Hemato - Citoquimica Como Diagnostico de Hematologia 2 PDF

LA CITOQUIMICA COMO APOYO AL DIAGNOSTICO
HEMATOLOGICO
LA CITOQUIMICA EN LA HEMATOLOGIA
HISTORIA
Las primeras observaciones citoquímicas datan
de 1830 y no fueron usadas hasta más de un
siglo después.
En 1853 Perls hace la demostración histoquímica

de la hemosiderina, la que constituye una de las
reacciones mas valiosas para el estudio de los
síndromes anémicos
HISTORIA
La primera reacción enzimática aplicada a la

Hematología fue la de las oxidasas y peroxidasas,
que adquirió reconocido prestigio en la
diferenciación entre células mieloides y linfoides
GENERALIDADES:
La mayorìa,son tècnicas que derivan de modificaciones

de tècnicas histoquìmicas.
Nexo entre morfología y bioquímica
Conjuga forma y funciòn.
Brinda resultados de ìndole cualitativo o

semicuantitativo.
Apoyo para el diagnòstico de las distintas hemopatìas.

La citoquìmica estudia la composiciòn quìmica de la cèlula

hematopoyética , permitiendo detectar y precisar la
localizaciòn topogràfica de diversas sustancias al interior de
esta, sean principios inmediatos, enzimas o compuestos
inorgánicos, por medio de mètodos tintoriales que permiten la
formaciòn de productos coloreados visibles al microscopio
òptico.
Es la reacción que por el empleo de uno o más reactivos

químicos aplicados a la célula, en condiciones definidas,
determina la formación de productos coloreados,
insolubles, no difusibles, que permiten el reconocimiento
microscópico de sustancias o grupos químicos definidos
en su real ubicación citológica, para lo cual no deben
destruir la célula o si lo hacen, deben reemplazar la
sustancia identificada en su topografía.
FINALIDAD
Reconocimiento y diagnostico celular
Estudio de la fisiología y fisiopatología celulares
Diagnóstico de la patología
PASOS FUNDAMENTALES
A-. Fijaciòn de la extensiòn para preservar las estructuras y
reactividad funcional celulares, evitando fenómenos
nocivos para las mismas e impidiendo también la difusión
de componentes bioquímicos entre los diferentes
compartimientos celulares, así como al medio extracelular.
Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona,
glutaraldehido, formaldehido, etc.
B-.Incubaciòn en el medio de reacción, como
consecuencia se liberan productos que por si mismos o al
combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un
precipitado visible en el lugar de la reaccíón.
C-.Contraste: para resaltar en lo posible el producto de
reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y
de citoplasma.
REQUISITOS PARA UNA REACCION CITOQUIMICA:

Los reactivos empleados deben ser asequibles y exentos
de toxicidad.
Reacciones deben ser suficientemente sensibles y
especìficas para una lìnea celular.
Reacciones deben ser reproducibles.
Reacciones no deben ser influenciadas por las condiciones
ambientales.
Muestras recientes y en lo posible sin anticoagulante.
Interpretación del resultado lo màs objetiva posible.
REQUISITOS
Debemos tener exigencia con el material de trabajo a fin de
evitar:
Falta de reproducibilidad.
Falsos positivos por artefactos de difusión.
Falsos negativos por contacto con inhibidores
(diversos anticoagulantes) o por preparaciones
envejecidas.
Obligatoriamente deben intercalarse controles positivos y
negativos.
Rigurosismo técnico extremo.
ESTANDARIZACION DEL METODO

Fundamental para la uniformidad en la lectura e
interpretación.
Se debe establecer como norma general:
- Preparación de los reactivos con productos de calidad probada.
- Práctica permanente de las reacciones con preparados testigo.
- Fijación y conservación adecuada de los preparados.
- Determinación de tiempos exactos para cada uno de los casos.
- Determinación de temperaturas exactas ( en especial para
los métodos enzimáticos).
- Tipo y condiciones de la inmersión para la lectura.
-Conservación idónea de los elementos sobre los cuales se
realiza
la determinación.
EMPLEO DE KITS PARA CITOQUIMICA

-Son de marcas reconocidas y dan buenos resultados
cuando se les usa según las indicaciones y dentro de
los tiempos indicados.
-Los costos en comparación con los reactivos
preparados en el propio laboratorio, son equivalentes
y a veces menores , en centros que tienen suficiente
demanda de pruebas.
-Sin embargo, para un adecuado aprendizaje el
usuario debe conocer la preparación de los reactivos,
en forma previa al uso del kit, lo cual le dará un
conocimiento más profundo de las reacciones y de las
causas de falla o error de estos.
¿QUE MUESTRAS PODEMOS USAR?
* Frotices de sangre perifèrica.

* Extensiones de mèdula òsea.
* Improntas de tejidos.
* Muestras delìquidos biològicos obtenidas por
citocentrifugación.
COMPUESTOS A ESTUDIAR
-Carbohidratos, detectados mediante la reacción de ácido
peryódico de Schiff o reacción de PAS.
-Enzimas oxidantes, evidenciadas mediante la reacción de
la peroxidasa.
-Enzimas hidrolíticas, como las fosfatasa alcalina,
fosfatasa ácida, beta glucoronidasa,esterasas, etc.
-Lípidos, detectados con la reacción de Sudan Black.
-Componentes inorgánicos, fundamentalmente hierro,
puesto de manifiesto mediante la reacción de azul de
Prusia o de Perls .
IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS
REACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS)
FUNDAMENTO:
El ácido periódico oxida carbohidratos (glicoles) y componentes
similares, rompe el enlace entre los átomos de carbono
transformando los grupos OH en aldehídos, los que reaccionan
con el reactivo de Schiff (leuco-fucsina), liberando fucsina y
tiñendo los componentes celulares que contienen los compuestos
oxidados.
Una variedad de compuestos intracelulares reacciona con el
PAS; pero el glucógeno es el componente principalmente
reaccionante.

INTERPRETACION:
(+) : Toda la serie linfoide con un patròn de distribuciòn
intracitoplasmàtico de tipo granular fino ,mediano o
grueso.
(+) : Los neutrófilos y eosinófilos en todos sus estadíos de
desarrollo y con mayor intensidad en el estadío maduro,
de distribuciòn homogènea difusa .
(+) : Serie monocìtica con patrón de distribución homogéneo
o mixto.
(+) : Megacariocitos y plaquetas patrón granular difuso
(- ) : Serie eritroide

APLICACION
Eritroleucemia: eritroblastos y eritrocitos anormales
positivos.
Transtornos madurativos de serie eritroide presentan
precursores positivos.
Células linfoides neoplásicas de leucemias linfáticas
crónicas y linfomas no Hodgkin pueden exhibir intensa
positividad.
Se usó para la diferenciación de diferentes tipos de
leucemias linfoblásticas (FAB).
PAS ( + )
PAS (+)
IDENTIFICACIÒN DE ENZIMAS OXIDANTES
MIELOPEROXIDASA: Introducida en 1918,fue la primera

reacciòn citoquìmica usada.
FUNDAMENTO :
La demostraciòn de esta enzima localizada en los grànulos
azuròfilos, se basa en su acciòn oxidante sobre el sustrato, la
bencidina, en presencia de H2O2.
La positividad de la reacciòn se pone de manifiesto por la
apariciòn de un precipitado pardo-oscuro en el citoplasma
celular.
MIELOPEROXIDASA
INTERPRETACIÒN:
(+) : Serie neutròfila en todos sus estadìos de desarrollo.

(++) : Eosinófilos
(+/d+/-) : Serie monocìtica
(-) : Linfocitos y eritrocitos
(-) : Basòfilos maduros de individuos normales
(-) : Megacariocitos y plaquetas (demostrable solo por
citoquímica ultraestructural)
MIELOPEROXIDASA
APLICACIÓN
• Diferenciación de celularidad blástica mieloíde (+) y
linfoíde (-)
• En las leucemias mieloides la mayoría de los
•
blastos (+/- 85%) y los
promielocitos son positivos.
• • Los cuerpos de Auer también son positivos.
• • En las leucemias monocíticas, los blastos y monocitos precursores son
dèbilmente positivos a negativos.
• • En eritroleucemias los precursores eritroides son negativos
• En leucemias megacariocíticas sòlo es demostrable por microscopía
• electrònica.
MIELOPEROXIDASA
APLICACIÓN
• En síndromes mielodisplásicos, leucemias mieloides

agudas y leucocitosis debida a infecciòn, los neutròfilos
pueden mostrar una disminuciòn de la actividad
peroxidàsica.
• En leucemia mieloide crónica tambièn hay disminuciòn de
la actividad.
• Existen también raros casos de deficiencia congénita de
mieloperoxidasa.
PX ( + )
PEROXIDASA (-)
.PEROXIDASA(+)
.MPO (+)
IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS

FOSFATASA ACIDA
FUNDAMENTO:
Es una enzima hidrolìtica de localización lisosómica del

grupo de las fosfoesterasas, que provoca la hidrolisis del
sustrato a pH ácido, liberando productos intermedios, que
al unirse con la sal diazoica dan un precipitado rojo-
naranja en el citoplasma celular.
FOSFATASA ACIDA
INTERPRETACION
(++) : Osteoclastos , macròfagos.

(+) : Plasmocitos, megacariocitos, monocitos
( - /+) : Neutròfilos y sus precursores
( - /+) : Eritroblastos
( - /++) : Linfocitos normales
FOSFATASA ACIDA
APLICACIÓN
Diagnóstico diferencial de sìndromes linfoproliferativos
agudos y crònicos: reacción positiva polar en los de
fenotipo T y reacción positiva multifocal en los de
fenotipo B, donde tiende a descender la actividad.
En las patologías anteriores la fosfatasa es tartrato
sensible.
Es tartrato resistente en las leucemias de células peludas
(tricoleucemias), donde es de utilidad para el diagnóstico
diferencial.
IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS

FOSFATASA ALCALINA LEUCOCITARA (FAL)
FUNDAMENTO:
Es una enzima que se encuentra en los grànulos
secundarios de los neutrófilos y se localiza en ellos desde
el metamielocito hasta el estadío segmentado.
Hidroliza monoésteres de ácido fosfórico, siendo activa a pH

alcalino (9,1-9,6) liberando productos intermedios los cuales
combinados con una sal diazoica originan un precipitado
coloreado en el citoplasma de la cèlula.
FOSFATASA ALCALINA (FAL)

INTERPRETACION
(+) : Neutrófilos desde metamielocitos hasta las formas

segmentadas.
(-) : Todas las demás células de sangre periférica y
médula ósea

INTERPRETACION
OBTENCION DEL SCORE LAPA
Se realiza el conteo de 100 células polimorfonucleares maduras o

las células en banda.
Se asigna 5 grados de reacciòn:
0+ : No hay reacciòn
1+ : Escasa presencia de precipitado visible
2+ : Reacciòn moderada
3+ : Reacciòn fuerte
4+ : Reacciòn muy fuerte, precipitado cubre casi toda la
superficie celular.

OBTENCION DEL SCORE LAPA
Se establece el ìndice de FAL o score LAPA:

* Multiplicando el nùmero de cèlulas contadas por su grado
de intensidad.
* Luego se suman los valores obtenidos.
* Valor normal promedio varía deacuerdo a cada laboratorio
y al cromògeno usado:
Fast Red Violet = 20-146
Fast Blue BB = 25-180
INTERPRETACION:
El test es óptimo en sangre periférica y debe realizarse
dentro de las 48 horas.
Los extendidos pueden congelarse por dos a tres semanas

con una pequeña pérdida de la actividad
LA CITOQUIMICA EN LA
HEMATOLOGIA
APLICACION:
* La determinaciòn semicuantitativa de FAL permite el
diagnòstico diferencial de diversas hemopatìas.
* La mayor utilidad está en la diferenciaciòn de leucemia
mieloide crónica, donde el score es bajo versus las
reacciones leucemoides en respuesta a una infección y
otros transtornos mieloprolifereativos crónicos, que
presentan un score elevado , aunque no es 100%
específico.
1+ 2+
3+ 4+
ESTERASAS:
FUNDAMENTO:
Son enzimas de localización no lisosómica que
hidrolizan los ésteres de cadena corta de los ácidos
grasos.
Actúan sobre un sustrato sintético liberando naftol, el
cual se acopla a la sal diazoica formando un
precipitado citoplasmático altamente coloreado.
ESTERASAS:
Existen varias clases de esterasas .

Se diferencian por:
Sustrato donde actúan
Los niveles òptimos de pH
ESTERASAS:
ESTERASAS ESPECIFICAS
CLOROACETATO ESTERASA (CAE)
Su sustrato: Naphthol-AS-D-cloroacetato
ESTERASAS:
ESTERASAS ESPECIFICAS
CLOROACETATO ESTERASA (CAE)
INTERPRETACION:
(++) : Casi exclusiva de toda la serie neutrofílica, células
cebadas .
(-) : Eosinòfilos, monocitos maduros
(+) : Cuerpos de Aûer
LA CITOQUIMICA EN LA
HEMATOLOGIA
ESTERASAS ESPECIFICAS:CLOROACETATO
ESTERASA (CAE)
APLICACIÓN:
El CAE no es tan sensible como la MPO para la
detecciòn de las etapas tempranas de la
diferenciaciòn granulocìtica, por lo que los blastos
mieloides más inmaduros pueden ser negativos.
CAE (+)
ESTERASAS
ESTERASAS INESPECIFICAS
Tenemos:
* Alfa-naftil-acetato esterasa (ANAE)

* Alfa-naftil-butirato esterasa (ANBE)
* Naftol-AS-D-acetato esterasa (NASDA)
* Naftil-AS-acetato esterasa (NASA)
ESTERASAS INESPECIFICAS:
INTERPRETACION
Con cualquiera de ellas, màs frecuentemente con el ANAE,
se demuestra la existencia de esterasas inespecìficas en
pràcticamente todas las cèlulas de las tres series
hematopoyèticas, pero con mucha mayor intensidad en los
monocitos
ESTERASAS:
INTERPRETACION
La reacción positiva en los monocitos es
característicamente inhibida por la adición de
fluoruro de sodio al medio de incubación.
Permiten diferenciar los mieloblastos y

promielocitos de los monoblastos y
promonocitos.
ESTERASAS:
APLICACION
Permiten diferenciar los mieloblastos y demás elementos
de la serie granulocítica que no presentan
fluorosensibilidad de los monoblastos y promonocitos cuya
reactividad es fluorosensible.
ANAE (+)
ANBE(+)
IDENTIFICACION DE LIPIDOS:
TINCION DEL NEGRO SUDAN B
FUNDAMENTO:
Se basa en la solubilidad del colorante empleado e
los lìpidos.
Tiñe grasas neutras, fosfolìpidos y esteroles.
Tambièn colorea componentes celulares no lipìdicos
tales como grànulos azuròfilos especìficos y cuerpos
de Auer.
TINCION DEL NEGRO SUDAN B:

INTERPRETACION
La sudanofilia es equivalente a la reacciòn de la

mieloperoxidasa.
TINCION DEL NEGRO SUDAN B :

APLICACION
Distingue la celularidad blástica mieloíde (+) de la linfoíde

(-).
COMPONENTES INORGANICOS:
REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS
FUNDAMENTO
El hierro de depósito se encuentra en el interior de las
células en forma de agregados de hemosiderina
detectable por la reacción de Perls.
Esta se basa en la acción del ácido clorhídrico para

liberar los iones férricos, que reaccionan con el
ferrocianuro de potasio dando un precipitado azul
verdoso de ferrocianuro férrico.
REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:

INTERPRETACION
En condiciones normales se observan los gránulos
hemosiderínicos en los eritroblastos (sideroblastos).
Igualmente en algunos eritrocitos (siderocitos) y

macrófagos de la médula ósea, hìgado y bazo.
En condiciones normales se ve un 30-60% de

sideroblastos con 1 a 4 gránulos en la superficie del
citoplasma.

INTERPRETACION
Un nùmero mayor indica disfunción del metabolismo del
hierro.
Ello puede conducir al depósito de este en las
mitocondrias,característico de una anemia refractaria
sideroblástica.
Los depòsitos de hemosiderina pueden informarse como
(+) , (-) o en porcentaje.
.

APLICACION
Sirve para diagnosticar anemias carenciales y síndromes
mielodisplásicos.

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En 1853 Perls hace la demostración histoquímica

La primera reacción enzimática aplicada a la

La mayorìa,son tècnicas que derivan de modificaciones

Nexo entre morfología y bioquímica

Conjuga forma y funciòn.

Brinda resultados de ìndole cualitativo o

Apoyo para el diagnòstico de las distintas hemopatìas.

La citoquìmica estudia la composiciòn quìmica de la cèlula

Es la reacción que por el empleo de uno o más reactivos

Reconocimiento y diagnostico celular

Estudio de la fisiología y fisiopatología celulares

REQUISITOS PARA UNA REACCION CITOQUIMICA:

ESTANDARIZACION DEL METODO

EMPLEO DE KITS PARA CITOQUIMICA

¿QUE MUESTRAS PODEMOS USAR?

* Frotices de sangre perifèrica.

REACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS)

REACCION DEL ACIDO PERYODICO DE SCHIFF (PAS)

IDENTIFICACIÒN DE ENZIMAS OXIDANTES

MIELOPEROXIDASA: Introducida en 1918,fue la primera

(+) : Serie neutròfila en todos sus estadìos de desarrollo.

• En síndromes mielodisplásicos, leucemias mieloides

IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS

Es una enzima hidrolìtica de localización lisosómica del

(++) : Osteoclastos , macròfagos.

IDENTIFICACION DE ENZIMAS HIDROLITICAS

Hidroliza monoésteres de ácido fosfórico, siendo activa a pH

FOSFATASA ALCALINA (FAL)

(+) : Neutrófilos desde metamielocitos hasta las formas

FOSFATASA ALCALINA (FAL)

Se realiza el conteo de 100 células polimorfonucleares maduras o

FOSFATASA ALCALINA (FAL)

Se establece el ìndice de FAL o score LAPA:

FOSFATASA ALCALINA (FAL)

Los extendidos pueden congelarse por dos a tres semanas

FOSFATASA ALCALINA (FAL)

Existen varias clases de esterasas .

* Alfa-naftil-acetato esterasa (ANAE)

Permiten diferenciar los mieloblastos y

TINCION DEL NEGRO SUDAN B:

La sudanofilia es equivalente a la reacciòn de la

TINCION DEL NEGRO SUDAN B :

Distingue la celularidad blástica mieloíde (+) de la linfoíde

Esta se basa en la acción del ácido clorhídrico para

REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:

Igualmente en algunos eritrocitos (siderocitos) y

En condiciones normales se ve un 30-60% de

REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:

REACCIÓN DE AZUL DE PRUSIA O DE PERLS:

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