aplica
70

ANALÍTICOS.
repetidamente a múltiples tomas de una muestra homogénea. La precisión

de un procedimiento analítico generalmente se expresa como la desviación
estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. Las
determinaciones se realizan con 6 soluciones de estándar y 6 soluciones de
prueba.
Procedimiento:
solución oftálmica de cloranfenicol, con una concentración final de 100
µg/mL de cloranfenicol equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver
71

ANALÍTICOS.
Ver anexo N° 11, fórmulas generales de cálculo.
Especificación:
CV ≤ 2.0% para respuestas de los estándares.
CV ≤ 2.0% para las concentraciones de la valoración de las muestras.
Precisión intermedia.
También conocida como tolerancia o fortaleza, expresa la variación de los
resultados dentro de un laboratorio, es decir:
- Días diferentes.
- Diferentes analistas.
- Equipos diferentes dentro del mismo laboratorio.
72

ANALÍTICOS.
Esta prueba será realizada por un segundo analista, utilizando como muestra
el mismo lote de producto terminado, bajo las condiciones anteriormente
mencionadas.
Procedimiento:
solución oftálmica de cloranfenicol con una concentración final de 100
µg/mL de cloranfenicol base equivalente al 100% de la concentración
teórica. Ver anexo N°1, preparación de soluciones de prueba al 100%.
73

ANALÍTICOS.

- Determinar el coeficiente de variación global de los promedios de las
respuestas de las muestras, los miligramos obtenidos y concentraciones de
las muestras, entre analista 1 y analista 2. Ver anexo N°11, fórmulas de
cálculo.
Especificación:
CV ≤ 3.0% para promedios globales de las respuestas de las muestras, los
miligramos obtenidos y concentraciones de las muestras, entre analista 1 y
analista 2.
Exactitud.
La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados
obtenidos por ese método y el valor real. Representa el grado en que un
método analítico se ajusta al valor verdadero para todo propósito práctico.
En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la
aplicación del procedimiento analítico a placebos al que se le han añadido
pequeñas cantidades de principio activo. A partir de los resultados luego se
calcula como la exactitud como el porcentaje de analíto recuperado por
medio de la valoración.
74

ANALÍTICOS.
Procedimiento:
- Preparar por triplicado las siguientes soluciones de prueba a partir del
producto de solución oftálmica de cloranfenicol (9 en total).

Ver anexo N°1, preparación de soluciones de prueba para exactitud del

método.

solución, de acuerdo a la siguiente secuencia. Ver anexo N° 3, método de
análisis.
Estándar 1
Muestra al 80%
Muestra al 100%
Muestra al 120%
Hasta terminar las 3 series.
75

ANALÍTICOS.
- Determinar para cada serie de muestras, con referencia a su estándar
respectivo, el porcentaje de recobro de la cantidad conocida del analíto
agregado a la matriz y comparar el valor real obtenido con el valor teórico
esperado, tomando en cuenta el nivel de porcentaje utilizado.
- Determinar el coeficiente de correlación de los datos obtenidos en la
regresión. Ver anexo N°11, fórmulas de cálculo.
Especificación:
Coeficiente de correlación de la regresión ≥ 0.98%.
CV ≤ 2.0% para cada serie de muestras por nivel de concentración.
Porcentaje de recobro del 98.0% al 102.0% para métodos cromatográficos.
Selectividad o especificidad.
La especificidad es una medida del grado (o ausencia) de interferencia de
sustancias debidas a la matriz o placebo y al solvente con respecto al analíto
de interés.
Procedimiento:
- Preparar una solución del estándar de cloranfenicol base con una
76

ANALÍTICOS.
- Preparar una solución de prueba a partir del producto de solución oftálmica

de cloranfenicol con una concentración final de 100 µg/mL de cloranfenicol
base equivalente al 100% de la concentración teórica. Ver anexo N°1,
preparación de solución de prueba al 100%.
- Preparar de manera similar a la solución de prueba al 100%, una solución
solamente con matriz o placebo, con una cantidad equivalente a la de la
muestra. Ver anexo N°1, preparación de solución de placebo.
solución. Ver anexo N° 3, método de análisis.
Evaluar la probable interferencia debido al placebo y obtener los respectivos
cromatográmas de estándar, muestra y placebo.
Especificación:
No debe de existir interferencia significativa por parte de los componentes de
la matriz.
77

ANALÍTICOS.
7. CUADRO N° 7. ESQUEMA DE VALIDACION DEL METODO ANALITICO

FARMACOPEICO.
Parámetro Determinación Reporte

Concentraciones del
1. Linealidad estándar N° de Rango lineal.
del sistema Valoración del fármaco determinaciones Análisis de regresión que
80% 3 demuestre:
-Coeficiente de
90% 3
determinación:
100% 3 r ≥ 0.98 < 1
110% 3 -Coeficiente de correlación:
120% 3 r ≥ 0.98 < 1
2. Precisión del 6 inyecciones consecutivas de una solución del Coeficiente de variación en

sistema estándar al 100%. cuanto a:
-Área: ≤2.0%
-Tiempo de retención:
≤1.0%
3. Precisión del 6 determinaciones: Coeficientes de variación

método Cada una consiste de un estándar y una de:
muestra preparada al 100% de la concentración -respuestas y factores de
teórica. respuesta: ≤2.0%
-Principios activos
(concentración de
muestra):
≤2.0%
78

ANALÍTICOS.
4. Exactitud Cantidades del analíto, se añaden a la matriz (al -Porcentaje de recobro: del
100% de su peso establecido en el método para 98.0% al 102.0%
valoración para obtener niveles del 80%, 100%
y 120% de la concentración teórica de la -Coeficiente de variación:
sustancia). ≤2.0%
La exactitud es expresada como un porcentaje
de la cantidad recuperada. -Coeficiente de correlación:
Número de determinaciones: 9 (3 por cada nivel r ≥ 0.995
de concentración)
5. precisión Cada uno de dos analistas efectúa la precisión Coeficiente de variación

intermedia del método, utilizando como muestra el mismo global:
lote del producto terminado, en dos días -principios activos: ≤3.0%
diferentes y en equipos diferentes. -Promedio total de datos:
(90.0% - 110.0%)
6. Especificidad Evaluar la interferencia debida al placebo dentro No debe haber

del tiempo de retención del activo y obtener los interferencia
respectivos cromatográmas
8. MATERIALES Y REACTIVOS.
Los materiales certificados a ser utilizados para la validación del método
analítico farmacopéico para la valoración de contenido de cloranfenicol colirio
0.25%, son los siguientes:
79

ANALÍTICOS.
- Balones volumétricos de 100.0 mL

- Pipetas volumétricas de 5.0 mL
- Bureta de 25.0 mL
- beaker de 250 mL
- Probeta de 1000 mL
- Kit de filtración al vacío.
- Viales de 1.5 ml.
- Columna: Merck LiChospher 100 RP-18 endcapped 5µm (125x4.6) mm
9. BIBLIOGRAFIA.
- Guía de validación de métodos analíticos (Editada por el colegio nacional

de químicos farmacéuticos biólogos de México)
- Procedimiento interno del Laboratorio Farmacéutico Nacional, Validación
de métodos analíticos.
- USP 38, Verificación de procedimientos farmacopéicos <1226>
- USP 38, Validación de métodos analíticos <1225>
- Validación de métodos analíticos para la evaluación de la calidad de los
medicamentos. Reglamento técnico centroamericano 11.03.39:06
COMIECO-XL, 2006
80
5.2 RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE

DESEMPEÑO.
Se evaluaron todos los parámetros de validación, Linealidad del sistema,

Precisión del sistema, Precisión del método, Precisión intermedia, Exactitud y
Selectividad; Se realizó la evaluación de los parámetros de acuerdo a lo
especificado en el protocolo de validación, tanto el procedimiento como los
criterios de aceptación. Para la realización de la propuesta de validación del
método de cromatografía liquida de alta eficiencia para la cuantificación de
cloranfenicol colirio 0.25%, se tomó en cuenta el método analítico más reciente
que se encontró descrito en la Farmacopea de los Estados Unidos 38, y se
validó de acuerdo al procedimiento interno de validación del Laboratorio
Farmacéutico Nacional. A continuación se presentan los resultados para cada
parámetro de validación evaluado.
5.2.1 Determinación de Linealidad del sistema.
En la evaluación del parámetro linealidad del sistema, se evalúa la

proporcionalidad que existe entre la cantidad de analíto versus la respuesta
instrumental obtenida en un intervalo definido. En el Cuadro N° 8 se presentan
las respuestas obtenidas y el coeficiente de variación en cada nivel de
concentración.
Cuadro N° 8. Resultados de la evaluación del parámetro Linealidad del

sistema.
Nivel de
Respuesta 1 Respuesta 2 Respuesta 3 CV de las respuesta
concentración
80% 22.803 22.910 22.837 0.24
90% 25.663 25.683 25.731 0.14
100% 28.489 28.559 28.571 0.16
110% 31.503 31.410 31.519 0.19
120% 34.313 34.210 34.257 0.15
81
En el Cuadro N° 8 podemos ver que los coeficientes de variación en cada nivel

de concentración son menores a 1, lo cual es muy importante de tomar en
cuenta ya que nos está indicando que existe repetibilidad en la prueba, que
tanto las soluciones fueron bien preparadas, como el equipo está funcionando
correctamente. Con las respuestas obtenidas y las concentraciones finales
reales se realizó una regresión lineal con la ayuda de la herramienta de hoja de
cálculo, obteniéndose la gráfica y la ecuación que siguió el comportamiento de
los datos.
Cuadro N° 9. Cuadro resumen de tratamiento de datos de la evaluación

del parámetro Linealidad del sistema
Concentración real
Porcentaje Área. Factor de respuesta
(mg/mL)
80% 0.0802 22.803 0.00351708
80% 0.0802 22.910 0.00350065
80% 0.0802 22.837 0.00351184
90% 0.0902 25.663 0.00351479
90% 0.0902 25.683 0.00351205
90% 0.0902 25.731 0.00350550
100% 0.1002 28.489 0.00351715
100% 0.1002 28.559 0.00350853
100% 0.1002 28.571 0.00350705
11O% 0.1102 31.503 0.00349808
11O% 0.1102 31.410 0.00350844
11O% 0.1102 31.519 0.00349630
120% 0.1202 34.313 0.00350305
120% 0.1202 34.210 0.00351359
120% 0.1202 34.257 0.00350877
0.00350819
CV 0.19
En la figura N° 3 se observa el comportamiento de la curva de los datos área

versus la concentración de las soluciones en cada uno de los 5 niveles de
concentración propuestos. Pero además de la gráfica se necesita la estadística
82
de la regresión obtenida por el tratamiento de los datos en la herramienta Excel

la cual es presentada en el cuadro N° 10.
Curva de regresión ajustada

40.000
y = 286.05x - 0.0983
35.000
30.000
25.000
Área
20.000
15.000 Y
10.000
Pronóstico para Y
5.000
0.000
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14
Concentracion mg/mL
Figura N° 3. Curva de regresión para los datos obtenidos en la

evaluación del parámetro linealidad del sistema.
En la evaluación del parámetro linealidad del sistema, una de las

especificaciones requeridas es que el coeficiente de determinación sea mayor o
igual a 0.98 de acuerdo a lo especificado previamente en el protocolo de
validación. El coeficiente de determinación, en este sentido, nos está indicando
que entre más se acerque su valor a 1, mas relación habrá entre el conjunto de
datos que componen la curva. El valor obtenido para el coeficiente de
determinación de esta curva fue de 0.9998, cumpliendo la especificación.
Otro parámetro muy importante a considerar a partir de la gráfica es la

obtención de la ecuación que sigue la curva, la cual en este trabajo fue obtenida
en la hoja de cálculo. Mientras la pendiente nos está indicando el grado de
inclinación de la curva ó la proporcionalidad entre los valores de las variables
“X” y “Y”, el intercepto nos indica en que valor del eje “Y” es intercepta la curva.
83
Según lo estipulado en el protocolo de validación, el intervalo de confianza de la

pendiente no debe incluir el cero. Matemáticamente, un valor de pendiente igual
a cero, está indicando que mientras “X” crece, “Y” se mantendrá constante, por
lo cual no existirá proporcionalidad alguna entre las variables. En el cuadro N°
10 se presentan los intervalos de confianza para la pendiente y el intercepto;
Podemos ver que en el intervalo de confianza para la pendiente obtenida no
está incluido el cero, cumpliendo esta especificación estipulada en el protocolo
de validación.
Cuadro N° 10. Cuadro resumen de la estadística de la regresión del

parámetro linealidad del sistema
Estadística de la regresión
Coeficiente de correlación 0.999924367
Coeficiente de determinación 0.999848739
Intervalos de confianza Inferior 95.0% Superior 95.0%
Intercepto -0.311670083 0.114983417
Pendiente 283.9418841 288.1581159
También se presenta el intervalo de confianza para el intercepto, que aunque

no se requiera especificación de acuerdo al protocolo de validación, sirve de
referencia adicional para conocer el comportamiento de la curva, en donde se
prefiere que se incluya el cero dentro del intervalo de confianza, indicando con
esto que la curva parte del origen cero.
De acuerdo al intervalo de confianza presentado en la tabla N° 10, podemos

ver que el cero está incluido, concluyendo de esta manera que se tiene una
linealidad del sistema aceptable.
5.2.2 Determinación de la Precisión del sistema.
En la precisión del sistema se realizan 6 inyecciones consecutivas de la

preparación de un estándar obteniéndose el área y el tiempo de retención de
84
cada inyección. En el Cuadro N° 11 se presentan las áreas y tiempos de

retención de la evaluación del parámetro de validación precisión del sistema.
Cuadro N° 11. Áreas y tiempos de retención de la precisión del

sistema.
N° de inyección Tiempo de retención (Minutos) Área
1 3.527 28.453
2 3.530 28.393
3 3.537 28.440
4 3.527 28.501
5 3.518 28.586
6 3.525 28.498
̅ 3.527 28.478
CV 0.18 0.23
Se puede observar que el coeficiente de variación de los tiempos de retención

es de 0.18%, el cual cumple la especificación del protocolo de validación donde
se establece que debe ser menor a 1.0% para los tiempos de retención,
mientras para las áreas se estableció un coeficiente de variación de menor o
igual al 2.0%, obteniéndose en el presente estudio un coeficiente de 0.23%,
cumpliendo también ésta especificación.
Cumplidas ambas especificaciones para el parámetro de validación precisión

del sistema, nos indica que el sistema instrumental constituido por los diferentes
módulos que componen el Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiencia están
trabajando efectivamente como un sistema.
5.2.3 Determinación de la Precisión del método
En la precisión del método se está evaluando la capacidad de repetibilidad

intraensayo que tiene el método al ser aplicado tanto a muestras como a
estándares sin verse alterado, alternando en el equipo preparaciones de 6
estándares y 6 muestras. En la cuadro N° 12 se presentan los datos obtenidos
85
en la evaluación del parámetro de validación precisión del método junto con su

estadística obtenida con la ayuda de la herramienta de hoja de cálculo.
Cuadro N° 12. Datos obtenidos en la precisión del método junto con su

estadística.
Concentración Concentración
Áreas de Áreas de FR de
N° de estándares de muestras
estándares muestras estándares
(mg/mL) mg/mL %
1 28.531 27.531 0.1002 0.003511969 2.42 96.69
2 28.965 27.050 0.1002 0.003459347 2.34 93.58
3 28.650 27.557 0.1002 0.003497382 2.41 96.38
4 28.584 27.330 0.1002 0.003505458 2.40 95.80
5 28.546 27.619 0.1002 0.003510124 2.42 96.94
6 28.620 27.750 0.1002 0.003501048 2.43 97.15
̅ 28.649 27.473 0.1002 0.003497555 2.40 96.09
CV 0.56 0.90 0.0 0.56 1.36 1.37
Primeramente observamos el coeficiente de variación tanto para las áreas de

los estándares como para las áreas de las muestras, los cuales son 0.56% y
0.90% respectivamente. La especificación del coeficiente de variación de las
respuestas de estándares y muestras establecido en el protocolo de validación
es que debe ser menor o igual a 2.0%, cumpliendo esta especificación de
acuerdo a los coeficientes de variación obtenidos, de 0.56 para los estándares y
de 0.90 para las muestras.
El siguiente requerimiento establecido en el protocolo de validación para la
evaluación de este parámetro de validación es que el coeficiente de variación
de la concentraciones de las muestras sea menor o igual a 2.0%. De acuerdo al
cuadro N° 12 los coeficientes de variación obtenidos en las concentraciones de
las muestras fueron de 1.36% para los miligramos obtenidos por mililitro, y de
1.37% para los porcentajes sobre lo rotulado, cumpliendo con esto las
especificación requerida para el cumplimiento de este parámetro de validación.
En este caso también se calculó el factor de respuesta de cada estándar, el
cual aunque no es requerido, sirve de parámetro para evaluar el
comportamiento de la relación entre la concentración de cada estándar y la
86
respuesta de cada uno. El coeficiente de variación de los factores de respuesta

obtenido es bajo, lo cual indica que se tiene una relación concentración versus
respuesta muy buena.
5.2.4 Determinación de la Exactitud.
En la exactitud del método se evalúa el porcentaje de la cantidad añadida

versus la cantidad recuperada con la adición de placebos enriquecidos con el
principio activo. En el cuadro N° 13 se presentan los datos obtenidos en la
evaluación de éste parámetro de validación como un cuadro resumen.
Los porcentajes de recobro especificados en el protocolo de validación tomando
en cuenta que es un método analítico cromatográfico, es del 98.0% al 102.0%
de la cantidad añadida. Podemos ver en el cuadro N° 13 que en todos los
niveles de concentración incluyendo los promedios se cumple la especificación
previamente establecida en el protocolo de validación. También se especifica
que los coeficientes de variación de las respuestas en cada nivel de
concentración sea menor o igual a 2.0% por ser un método cromatográfico.
Cuadro N° 13. Cuadro resumen de las respuestas y porcentajes de recobro

obtenidos en la exactitud del método.
Muestra Respuesta Respuesta Respuesta CV de las

(respuestas) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 respuestas.
80% 22.951 22.617 22.522 0.99
100% 28.969 28.298 28.310 1.35
120% 34.058 34.073 34.754 1.16
Muestra %Recuperado %Recuperado %Recuperado ̅ %Recuperado
(%recuperado) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
80% 99.48 99.28 98.11 98.96
100% 100.40 99.32 98.61 99.44
120% 98.50 99.79 101.01 99.77
Estadística de correlación de datos
Coeficiente de correlación 0.9982

Coeficiente de determinación 0.9965
87
Adicional también se realizó una regresión utilizando los datos de la exactitud

del método específicamente la cantidad añadida como la concentración real
final y la respuesta obtenida, evaluando con esto la correlación de los datos
obtenidos. En el cuadro N° 14 se presenta un cuadro resumen de los datos
utilizados en la regresión.
Cuadro N° 14. Cantidad añadida como concentración final con su

respectiva respuesta en cada nivel de concentración.
Porcentaje Concentración final (Mg/mL) Área.
80% 0.0801 22.951
80% 0.0801 22.617
80% 0.0801 22.522
100% 0.1002 28.969
100% 0.1002 28.298
100% 0.1002 28.310
120% 0.1201 34.058
120% 0.1201 34.073
120% 0.1201 34.754
En la figura N° 4 se presenta la gráfica obtenida con los datos de la exactitud

del método, en la cual se puede evidenciar el comportamiento de la curva.
40.000
Curva de regresión ajustada
y = 289.96x - 0.5287
30.000
Area
20.000
10.000 Y
0.000
0 0.05 0.1 0.15
Concentracion final (mg/mL)
Figura N° 4. Curva de regresión para los datos obtenidos en la

evaluación del parámetro Exactitud del método.
88
La especificación establecida en el protocolo de validación para la regresión de

la exactitud del método es que el coeficiente de correlación sea mayor o igual a
0.98. En este caso se obtuvo un coeficiente de correlación para la regresión de
0.99 cumpliendo la especificación requerida para la exactitud del método.
5.2.5 Determinación de la Precisión intermedia.
En la precisión intermedia se evalúa la capacidad de repetibilidad interensayo

del método, realizado diferente día, en diferente equipo y por un analista
diferente. En este caso primeramente hay que tener en cuenta que este
parámetro es una segunda precisión del método por lo tanto intrínsecamente
deben cumplirse las mismas especificaciones. En el cuadro N° 15 se presentan
los datos de igual manera que se hizo con la precisión del método.
Cuadro N° 15. Datos obtenidos en la precisión intermedia junto con su

estadística
Concentración Concentración
Áreas de Áreas de FR de
N° de estándares de muestras
estándares muestras estándares
(mg/mL) mg/mL %
1 28.530 27.510 0.1002 0.003512093 2.42 96.62
2 28.492 27.022 0.1002 0.003516777 2.38 95.03
3 28.704 27.525 0.1002 0.003490803 2.40 96.08
4 28.536 27.076 0.1002 0.003511354 2.38 95.07
5 28.747 27.484 0.1002 0.003485581 2.39 95.80
6 28.302 27.557 0.1002 0.003540386 2.44 97.56
̅ 28.552 27.362 0.1002 0.003509499 2.40 96.03
CV 0.56 0.89 0.0 0.56 1.00 1.01
Podemos ver que en efecto se cumplen todas las especificaciones como una
precisión del método, las cuales son que el coeficiente de variación de las
respuestas de estándares y muestras sean menor o igual a 2.0% al igual que
con las concentraciones de las muestras por ser un método cromatográfico.
89
En el cuadro N° 16 se presenta un consolidado de los datos de las muestras

obtenidos entre el analista 1 y analista 2, en el cual se puede observar una leve
diferencia entre los resultados obtenidos entre el analista 1 y el analista 2,
evidenciando que el método presenta una muy buena repetibilidad dentro del
mismo laboratorio realizado por diferente analista, en diferente día y equipo.
Cuadro N° 16. Cuadro comparativo de datos en la entre analista 1 y analista 2
Analista 1 / Equipo 1 / Día 1 Analista 2 / Equipo 2 / Día 2

N° Áreas de Concentración de muestras Áreas de Concentración de muestras
Muestras Mg/mL % muestras mg/mL %
1 27.531 2.42 96.69 27.510 2.42 96.62
2 27.050 2.34 93.58 27.022 2.38 95.03
3 27.557 2.41 96.38 27.525 2.40 96.08
4 27.330 2.40 95.80 27.076 2.38 95.07
5 27.619 2.42 96.94 27.484 2.39 95.80
6 27.750 2.43 97.15 27.557 2.44 97.56
̅ 27.473 2.40 96.09 27.362 2.40 96.03
CV 0.90 1.36 1.37 0.89 1.00 1.01
En el Cuadro N° 17 se presenta el resumen de la variación global de las

respuestas y concentraciones promedio obtenidas por cada uno de los dos
analistas.
Cuadro N° 17. Cuadro resumen de los coeficientes de variación obtenidos
entre analista 1 y analista 2
Variación global Respuesta mg/mL %
Analista 1 27.473 2.40 96.09
Analista 2 27.362 2.40 96.03
̅ global 27.418 2.40 96.06
CV global 0.29 0.0 0.04
La especificación establecida en el protocolo de validación para la precisión

intermedia es que el coeficiente de variación para las respuestas de las
muestras, los miligramos obtenidos y los porcentajes sobre lo rotulado entre
analista 1 y analista 2 sea menor o igual a 3.0. En el presente estudio de
precisión intermedia se obtuvo un coeficiente de variación de 0.29 para las
respuestas, de 0.00 para los miligramos obtenidos por mililitro y de 0.04 para
90
los porcentajes sobre lo rotulado, con lo cual se cumple la especificación

establecida para este parámetro.
5.2.6 Determinación de Selectividad o especificidad.
En el parámetro de validación especificidad se evaluó el grado de interferencia

al analizar el principio activo en presencia de los componentes de la matriz.
Esta evaluación se realiza sobreponiendo los cromatográmas en busca de
interferencias. En la Figura N° 3 se presentan los cromatográmas sobrepuestos
de las soluciones de muestra, matriz y estándar de que se prepararon para la
evaluación de la selectividad del método; La especificación establecida en el
protocolo de validación para esta prueba es que no debe existir interferencia
significativa por parte de los componentes de la matriz. En el Cuadro N° 18 se
presentan las respuestas obtenidas de placebo, principio activo y producto.
Cuadro N° 18. Respuestas obtenidas en la evaluación del

parámetro de validación Selectividad
Tipo de muestra Respuesta
Matriz (Placebo) 0.074
Estándar (Principio Activo) 29.606
Producto (Cloranfenicol colirio 0.25%) 27.762
Se puede observar en la figura N° 5 que la matriz (placebo) no presenta

ninguna interferencia en el análisis del principio activo cloranfenicol, el cual
posee un tiempo de retención de 3.5 minutos. Cumpliendo con la especificación
para la evaluación de la selectividad del método. Sin embargo se encontró que
la matriz presenta un pico cercano al del pico del principio activo de
cloranfenicol, con un tiempo de retención aproximado de 4.2 minutos, el cual
91
aunque actualmente no interfirió en la validación, podría interferir por ejemplo si

no se tiene cuidado en la preparación exacta de las proporciones de la fase
móvil o si se cambia el tipo de columna especificada en el método analítico
validado por otra diferente.
Figura N° 5. Cromatográmas sobrepuestos de muestra, placebo y estándar

respectivamente en forma descendente.
También se encontró un pico perteneciente a la matriz con un tiempo de

retención aproximado de 15.9 minutos el cual también, aunque no interfirió con
la validación realizada, podría hacerlo si se cambia el tiempo de corrida del
análisis y podría traslaparse en los cromatográmas dando lugar a interferencias.
En el Cuadro N° 19 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en la
evaluación de los parámetros de validación del método de cromatografía liquida
de alta eficiencia para la cuantificación de cloranfenicol colirio 0.25%
92
Cuadro N° 19. Cuadro resumen de resultados obtenidos en la evaluación de los

parámetros de validación
cumple
Parámetro Especificación Resultados
si no
- Rango lineal. - Rango lineal:
Análisis de regresión que demuestre: (0.0802 – 0.1202) mg/mL
Linealidad - Coeficiente de determinación: - Coeficiente de determinación:
√
del sistema r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9999
- Coeficiente de correlación: - Coeficiente de correlación:
r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9998
Coeficiente de variación en cuanto a: - Áreas:

Precisión del - Factor de respuesta : < 2.0 % cv = 0.23%
√
sistema - Área: ≤ 2.0% - tiempo de retención:
- Tiempo de retención: ≤ 1.0% cv = 0.18%
- Factor de respuesta:
Coeficiente de variación de: cv = 0.56%
- Respuestas y factores de respuesta: - Área de estándares:
Precisión del ≤ 2.0% cv = 0.56%
√
método - Concentración del activo: - Área de muestras:
≤ 2.0% cv = 0.90%
- principio activo:
cv = 1.37%
- Porcentaje de recobro: Porcentajes de recobros:

98.0% - 102.0% - 80 %: 99.68%, cv = 0.33 %
- coeficiente de variación: - 100 %: 100.61%, cv = 0.23 %
Exactitud del ≤ 2.0% - 120 %: 100.74%, cv = 0.36 %
√
método - Coeficiente de determinación:
r ≥ 0.98 < 1 - Coeficiente de determinación:
- Coeficiente de correlación: r = 0.9998
r ≥ 0.98 < 1 - Coeficiente de correlación:
r = 0.9997
Coeficiente de variación global: Principio activo:

- principios activos: cv global = 0.04 %
Precisión
≤ 3.0% √
intermedia
Promedio total de datos: Promedio global de datos:
90% – 110% 2.40 mg/mL ; 96.06 %
No debe existir interferencia

No se encontró interferencia
Especificidad significativa entre el principio activo y √
significativa
el placebo.
93
5.3 ELABORACION DE REPORTE Y CERTIFICADO DE VALIDACION

Se redactó el reporte de validación en el cual se incluyó una introducción, los
resultados de la evaluación de riesgos, los equipos que se utilizaron, un
esquema resumen del proceso que se llevó a cabo derivado del protocolo de
validación, un cuadro de resultados conteniendo por cada parámetro de
validación realizado, la especificación junto con el resultado obtenido y el
dictamen. A continuación se presenta el reporte, certificado y técnica validada.
94
REPORTE DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS

ANALÍTICOS.
Edición: 01 Febrero 2017 Página 1 de 9
Elaborado por:
Firma:
Nombre: Oscar López
Cargo: Químico Analista
Fecha: Febrero 2017
Autorizado por:
Firma:
Nombre: Lic. Eliseo Ayala
Cargo: Asesor
Fecha: Febrero 2017
95

ANALÍTICOS.
INDICE:
1. Introducción.
2. Resultado de la evaluación de riesgos.
3. Equipos utilizados.
4. Esquema de validación del método analítico farmacopéico.
5. Resultados de la validación del método analítico farmacopéico.
6. Conclusiones y dictamen.
7. Bibliografía.
8. Complemento
96

ANALÍTICOS.
1. INTRODUCCION.
De acuerdo a lo descrito en el apartado <1226> de la USP 38, los métodos

analíticos oficiales o farmacopéicos no requieren ser validados
completamente, por ello, debe de realizar una verificación documentada,
para dejar una constancia que el método analítico funciona correctamente en
el laboratorio donde se utilizara. El proceso de verificación de métodos
analíticos farmacopéicos es la evaluación que sirve para determinar si el
método puede ser utilizado para su propósito previsto, en las condiciones de
uso reales; lo que permite una obtención exhaustiva de pruebas
demostrativas que están debidamente documentadas, en donde, un método
analítico farmacopéico debe ser lo suficientemente fiable como para poder
reproducir el resultado previsto en las condiciones de uso reales. Por lo que
se procedió a la validación del método analítico farmacopéico cromatográfico
para la valoración de cloranfenicol colirio 0.25%.
2. RESULTADOS DE LA EVALUACION DE RIESGOS.
En la validación del Método Cromatográfico para la valoración de

Cloranfenicol Colirio 0.25%, se tomaron en cuenta ciertos factores como las
condiciones de temperatura en el área de análisis y tiempo de preparación
97

ANALÍTICOS.
de la muestra, dichos factores no interfirieron en los resultados finales de la

validación.
3. EQUIPOS UTILIZADOS.
Los equipos a utilizar para la verificación del método analítico farmacopéico

para la valoración de cloranfenicol colirio 0.25%, son los siguientes:
Marca: Sartorius
Modelo: Quintix 224-1S
Marca: Mettler Toledo
Modelo: AG204-S
-Cromatógrafo liquido de alto desempeño (HPLC).

Marca: Thermo Scientific
Modelo: Dionex ultimate 3000
98

ANALÍTICOS.
-Cromatógrafo liquido de alto desempeño (HPCL).

Marca: Shimadzu
Modelo: Prominence 20A
4. CUADRO N° 7. ESQUEMA DE VALIDACION DEL METODO ANALITICO

FARMACOPEICO.
Parámetro Determinación Reporte

Concentraciones del
1. Linealidad estándar N° de Rango lineal.
del sistema Valoración del fármaco determinaciones Análisis de regresión que
80% 3 demuestre:
90% 3 -Coeficiente de
determinación:
100% 3
r ≥ 0.98 < 1
110% 3 -Coeficiente de
120% 3 correlación:
r ≥ 0.98 < 1
2. Precisión del 6 inyecciones consecutivas de una solución del Coeficiente de variación

sistema estándar al 100%. en cuanto a:
-Área: ≤2.0%
-Tiempo de retención:
≤1.0%
99

ANALÍTICOS.
3. Precisión del 6 determinaciones: Coeficientes de variación

método Cada una consiste de un estándar y una de:
muestra preparada al 100% de la concentración -respuestas y factores de
teórica. respuesta: ≤2.0%
-Principios activos
(concentración de
muestra): ≤2.0%
4. Exactitud Cantidades del analíto, se añaden a la matriz (al -Porcentaje de recobro:

100% de su peso establecido en el método para del 98.0% al 102.0%
valoración para obtener niveles del 80%, 100%
y 120% de la concentración teórica de la -Coeficiente de variación:
sustancia). ≤2.0%
La exactitud es expresada como un porcentaje
de la cantidad recuperada. -Coeficiente de
Número de determinaciones: 9 (3 por cada nivel correlación:
de concentración) r ≥ 0.995
5. Precisión Cada uno de dos analistas efectúa la precisión Coeficiente de variación

intermedia del método, utilizando como muestra el mismo global:
lote del producto terminado, en dos días -principios activos: ≤3.0%
diferentes y en equipos diferentes. -Promedio total de datos:
(90.0% - 110.0%)
6. Especificidad Evaluar la interferencia debida al placebo dentro No debe haber

del tiempo de retención del activo y obtener los interferencia
respectivos cromatográmas.
100

ANALÍTICOS.
5. CUADRO N° 20. RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO

ANALÍTICO CROMATOGRÁFICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE
CLORANFENICOL COLIRIO 0.25%.
cumple
si no

√
del sistema r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9999
r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9998
- Áreas:
Coeficiente de variación en cuanto a:
Precisión del cv = 0.23%
- Área: ≤ 2.0% √
sistema - tiempo de retención:
- Tiempo de retención: ≤ 1.0%
cv = 0.18%
√
≤ 2.0% cv = 0.90%
- principio activo:
cv = 1.37%
101

ANALÍTICOS.

98.0% - 102.0% - 80 %: 99.68%, cv = 0.33 %
Exactitud del ≤ 2.0% - 120 %: 100.74%, cv = 0.36 %
√
r = 0.9997

Precisión
≤ 3.0% √
intermedia
90% – 110% 2.40 mg/mL ; 96.06 %

significativa
el placebo.
6. CONCLUSIONES Y DICTAMEN
Cumplidas las especificaciones de las pruebas de Linealidad del sistema,
Precisión del Sistema, Precisión del Método, Precisión Intermedia, Exactitud
del método y especificidad del método, queda establecido que el método
analítico Cromatográfico para la Valoración de Cloranfenicol colirio 0.25%,
funciona correctamente, en las condiciones reales de uso, cuando se aplica a
102

ANALÍTICOS.
muestras que contienen el analíto a concentraciones iguales a las

establecidas, por lo que, se concluye que éste método, queda VALIDADO y
es apto para ser utilizado en las condiciones reales de uso
7. BIBLIOGRAFIA
- Guía de validación de Métodos Analíticos Fisicoquímicos del Organismo
Salvadoreño de Acreditación
- Guía de Validación de Métodos Analíticos (editada por el Colegio Nacional de
Químicos Farmacéuticos Biólogos de México, equivalente a:
Guideline for industry: Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-Q2A.
- Procedimiento interno de Validación de Métodos Analíticos, Laboratorio
Farmacéutico Nacional.
- USP 38, Verificación de Procedimientos Farmacopéicos <1226>
- USP 38, Validación de Métodos Analíticos <1225>
8. COMPLEMENTO
- Certificado de Validación del Método Analítico Cromatográfico para la
valoración de Cloranfenicol colirio 0.25%.
- Técnica de Análisis validada para la valoración de Cloranfenicol colirio
0.25%.
103
CERTIFICADO DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS

ANALÍTICOS.
1. Resumen
La presente Validación del Método Analítico Farmacopéico realizada, se
evaluaron los parámetros: Linealidad del sistema, Precisión de sistema,
Precisión del método, Precisión Intermedia, Exactitud del método y
Especificidad del método la cual se llevó a cabo con la finalidad de obtener
pruebas documentadas que demuestren que el método cromatográfico de
análisis utilizado para la Valoración de Cloranfenicol colirio 0.25%, produce
resultados confiables.
2. Responsables
Lic. Eliseo Ayala.
Oscar López
3. Cuadro N° 20. Resultados de la validación del método analítico.
cumple
si no

√
del sistema r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9999
r ≥ 0.98 < 1 r = 0.9998
104

ANALÍTICOS.
- Áreas:
Coeficiente de variación en cuanto a:
Precisión del cv = 0.23%
- Área: ≤ 2.0% √
sistema - tiempo de retención:
- Tiempo de retención: ≤ 1.0%
cv = 0.18%
√
≤ 2.0% cv = 0.90%
- principio activo:
cv = 1.37%

98.0% - 102.0% - 80 %: 99.68%, cv = 0.33 %
Exactitud del ≤ 2.0% - 120 %: 100.74%, cv = 0.36 %
√
r = 0.9997

Precisión
≤ 3.0% √
intermedia
90% – 110% 2.40 mg/mL ; 96.06 %
105

ANALÍTICOS.

significativa
el placebo.
4. Conclusión.
Cumplidas las especificaciones de las pruebas de Linealidad del sistema,
Precisión del Sistema, Precisión del Método, Precisión Intermedia, Exactitud
del método y especificidad del método, queda establecido que el método
analítico Cromatográfico para la Valoración de Cloranfenicol colirio 0.25%,
funciona correctamente, en las condiciones reales de uso, cuando se aplica
a muestras que contienen el analíto a concentraciones iguales a las
establecidas, por lo que, se concluye que éste método, queda VALIDADO y
es apto para ser utilizado en las condiciones reales de uso.
Elaborado por: Revisado por:
F. F.
Oscar López. Lic. Eliseo Ayala.
106
Método de análisis validado

Código: MAV-001 Vigente a partir de:
1. Alcance:
El presente método de análisis aplica para el producto registrado con el siguiente
nombre:
- Cloranfenicol Colirio 0.25%
2. Referencia bibliográfica:
USP 38
3. Principio activo:
Cada 1 mL contiene:
Cloranfenicol………………………..2.5 mg
4. Descripción:
Liquido transparente incoloro ligeramente amarillo, inodoro, libre de partículas
extrañas.
5. Contenido Químico Cloranfenicol Colirio 0.25%

5.1 Método: Cromatografía Liquida de alta eficiencia.
5.2 Sistema cromatográfico:

Columna: C18 (L1), 5um, (125x4.6)mm
Longitud de onda: 280nm
Velocidad de flujo: 1.0 mL/min.
Volumen de inyección: 10 microlitros
Tiempo de corrida: 20 minutos
Temperatura del horno: 30°C
5.3 Preparación de fase móvil: Mezclar agua grado HPLC, Metanol HPLC, Y ácido
acético glacial en proporción de (55:45:0.1) v/v respectivamente y
homogenizar. Filtrar al vacío por membrana de nylon de poro 0.45 m.
107

5.4 Preparación de solución estándar:

a) Pesar con exactitud y ajustado al 100% de su pureza, 25.0mg de
cloranfenicol base y agregarlos con cuidado a un balón volumétrico
de 50mL.
b) Agregar 30mL de fase móvil y someter a agitación mecánica durante
10 minutos a 450 rpm, posteriormente aforar con fase móvil.
c) Tomar una alícuota de 5mL y transferirla a un balón de 25mL y aforar
con fase móvil.
d) Filtrar la solución mediante un filtro jeringa con tamaño de poro de
0.45 µm y transferir a un vial de 1.5mL de capacidad.
e) Preparar por duplicado.
Fase móvil
25.0mg Cloranfenicol base 50.0mL
Fase móvil
5.0mL 25.0mL
Concentración final = 100 µg/mL de cloranfenicol base
5.5 Preparación de solución muestra:

a) Tomar una alícuota de 20.0mL de solución oftálmica de cloranfenicol
0.25%, con pipeta volumétrica, equivalentes a 50.0 miligramos de
cloranfenicol base y agregarlos con cuidado a un balón volumétrico
de 100mL.
b) Agregar 30mL de fase móvil y someter a agitación mecánica durante
10 minutos a 450 rpm, posteriormente aforar con fase móvil.
c) Tomar una alícuota de 5mL y transferirla a un balón de 25mL, aforar
con fase móvil y homogenizar.
d) Filtrar la solución mediante un filtro jeringa con tamaño de poro de
0.45 µm y transferir a un vial de 1.5mL de capacidad, descartando los
primeros 5mL.
108

e) Preparar por triplicado

f) Filtrar fase móvil mediante un filtro jeringa con tamaño de poro de
0.45 µm y transferir a un vial de 1.5mL, como blanco.
Fase móvil
20.0ml De solución oftálmica 100.0mL
Fase móvil
5.0mL 25.0mL.
Concentración final = 100 µg/mL de cloranfenicol base
5.6 Procedimiento:
a) Ambientar la columna cromatográfica con fase móvil durante 1 hora.
b) Cuando el sistema se haya equilibrado, realizar una inyección de la
solución blanco.
c) Realizar cinco inyecciones de una de las soluciones de estándar y
verificar que el coeficiente de variación de las áreas del pico del
principio activo no sea mayor a 2.0%.
d) Realizar una inyección de cada uno de los dos estándares y calcular
el factor de correlación, el cual debe estar entre 98.0% y 102.0%. En
caso de no estar en ese rango, preparar dos nuevas soluciones
estándar y repetir las inyecciones de ambos estándares.
e) Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales de 10µL
de cada solución estándar y muestra.
f) Registrar los cromatográmas y medir las respuestas de los picos
principales.
109

5.7 Especificación:
Contiene no menos del 90.0% y no más del 110.0% de la cantidad
declarada de cloranfenicol base
5.8 Cálculos y formulas:

Ajuste de pureza del estándar al 100%:
Peso teórico del estándar %Pureza

X 100%
X = Cantidad a pesar de estándar
Factor de correlación:
Fc = (A2 x W 1) / (A1 x W 2) x 100

Donde:
A1: Área del pico del activo en el cromatográma de la solución estándar 1
A2: Área del pico del activo en el cromatográma de la solución estándar 2
W 1: Peso del activo usado en la preparación de la solución estándar 1
W 2: Peso del activo usado en la preparación de la solución estándar 2
Concentración final del estándar y Factor de respuesta:
Cst = (Pst x pureza / 100) / FD ; FR = Cst / Ast

110

Donde:
Cst : Concentración del estándar.
Pst : Peso real del estándar.
Ast : Área del estándar.
FD : Factor de dilución
FR : Factor de respuesta.
Concentración de la muestra:
Cmx = Amx x FR x FDmx ; %SR = Cmx / 50 x 100
Donde:
Cmx : Concentración de la muestra en mg / 20 mL
Amx : Área de la muestra.
FR : Factor de respuesta.
FDmx : Factor de dilución de la muestra.
%SR : Porcentaje sobre lo rotulado.
Elaborado por: Revisado por:
F. F.
Oscar López. Lic. Eliseo Ayala.
111
CAPITULO VI
CONCLUSIONES
112
VI. Conclusiones.
1. En la evaluación del parámetro de Linealidad del sistema se obtuvo un

coeficiente de determinación de 0.99 el cual se encuentra dentro del
intervalo especificado en el protocolo de validación de ser mayor o igual
a 0.98 y menor a 1.0, y el intervalo de confianza obtenido para la
pendiente no incluyó el cero. El método es lineal en el intervalo de
concentración de 0.0802 a 0.1202 mg/mL.
2. El equipo HPLC utilizado en la validación funciona correctamente ya que

en la evaluación de la precisión del sistema se obtuvo un coeficiente
variación de áreas de 0.23% y de 0.18% para los tiempos de retención
los cuales cumplen la especificación de ser menor o igual a 2.0% para
áreas y menor o igual a 1.0% para tiempos de retención.
3. El método analítico para la cuantificación de cloranfenicol demostró ser

exacto obteniéndose todos los porcentajes de recobro dentro de la
especificación del 98.0% al 102.0%.
4. La matriz utilizada en la formulación de cloranfenicol colirio 0.25% no

interfiere en la cuantificación de su principio activo permitiendo que el
método analítico empleado sea selectivo.
5. El método analítico cromatográfico para la cuantificación de cloranfenicol

se validó correctamente bajo las condiciones, equipos, reactivos y
analistas cumpliendo todas las especificaciones requeridas en el
protocolo de validación y es apto para ser usado dentro del Laboratorio
de Control de Calidad del Laboratorio Farmacéutico Nacional
113
CAPITULO VII
RECOMENDACIONES
114
VI. Recomendaciones
Al Laboratorio Farmacéutico Nacional se recomienda:
1. Que se utilice el método de análisis validado propuesto siguiendo todas

las indicaciones a cabalidad para la obtención de resultados confiables.
2. Que se incluya en el procedimiento interno de validación, la realización

del parámetro Linealidad del sistema para métodos analíticos
normalizados incluyendo los proporcionados por la Farmacopea de los
Estados Unidos
3. Realizar una calificación técnica a los analistas encargados de la

validación de los métodos analíticos, la cual quede amparada en un
documento formal y anexado dentro de las validaciones realizadas.
4. Que el jefe del departamento de validación realice una revisión de las

especificaciones de cada parámetro de validación establecidas en el
procedimiento interno del Laboratorio Farmacéutico Nacional y
actualizarlas, ó adecuarlas a las condiciones de uso reales de nuestro
país según sea el caso.
5. Que se gestione un plan de calificación propio de los equipos utilizados

tanto para la validación de métodos analíticos, como los utilizados para
los análisis de rutina del Laboratorio de Control de Calidad.
Bibliografía
1. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos (2002). Guía de

Validación de Métodos Analíticos. México A.C.
2. Comisión permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos

Mexicanos. Secretaria de la Salud (2011). Farmacopea de los Estados
Unidos Mexicanos (10 ed.). Tomo II pág. 1406-1407
3. Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América.

Farmacopea de los Estados Unidos. (2015). Trigésima octava revisión y
Formulario Nacional trigésima tercera edición. Estados Unidos de
América.
4. Genaro, A. (2003). Remington farmacia (20 ed.). Tomo II Buenos Aires:

Medica Panamericana.
5. Lorenzo, P.; Moreno, A.; Lizasoain I.; Leza, J.; Moro, M. y Portoles, A.
(2008). Velásquez Farmacología básica y clínica (18 ed.). Buenos aires:
Medica panamericana.
6. Organismo Salvadoreño de Acreditación (OSA) (2010). Guía de validación

de métodos analíticos fisicoquímicos versión 1. El salvador
7. Procedimiento interno de validación de métodos analíticos del Laboratorio

Farmacéutico Nacional.
ANEXO N° 1
PREPARACION DE SOLUCIONES Y REACTIVOS (1)
PREPARACIÓN DE FASE MÓVIL:
Agua : Metanol : Ácido acético glacial en proporción: (550:450:1)
1. Rotular adecuadamente un balón volumétrico de 1000mL como “Fase móvil
para validación de cloranfenicol colirio”, y llevarlo a la cámara de extracción
de gases.
2. Medir con probeta exactamente 550mL de agua grado HPLC y agregarlos al
balón volumétrico previamente rotulado con la ayuda de un embudo.
3. Medir con probeta exactamente 450mL de metanol grado HPLC y
agregarlos con cuidado al balón volumétrico con la ayuda del embudo.
4. Medir con una pipeta, 1mL de ácido acético glacial y agregarlo con cuidado
al balón volumétrico, tapar y agitar suavemente.
5. Filtrar la solución al vacío con la ayuda de un equipo de filtración con un filtro
de tamaño de poro de 0.45µm, posteriormente trasladar a un reservorio de
vidrio para HPLC. No es necesario desgasificar la fase móvil, ya que el
equipo a utilizar posee módulo desgasificador incluido.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE PRUEBA.

* Para la preparación de todas las soluciones se utilizara un estándar con una pureza de 99.40%.
Preparación de solución de estándar al 100%:
1. Pesar con exactitud y ajustado al 100% de su pureza, 25.0mg de

cloranfenicol base y agregarlos con cuidado a un balón volumétrico de
50.0mL.
2. Agregar 30mL de fase móvil y someter a agitación mecánica durante 10
minutos a 450 rpm, posteriormente aforar con fase móvil.
3. Tomar una alícuota de 5.0mL y transferirla a un balón de 25.0mL y aforar
con fase móvil. Esta solución contendrá una concentración final de
100µg/mL.
Fase móvil
25.0mg Cloranfenicol base 50.0mL
Fase móvil
5.0mL 25.0mL
Concentración final = 100µg/mL de cloranfenicol base
Cálculos:
Ajuste al 100% de pureza.
99.40g 100.0g
0.0250g Xg
X = 0.0252 g a pesar de estándar. (25.2mg)
Preparación de solución de prueba al 100%.

1. Tomar una alícuota de 20.0mL de solución oftálmica de cloranfenicol, con
pipeta volumétrica, equivalentes a 50.0 miligramos de cloranfenicol base y
agregarlos con cuidado a un balón volumétrico de 100.0mL.
100µg/mL.
Fase móvil
20.0mL De solución oftálmica 100.0mL
Fase móvil
5.0mL 25.0mL.
Cálculos:
Calculo de alícuota equivalente a 50.0 mg de cloranfenicol base a partir de la
solución oftálmica de cloranfenicol al 0.25% (p/v).
250.0 mg cloranfenicol base 100.0 mL
50.0 mg cloranfenicol base. X mL
X = 20.0 mL de solución oftálmica (50.0 mg de cloranfenicol base)
Soluciones de prueba para exactitud al 80%.

cloranfenicol base equivalentes al 80% de la concentración teórica y
agregarlos con cuidado a un balón volumétrico de 100mL.
2. Tomar una alícuota de 20.0mL de placebo de solución oftálmica de
cloranfenicol, con pipeta volumétrica, equivalentes a la matriz y agregarlos
con cuidado al mismo balón volumétrico de 100.0mL que contiene los
40.0mg de cloranfenicol base.
con fase móvil. Esta solución contendrá una concentración final de 80µg/mL
equivalentes al 80% de la concentración teórica.
Fase móvil
40.0 mg de cloranfenicol base 100.0mL
+ 20.0 mL de matriz
Fase móvil
5.0mL 25.0mL.
Cálculos:
99.40g 100.0g
0.0400g Xg


100µg/mL equivalentes al 100% de la concentración teórica.
Fase móvil
+20.0 mL de matriz
Fase móvil
5.0mL 25.0mL.
Cálculos:
99.40g 100.0g
0.0500g Xg


120µg/mL equivalentes al 120% de la concentración teórica.
Fase móvil
+ 20.0 mL de matriz
Fase móvil
5.0mL 25.0mL.
Cálculos:
99.40g 100.0g
0.0600g Xg

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA.
Preparación de solución madre para linealidad.
- Pesar con exactitud y ajustado al 100% de su pureza, 50.0mg de

cloranfenicol base y agregarlos con cuidado a un balón volumétrico de
50.0mL.
- Agregar 30mL de fase móvil y someter a agitación mecánica durante 15
minutos a 450 rpm.
- Posteriormente aforar con fase móvil. Esta solución contendrá una
concentración de 1000µg/ml. Preparar por triplicado.
Preparación de soluciones para linealidad.
- Ambientar una bureta de 25.0mL y posteriormente llenarla con la solución

madre preparada anteriormente.
- Agregar a cada balón volumétrico de 100.0mL, una alícuota correspondiente
a cada nivel de concentración de acuerdo a la siguiente tabla:
Alícuota “x” a añadir de Concentración final

Nivel de concentración
solución madre (Vol. final 100mL)
80% 8.0mL 80 µg/mL
90% 9.0mL 90 µg/mL
100% 10.0mL 100 µg/mL
110% 11.0mL 110 µg/mL
120% 12.0mL 120 µg/mL
- Agregar 50mL de fase móvil y someter a agitación mecánica durante 10

minutos a 450 rpm, posteriormente aforar con fase móvil. Preparar cada
solución por triplicado
Fase móvil
Fase móvil
X mL 100.0mL
Cálculos:
99.40g 100.0g
0.0500g Xg

ANEXO N° 2
PROCEDIMIENTO DE OPERACIÓN HPLC
THERMO SCIENTIFIC DIONEX ULTIMATE 3000 (3)
Procedimiento de operación HPLC Thermo Scientific Dionex Ultimate
3000:
1. Encender la fuente de poder del equipo presionando la tecla ON/OFF,
ubicado en la parte posterior del equipo.
2. Encender cada módulo del equipo a utilizar, presionando el botón
ON/OFF, ubicado en la parte posterior de cada unidad.
3. Observar y esperar que el equipo realice un chequeo automáticamente.
4. Encender la computadora y abrir el software Chromeleon 7.
5. En la ventana desplegada del software del equipo seleccionado, dar clic
en la categoría de “instrument”, y luego en “sampler”, en esta ventana
dar clic en cada una de las pestañas “prime siringe”, “wash buffer loop”, y
“wash needle externally”, para purgar la jeringa y el puerto de inyección.
6. Preparar la fase móvil de acuerdo a la técnica de análisis y transferir a un
reservorio HPLC.
7. Colocar la fase móvil en la bandeja del equipo HPLC y ubicar la línea “A”
designada para la fase móvil. (líneas B, C y D son destinadas para los
solventes puros HPLC metanol, agua y acetonitrilo respectivamente).
8. Abrir la válvula de drenaje y realizar desde el software Chromeleon 7 el
Purgado de todas las líneas de solvente incluyendo la fase móvil, con la
opción “purge”. (terminara el purgado automáticamente en 5 minutos)
9. Cerrar la válvula de drenaje.
10. Abrir la compuerta del horno y colocar la columna cromatográfica,
enroscando las férulas en cada extremo de la columna.
11. Cerrar la compuerta del horno.
12. Encender el horno y la lámpara UV desde el software Chromeleon 7.
13. Ambientar la columna cromatográfica con la misma proporción de
solventes que la fase móvil durante una hora como mínimo a un flujo de
1.0ml/min. (Nota: Controlar la presión del equipo que ésta no exceda de
4000psi mientras se ambienta y se esté realizando el análisis)
14. Posteriormente ambientar la columna cromatográfica con la fase móvil
durante una hora como mínimo con el mismo flujo de 1.0ml/min.
15. Preparar las muestras y estándares según la metodología analítica, filtrar
y colocar en viales HPLC.
16. Colocar los viales de muestras y estándares en el portaviales del HPLC
en el orden requerido.
17. Crear en el software Chromeleon 7, el método de análisis, especificando
las condiciones HPLC. (Duración de la corrida en minutos, temperatura
del horno, longitud de onda, flujo y proporción de solventes o fase móvil).
18. Crear en el software Chromeleon 7, la secuencia a utilizar por el
automuestreador, especificando el orden, el nombre, el número de
muestras y estándares a analizar, el número de repeticiones. el volumen
de inyección y el método de análisis creado anteriormente.
19. Verificar que la línea base del cromatográma se encuentre estable antes
de iniciar el análisis.
20. Iniciar la corrida de la secuencia creada anteriormente haciendo clic en el
botón “START” en el software Chromeleon 7. (El equipo iniciara a
analizar estándares y muestras en el orden especificado).
21. Una vez finalizada la secuencia de análisis, proceder al lavado de la
columna utilizando un gradiente con los mismos solventes de la fase
móvil.
22. Proceder a la obtención de los cromatográmas así como la integración
de las áreas obtenidas del pico de interés, y posterior generación de
reportes.
ANEXO N° 3
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE LINEALIDAD DEL
SISTEMA
ANEXO N° 4
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE PRECISION DEL
SISTEMA
ANEXO N° 5
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE PRECISION DEL
METODO
ANEXO N° 6
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE PRECISION
INTERMEDIA
ANEXO N° 7
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE EXACTITUD DEL
METODO
ANEXO N° 8
CROMATOGRAMAS DE LA DETERMINACION DE SELECTIVIDAD
ANEXO N° 9
FORMULAS GENERALES DE CÁLCULO (2)
FORMULAS GENERALES DE CÁLCULO.
-Media aritmética:
-Desviación estándar:
∑ ∑
√
-Coeficiente de variación:
-Ecuación linealidad:
-Cálculo de b:
∑ ∑
∑
∑
∑
-Cálculo de a:
∑ ∑
-Coeficiente de determinación:
∑ ∑
∑
∑ ∑
√(∑ ) (∑ )
ANEXO N° 10
CARTA DE ACEPTACION DE DOCUMENTACION PRESENTADA

Cloranfenicol

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Cloranfenicol

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Cloranfenicol

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UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA

PROPUESTA DE VALIDACION DEL METODO DE CROMATOGRAFIA

TRABAJO DE GRADUACION PRESENTADO POR

PARA OPTAR AL GRADO DE

SAN SALVADOR, EL SALVADOR, CENTROAMERICA

MAESTRO ROGER ARMANDO ARIAS ALVARADO

MAESTRO CRISTOBAL HERNÁN RÍOS BENITEZ

FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA

LIC. SALVADOR CASTILLO AREVALO

MAE. ROBERTO EDUARDO GARCIA ERAZO

MSc. Cecilia Haydeé Gallardo de Velásquez

Coordinadora de Área de Control de Calidad de Productos Farmacéuticos

MSc. Rocío Ruano de Sandoval

Coordinadora de Área de Industria Farmacéutica, Cosmética y

Lic. Mercedes Rossana Brito Mendoza

MSc. Eliseo Ernesto Ayala Mejía

A mi madre, por su paciencia (…vaya que si la necesito…), por sus sabios

A mi asesor MSc. Eliseo Ayala, por su valioso apoyo al desarrollo de este

Al licenciado Manuel Pineda, por su incondicional apoyo y apertura desde el

A mis queridos maestros de la Facultad de Química y Farmacia de la

A todos y cada uno de ellos infinitas gracias, atentamente:

Dedico este logro de manera especial a ti mamá, que me ayudaste a construir

Con mucho cariño:

1. Preparación de soluciones y reactivos 117

2. Procedimiento de operación HPLC Thermo Scientific Dionex

3. Cromatogramas de la determinación de Linealidad del sistema 127

4. Cromatogramas de la determinación de Precisión del sistema 135

5. Cromatogramas de la determinación de Precisión del método 136

6. Cromatogramas de la determinación de Precisión intermedia 141

7. Cromatogramas de la determinación de Exactitud del método 145

8. Cromatogramas de la determinación de Selectividad 150

9. Formulas generales de calculo 152

10. Carta de aceptación de documentación presentada 155

1. Características analíticas típicas utilizadas para la validación

2. Alcance de la validación para métodos analíticos 30

6. Niveles de concentración con su respectiva concentración 51,67

8. Resultados de la evaluación del parámetro linealidad del

9. Cuadro resumen de tratamiento de datos para la evaluación

12. Datos obtenidos en la precisión del método junto a su 85

13. Cuadro resumen de las respuestas y porcentajes de recobro

18. Respuestas obtenidas en la evaluación del parámetro de

19. Cuadro resumen de resultados obtenidos en la evaluación de

1. Estructura de la molécula de cloranfenicol 20

2. Diagrama de flujo de un cromatógrafo líquido de alto

3. Curva de regresión para los datos obtenidos en la evaluación

4. Curva de regresión para los datos obtenidos en la evaluación

5. Cromatogramas sobrepuestos de muestra, placebo y estándar

El presente trabajo tuvo por objeto proponer la validación del método de

Se elaboró el protocolo de validación en el cual se estableció el procedimiento,

De acuerdo a los resultados obtenidos, se concluyó que el método es seguro y

Esta investigación se desarrolló en base a lo establecido en el procedimiento

Los métodos utilizados en un laboratorio de análisis químico deben de ser

La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas

En el presente trabajo de investigación realizó la propuesta de validación del

mostraron resultados satisfactorios cumpliendo las especificaciones

La validación del método analítico fue realizado en las instalaciones del

2.1 OBJETIVO GENERAL

Proponer la validación del método de cromatografía liquida de alta eficiencia para

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS