Memoire Exemple 1 PDF

‫اﺔﻳﺭﻭﻬﻣﺠﻟ ﺔﻴﺮﺋﺍﺯﺟﻟﺍ ﺔﻴﻂﺍﺮﻗﻤﻳﺪﻟﺍ ﺔﻳﺑﻌﺸﻟﺍ‬
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫ﺓﺭﺍﺯﻮ ﻢﻴﻟﻌﺘﻠﺍ ﻲﻟﺍﻌﻠﺍ ﺚﺤﺑﻟﺍﻭ ﻱﻣﻠﻌﻟﺍ‬
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE M’HAMED BOUGARA BOUMERDES

DEPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE
En vue de l’obtention du diplôme
De MASTER en GENIE DES PROCEDES
Option : Qualité et conservation des aliments
THEME
Extraction, purification et caractérisation d’une

enzyme protéolytique issue de caillettes de bovins
adultes. Aptitudes technologiques des extraits
Soutenu le : 22 Juin 2017 par : BOUCETTA Sabrina

BOUBRIT Soumeya
Jury de soutenance :
Présidente : Mme TALANTIKITE S. MCB (UMBB)
Promoteur : Mr. NOUANI A. Pr. (UMBB)
Examinatrices : Mme YELLES F. MAA (UMBB)
: Mme BENMALEK N. MAA (UMBB)
Promotion 2017
Remerciements
Avant tout nous remercions « ALLAH » le tous puissant, de nous avoir ouvert les
portes du savoir et qui sans lui ce travail ne serait jamais réalisé.
Nous tenons à exprimer nos essentiels remerciements à nos parents pour leur éternel et
inconditionnel soutien, toujours présents de notre naissance à ce jour.
Nos grands remerciements à Mr NOUANI Abdelouahab, notre encadreur pour sa

générosité et l’aide nécessaire qu’il nous a apportées et nous a dirigé dans ce travail et
qui nous avons prodigué ses conseils et ses orientations.
Notre profonde gratitude aux membres du jury qui vont juger ce travail.
Madame Talantikite Souad , présidente de ce jury
Madame Yelles Fouzia , examinatrice
Madame Benmalek Nabila, examinatrice
des enseignantes du département de technologie alimentaire, a qui nous leur devons un
profond respect pour le savoir qu’ils nous ont transmis tout au long de leur carrière.
Un grand remerciement a Mr Sabaoui Khaled, responsable du laboratoire d’analyse

de l’entreprise FAIZ pour ses précieux conseils, son dévouement sans limite pour les
étudiants de notre département et son aide dans les applications technologiques. Merci
Mr SABAOUI.
Enfin, que tous ceux, de loin comme de prés, ont contribué à l’élaboration de ce
mémoire trouvent ici l’expression de nos remerciements.
BOUCETTA Sabrina
BOUBRIT Soumeya
de la promotion Master MQCA 2015/2017
Résumé
Le lait de vache est un produit noble qui présente une grande valeur nutritionnelle. Il est
utilisé dans les industries fromagères grâce à ces fortes aptitudes de coagulation.
L’objectif de notre travail est de valoriser des caillette de bovin adulte destinés a l’abattage
par l’isolement des extrais de pepsine destinés a la coagulation du lait.
L’obtention des extraits enzymatiques coagulants à été effectué selon la méthode de

VALLES et FURET, possédant une activité coagulante importante de 1697, une activité
protéolytique de 0,68 et un taux de protéine de 23.68mg/ml
L’EEB obtenu a été prépurifié par une ultrafiltration avec un Cut of de 10 kDa L’extrait
obtenue est caractérisé par une activité coagulante de 1086 US, une activité protéolytique de
0.53 et un taux de protéine de 40 mg/ml.
L’influence de certains paramètres, pH du lait température, concentration en enzyme et

concentration en CaCl2 a été étudié.. L’influence des effecteurs confirme l’appartenance des
pepsines dans le groupe des aspartyl protéases. Par ailleurs, la purification sur G75 a élué une
seule fraction douée d’activité coagulante caracterisée par un PM égal à 35 kDa.
L’évaluation des propriétés sensorielles de la pate de fromage par un jury de paneliste a

montre une similitude dans la qualité du produit avec une pate ferme, un bon aspect visuel et
une texture très appréciée au tranchage.
Mot clé : coagulation, lait, frommage, enzyme, purification, aspartyle
‫ملخص‬
‫يعتبر حليب ال بقر غذاء ذو قيمة غذائية عالية يستعمل في صناعة الجبن بسبب قوة التثخن‬
‫الهدف من دراستنا هو تقييم معدة البقر من اجل استخراج إنزيمات تستعمل في صناعة الجبن‬
‫ مغ مل‬23.68 ‫ غني بالبروتينات‬1697 ‫اإلنزيم المستخلص الخام له قوة التثخن كبيرة قيمتها‬
‫مر هذا اإلنزيم بعدة مراحل من اجل تنقيته من الشوائب مع دراسة تأثير عدة عوامل مثل تأثير الحموضة تأثير تركيز‬
‫اإلنزيم تأثير تركيز كلور الكالسيوم و تأثير الحرارة‬
‫الكلمات المفتاحية الحليب التثخن إنزيم الحموضة‬

Liste des tableaux
Liste des tableaux
Tableau N°01 : Principales différences entre la chymosine A, B et C (Lilla 2005 ; Rampilli

2005 ; Harboe et al, 2010)…………………………………………………………………04
Tableau N°2 : Origine des différentes enzymes utilisées pour coaguler le lait (Mietton et al
1994)………………………………………………………………………………………...05
Tableau N°3 : La composition des micelles du lait de vache (Vierling 1999)……………09
Tableau N°4 : Principales caractéristiques des constituants majeurs de la caséine de vache

(Alais et Linden 1994 ………………………………………………………………………10
Tableau N°5 : Caractéristique d’extrait brut de la pepsine bovine………………………….35
Tableau N°6 : caractéristique de l’extrait enzymatique ultrafiltré…………………………38
Tableau N°7 : Bilan de purification d l’extrait coagulant de la pepsine bovine …………….49
Tableau N°8: Détermination du poids moléculaire des protéines standards………………..51
Tableau N°9 : Analyse physico-chimique de la pate de fromage …………………………52

Tableau 10 : Résultats des analyse sensoriel du fromage après tranchage .........................53
Liste des figures
LISTE DES FIGURES
Figure N°1 : Modèle de micelle de caséine avec sous unités κ (Amiot et al 2002)……….11
Figure N°2 : Modification de la structure micellaire au cours de l’acidification (Jeantet
2007)………………………………………………………………………………………….13
Figure N°3 : Modification de la structure micellaire au cours de la coagulation présure
(Jeantet, 2007………………………………………………………………………………..14
Figure N°4 : Mécanisme de la coagulation du lait par la présure ((Garnier et al., 1968 ;
Alais, 1984)…………………………………………………………………………………..16
Figure N°5 : Caillette de bovin………………………………………………………..21
Figure N°6 : Caillette de bovin découpé avant congélation………………………………22
Figure N°7 : Extraction des enzymes à partir de caillette bovine (Valles et Furet
1977)………………………………………………………………………………………….23
Figure N° 8 : Dispositif d’ultrafiltration de laboratoire……………………………………26
Figure N°9: Schéma du dispositif d’ultrafiltration………………………………………….27
Figure N°10: Dispositif du Système de chromatographie basse pression sur colonne
G75 et spectrophotomètre UV-Vis pour la lecture à 280nm des fractions
éluées..... …………………………………………………………………………….....30
Figure N°11 : Droite d’étalonnage du log PM des standards protéiques…………………..31
Figure N°12 : Influence du pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait enzymatique
ultrafiltre………………………………………………………………………………………39
Figure N°13 : Effet de température du lait sur activité coagulante de l’extrait enzymatique
ultrafiltré………………………………………………………………………………………40
Figure N°14: Effet de la concentration en cacl2 du lait sur l’activité coagulante de l’extrait
enzymatique ultrafiltré ……………………………………………………………………….41
Figure N°15 : Effet de la concentration de l’enzyme sur l’activité coagulante sur l’extrait
enzymatique ultrafiltré………………………………………………………………………..42
Figure N°16 : Effet de quelque Effecteur sur l’activité coagulante des extraits enzymatiques
de la caillette de bovins adultes.....................................................................................43
Figue N°17 : Influence de la température sur la stabilité de l’extrait enzymatique
ultrafiltre………………………………………………………………………………………44
Liste des figures
Figure N°18 : Stabilité de l’extrait enzymatique ultrafiltre de au cours de sa conservation à

température ambiante…………………………………………………………………………45
Figure N°19 : Stabilité de l’extrait enzymatique ultrafiltre au cours de sa conservation
à + 4° C ………………………………………………………………………………………46
Figure N°20 : Stabilité de l’extrait enzymatique ultrafiltre au cours de sa conservation
à -18 C ° ……………………………………………………………………………………...47
Figue N°21 : Profil chromatographique d’EEUF sur gel séphadex G-75 de l’extrait
enzymatique brut ………………………………………………………………………….....48
Figure N°22: Profil d’élution sur Sephadex G-75 des protéines standards………………….50
Figure N°23 : Aspect et texture des pate de fromage témoin et expérimentale……………..53
Figure N°24 : Histogramme d`analyse statistique des paramètres sensoriels (aspect et
Texture de la pate) au seuil de probabilité de 5%. L’intervalle entre les traits pleins (Somme
des rangs compris entre 8 et 13) indique une différence non significative…………………...54
Liste des abréviations
Liste des abréviations
AC: Activité Coagulante.
AP: Activité Protéolytique.
BSA: Bovine sérum albumine.
CMP: Caseinomacropeptide.
Da: Dalton.
DO: Densité Optique.
°D: Degré Doronic.
EDTA: Acide Ethyle Diamine Tétra Acétique.M
EEB: Extrait Enzymatique Brut.
EEUF: Extrait Enzymatique Ultafiltré.
EEP: Extrait Enzymatique Purifié.
ET : Ecart Type
MM: Masse Moléculaire.
pHi: pH isoélectrique
TCA: TriChloroAcetic acid
US: Soxhlet
Table des matières
Table des matières
Introduction…………………………………………………………………………………..01
Synthèse bibliographique
I.1Chapitre I : Enzyme Coagulants
I.1.1Présure……………………………………………………………………………….…03
I.1.1.1Chymosine : (E.C.3.4.23.4) ………………………………………………...…03
I.1.1.2Pepsine (E.C. 3.4.23.1, 2,3)……………………………………………………04
I.1.2succédanés de présure…………………………………………………………………06
I.1.2.1Succédanés de présure d’origine animale……………………………………..07
I.1.2.2Succédanés de présure d’origine végétale……………………………………08
I.1.2.3Succédanés de présure d’origine microbienne ………………………………08
I.2Chapitre II : Caséines
I.2.1Caséines ....................................................................................................................09
I.2.2Structure des caséines……………………………………………………………………10
I.2.3Caséine κ…………………………………………………………………………………11
I.3Chapitre III : Coagulation du lait
I.3.1Coagulation du lait……………………………………………………………………...12
I.3.2Type de coagulation…………………………………………………………………….12
I.3.2.1Coagulation acide…………………………………………...………………...12
I.3.2.2Coagulation enzymatique……………………………………………………..13
I.3.2.3Coagulation mixte……………………………………………………………..14
I.3.3Mécanisme d’action de la coagulation…………………………………………………14
I.3.3.1Phase primaire…………………………………………………………………15
I.3.3.2Phase secondaire………………………………………………………………15
I.3.3.3Phase tertiaire………………………………………………………………….15
I.3.4Facteurs influant la coagulation du lait………………………………………………...17
I.3.4.1Effet de la température…………………………………………………..……17
I.3.4.2Effet du pH du lait……………………………………………...……………..17
Table des matières
I.3.4.3Effet de la teneur en ions calcium (CaCl2)……………………………….......17
I.3.4.4Effet de la concentration en d’enzyme……………………………………….17
I.4Chapitre IV : Fromage
I.4.1Fromage…………………………………………………………………………….……17
I.4.2Les étapes de fabrication du fromage………………………………………………….18
I.4.2.1Coagulation…………………………………………………………………………...19
I.4.2.2Egouttage………………………………………………………………………19
I.4.2.3Salage…………………………………………………………………….........19
I.4.2.4 Affinage……………………………………………………………………....19
Matériel et méthodes
II.1 Matériel biologique………………………………………………………………….…..21
II.1.1 Caillette de bovin………………………………………………………………21
II.2 Obtention de l’extrait coagulant ………………………………………………..22
II.3 Extraction de L’enzyme brut……………………………………………………22
II.4 Etude de l’extrait brut …………………………………………………………..24
II.4.1 Activité coagulante………………………………………………………..24
II.1.2 Activité protéolytique………………………………………………….....24
II.4.3 Détermination de l'indice AC/AP………………………………………..25
II.4.4 Dosage des protéines…………………………………………………….25
II.5Prépurification concentration des extraits enzymatiques ……………………...25

II.5.1 Ultrafiltration des extraits enzymatiques ……………………………….25
II.5.2 Caractérisation de l’extrait pré-purifié…………………………………27
II.5.2.1 Effet du pH. ……………………………………………………………27
II.5.2.2 Effet de la température ……………………………………………….28
II.5.2.3 Effet de la concentration en CaCl2…………………………………….28
II.5.2.4 Effet de concentration en enzyme…………………………………….28
II.5.2.5 Effet de quelque effecteur de protéases sur l’activité de l’extrait
enzymatique…………………………………………………………………………28
II.5.2.6 Etude de la stabilité d’extrait enzymatique ultrafiltre :……………….28
II.5.2.6.1 Stabilité thermique ………………………………………………...28
II.5.2.6.2 Stabilité par la conservation……………………………………….28

Table des matières
II.6 Purification de l’extrait prépurifié par chromatographie d'exclusion moléculaire sur
Sephadex G-75 …………………………………………………………………………........29
II.6.1 Détermination du poids moléculaire ………………………………………………...30

II.7 Aptitudes technologiques : Essai de fabrication d’une pate de fromage
pressée……………………………………………………………………………………….31
II.7.1 Procédé de fabrication ………………………………………………..31
II.7.2 Etapes de la fabrication ………………….……………………………32
II.3 Méthode analytiques……………………………………………………...33
II.3.1 Analyse physicochimique………………………………………………33
II.3.2 Rendement fromager……………………………………………………33
II.4 Aptitudes technologiques………………………………………………….33
II.4.1 Evaluation de la texture de la pate ……………………………………33
Résultats et discussion
III. Résultat et discussion…………………………………………………………………….35
III.1 Obtention de la condition d’extraction d’enzyme coagulante ………………...35
III.2 Caractérisation de l’extrait brut ………………………………………………..35
III.2.1 Activité coagulante …………………………………………………….35
III.2.2 Indice AC/AP …………………………………………………………..36
III.2.3 Activité protéolytique…………………………………………………..37
III.2.4 Détermination de taux de protéines de l’extrait enzymatique brut ……37
III.3 Prépurification et concentration de l’extrait clarifié par ultrafiltration avec un cut of de
10 KDA ……………………………………………………………………………………..38
III.3.1 Caractérisation de l’extrait enzymatique ultrafiltré……………………..39
III.3.1.1 Effet du pH du lait sur l’activité coagulante…………………………39
III.3.1.2 Effet de la température du lait ………………………………………40
III.3.1.3 Effet de la concentration de CaCl2 du lait…………………………41
III.3.1.4 Effet de la concentration en enzyme…………………………………42
III.3.1.5 Effet de quelques effecteurs sur l’activité de l’extrait enzymatique
ultrafiltre …………………………………………………………………………………...…43
III.3.1.6.1 Stabilité thermique ………………………………………………..43
III.3.1.6.2 Stabilité par la conservation ……………………………………..44
Table des matières
III.4 Purification d’extrait enzymatique ultrafiltre de pepsine bovine …………………….48
III.4.1 Bilan de purification d’extrait coagulant de la pepsine bovine ……….49
III.4.2 Détermination du poids moléculaire de la pepsine bovine ……………50
III.5Application fromagère : Essai de fabrication d’une pate de fromage pressée à partir de
lait de vache …………………………………………………………………………………52
III.5.1 Analyse physico-chimique de fromage ……………………………..52
III.5.2Rendement fromager………………………………………………….52
III.6.Aptitudes technologiques……………………………………………………………..53
III.6.1Aspect et texture de la pate de fromage……………………………..53
Conclusion générale
Conclusion générale………………………………………………………………………….54
Introduction
Introduction
Introduction
Dans les années 80, à l’heure de la crise d’approvisionnement en enzymes de coagulation

du lait, seules la pepsine bovine et porcine présentaient un intérêt industriel suivi des
enzymes d’origine microbienne. Les deux premières se sont révélées adéquates et sont, par
conséquent, largement utilisées en fromagerie sous forme de mélange avec la présure. Mais
depuis les deux dernières décades, cet engouement a été délaissé et la chymosine
transgénique est devenu un substitut d’excellence.
Parmi les voies de substitution de la présure, la production d’enzymes coagulant le lait à

partir de la culture microbienne, suscite un intérêt pour la fromagerie locale et dans le monde
où plusieurs souches de microorganismes font l’objet de productions industrielles de protéases
coagulantes. En Algérie, ou quelques rares fromageries existent, la source de protéase
coagulant le lait est certainement Aspergillus niger var. awamori, une enzyme probablement
transgénique réglementée dans notre pays qui produit 100% de chymosine. Des études
comparatives de cette enzyme avec la chymosine ont indiqué de grandes similarités dans le
mécanisme de la coagulation du lait et plusieurs variétés de fromages préparées avec cet
extrait sont semblables à ceux obtenus avec la présure traditionnelle.
Il est utile de rapporter que d’autres sources de protéases sont utilisées en fromagerie
notamment celle d’origine végétale ou plusieurs variétés de fromages nobles sont préparées a
travers le monde. L’enzyme la plus connue est la cardosine obtenue a partir d’une macération
de pistil du cardon (Cynara cardunculus).
Qu’en est-il des protéases d’origine animale aujourd’hui. La majorité des chercheurs se
vantent a dire que les extraits issus des caillettes de ruminants ne sont plus attractifs suite
aux pathologies qui affectent le cheptel bovin particulièrement celles dues a la maladie de la
vache folle. Cependant, la déperdition aujourd’hui se fait sentir sur le plan économique ou
des volumes importants de protéases coagulant le lait (particulièrement la pepsine) ne sont pas
valorisés. Cet état de fait a été encouragé par le développement du génie microbien et du
génie génétique dans la production des enzymes d’origine microbienne bon marché.
Toutefois, l’emploi de la pepsine bovine seule ou en synergie avec la pepsine porcine est
toujours en vigueur dans certains fromages.
1
Introduction
En Algérie, comme cite plus haut, l’industrie naissante du fromage utilise essentiellement
la source microbienne par des importations massives. C’est dans un esprit de recherche que
nous intéresses a l’estomac de bovin adulte destine a l’abattage pour produire des extraits a
partir de la caillette destinés a la coagulation du lait. En effet, Dans une revue de la littérature,
travaux rapportent que cette classe de protéases révèle dans leurs structures la présence de
deux résidus aspartyles (Asp32 et Asp215) au niveau de leurs sites actifs et le haut degré de
similitude de structure confère a ces dernières des actions analogues sur les caséines des laits.
Pour rendre compte des résultats des travaux de notre recherche, le document traite
essentiellement 3 chapitres :
1. La synthèse bibliographique, elle rapporte les travaux sur la présure de
remplacement, le lait et les mécanismes d’action des enzymes coagulant le lait
2. La méthodologie, ce chapitre rapporte les méthodes ayant trait a la production, la
caractérisation et l’étude de certaines propriétés des extraits enzymatiques
3. Les résultats et discussion, cette partie traite des résultats sur les propriétés
biochimiques de l’extrait et un’ essai de fabrication d’une pate de fromage pressée
d’une analyse sensorielle portant particulièrement la texture et l’aspect de la pate.
2
Synthèse
bibliographique
Partie I : Synthèse bibliographique
I.1Chapitre I : Enzyme Coagulants
I.1.1.Présure
La présure est une enzyme protéolytique, extrait de la quatrième poche de l’estomac

(abomasum ou caillette) des jeunes ruminants nourris exclusivement au lait (avant sevrage)
(Eck et Gillis, 1997).
La présure de veau est l’agent coagulant traditionnellement utilisé pour la coagulation du
lait en vue de la fabrication de la majorité des fromages (Alais, 1984 ; Ramet, 1997). Elle
contient deux fractions actives, l’une majeure, constituée par la chymosine (80%) l’autre,
mineure, par la pepsine (10 – 20%) (Alais, 2003).
I.1.1.1.Chymosine : (E.C.3.4.23.4)
La chymosine est sécrétée inactive sous forme de « pro-chymosine » dans la caillette, sous
«
l’action de l’acidité provenant du suc gastrique, elle se transforme en chymosine active »
(Goursaud, 1999). C’est une protéase acide aspartate. Son poids moléculaire est de 30 700
Da. Elle est constituée d'une seule chaîne peptidique renfermant 323 acides aminés
(Foltmann, 1979).
La prochymosine devient active sous l’action de l’acidité présente dans le milieu
gastrique. a pH 4-5, elle est convertie en chymosine mature par coupure d’un pro-segment de
42 acides aminés N terminaux, tandis qu’à pH 2, elle subit un clivage d’un peptide de 27
acides aminés N-terminaux générant un intermédiaire actif appelé pseudo-chymosine de 338
acides aminés (37,4 kDa) Pedersen et al, (1979 ) et Ricter et al, (1998). Ce dernier est stable
à un pH inferieur à 3 ou supérieur à 6 mais à pH 4,5, il se transforme en chymosine (Kumar
et al, 2010).
L'activité optimale de la chymosine est à pH 5,5 et à une température de 42°c. Il ya
plusieurs configuration de la chymosine telle que : la chymosine A, la chymosine B, la
chymosine C, les principales différences entre ces chymosine sont indiquer dans le tableau au
dessous (Tableau N°1).
3
Tableau N°1 : Principales différences entre la chymosine A, B et C (LILLA et al, 2005 ;

Rampilli et al, 2005 ; Harboe et al, 2010).
Propriétés Chymosine A Chymosine B Chymosine C
Acides aminés Acide aspartique en Glycine en position Plusieurs acides

différents position 244 244 aminés différents
MM 35,71 kDa 35,65 kDa Non déterminé
pHi 4,44 4,57 4,60
Stabilité Moins stable, Plus stable, Plus stable,
facilement difficilement difficilement
dégradable dégradable dégradable
Abondance dans la Peu abondante La plus abondante Composant mineur
présure animale
Activité Activité coagulante La plus faible Activité coagulante
30% supérieure à activité coagulante ; 65% supérieure à
celle de la ≈ 223 IMCU mg-1 celle de la
chymosine B ; chymosine B ;
≈ 290 IMCU mg-1 ≈ 368 IMCU mg-1
I.1.1.2.Pepsine (E.C. 3.4.23.1, 2,3)
La pepsine est une protéase acide sécrétée dans le sac gastrique de tous les mammifères
après sevrage sous forme de précurseur inactif appelé pepsinogène d’un poids moléculaire de
42000 daltons. Contrairement à la chymosine, la pepsine à une activité plus élevée et une
activité coagulante faible.
 Propriétés
La présure à deux propriétés importante qui sont :

 Une activité élevée sur la caséine κ qui conduit à la déstabilisation micellaire au cours
de la phase de coagulation.
 Une activité faible de protéolyse générale sur les différentes fractions caséiniques, qui
intervient essentiellement pendant l’affinage du fromage.
4
Tableau N°2 : Origine des différentes enzymes utilisées pour coaguler le lait
Origine Enzymes
Animaux Ruminants Chymosine + pepsine
 Veaux ()
 Chevaux ()
 Agneaux ()
 Bovins adultes ()
Monogastriques
 Porc
Pepsine + chymosine
 Oiseaux
Pepsine
 Poulets
Pepsine
Végétaux  Figuier (suc) Ficine
 Ananas (tige) Broméline
 Chardon, artichaut
 Gaillet
 Courge
Moisissures  Endothia parasitica

()
 Mucor pusillus () Protéase
 Mucor miehei () Protéase

Protéase
 Aspergillus niger
Chymosine "PVGG"**
Levures  Kluyvermyces lactis Chymosine "PVGG"**
Bactéries  Escherichia coli Chymosine "PVGG"**
 Bacillus subtilis Subtiline "PVGG"**
* coagulants autorisés en France

** PVGG : préparée par voie de génie génétique
5
I.1.2.Succédanés de la présure
La présure traditionnelle telle que la chymosine est très utilisé dans les industries
fromagères. La forte demande subite l’approvisionnement de la présure est plus difficile. Des
travaux on été lancé afin de trouver d’autre sources potentielle de protéase pour remplacer la
présure nommées des succédané de présure ( Nouani et al, 2009)
Les enzymes coagulantes appelées aussi les succédanés de présure, ils sont classées on 3
catégories selon l’origine de l’enzyme :
 Succédanés de présure d’origine animale.
 Succédanés de présure d’origine végétale.
 Succédanés de présure d’origine microbienne.
Les succédanés de présure doivent représentés certains nombre de condition pour pavoir les
utilisé :
 l’activité protéolytique doit être faible comparativement à l’activité coagulante.
 la spécificité protéolytique sur la β-caséine doit être faible, sinon l'amertume se
produit dans le fromage (Dalgleish, 1992 ; Fox et Kelly, 2004).
 la pureté chimique et la qualité microbiologique doivent être élevées.
 le rendement fromager devrait être identique à celui de la présure (Germonville,
2003) et (Mistry, 2012).
 prix nettement inférieur à celui de la présure de veau (Nouani et al, 2009)
 Caractéristique physico-chimique de succédanés de présure
 Bonne solubilité dans l’eau : Celle-ci conditionne la répartition du produit et

permet l’obtention d’une coagulation homogène dans toute la masse du lait.
 Une odeur et couleur faible ou nulle de façon à ne pas modifier l’aspect et les
qualités organoleptiques du fromage.
 Un degré de pureté élevée, indispensable pour éviter divers accidents dus à la
prolifération des micro-organismes indésirables ou à des activités d’enzymes
contaminants.
 Absence de toxicité pour le consommateur.
 Activité antibiotique nulle de façon à ne pas perturber le développement des
ferments lactiques au cours du processus d’élaboration du fromage.
 Activité protéolytique et lipolytique faible.
6
I.1.2.1.Succédanés de présure d’origine animale
I.1.2.1.1Pepsine bovine (E.C.3.4.23.1)
Nommée aussi la pepsine A, elle provient de l’estomac d’animaux adultes, sa masse

moléculaire est de 33370 Da et contient 313 acides aminés (Graindy, 1978), (Fox, 1969) et
(Mathieu, 1981.). La pepsine bovine a une activité protéolytique proche de celle de la
chymosine, cette activité dépond du pH du milieu, elle est généralement active dans des
milieux acide ou le PH est de 1.5 à 2 et l’activité soit plus élevé (Goursaud, 1992). Par contre
dans des milieux basique pH supérieure de 6.3, l’activité baisse rapidement et le lait ne
coagule pas (Eck et Gillis, 1997). La pepsine bovine est destinée à la fabrication du Cheddar
(Shamsuzzuman et al ,1985) et (Cuvellier, 1999).
D’après Bengana, (2001), le remplacement de la présure par la pepsine bovine permet la
fabrication de fromage à patte molle type Camembert.
I.1.2.1.2.Pepsine porcine
Nommée aussi la pepsine B, elle à une particularité plus limitée que la pepsine bovine et
dégrade faiblement l’hémoglobine (Linden et Humbert, 1991). Elle est composée d’une
seule chaine polypeptidique de 321 résidus d’acides aminés et sa masse moléculaire est de
35000 Da (Sepulveda et al, 1975) et (Kageyama et Takahashi, 1976).
Le mélange de la pepsine porcine avec la présure permet la fabrication de fromage acide de
bonne qualité (Ramet ,1990). Elle est utilisé aussi pour la fabrication des fromages à patte
molle et à patte pressé non cuite grâce à l’application des traitements de correction
(augmentation du T °c de maturation, de la concentration en CaCL2).
I.1.2.1.3.Pepsine gastricine
Nommée aussi pepsine C, elle à une forte activité vis-à-vis l’hémoglobine (Linden et
Humbert, 1991). Elle est extrait de proventicule de poulet utilisé pour la fabrication du
fromage à patte molle, les résultats obtenue sont comparer avec un fromage faite par la
présure confirme qu’il ya aucune déférence dans le rendement et la qualité du fromage.
D’après l’étude de Morsli, (1996).
Cette pepsine à été utilisé en Israël pour la fabrication des fromages locaux d’après
(Cuvellier ,1999). Récemment en Turquie les travaux en été reprise (Hasan Temiz, 2009).
7
I.1.2.2.Succédanés de présure d’origine végétale
Des travaux très récents menés sur des substrats de plantes ont été publies montrant le
nouvel intérêt que suscite les protéases d’origine végétale (Egito et al ; 2007;Tejada et al.,
2008; Chazarra et al., 2007; Pereira et al., 2008). Il existe plusieurs préparations
coagulantes issues de règne végétale et sont extraite par macération de différente partie de
plante supérieure (Eck et Gillis, 1997).
Parmi les espaces connues de climat tempéré on peut citer : le gaillet, l’artichaut et le chardon
(Rao et al, 1998 ; Sousa et Malkata, 2005 ; Silva et Malkata, 2005).
Actuellement la tendance tans vers les coagulants végétaux grâce à la disponibilité de matériel
végétale et la forte stabilité de coagulase (Nadhour et Belloul, 2003) cet extrait présente un
bonne potentiel coagulant dans l’industrie fromager.
I.1.2.3.Succédanés de présure d’origine microbienne
Plusieurs protéases d’origine microbienne on été utilisé dans la fabrication du fromage car
ils ont le même fonctionnement que celle de la chymosine. Elles sont produites par
fermentation. Elle présente des inconvénients telle que une grande activité protéolytique, un
rendement faible dans la fabrication fromagère (Harboe et al, 2010).
Parmi les espèces microbiennes utilisées pour la fabrication à grande échelle sont :
Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Cryphonectria parasitica (Claverie-Martin et
Vega-Hernànndez, 2007). D’après (Chitpinityol et Crabbe, 1998 et Germonville ; 2003) la
protéase aspartique produite par Rhizomucor miehei est la plus utilisé dans les industries
fromagère. En Algérie une protéase transgénique d’origine microbienne Aspergillus niger var.
awamori est actuellement utilise par les fromagers dans la coagulation du lait.
8
I.2Chapitre II : Caséines
I.2.1.Caséines
Elles représentent 80 % des protéines du lait. Ce sont elles qui constituent le coagulum qui
donnera naissance, après égouttage et maturation, au fromage.
Les protéines du lait peuvent être réparties en deus catégories :
 les caséines (insoluble à pH 4.6)
 les protéines du lactosérum (soluble à pH4.6).
L’appellation caséine regroupe en fait quatre protéines majeures : les caséines s1, s2,  et 
et des protéines mineures (existant en plus faible quantité) ainsi que des composants issus de
l’hydrolyse de la caséine  par la plasmine (γ caséines et protéase-peptones).
La micelle de caséine est une particule sphérique d’un diamètre de 30 à 300nm (Mahaut et
al, 2000).
Toutes les micelles n’ont pas les mêmes dimensions mais la même composition. Les grosses
micelles ont une charge minérale plus élevés et des proportions relatives de caséine β et  plus
faible que les petites. (Brule et al, 1997).
Tableau N°3 : La composition des micelles du lait de vache. (Vierling, 1999).
Constituants %
Caséine 94
Calcium 2,9
Magnésium 0,1
Phosphore organique 0,8
Phosphore inorganique 1,4
Citrate (en acide citrique) 0,5
9
Caractéristiques des constituants majeurs de la caséine de vache :
Tableau N°4 : Principales caractéristiques des constituants majeurs de la caséine de

vache (Alais et Linden, 1994) * Données pour les variantes s-B, s2-A, -A2, -B et -A2
Caséines s1 s2   
Proportion moyenne en p. cent 36 10 34 13 3

Poids moléculaire (Da) 23600 25250 24000 19000 21000
Résidus d’acides aminés * 199 207 209 169 181
Phosphore (p. cent) 1.10 1.23-1.60 0.56 0.2 0.16
Glucides (p. cent) 0 0 0 5 0
Résidus cystéine* 0 2 0 220 0
Proline 17 10 35 0 34
Sensibilité au calcium ++ +++ + +++ ?
Sensibilité à la chymosine + - + A;B -
Variants génétiques A; B; A;B;D A1 ; A2 ; A3 ; 5.30 A1 ; A2 ;
Hydrophobicité (en KJ) C;D 4.64 B;C;E 18 A3 ; B
Groupes acides (Asp + Glu + Px2) 4.89 49-55 5.66 17 -
Groupes basiques (Lys + Arg + 48 33 31 16
His) 25 20 16
I.2.2.Structure des caséines
Jusqu’à maintenant, on a proposé différents modèles structuraux de micelles et il semble

clair que les micelles sont formées de sous-micelles reliées ensemble par des ponts phosphate
de calcium. Les sous-micelles périphériques sont plus hydrophiles et contiennent une plus
grande proportion de κ-caséine.
La constitution de la micelle de caséine est différente au centre et en périphérie. Les
caséines β et αs1 sont plus présentes au centre de la micelle et forment le cœur hydrophobe,
tandis que la partie externe de la micelle est formée de caséines α s1, αs2 et κ (Amiot et al ;
2002) (Figure N°1)
10
Figure N°1 : modèle de micelle de caséine avec sous unités κ (Amiot et al ; 2002).
I.2.3.Caséine κ
Une grande majorité de cette caséine se trouve à la surface de la micelle, accessible à la

présure. Cette caséine est insensible au Ca2+ et stabilise les autres caséines phosphoryles vis-
à-vis de ce cation. La coagulation du lait se fait suite à la protéolyse de cette caséine par la
présure qui scinde la molécule en deux parties : la partie N-terminale ou paracaséine κ (1-105)
et le fragment C-terminale ou caséineomacropeptide (CMP : 106-169) aux propriétés très
contrastes.
A pH 7 :
 le CMP possède une charge électrique négative et hydrophile.
 la paracaséine κ possède une charge électrique positive et hydrophobe.
Dans le caillé, seules sont récupérées les caséines αs1, αs2, β, et paracaséine κ tandis que le
CMP se retrouve dans le lactosérum (Debry, 2001)
11
I.3Chapitre III : Coagulation du lait
I.3.1. Coagulation du lait
 Définition
La coagulation du lait est une étape importante dans la préparation du fromage. Il s’agit de
la transformation du lait liquide en un gel, appelé aussi coagulum ou caillé. On distingue deux
types de coagulation : la coagulation acide et la coagulation enzymatique. Cependant, en
fromagerie, la coagulation du lait résulte le plus souvent de l’action combinée d’une enzyme
et de l’acidification, seule varie l'importance relative de leur action coagulante respective.
I.3.2.Type de coagulation
I.3.2.1.Coagulation acide
Elle consiste à précipiter les caséines à leur point isoélectrique (pHi= 4,6) soit :
 par acidification biologique à l’aide de bactéries productrices d'acide lactique
(bactéries lactiques contaminant à l'état naturel le lait ou apportées sous forme de
levains) (Mahaut et al, 2005).
 par acidification chimique (injection de CO2 addition de gluconodeltalactone)
(Mahaut et al, 2000).
Le gel formé présente une perméabilité satisfaisante, mais une friabilité élevée avec une
élasticité et plasticité pratiquement nulles dues au manque de structuration du réseau. (Figure
N°2).
12
Figure N°2 : Modification de la structure micellaire au cours de l’acidification

(Jeantet, 2007).
I.3.2.2.Coagulation enzymatique
Il s’agit de l’action de la présure (plus précisément de la chymosine) qui va hydrolyser
préférentiellement la caséine  en un site préférentiel de coupure. (Figure N°3)
La coagulation de type présure a généralement lieu pour des pH compris entre 6.2 et 6.7 : pH
pour lesquels la déminéralisation de la micelle est nulle ou faible. Dans ces conditions, la
structure de la micelle est stabilisée. (Lenoir et al, 1985).
13
Figure N°3 : Modification de la structure micellaire au cours de la coagulation présure

(Jeantet, 2007).
I.3.2.3.Coagulation mixte
Ce type de coagulation consiste en l’action de la présure et l’acidification du lait. C’est la
voie la plus utilisée dans les industries fromagères en particuliers pour la fabrication des
fromages frais (petit suisse, demi sels….) et des fromages à pâte molle (Camembert, Brie…)
(Green.1977 ; Cheftel et Cheftel, 1980 ; wigley 1996)
Dans les deux cas, après formation de coagulum, celui-ci s’exsude et se détache du
lactosérum : c’est la synérèse de caillé ou égouttage. Ce phénomène de synérèse est rapide
pour le coagulum par emprésurage et lent pour le coagulum acide (Lenoir, 1985).
I.3.3.Mécanisme d’action de la coagulation
On distingue 3 phases de coagulation :

 Phase primaire ou hydrolyse enzymatique.
 Phase secondaire ou agrégation des micelles.
 Phase tertiaire ou réticulation du gel (Mahaut et al ; 2003).
14
I.3.3.1.Phase primaire
La phase enzymatique correspond à une protéolyse limitée de la caséine κ, portant sur la
liaison Phe105-Met106.
La chaîne peptidique de la caséine κ est ainsi coupée en 2 segments de caractéristiques
différentes :
 Le segment 1-105 ou paracaséine κ est hydrophobe, basique et reste intégré la
micelle.
 le segment 106-169 ou caséinomacropeptide (CMP) est très hydrophile, acide et
passe dans le lactosérum (Fox et al, 2000 ; Mcsweeney, 2004).
Lorsque le CMP se détache de la caséine, il se produit une réduction des charges négatives
de la micelle ainsi que son degré d’hydratation par la perte de sa partie hydrophile. Du fait de
la suppression de ces deux facteurs essentiels dans la stabilité des caséines en solution, des
liaisons peuvent alors s’établir entre les micelles modifiées, permettant leur agrégation et
finalement la formation d’un gel, c’est la phase de coagulation proprement dite .
I.3.3.2.Phase secondaire
A pH 6,6, lorsque 80 à 90% de la caséine κ est hydrolysée (correspondant à 60% du temps
nécessaire pour observer virtuellement la coagulation), l’agrégation se met en place par des
liaisons électrostatiques et hydrophobes entre les micelles modifiées (Mahaut et al ; 2000).
I.3.3.3.Phase tertiaire
L’agrégation démarre lorsque 85 à 90 % de la caséine  est hydrolysée et elle atteint sa
vitesse maximale lorsque la totalité de la caséine  est hydrolysée. Des liaisons
électrostatiques et des liaisons hydrophobes participent à la formation du gel. Le calcium
ionique et le phosphate de calcium colloïdal jouent aussi un rôle déterminant dans le
phénomène.
15
Figure N°4 : Mécanisme de la coagulation du lait par la présure

(Garnier et al., 1968 ; Alais, 1984).
16
I.3.4.Facteurs influant la coagulation du lait
I.3.4.1.Effet de la température
La coagulation dépend de la température, la température optimale de la présure est de 40-
42°C. À température inférieure de 10 c il ya pas de coagulation du lait. La coagulation est
Lente à des températures supérieures à 20. De 20 à 42 la vitesse de formation de coagulant
Augmente progressivement, mais à des températures plus élevé le processus de coagulation
ralentie et au dessus de 6,5 cil ya pas de coagulation l’enzyme est inactivé (Brule, 2006)
I.3.4.2.Effet du pH du lait
L’influence de pH joue un rôle très important sur le temps de coagulation (Najera et al,
2003). En passant de pH 6.7 à 5.6 la vitesse de coagulation se multiple par 30 résulte
l’élévation de la vitesse d’hydrolyse nécessaire pour l’agrégation. À pH supérieur à 7, il n’y a
plus de coagulation, l’enzyme étant rapidement inactivée (Lenoir et al, 2006).
I.3.4.3.Effet de la teneur en ions calcium (CaCl2)

D’après Roupas, (2001) l’ajout de CaCl2 est très important dans la fabrication fromagère
implique la diminution de temps de coagulation et la fermenté d’un gel est plus élevés
(Mahautet et al ,2000).
L’addition de CaCl2 permet également de réduire le pH du lait résultant une augmentation de
taux d’agrégat des protéines.
I.3.4.4.Effet de la concentration en d’enzyme
Le temps de coagulation est inversement proportionnel à la quantité d’enzyme utilisé

(Mahaut et al, 2005). La formule suivante permet d’obtenir ce temps de coagulation :
TC = K/ E+Ta
TC : temps de coagulation
K : inverse de la constante de vitesse
E : concentration en enzyme
Ta : temps écoulé entre la fin de la réaction enzymatique et le moment de coagulation
17
I.4Chapitre IV : Fromage
I.4.1.Fromage
 Définition
Solon le codex alimentarius Le fromage est définie comme étant un produit affiné ou non
affiné, de consistance molle ou semi dure, ou extra dure qui peut être enrobé et dans lequel le
rapport protéines de lactosérum/ caséines ne dépasse pas celui du lait. Il est obtenu par :
 coagulation complète ou partielle des matières premières suivantes : lait et/ou
produits obtenus à partir du lait, grâce à la présure ou d’autres agents coagulants
appropriés et par égouttage partielle du lactosérum résultant de cette coagulation.
 Par l’emploi de techniques de fabrication entraînant la coagulation du lait et/ou
produits provenant du lait.
Fromage affiné
C’est un fromage qui n’est pas prêt à la consommation peu après sa fabrication, mais qui
doit être maintenu pendant un certain temps à la température et dans les conditions
nécessaires pour que s’opèrent les changements biochimiques et physiques caractéristiques du
fromage.
Fromage affiné aux moisissures

C’est un fromage affiné où l’affinage est provoqué essentiellement par la prolifération de
moisissures caractéristiques dans la masse et/ ou sur la surface du fromage.
Fromage non affiné

C’est le fromage frais est un fromage prêt à la consommation peu de temps après sa
fabrication.
I.4.2.Etapes de fabrication du fromage
La fabrication du fromage comporte trois phases principales :

 La coagulation.
 L’égouttage,
 L’affinage.
18
I.4.2.1.Coagulation
La coagulation du lait est une étape importante dans le processus de fabrication du
fromage. Il S’agit de la transformation du lait liquide en un gel, appelé aussi coagulum ou
caillé, résulte des modifications physico-chimiques intervenant au niveau des micelles de
caséines.
I.4.2.2.Egouttage
L’égouttage c’est l’étape de séparation du caillé et du lactosérum, la nature du fromage
fabriqué dépend de la méthode d’égouttage appliquer.
L’égouttage est le résultat de deux phénomènes physiques différents :
 Un phénomène actif, la synérèse.
 Un phénomène passif, L’exsudation spontanée du sérum, liée à la perméabilité du
coagulum, est une des caractéristiques des gels lactiques (Alais, 1984).
I.4.2.3. Salage
Le salage peut s’effectuer selon deux techniques :
 salage à sec par saupoudrage superficiel, par frottage ou par incorporation dans la
masse du caillé (cantal, cheddar).
 salage en saumure par immersion dans une solution saturée en NaCl.
L’incorporation du chlorure de sodium dans le fromage a pour objectifs :
 d’assurer un complément d’égouttage;
 de contribuer éventuellement à la formation de la croute;
 de régler l’activité de l’eau (aW) du fromage qui oriente et freinte les
développements microbiens et les actions enzymatiques au cours de l’affinage;
 d’accroître le potentiel organoleptique fromage (Mahaut et al, 2003).
I.4.2.4.Affinage
L’affinage correspond à une phase de digestion enzymatique des constituants du caillé,
c’est un processus biochimique complexe pour plusieurs raisons:
 d’une part, la matrice issue de la coagulation et de l’égouttage du lait présente
une très grande hétérogénéité physicochimique.
 d’autre part, les enzymes intervenant dans l’affinage ont plusieurs origines.
19
Ces transformations confèrent à la pâte fromagère des caractères nouveaux ; elles la modifient
dans son aspect, dans sa consistance. Simultanément, saveur, arôme et texture se développent
(Jeantet, 2007).
20
Matériel et méthodes
Partie II : Matériel et méthodes
II Matériel et méthodes
Le présent travail a été réalisé au niveau des laboratoires pédagogiques du département de

technologie alimentaire de la faculté des sciences de l’ingénieur.
La partie expérimentale se partage en deux volets, à savoir :
 Volet biochimique : inclue l’extraction de l’extrait enzymatique coagulant le lait à
partir de la caillette de bovin adulte, l’estimation de son activité coagulante, et sa
caractérisation par l’étude de l’influence de certains paramètres chimiques et la
détermination de son poids moléculaire.
 Volet technologique : qui concerne l’essai de fabrication du fromage a pate pressée à
partir du lait de vache utilisant l’agent coagulant caractérisé.
II.1 Matériel biologique
II.1.1Caillette de bovin
Notre étude est basée sur la caillette de bovin, qui est la matière première d’extraction
d’enzyme coagulante. La caillette provient de bovin adulte âgé de 2 ans après abattage au
niveau de l’abattoir de Thenia Wilaya de Boumerdes.
Figure N°5 : Caillette de bovin (photo réelle)
21
II.2 Obtention de l’extrait coagulant
Après abattage des bovins sélectionnés, la quatrième poche de leurs estomacs est prélevée.
Les caillettes sont lavées à l’eau de robinet, dégraissées, hachées en petits morceaux, et mises
dans des boites en plastique puis congelées à -18°C.
Figure N°6 : Caillette de bovin découpé avant congélation (photo réelle)
II.3 Extraction de l’enzyme brut
L’extraction de l’enzyme est réalisée selon la méthode de Valles et Furet (1977) utilisée
pour l’obtention de la pepsine.
Des échantillons de poids P (en g) chacun, son macérés à 42°C dans un volume (V = 1,25 x
P) d’une solution d’acide chlorhydrique 0,2M pendant 60 minutes. Après filtration de chaque
mélange, des extraits enzymatiques bruts sont obtenus. Ces derniers subissent alors une
clarification par addition de 1% (V/V) d’une solution de sulfate d’aluminium (AlSO 4) 1M et
de 5% (V/V) d’une solution de sulfate de sodium (Na 2SO4) 1M chauffée à 42°C.. Après un
repos d’une heure suivie d’une centrifugation à 7000xg /20 min, nous obtenons un précipité
humide que l’on fait dissoudre dans un minimum d’eau distillée. Le pH de ces extraits
enzymatiques gastriques clarifiés est ajusté 5.5 par une solution de phosphate dissodique1M.
La conservation des échantillons est réalisée à 4°C jusqu'à utilisation.
22
Préparation des
caillettes Caillettes (lavée,
dégraissés)
Hachage
Congélation (-18°C)
Macération
Hcl 0,2M à 42°C
Filtration (papier filtre)
Clarification
(42°C quelque minute)
+1% sulfate d’aluminium
1M (V/V) +5% sulfate
dissodique 1M (V/V) avec
agitation
Concentration du Filtration (papier filtre

filtrat Repos (60min)
Contrifugation
(2100xg/min)
Dissolution (eau distillé

20min) 10% (V/V)
Ajustement du pH
pH =5,5 par du phosphate

dissodique 1M ,42°C
Réfrigération à +4°C
Conservation
Figure N°7 : Diagramme d’extraction des enzymes à partir de caillette de bovin par la
méthode de Valles et Furet (1977).
23
II.4 Etude de l’extrait brut
II.4.1 Activité coagulante

L’activité coagulante de l’extrait enzymatique brut EEB est déterminée selon la méthode
rapportée par Shieh et al (2009). Cette activité exprimée en force coagulante correspond au
volume du lait coagulé par unité de volume de l’extrait enzymatique, en 40 minutes, à 35°C et
à pH= 6,4. Une unité Soxhlet (US) est définie comme la quantité d’enzyme qui coagule 1ml
d’une solution de substrat de Berridge à 35°c pendant 40mn
La formule de calcul de la force coagulante est la suivante :
𝟐𝟒𝟎𝟎.𝐕
𝐅= Fd
𝐓.𝐯
Où :
F : force coagulante.
V : volume du lait à coaguler (10ml).
T : temps de coagulation du lait en secondes.
v : volume de l’extrait enzymatique (1ml) ; Le nombre ‘2400’ représente le temps standard du
test (40 minutes) en secondes.
Fd : Facteur de dilution
Remarque : le lait utilisé pour déterminer la force coagulante correspond au substrat de
Berridge (Berridge,1945) Préparation en (Annexe 1)
II.1.2 Activité protéolytique
L'activité protéolytique est déterminée par la méthode rapportée par Silva et al (2014) et
Shieh et al (2009)
Le mélange réactionnel est composé de 0,4 ml de caséine à 0,5% (Sigma) (p / v) dans de l'eau
distillée, 0,4 ml de tampon acétate à 0,2 mol / L à pH 5,5 et 0,2 ml de l'enzyme brute. La
réaction s'est déclenchée dans un bain à 35 ° C et pendant de 30 minutes, et ensuite arrêtée en
ajoutant 1 ml d'acide trichloroacétique (TCA) à 10%.dans 2 ml du filtrat on additionne 5 ml
de solution de NaOH (0,28 N) et 1,5 ml de réactif phénol (solution de phénol Folin-Ciocalteu:
eau = 1: 2). Après avoir maintenu le mélange à 35 ° C pendant 15 minutes, la densité optique
(DO) sera mesurée à 660 nm. L'activité protéolytique est exprimée en unités (PA)
correspondant à DO 660nm.
24
II.4.3 Détermination de l'indice AC/AP
Selon Abel-Fattah et El-Hawwary (1974), le rapport de l’activité coagulante sur

l’activité protéolytique (AC/AP) pour les préparations enzymatiques représente l’indice
d’appréciation de la qualité de ces présures par rapport à la présure de référence.
Sa mesure permet de déterminer l’aptitude d’une préparation enzymatique à coaguler le lait
au même titre que la présure. C’est dans cet esprit que nous avons déterminé ce rapport qui
correspond à la mesure des deux activités décrites précédemment.
II.4.4 Dosage des protéines
Le dosage des protéines totales des extraits coagulants est réalisé selon la méthode de
Lowry et al (1951). Le principe de cette méthode est basé sur la coloration bleue développée
par les protéines suite à une réaction entre le réactif de folin et les acides aminés,
principalement la tyrosine et le tryptophane et à un degré moins de cystéines et l’histidine.
L’intensité de coloration est proportionnelle à la concentration protéiques contenue dans les
l’extraits. Cette concentration est détermine à l’aide d’un courbe étalon établie utilisant le
sérum d’albumine bovin (B.S.A à 200 µg/ml).
II.5 Prepurification et concentration des extraits enzymatiques
Le prépurification des protéines dont les enzymes utilise généralement le relargage par
précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium. C’est une technique qui a ses propres
limites telles les pertes de protéines lors du fractionnement. A cet effet et dans le but
d’améliorer la force coagulante de nos extraits enzymes tout en évitant les pertes en enzymes
actives et en augmentant leur concentration, nous avons appliqué la technique de
l’ultrafiltration.
II.5.1 Ultrafiltration des extraits enzymatiques
L'ultrafiltration est définie comme un procédé de séparation en phase liquide, par

perméation à travers une membrane permsélective sous l'effet d'un gradient de pression. La
séparation est principalement en fonction de la taille des particules dispersées dans la solution
(quelques dizaines à quelques centaines d'angströms) et de leur masse moléculaire.
L'ultrafiltration concerne donc les colloïdes, les macromolécules synthétiques et naturelles, les
25
virus. La taille des pores des membranes est comprise entre 1 et 100 nm (Maure ,1989 ;
Renner ; Abd El-Salam, 1991).
 Procédure
L’ultrafiltration est réalisée au niveau du laboratoire pédagogique du département a

partir d’un dispositif de l’ultrafiltration, type « oméga » de seuil de coupure (ou cut of) de 10
KDa. L’extrait enzymatique clarifie circule, à partir d’un réservoir de 500ml contenant Y ml
d’extrait enzymatique brut a l’aide d’une pompe péristaltique. Le liquide est homogénéisé à
l’aide d’une spatule. Au cours de la circulation de l’extrait enzymatique, le perméat est
collecté dans un cylindre gradué tandis que le retentât est retourné vers le réservoir Figure
N°8. À la fin de l’opération, la membrane est raclée avec un volume connu d’eau distillée afin
de récupérer les protéines collées à la surface de la membrane tout en évitant son colmatage
Pompe Réservoir
péristaltique
Membrane
d’ultrafiltration
Perméat
. Figure N° 8 : Dispositif d’ultrafiltration de laboratoire (photo réelle, Département de

technologie alimentaire, UMBB)
26
Retentât
1 3
1: Réservoir. Perméat
2 5
2: Pompe péristaltique.
3: Manomètre.
4: Membrane d’ultrafiltration.
5: Cylindre gradué (récupération du permeat)
6: Valve.
Figure N°9: Schéma du dispositif d’ultrafiltration (réalisé à partir de la photo ci-dessus)
Dans cet extrait, l’activité coagulante, l’activité protéolytique, l’indice AC/AP et le taux
de protéines ont été mesurés (Cf II.4 )
II.5.2 Caractérisation de l’extrait pré-purifié

La caractérisation de l’extrait enzymatique passe par la détermination des conditions
optimales de l’activité coagulante, ce dernier est susceptible d’être modifiée par plusieurs
facteurs en particulier le pH, la concentration en CaCl 2 et la température et concentration
d’enzyme.
II.5.2.1 Effet du pH
L’influence de pH du lait sur l’activité coagulante de l’extrait enzymatique a été

déterminée en faisant varier le pH du lait de 5,5 à 8.
27
II.5.2.2 Effet de la température
La température optimale de coagulation du lait a été déterminée en portant le lait à

différentes températures de 30°C à 80°C avec un incrément de 5° C
II.5.2.3 Effet de la concentration en CaCl2
L’influence de la concentration en CaCl2 sur l’activité coagulante a été déterminée en

faisant varier la concentration du lait en ions CaCl 2 de 0,01 M à 0,05 M.
II.5.2.4 Effet de la concentration en enzyme

La concentration optimale est évaluée en mesurant le temps de coagulation du lait le plus
court à des concentrations en enzyme Avec des dilutions de 1/2 à 1/10. Elle est exprimée en
mg/ml.
II.5.2.5 Effet de quelque effecteur de protéases sur l’activité de l’extrait enzymatique

L’effet des effecteurs sur l’activité coagulante des extraits prépurifiés est rapporté par la
méthode décrite par He et al (2010) ; Majember et al (2015). Différents inhibiteurs de
protéases, principalement l’inhibiteur des métalloprotéase (EDTA à 5mM), l’inhibiteur
des aspartyl protéases (Pesptatine A à 20 µM) et le (2-Mercaptoethanol à 5 mM) sont
ajoutés séparément dans l’extrait enzymatique. L’effet de l’inhibiteur sur l'activité
enzymatique représente l'activité résiduelle relative rapportée à l’activité initiale de
l’enzyme exprimée en %. L’activité témoin de l’enzyme sans effet de l’inhibiteur
représente 100% d’activité.
II.5.2.6 Etude de la stabilité d’extrait enzymatique ultrafiltre :
II.5.2.6.1 Stabilité thermique
Les activités coagulantes résiduelles de l’EEUF sont mesurées après 30mn d’incubation
de l’extrait à des températures allant de 40°C à 80°C avec un intervalle de 10°C.
II.5.2.6.2 Stabilité par la conservation
Évaluée en mesurant l’activité coagulante résiduelle au cours de la conservation de

l’EEUF à +4°C, -18°C et à la température ambiante.
Cette activité coagulante est mesurée chaque 5 jour pendant 20 jours.
28
II.6 Purification de l’extrait prépurifié par chromatographie d'exclusion moléculaire

sur Sephadex G-75
Les extraits enzymatiques bruts sont soumis à une chromatographie d’exclusion
moléculaire sur gel Séphadex G 75
 Principe
Le gel de filtration est une technique chromatographie qui permet de séparer des
molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise des granules de gel poreux tel
que le Sephadex, le diamètre des pores étant une caractéristique de chaque type de gel.
Cette méthode fréquemment utilisée dans la purification et la séparation des protéines sont
éluées dans un ordre décroissant, les protéines de poids moléculaire élevée sont éluées les
premières, les autres protéines de masse moléculaire plus faible sont éluées tardivement
(Durang et Monsan,1974).
 Procédure
Notre extrait enzymatique prépurifié par ultrafiltration est soumis à une
chromatographie d’exclusion moléculaire sur gel de filtration Sephadex G-75. L’élution est
réalisé a l’aide d’un tampon phosphate 0,1M, pH 5,3 et les fractions de 1,4ml et un debit de
0,56ml/mn sont récupérées après une lecture de l’absorbance à 280nm à l’aide d’un
spectrophotomètre JASCO V 530 (Japon).
 Appareillage employé
 Colonne analytique type SpectraChrom, de dimension 30 cm × 1cm.

 Pompe péristaltique STA-Multipurpose model DESAGA.
 Collecteur de fraction SpectraChromCF-2.
 Appareille de gradient.
 Spectrophotomètre UV Visible-Jasco V 530 réglé à 280 nm.
29
A B
1
5
2 6
4
Figure N°10: Dispositif du Système de chromatographie basse pression sur colonne

G75 (A) et spectrophotomètre UV-Vis pour la lecture à 280nm des fractions éluées
(B)
1-réservoir de tampon d’élution, 2-pompe péristaltique, 3-colonne analytique,
collecteur de fraction ,5-fraction, 6-spectrophotomètre
II.6.1 Détermination du poids moléculaire

Le poids moléculaire de la protéase obtenu après purification des extraits enzymatiques
prepurifies a été déterminé à partir du profil d’un mélange de protéines standards par passage
sur colonne Sephadex G-75. Il s’agit 1- de l’albumine d’œuf de poulet, grade VI) (43,3
kDa), 2- pepsine porcine Sigma (35 kDa), 3- trypsine de pancreas bovin Merck (23,3
kDa) et 4- lactoglobulline de lait bovin (18,36 kDa). La droite de régression est représentée
par la valeur du logarithme de la masse moléculaire de la protéine étalon (logPM) en
fonction de son volume d’élutions (Ve) Figure N°11. Cette méthode de mesure est la
technique classique de mesure du PM d’une protéine en biochimie ( Kamoun ,1991).
30
1,7
1 y = -0,0115x + 1,7285
1,6 R² = 0,9971
LogPM du standard
2
1,5
3
1,4 LogPM du standard
1,3
4
1,2
0 10 20 30 40 50
Fractions
Figure N°11 : Droite d’étalonnage du log PM des standards protéiques

1- Albumine d’œuf de poulet grade (VI) (43,3 k Da) 2- Pepsine porcine sigma(35 k Da),
3 –Trypsine de pancréas bovin (23,3 k Da),4-Lactoglobulline du lait bovine(18,36
kDa).
II.7 Aptitudes technologiques : Essai de fabrication d’une pate de fromage pressée

Dans cet essai notre but est d’étudier les aptitudes à la coagulation du lait de l’enzyme
extraite de la caillette bovine, on la comparant avec la présure de référence (Présure LFB)
II.7.1 Procédé de fabrication :

L’essai de fabrication comprend en réalité deux essais : le premier est réalisé avec l’extrait
enzymatique coagulant brut issu de la caillette bovine et le deuxième avec la présure
commerciale provenant de la laiterie LFB de Boudouaou.
Ces essais ont été réalisés au niveau du laboratoire de l’entreprise fromagerie Faiz sis à
Corso (W. Boumerdes).
31
II.7.2 Etapes de la fabrication sont les suivantes :
 Traitement du lait
La quantité de lait utilisée pour la fabrication est de 2 litres de lait provenant de la ferme
de Corso). Les conditions sont les suivantes :
Le lait de vache cru : Ajouter du CaCl2 à raison de 1g/l
 La pasteurisation est réalisée dans un thermomix de l’entreprise à 75°C pendant
20 secondes.
Cette pasteurisation va permettre de réduire la flore banale et d’éliminer la flore
pathogène.
 Le lait est ensuite refroidi à 38°C.
 Ensemencement du lait traité

La maturation du lait est réalisée par ajout de ferments lactiques mésophiles. Les
ferments ou levains lactiques sont des cultures pures en proportions définies de différentes
bactéries lactiques qui se multiplient dans le lait et dans les fromages, assurent deux fonctions
essentielles :
 Abaisser le pH du milieu en transformant le lactose en acide lactique.
 Contribuer aux caractères organoleptiques des fromages en libérant les
systèmes enzymatiques.
Les ferments proviennent de l’unité LFB de Boudouaou. Ils sont ajoutés par ensemencement
direct à raison de 30mgl/4l de lait, avec agitation jusqu'à dissolution complète des ferments.
 Emprésurage:
Deux petites cuves ou casserole ou autre servant à l’essai sont remplies avec du lait
ensemencé à raison de 10ml.
Les cuves sont emprésurées séparément, l’une avec l’extrait enzymatique coagulant brut de
caillette bovine et l’autre avec la présure commerciale. On ajoute l’enzyme coagulante dans
le lait à 38°C, et on laisse coaguler pendant 40 mn environ. La concentration des extraits
enzymatiques est préparée de façon à donner un temps de coagulation égal ou le plus proche
l’un de l’autre, et cela en se basant sur la force coagulante de chaque enzyme:
32
 Formation et récupération du caille

Après la coagulation complète du lait (40 mn), le caillé est mis a égoutter dans une gaze
afin d’éliminer le lactosérum puis soumis à un pressage. Une fois égoutté, le caillé est
conserve au réfrigérateur pour une analyse ultérieure.
II.3 Méthode analytiques
II.3.1 Analyse physicochimique

L’analyse physicochimique des caillés pressés a porté sur la détermination de l’acidité, et
l’extrait sec selon la norme (AFNOR 1986, norme NF-V04-210) (Annexe 4)
II.3.2 Rendement fromager

Le rendement fromager ou le rendement de la transformation du lait en fromage est
l'expression mathématique de la quantité de fromage obtenu à partir d'une quantité donnée de
lait, est calculé selon l’équation suivante
Le rendement = le poids de caillé /le poids du lait x 100
II.4 Aptitudes technologiques
II.4.1 Evaluation de la texture de la pate
Cette analyse a pour but d’estimer et d’évaluer les quantités organoleptiques du fromage, la
méthode est basée sur les appréciations d’un jury d’évaluation des propriétés sensorielles ;
Selon ECK (1990), l’analyse sensorielle regroupe l’ensemble des informations recueillies
par les organes des sens. En effet, elle détermine l’attrait qu’exercent les caractères
organoleptiques sur le consommateur qui provoquent des réactions plus ou moins vives de
désir ou de rejet.
Le test sensoriel st mené sur deux (02) échantillons de pate de fromage pressée (Témoin et
expérimentale) réalisé exclusivement sur l’aspect et la texture de la pate au toucher, et après le
tranchage de la pate. Cet aspect est évalué par 8 panélistes (non professionnels) et les
33
résultats sont estimes par le Quick rank test de Kramer (Kramer, 1961) au seuil de
probabilité de 5%. Le score attribué par le paneliste (échelle hédonique) est donné d’une
manière arbitraire :
1 : Pate ferme, très bon aspect et texture, 2 : pate ferme, et bon aspect, 3 : fermeté moyenne,
texture moyenne début de friabilité, 4 : Pate friable au tranchage, mauvaise texture.
L’intervalle de la somme des rangs pour 8panelistes selon Kramer est de 8-13 au seuil de
probabilité. Les échantillons dont la somme des rangs se trouve a l’intérieur de l’intervalle ne
différent pas significativement pas sur le plan statistique (Annexe 7)
34
Résultats et discussion
Partie III : Résultats et discussion
III. Résultat et discussion
III.1 Obtention de la condition d’extraction d’enzyme coagulante :
L’extraction a été menée en utilisant le protocole proposée par Valles et Furet (1977) pour
l’isolement d’extrait.
III.2 Caractérisation de l’extrait brut :
L’extrait brut de pepsine de bovin adulte de 2 ans obtenu après extraction est caractérisée
par :
La force coagulante, Indice AC/AP, Taux de protéines, Activité protéolytique
Tableau N°5 : Caractéristique d’extrait brut
Caractéristique Extraits brut pepsine de bovin

(moyenne±ET)
La force coagulante (US) 1697±197
Indice AC/AP 2495
Taux de protéinées (mg/ml) 23,68
Activité protéolytique 0,68±0,07
III.2.1 Activité coagulante :

L’extrait enzymatique clarifié obtenu à partir du caillette du bovin a permis l’obtention
d’un temps de floculation de 14 (S) Avec ce temps nous a permis de calculer la force
coagulante exprimé en US égale à 1697 tableau N°5.
Cette valeur est bien comparé à la présure commerciale donc la force 1 /10000. Cependant
cette comparaison n’est pas très significative étant donne que les préparations commerciales
sont à l’état pur contrairement a l’extrait coagulant de la pepsine bovine qui se trouve à l’état
brut.
Comparaison de l’activité coagulante des protéases issue des différant d’origine :
 Protéases d’origine animale :
Pour la pepsine bovine les travaux de Valles et Furet (1981) montrent que l’activité
coagulante est très proche à notre valeur 1290 (US) ceci s’explique par l’utilisation d’extrait
issue de bovillon (24 moins) de même âge a notre étude .par rapporte aux travaux de (Nouani
et al, 2011 ;Morsli ,1997) ont trouvé la même valeur 1/3200 de la pepsine de proventricule de
35
poulet, cette valeur supérieur à la notre .par contre Maachou (2004) a trouvé une valeur
proche 1/1200 d’extrait de proventricule du limon.
 Protéase d’origine végétale :

Pour les protéases d’origine végétale Beka et al (2014) ont trouvé une valeur de 2,43±0,68
de EEB de fruit de Banlanit aegyptiacia .Fernani L (2002) a trouvé nue valeur de 1 /800
d’extrait obtenu des grains de melon (.Gagouna et Haggas , 2015) ont trouvé une valeur de
l’activité totale de 30,84 d’extrait issue de zingiber officinale roscoe rhizone de la région de
khanchla.Tous ces travaux montrent une activité inférieur à la notre ,cela est due à l’origine de
la matière d’extraction des protéases coagulantes.
 Protéase d’origine microbienne :

par rapport aux protéases d’origine microbiennes Belhamiche (2000) a obtenu une AC de
Mucur pusillus 1 /2400. Donsova al (2014) ont trouvé une valeur de 30,88 issue de caprinus
logopides basidial muhron. Majumder et al (2014) ont trouvé différentes valeurs de
metalloprotéase de thermitomyce chypeatus MTcc5091 Cette différence est due au milieu de
culture ou de la fermentation.
Ainsi, à ce stade expérimental, l’activité coagulante de l’extrait brut obtenue est relative
puisque elle dépend de plusieurs facteurs telles que la présence de diverses substances
indésirables, la nature des solvants utilisés, leurs pH, leurs forces ioniques…etc. Aussi, la
concentration de l’extrait en protéines, laquelle est fonction de plusieurs facteurs : des
méthodes d’extractions, des conditions de stabilité spécifiques à chaque type d’enzymes et du
taux de concentration. Ainsi que les facteurs liés à la matière première la quantité de matière
utilisée dans l’extraction et l’origine de la matière utilisée.
III.2.2 Indice AC/AP :

L’indice AC/AP de l’extrait enzymatique à l’état brut de pepsine bovine 2495.Les
enzymes microbiennes et végétales manifestent une forte activité protéolytique par
comparaison aux protéases d’origine animale. En effet, selon certains auteurs Krause et al
(1998), les enzymes fongiques manifestent une activité plus grande que celle de la présure et
de la pepsine. Dans nos conditions expérimentales, une forte activité protéolytique est
observée dans nos échantillons comparés au tableau ci-dessus.
36
III.2.3 Activité protéolytique

Dans notre étude, nous avons observé une très forte activité protéolytique d’EEB est de
l’ordre de 0,68. Ainsi, l’action de rupture de la liaisonPhe105-Met106 de la caséine K par les
aspartyl protéases comme l’EEB est semblable à celle de la chymosine et les autres protéases
d’origine fongique et bactériennes (Sidrach et al, 2005)
Ce phénomène est généralement indésirable en technologie laitière car il est à l’origine du
développement d’amertume retrouvé dans les produits fromagers.
III.2.4 Détermination de taux de protéines de l’extrait enzymatique brut :

La teneur des fractions protéique isolées est estimée par dosage spectrométrique en
utilisant la méthode de (Lowry ,1951)
D’après (l’annexe 3), nous pouvons constate une corrélation (R=0 ,924) avec une équation
concentration=DO .80/0,001=23680ug/ml soit 23,68mg/ml
Cette équation nous a permis de calculer la concentration en protéine de nôtres EEB dilué 80
Fois qui de 23,68mg/ml.
37
III.3 Prépurification et concentration de l’extrait clarifié par ultrafiltration avec un cut

of de 10 KDA :
Le principe de ce procédé est de fractionner, par passage à travers d’une membrane poreuse
sous l’action d’un gradient de pression, les constituants d’un liquide en fonction de leurs
caractéristiques de taille et/ou de charge.
A partir d’un liquide(EEB) donné, on obtient trois fractions :
 le retentât retenu dans le circuit d’alimentation/recyclage,
 le perméat ou filtrat qui est le liquide ayant traversé la membrane
 le récupère
D’après les tests de coagulation sur les trois fractions . Les résultats obtenus montrent que le
retentât et le récupère sont proches et sont mélangés, La détermination de l’activité
coagulante, l’activité protéolytique, l’indice AC/AP, et le taux de protéines de ce mélange est
exprimé dans le Table N°6
Tableau N°6 : Caractéristique de l’extrait ultrafiltré de la l’extrait enzymatique
Caractéristique Extrait ultrafiltré de pepsine bovine

(moyenne±ET)
La force coagulante (US) 1086±28
Indice AC/AP 2049
Taux de protéinées (mg/ml) 40
Activité protéolytique 0,53±0,03
38
III.3.1 Caractérisation de l’extrait enzymatique ultrafiltré
III.3.1.1 Effet du pH du lait sur l’activité coagulante

L’influence du pH du lait sur l’activité coagulante relative d’EEUF est illustrée dans la
figure N°12 Les résultats obtenues indiquent une activité coagulante optimal au pH 6 et au
pH 7 l’activité coagulante n’est pas inhibée. Richerdson (1975) montre que la pepsine
bovine est capable de coagule le lait à pH 6 ,9 . Par contre la pepsine porcine est tés sensible a
l’augmentation de pH et son activité diminue considérablement à partir du pH 6,5 comparée a
celle de la présure (Richerdson ,1975 ; Ernstrom et Wongt ,1983) et c’est la raison pour
laquelle la pepsine porcine est employée en mélange avec la présure. Selon Morsli (1996), la
majorité des enzymes d’origine animale ou végétale ont des pH acides se situent dans
l’intervalle acide. Roposo et al ,( 2008) ont trouvé une activité coagulante optimale à pH 5,5
de protéase de centaurea calciptrapa Kumar et al ,(2005) ont trouvé même valeur de
protéase de Rhizopus oryzaee
L’influence de l’acidification sur le temps de floculation résulte par une part d’un effet sur
l’activité de l’enzyme et d’autre part sur la réaction d’agrégation par suit de la diminution de
la stabilité des micelles, lies à la neutralisation des charges négative et la libération d’ions de
calcium à partir de complexes dissous et colloïdaux (Ramet ,1997). La figure N°12 montre
une inactivation totale à pH 7,5 et 8 suite a une dénaturation de l’enzyme.
120
100
Activité relative(%)
80
60
40
20
0
5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
pH du lait
Figure N°12 : Influence du pH du lait sur activité coagulante d’extrait enzymatique

ultrafiltre.
39
III.3.1.2 Effet de la température du lait

L’influence de la température du lait sur l’activité coagulante de l’enzyme a été étudiée
dans l’intervalle de température de 35°C à 70°C.
Les résultats rapportés dans la figure N°13 indique que l’activité coagulante diminue avec
l’élévation de la température avec un optimum à 35°C .Les travaux de (Guerad 1987 ;
Guerad et Legal 1997 ;Amiza et al, 2000) montrent que les températures optimum entre
30°C et 40°C pour les pepsine animal d’origine aquatique (.Nouani et al, (2011) ;(yegin et al,
2012) ont trouvé une température optimum à 40°C pour la pepsine de poulet et de Mucor
muedo DSM 809. La pepsine bovine et porcine montrent également une sensibilité à
l’augmentation de la température entre 30 et 50°C ( Haard et al, 1982).Toutefois, il faut noter
que l’effet de la température résulte de la conjugaison de deux effets, l’un sur la réaction
enzymatique, l’autre sur la phase secondaire de la coagulation et qui correspond à l’étape
d’agrégation. Par contre les protéases d’origine végétale ont un pouvoir thermorésistant
(Kumar et al, 2005) ont trouvé de 60°C de Rhizopus oryzae (Reposo et al, 2008) une
température de 52 °C de centaurea calciptrapa.la figure N° 13 montre une inactivation
d’EEUF à 50°C du à l’inhibition total de l’enzyme.
120
100
Activité relative (%)
80
60
40
20
0
35 40 45 50 55 60 65 70 75
tempéraure du lait (°C)
Figure N°13 : Effet de température du lait sur activité coagulante d’extrait

enzymatique ultrafiltré.
40
III.3.1.3 Effet de la concentration de CaCl2 du lait

L’influence de calcium à été réalisé en modifiant sa concentration dans le lait de 0,01 à 0,05M
.Les résultats obtenus dans la Figure N°14 montrent que l’activité coagulante relative augmente
avec l’augmentation de la concentration de CaCl 2, l’activité optimal est obtenue pour une
concentration de 0,03 M, Pour les concentrations supérieures, l’activité baisse par un effet
inhibiteur de l’ion En effet, plusieurs auteurs ont rapportés que les fortes concentrations en
Calcium peuvent être un facteur inhibiteur de la coagulation pour certaines enzymes très sensibles
à ce facteur (Iwasaki et al , 1979 ; Anstrup, 1980 ; Belhamiche ,2005). L’addition du calcium
soluble entraîne une augmentation de la teneur en phosphate de calcium colloïdal lequel semble
être le facteur déterminant de l’aptitude du lait à la coagulation par la présure Brule et Lenoir
(1990). En effet, Cette addition provoque, selon (Najera et al, 2003), une diminution du temps de
coagulation. Cependant, pour une concentration élevée en CaCl 2, le temps de coagulation tend à
augmenter.
120
100
80
60
40
20
0
0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05 0,055
Concentration en cacl2 du lait
Figure N°14: Effet de concentration en cacl2 du lait sur l’activité coagulante.
41
III.3.1.4 Effet de la concentration en enzyme

L’influence de la concentration en enzyme sur l’activité coagulante a été déterminé en
variant la teneur en protéine de l’extrait de 0,1 à 1 mg/ml, la figure N°15 .indique que
l’activité coagulante relative augmente avec l’augmentation de la quantité d’extrait cependant
dans l’intervalle Testé
120
100
activité relative(%)
80
60
40
20
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
concentation de l'enzyme mg/ml
Figure N°15 : Effet de concentration de l’enzyme sur l’activité coagulante d’extrait

enzymatique ultrafiltré ( mg/ml)
42
III.3.1.5 Effet de quelques effecteurs sur l’activité de l’extrait enzymatique ultrafiltre :
100
85
70
55
40
25 Activite residuelle
10
-5
Figure N°16 : Effet de quelque effecteur sur l’activité coagulante des extraits enzymatiques
de la caillette des jeunes bovines.
L’effet inhibiteur de la pepstatine A s sites actifs pepsines animales est confirmé dans
ce présent travail. En effet avec une activité résiduelle de moins de 10% comparativement au
témoin ou aux autres inhibiteurs, la pepsine extraite de la caillette de bovin adulte appartient
bien au groupe des aspartyl protéases. Avec des résidus d’acide aspartique sur le site actif la
pepsine est une protéase acide.
III.3.1.6 Etude de la stabilité d’extrait enzymatique ultrafiltre :
III.3.1.6.1 Stabilité thermique :

L’influence de la température sur la stabilité d’EEUF a été étudiée en maintenant notre
extrait à des températures variant dans l’intervalle de 40 à 80 °C le temps d’exposition et de
30 min.
Les résultats illustrés dans la figure N°17, montre une activité coagulante stable dans
l’intervalle 40 C° à 50 C° et une inhibition totale est observée à 60 °C cette inhibition résulte
de la dénaturation des protéines enzymatique. Alais ,(1984) a noté que lorsque la température
s’élève au dessus de 50 °C, la dénaturation de la présure devient sensible. A titre de
43
comparaison (Mouzali, 2001) indique une activité coagulante relativement stable dans
l’intervalle de température compris entre 35 °C et 50 °C pour l’extrait brut de fleurs de
cardon après 5 minutes d’exposition. (Fernani, 2003) en étudiant l’extrait coagulant des
graines de melon a noté une stabilité thermique entre 30 °C et 55°C après 30 minutes
d’exposition. Matoub (2000) et Belhamiche (2005) ont indiqué une stabilité thermique dans
l’intervalle de température compris entre 30 °C et 50 °C, respectivement, pour la coagulase
produite par une souche locale de Bacillus subtilis sélectionnée (Lc33) et la coagulase
produite à partir de la souche de Mucor pusillus.
120
100
Activité relative en %
80
60
40
20
0
40 50 60 70 80 90
Température en °C
Figue N°17 : Influence de la température sur la stabilité d’extrait enzymatique ultrafiltre

Stabilité
III.3.1.6.2 Stabilité à la conservation :

L’estimation de la stabilité au cours de la conservation à été déterminé par l’entreposage de
EEUF à la température ambiante et à +4 °C et à -18 °C pendant 20 jours, l’activité relative a
été évalué périodiquement (chaque 5 jour).
44
Les résultats indiqués par figure N°18 montrent une baisse de l’activité coagulante à partir
de 5 jours, pour une conservation à la température ambiante au bout de 20 jours , l’enzyme
présente une activité résiduelle de 21% .
120
100
Activité résiduelle (%)
80
60
40
20
0
5 7 9 11 13 15 17 19 21
Temps (jours)
Figure N°18 : Stabilité de l’extrait enzymatique ultrafiltre de la pepsine bovine au cours de sa

conservation à température ambiante dans la solution tampon de phosphate 0,1M, PH 5,3.
45
de 5 jours, pour une conservation à +4 °C au bout de 20 jours , l’enzyme présente une activité
résiduelle de 65%
120
100
80
60
40
20
0
5 7 9 11 13 15 17 19 21
Temps (jours)

conservation à + 4 C° dans la solution tampon de phosphate 0,1M, PH 5,3.
46
de 5 jours, pour une conservation à -18 °C au bout de 20 jours, l’enzyme présente une activité
résiduelle de 52 %
120
100
80
60
40
20
0
5 7 9 11 13 15 17 19 21
Temps (jours)

conservation à -18 C °dans la solution tampon de phosphate 0,1M, PH 5,3.
47
III.4 Purification d’extrait enzymatique ultrafiltre de pepsine bovine :

Les fractions actives des tubes 15, 16, 17, 18,19 ‘ montrent qu’un seul pic est doué
d’activité coagulante. .Le volume totale obtenu est 5,5 ml, avec une force de 126±8 (US), un
taux de protéines de 0,4 mg/ml, un indice AC/AP d 1680 et une Acticité protéolytique
0,075±0,004.
Le profil chromatographique d’EEUF montre 3 pic d’adsorption bien distincts figure N°21
l’activité coagulante a été retrouvée des fractions actifs qui se situe entre le premier et le
deuxièmes pic.
Les trois pics sont inactifs correspondent aux protéines contaminantes mais l’activité est
observée est entre le premier et le second pic ce qui confirme que la gel filtration employée
seule est une technique de purification partielle. Ceci, n’exclue pas que d’autre protéines de
masse moléculaire rapprochées peut être incluse dans cette même fraction .
1,6 120
1,4
100
1,2

Absorbance 280nm
80
1
0,8 60
0,6
40
0,4
20
0,2
0 0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56
Fractions
Figue N°21 : Profil chromatographique d’EEUF sur gel séphadex G-75 de l’extrait
enzymatique brut issue de caillette du bovin adulte, (tampon de phosphate 0,1M, PH 5,3
Débit 0,56ml/min, fraction 1,4ml).
48
III.4.1 Bilan de purification d’extrait coagulant de la pepsine bovine :
Tableau N°7 : Bilan de purification d’extrait coagulant de la pepsine bovine :
Activité Protéines Activité Rendement Facteur de

coagulante total (mg) spécifique (100%) purification
total (US) (US/mg)
EEB 220610 3026,4 72,9 100 1
Ultrafiltration 65160 2400 27,1 79,3 0, 38
d’EEB
Gel de 693 2,2 315 0,07 4,37
filtration
d’EEUF
La filtration sur gel a permis d’obtenir , d’après tableau N°7 , un facteur de purification
élevé de l’ordre de 4,37 , une activité spécifique également élevée (315 US/mg prot. ) et un
faible rendement en activité ( 0,07 )
L’obtention d’un faible rendement en activité peut s’expliquer soit par une perte en
activité, soit par une dilution de l’enzyme au cours de la purification.
49
III.4.2 Détermination du poids moléculaire de la pepsine bovine :
Le poids moléculaire de la protéine active a été estimée à partir de droit étalon des
protéines standards Albumine d’œuf de poulet grade (VI) (43,3 k Da), Pepsine porcine sigma
(35kDa), Trypsine de pancréas bovin (23,3 k Da), Lacolobulline de lait bovine(18,36 kDa).
Et dont profils chromatographique ont été obtenue par gel filtration sur séphadexe G- 75
comme illustre la figure N°22.
0,3 2
0,25
3
0,2
D0 à 280nm
0,15
0,1
0,05 1
4
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Fractions
Figure N°22: Profil d’élution sur Sephadex G-75 des protéines standards. (Tampon d’élution
Phosphate (0,01 M; pH 5,3), débit : (0 ,56ml /mn, Fraction de 1,4 ml). Proteine Standards:1-
Albumine d’œuf de poulet grade (VI) (43,3 k Da), 2- Pepsine porcine sigma(35 k Da),
3 –Trypsine de pancréas bovin (23,3 k Da),4-Lacolobulline de lait bovine(18,36 kDa).
50
Il existe une relation linéaire entre le volume d’élution d’une substance et le logarithme de
masse moléculaire (Cf. Matériels et méthodes). Le tableau N8 résume les résultats obtenus.
Tableau N°8 : Détermination du poids moléculaire des protéines standards.
Protéines Poids moléculaire Fraction (ml) Log PM

(K Da)
Albumine d’œuf de 43,3 8 1,63

poulet grade (VI)
Pepsine porcine sigma 35 17 1 ,54
Trypsine de pancréas 23, 3 33 1,36
bovin
Lacolobulline de lait 18,36 41 1,25
bovine
PM de l’extrait purifié 35 17 1,54
(notre échantillon)
L e tableau rapporte le poids moléculaire de l’extrait purifie de bovin adulte, soit 35 kDa
calculé a partir de la droite de régression des poids moléculaires des protéines standards élués
sur colonne de G-75.
Ces résultats est en concordance avec ceux rapportés par des travaux menés sur les
pepsines animales. En effet, selon Garnot et Martin (1980), la chymosine et la pepsine sont
caractérisés par une masse de 30 000 Da et de 35 000 Da respectivement.
Des différences de PM sont observes sur les pepsines de différentes espèces de mammifères et
poissons. Ainsi, Moschopoulou (2011) a montré que cette caractéristique dépend de l’origine
de la protease et que les travaux portés sur les coagulases animales ont indiqué des poids
moléculaires compris entre 31 000 et 40 000 Da.
51
III.5Application fromagère : Essai de fabrication d’une pate de fromage pressée à

partir de lait de vache
III.5.1 Analyse physico-chimique de fromage :
Tableau N°9 : Analyse physico-chimique de fromage
caractéristique Pate de fromage issu de la Pate de fromage témoin

coagulation par l’extrait de issu de la coagulation par
bovin l’enzyme commerciale
Acidité (°D) 40 50
Extrait sec (%) 35 41
Les résultats du tableau ci-dessus rapportent les observations suivantes :

Une acidite assez poussée du caillé des 2 pates de fromage
La teneur en extrait sec total du lactosérum est un indicateur du rendement potentiel du
fromage, qui pourrait être influencé par le type de coagulant utilisé lors de la fabrication.
L’action protéolytique du coagulant peut affecter les propriétés du réseau de la caséine du
caillé, affectant de ce fait la quantité de matière sèche exsudée dans le lactosérum.
(SHAOJIANG et al, 2003). Cette hypothèse semble se vérifier avec la pepsine (35%
d’extrait sec) protéolyse élevée par rapport a la présure commerciale (41%)
III.5.2. Rendement fromager

Le rendement fromager présente un grand intérêt en industrie fromagère car il reflète
globalement la répartition quantitative des constituants du lait lors de l'égouttage. Il permet
donc de juger pour un type de fromage donné si la fabrication a été menée dans de bonnes
conditions. Les rendements fromagers obtenus lors de la réalisation des essais sont de 9% et
10% respectivement pour le fromage issu de la coagulation par l’extrait de bovin et le
fromage témoin. Ce sont des rendement jugés faibles , probablement dus a des nombreuses
pertes lors de l’essai de préparation. Toutefois un essai réalise dans de meilleurs conditions a
donne un caille ferme pour les deux échantillons de pate de fromage (Cf Aptitudes
technologiques) Figure N°23
52
Pate de fromage Témoin pate de fromage expérimentale
Figure N°23 : Aspect et texture ferme des pate de fromage témoin et expérimentale
III.3 Aptitudes technologiques

III.3.1 Aspect et texture de la pate de fromage
Le tableau suivant rapporte le résultat récapitulatif du test sensoriel basé sur l’aspect et la
texture de la pate après tranchage Tableau N°10
Tableau N°10 : Résultats des analyses sensoriel de fromage apr2s tranchage
Pate de fromage présure Pate de fromage extrait bovin

(Témoin) (expérimental)
Score 1,5 1,6

moyen
Somme des 11,5 12,5
rangs
L’évaluation de ce paramètre montre que les deux échantillons de pate de fromage possèdent
un aspect et une texture ferme identique. En effet, sur le plan statistique, aucune différence
n’est observée au seuil de p : 0,05% (somme des rangs compris entre 11,5 et 12,5). Par
ailleurs, l’ensemble des panelistes ont évalué positivement la texture des deux échantillons
de pate caractérisés par un score compris entre 1,5 et 1,6 soit bonne à très bonne texture après
tranchage de la pate de fromage. L4hitogramme de la Figure N°23 illustre parfaitement ces
résultats.
53
1,7 14
1,6 12
1,5 10
moyenne des scores
Somme des rangs

1,4 8
Score
1,3 6 Rang
1,2 4
1,1 2
1 0
Pate de fromage presure Pate de fromage pepsine
.
Figure N°24 : Histogramme d`analyse statistique des paramètres sensoriels (aspect et
Texture de la pate) au seuil de probabilité de 5%. L’intervalle entre les traits pleins (Somme
des rangs compris entre 8 et 13) indique une différence non significative.
54
Conclusion générale
Conclusion et perspectives
L’étude menée sur la recherche des succédanées de la présure traditionnelle nous a permis
a travers les résultats enregistres de situer les avantages et les inconvénients des
caractéristiques biochimiques de L’extrait coagulant obtenu. Cet extrait a travers l a pepsine
enzyme de base sont issus des caillettes de bovins adultes généralement destines a l’abattage.
Il faut rappeler que la pepsine, enzyme protéolytique peut être un bon coagulant de
remplacement pour certains fromages. Ella fait l’objet de nombreux travaux et est employé en
synergie avec d’autres protéases. Pendant les deux dernières décades, la pepsine a l’objet de
critiques notamment avec l’apparition de la pathologie spongiforme bovine et l’avènement du
génie microbien.
L’étude menée sur cet extrait nous a permis d’évaluer les principales caractéristiques de
l’enzyme à savoir une purification par gel filtration, son activité coagulante, sa composition
en protéine et la caractérisation son activité en fonction de divers paramètres. Une meilleure
connaissance des propriétés de la protéase extraite a été établie pour une meilleure future
application en fromagerie locale.
Les résultats enregistrent et pour ne pas faire une répétition rejoigne les propriétés d’une
pepsine animale à travers soit la littérature soit les travaux antérieurs déjà réalisé au niveau
du département de technologie alimentaire.
L’extrait se caractérise par une activité coagulante élevée d’environ 1400 US sur le
substrat de Berridge et une activité protéolytique moyenne de 0 ,68 exprimé en densité
optique sur le substrat caseinique. La détermination de l’indice AC/AP place l’extrait avec les
protéases qui peuvent être un bon substitut de la présure traditionnelle.
Par ailleurs, comme toutes les pepsines animale, l’extrait enzymatique de bovin a été identifie
comme une protéase acide et fait partie du groupe des aspartyle protéases.
Les aptitudes technologiques des extraits obtenus manifestent un intérêt en fromagerie
comme il a été démontré depuis plusieurs années. Ainsi, l’essai de fabrication d’une pate de
fromage pressée présentait beaucoup de similitudes sur la plan sensoriel avec la présure
commerciale. Le test de statistique appliqué à l’évaluation seulement de l’aspect et de la
texture après tranchage de la pate a montre qu’aucune différence n’est observé au seuil de
probabilité de 5%. Par ailleurs le score attribué par les panelistes indique que la pate possède
une bonne à très bonne texture pour les deux échantillons, témoin et expérimental.
55
En perspectives de ce présent travail, il faut juste rappeler que la pepsine animale en

fromagerie a montre ses preuves et de nombreux travaux ont été réalisé. L’enzyme est
actuellement fabrique a grande échelle et employé seule ou en synergie avec d’autres pepsine
particulièrement celle d’origine porcine. En Algérie, sa production passe nécessairement par
la valorisation des systèmes gastriques des bovins adultes destinés a l’abattage et son emploi
dans la fabrication de certains fromages est intéressante. Cependant, grâce a son caractère
acide, les pepsines peuvent avoir d’autres applications dans les industries alimentaires et non
alimentaires.
56
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Annexes
Les annexes
Annexe 1
 Préparation du substrat de Berridge
Le substrat de Berridge est préparé par addition de 12 g de lait écrémé à 100 ml de solution
de CaCl2 à 0,01M. Après 30 mn d’agitation lente, le pH est ajusté à 6,4.
La température du lait est ramenée à 35°C afin de mesurer le temps de coagulation qui
correspond à l’apparition des premiers flocons sur la paroi interne du tube dans
les conditions de réaction.
Annexe 2
Préparation de la solution Tampon Phosphate pH= 5.5 / 0.1 M
Solution A=KH2PO4 (0.1 M)
Solution B=Na2HPO4 2H2O (0.1M)
 Formule du Tampon = X ml de A+ (100-X)ml de B
X=84,5 ml
Les annexes
Annexes 3
Dosage des protéines (Lowry et al, 1951)
1. Solution
Solution A :
Na2CO3 ……………………………………………………………………………………5g
Eau distillée…………………………………………………………………………...100 ml
Solution B :
Cu SO4, 5 H2O …………………………………………………………………………..0.5 g
Tartrate double de Na et K ………………………………………………………………..1 g
Eau distillée……………………………………………………………………. …….100 ml
Solution C :
50 ml de la solution A + 2 ml de la solution B à préparer immédiatement.
Solution D :
NaOH (1 N) ……………………………………………………………………………..4 g
Eau distillée ……………………………………………………………………….1000 ml
Solution E :
Réactif de folin ciocalteau ……………………………………………………………0.5 g
Solution F :
BSA ………………………………………………………………………………..200 mg
Eau distillée ………………………………………………………………………..100 ml
Gamme étalon :
A partir de la solution mère de BSA des dilutions sont préparé selon le tableau ci- dessous :
Concentration en 0 25 50 75 100 150 200
BSA µg/ml
Solution mère 0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.75 1

BSA (ml)
Eau distillée (ml) 1 0.875 0.750 0.625 0.5 0.25 0

Les annexes
2. Méthodes
 1 ml d’échantillon.
 Ajouter 3 ml de la solution C ET mélanger.
 1 ml de la solution D.
 Laisser 10 mn à température ambiante.
 0.5 ml de folin coicalteau.
 Lire la DO 0 750 nm.
3. Expression des résultats :

Une courbe étalon est tracée en portant sur l’axe des abscisses les concentrations en BSA des
dilutions préalables préparées et sur l’axe des ordonnées les DO mesurées respectivement
pour chaque dilution.
La concentration en protéines inconnue X, est déterminée en portant la valeur de la
DO correspondante sur l’axe des ordonnées qui est en suite projetées sur l’axe des abscisses.
0,4
0,35
Absorbance 750nm
0,3
0,25 y = 0,0019x
0,2 R² = 0,9244
0,15
0,1
0,05
0
0 50 100 150 200 250
Concentration BSA (ug/ml)
FigureN°1 : Courbe étalon de protéines exprime en BSA (µg/ml) pour l’extrait enzymatique
brut.
Les annexes
0,35
0,3
DO à 750 nm 0,25
y = 0,0014x
0,2 R² = 0,9378
0,15
0,1
0,05
0
0 50 100 150 200 250
concentation en BSA (ug/ml)
FigureN°2 : Courbe étalon de protéines exprime en BSA (ug/ml) pour l’extrait prépurifié.
0,18
0,16
0,14
0,12
DO à 750 nm
y = 0,0008x
0,1 R² = 0,938
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 50 100 150 200 250
Concentration en BSA (ug/ml)
Figure N°3 : Courbe étalon de protéines exprime en BSA (ug/ml) pour l’extrait purifié.
Les annexes
Annexe 4
Analyses physico-chimiques de la pate de fromage
1) Détermination de l’acidité
 Mode opératoire
- Introduire dans un bêcher 10 ml d’une solution de 10g de pate de fromage dilué dans
100ml d’eau à l’aide d’une pipette graduée, puis ajouter 3 à 4 gouttes de
phénolphtaléine ;
- Titrer avec de la soude NaOH 0,11N jusqu'à premier virage au rose.
 Expression du résultat
- L’acidité est exprimée en degrés Dornic, donnée par une lecture directe du nombre de
millilitres de soude neutralisante, sachant que 1°D = 0,1g/l d’acide lactique.
2) Détermination de l’acidité
 Mode Opératoire
- Introduit dans un bêcher 10 ml de lait à l’aide d’une pipette graduée, puis ajouter 3 à 4
gouttes de phénolphtaléine ;
- Titrer avec de la soude NaOH 0,11N jusqu'à premier virage au rose.
III.2. Expression des résultats
L’acidité est exprimée en degrés Dornic, donnée par une lecture directe du nombre de
millilitres de soude neutralisante, sachant que 1°D = 0,1g/l d’acide lactique.
3) Détermination de l’extrait Sec et de l’Humidité (H%)
L’extrait sec total a été déterminé par dessiccation à l’étuve à 103 ±2°C d’une masse de 5g
de pate de fromage.
Les annexes
Annexe 5
Lait de vache Pasteurisation 75°c/20s
Ajout de ferments et emprésurage Coagulation
Egoutage et pressage Pate fromage temoin
Pate fromage experimentale

Etapes de fabrication de la pate de fromage pressée a base de l’extrait enzymatique
bovin et la présure commerciale (LFB)
Les annexes
Annexe 6
Table de Kramer
Nombre de
2 3 4 5
dégustateurs
3 3-9
4 4-8 4-11 5-13
5 5-11 6-14 7-17
6 6-9 7-13 8-17 10-20
7 7-11 9-15 11-19 12-24
8 8-13 10-18 13-22 15-27
9 10-14 12-20 15-25 17-31
10 11-16 14-22 17-28 20-34
11 12-18 16-24 19-31 13-37
12 14-19 18-26 21-34 25-41
13 15-21 19-29 24-36 28-44
14 17-22 21-31 26-39 31-47
15 18-24 23-35 28-42 33-51
16 19-26 25-35 30-45 36-54
17 21-27 27-37 33-47 39-57
18 22-29 28-40 35-50 41-61
Annexe 7
Résultats du test sensoriel appliqué à l’évaluation de l’aspect et la texture de la pate

de fromage fabriqué à base de présure commerciale et d’extrait enzymatique de bovin
adulte
Panelistes Pate de fromage présure Pate de fromage extrait bovin

(Temoin) (expérimental)
Score Rang Score Rang
1 1 1,5 1 1,5
2 1 *-+1 2 2
3 2 2 1 1
4 1 1,5 1 1,5
5 2 1,5 2 1,5
6 1 1 2 2
7 2 1 3 2
8 2 2 1 1
Score 1,5 1,6
moyen
Somme des 11,5 12,5
rangs

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‫اﺔﻳﺭﻭﻬﻣﺠﻟ ﺔﻴﺮﺋﺍﺯﺟﻟﺍ ﺔﻴﻂﺍﺮﻗﻤﻳﺪﻟﺍ ﺔﻳﺑﻌﺸﻟﺍ‬

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

UNIVERSITE M’HAMED BOUGARA BOUMERDES

Extraction, purification et caractérisation d’une

Soutenu le : 22 Juin 2017 par : BOUCETTA Sabrina

Présidente : Mme TALANTIKITE S. MCB (UMBB)

Promoteur : Mr. NOUANI A. Pr. (UMBB)

Examinatrices : Mme YELLES F. MAA (UMBB)

: Mme BENMALEK N. MAA (UMBB)

Nos grands remerciements à Mr NOUANI Abdelouahab, notre encadreur pour sa

Un grand remerciement a Mr Sabaoui Khaled, responsable du laboratoire d’analyse

L’obtention des extraits enzymatiques coagulants à été effectué selon la méthode de

L’influence de certains paramètres, pH du lait température, concentration en enzyme et

L’évaluation des propriétés sensorielles de la pate de fromage par un jury de paneliste a

Mot clé : coagulation, lait, frommage, enzyme, purification, aspartyle

‫الكلمات المفتاحية الحليب التثخن إنزيم الحموضة‬

Liste des tableaux

Tableau N°01 : Principales différences entre la chymosine A, B et C (Lilla 2005 ; Rampilli

Tableau N°3 : La composition des micelles du lait de vache (Vierling 1999)……………09

Tableau N°4 : Principales caractéristiques des constituants majeurs de la caséine de vache

Tableau N°5 : Caractéristique d’extrait brut de la pepsine bovine………………………….35

Tableau N°6 : caractéristique de l’extrait enzymatique ultrafiltré…………………………38

Tableau N°7 : Bilan de purification d l’extrait coagulant de la pepsine bovine …………….49

Tableau N°8: Détermination du poids moléculaire des protéines standards………………..51

Tableau N°9 : Analyse physico-chimique de la pate de fromage …………………………52

LISTE DES FIGURES

Figure N°18 : Stabilité de l’extrait enzymatique ultrafiltre de au cours de sa conservation à

Figure N°23 : Aspect et texture des pate de fromage témoin et expérimentale……………..53

Figure N°24 : Histogramme d`analyse statistique des paramètres sensoriels (aspect et

Liste des abréviations

AC: Activité Coagulante.

AP: Activité Protéolytique.

BSA: Bovine sérum albumine.

DO: Densité Optique.

°D: Degré Doronic.

EDTA: Acide Ethyle Diamine Tétra Acétique.M

EEB: Extrait Enzymatique Brut.

EEUF: Extrait Enzymatique Ultafiltré.

EEP: Extrait Enzymatique Purifié.

MM: Masse Moléculaire.

TCA: TriChloroAcetic acid

I.1.2.1Succédanés de présure d’origine animale……………………………………..07

I.1.2.2Succédanés de présure d’origine végétale……………………………………08

I.1.2.3Succédanés de présure d’origine microbienne ………………………………08

I.2.2Structure des caséines……………………………………………………………………10

I.3Chapitre III : Coagulation du lait

I.3.3Mécanisme d’action de la coagulation…………………………………………………14

I.3.4Facteurs influant la coagulation du lait………………………………………………...17

I.3.4.4Effet de la concentration en d’enzyme……………………………………….17

II.5Prépurification concentration des extraits enzymatiques ……………………...25

II.5.2.6.2 Stabilité par la conservation……………………………………….28

II.6.1 Détermination du poids moléculaire ………………………………………………...30

II.4.1 Evaluation de la texture de la pate ……………………………………33

Dans les années 80, à l’heure de la crise d’approvisionnement en enzymes de coagulation

Parmi les voies de substitution de la présure, la production d’enzymes coagulant le lait à

I.1Chapitre I : Enzyme Coagulants

La présure est une enzyme protéolytique, extrait de la quatrième poche de l’estomac

Tableau N°1 : Principales différences entre la chymosine A, B et C (LILLA et al, 2005 ;