Manual de Inmunohematologìa

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DIPLOMADO “HEMATOLOGÍA Y DIAGNÓSTICO EN EL LABORATORIO”
AVIDEZ
Consideraciones teóricas
Definición
La avidez según la NOM se define como el tiempo que tarda en reaccionar un anticuerpo
con su antígeno correspondiente.
En inmunohematología la avidez es el procedimiento manual mediante el cual se valora el

tiempo que tardan en aglutinar los anticuerpos clase IgM con su antígeno eritrocitario
correspondiente. Esta prueba se realiza únicamente para los antisueros anti-A, anti-B,
anti-AB y anti-D, y como control negativo de la prueba se utiliza el reactivo control de Rh.
La reacción antígeno-anticuerpo se visualiza mediante la reacción de aglutinación la cual

no requiere de ningún estímulo, como temperatura, potenciadores, antiglobulina humana
(suero de Coombs) o centrifugación para que se pueda desarrollar.
Si bien la prueba de avidez busca determinar el tiempo que tarda en aparecer el inicio de
la reacción de aglutinación derivada de la interacción del antígeno con su respectivo
anticuerpo, se requiere completar un tiempo de 2 minutos con agitación suave y
constante.
Una vez concluidos los 2 minutos se evaluará el tamaño del grumo. Si el tamaño del
grumo, el cual debe ser mayor a 1 mm para establecer que el antisuero es adecuado para
su uso en el laboratorio; en caso de no alcanzar el milímetro el antisuero deberá
descartarse pues su desempeño no es óptimo para procesar muestras en el laboratorio.
Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

M. en C. Soledad Gómez Ruiz (solgomezruiz@outlook.com)
De acuerdo con las especificaciones de la NOM, el tiempo máximo para observar los
primeros indicios de aglutinación con los sueros comerciales anti-A, anti-B, anti-AB y anti-
D ante sus antígenos correspondientes es de 30 segundos. Cabe señalar que para la
evaluación del anti-D se debe hacer uso de células RhD positivas heterocigotas.
Materiales y reactivos
• Bata
• Guantes
• Cubrebocas
• Placa de porcelana o placa de vidrio o placa de plástico o portaobjetos o placa
de aglutinación por ejemplo las utilizadas para reacciones febriles
• Aplicadores de plástico o de madera
• Pipetas automáticas (10 a 100 µL) o pipetas de transferencia o pipetas
Pasteur
• Puntas amarillas no estériles o bulbos para pipetas Pasteur
• Cronómetro manual o reloj de pulso o celular.
• Lámpara o lupa o fondo blanco si se utiliza placa de vidrio
• Anti-A clase IgM
• Anti-B clase IgM
• Anti-AB clase IgM
• Anti-D clase IgM y/o clase IgG+IgM
• Suero control de Rh correspondiente al anti-D utilizado
• Células A1
• Células A2
• Células B
• Células O
• Células RhD positivo heterocigoto

• Células RhD negativo

• Recipiente para desecho de material lavable
• Bolsas rojas para desecho de material
• Gasas
• Marcador indeleble
• Hoja de registro de resultados
Células para prueba de avidez
Las células pueden ser al 10% o al 40%, cualquiera es válida, pero siempre se debe
utilizar la misma concentración.
Si desea emplear células al 40% puede utilizar sangre total anticoagulada con EDTA o un
piloto de una unidad de sangre total de un donador sano con serología infecciosa no
reactiva. En este caso no es necesario el lavado de las células a menos que se observe
hemólisis en el sobrenadante, por lo que se recomienda que empleen muestras de no
más de 3 días a partir de su extracción.
Si utiliza células al 10%, debe lavar los eritrocitos 3 veces con solución salina fisiológica y
resuspenderlos a volumen adecuado en solución salina o PBS (buffer de fosfatos salino).
Técnica:
1. Marcar en una placa de vidrio o porcelana, áreas de 25 mm o una pulgada para

cada prueba.
2. Agregar 50µL o una gota de sangre total en un extremo del área marcada y 50µL o
una gota del antisuero a probarse en el extremo contrario.

3. Mezclar completamente los eritrocitos con el antisuero y activar el cronómetro.

Intente que la mezcla abarque toda el área marcada.
4. Agitar la placa suavemente procurando contar con iluminación o una fuente de luz
adecuada, o un fondo blanco (en el caso de placa de vidrio) para poder apreciar
los primeros indicios de aglutinación.
5. Detener el cronómetro cuando observe la aparición de pequeñas partículas de

aglutinación y registre el resultado.
6. Continuar con la agitación hasta completar los 2 minutos que marca la prueba para
valorar el tamaño del grumo.
Notas:
Realizar el mismo procedimiento al antisuero con todas las células (A1, A2, B y O)
independientemente del antisuero que se trate.
En el caso del anti-D y suero control de Rh realizar prueba de avidez con células RhD
positivas heterocigotas y RhD negativo.
En varias pruebas a realizar se esperan resultados negativos; sin embargo, las pruebas
se deben realizar para constatar y/o verificar que no existe algún anticuerpo o molécula
que ocasione reacciones falsas positivas; lo cual garantizará resultados verídicos al
procesar muestras de pacientes.

Resultados
Si no se observan partículas de aglutinación durante los 2 minutos que dura la prueba, se

reporta un resultado de avidez negativo.
Reportar los resultados inmediatamente de haber concluido la prueba, ya que la muestra

tiende a secarse y puede confundirse con una reacción de aglutinación, teniendo así un
falso positivo. En el caso de los positivos débiles se podrían evaluar con una mayor
intensidad por el secado de la muestra.
Si se observó aglutinación reportar 2 características:

1.- El tiempo de inicio de la formación de aglutinación (que corresponde a la
avidez) y
2.- El tamaño del grumo a los 2 minutos de agitación, estableciendo si es o no
mayor o igual a 1 mm (que corresponde a la cantidad de antisuero).
Conclusión de la prueba
La prueba de avidez valida la presencia de anticuerpos clase IgM capaces de formar

aglutinación sin ningún estímulo en sueros comerciales.

ESPECIFICIDAD
Definición
La especificidad es la capacidad que tiene un anticuerpo de reaccionar única y

exclusivamente con su antígeno correspondiente.
La especificidad en el control de calidad diario del laboratorio de inmunohematología,

valida los anticuerpos IgM presentes en un antisuero comercial.
La prueba se debe realizar en tubo o en tarjetas de gel, para lo cual se debe contar con
células a concentraciones adecuadas para cada metodología.
La NOM nos obliga a realizar la prueba de especificidad cada día de uso de los sueros
anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D y al suero control de Rh, utilizando la centrifugación como
promotor de la reacción de aglutinación.
• Bata
• Guantes
• Cubrebocas
• Gradilla
• Pipetas automáticas o pipetas de transferencia o pipetas Pasteur
• Puntas amarillas o bulbos
• Tubos de 10X75 o 12X75mm


• Anti-D clase IgM o clase IgG+IgM
• Suero control Rh adecuado para el anti-D
• Células A1
• Células A2
• Células B
• Células O
• Células RhD positivo heterocigoto
• Células RhD negativo
• Centrífuga para inmunohematología (3200 – 3400 rpm)
• Lámpara para lectura (o fondo blanco)
• Pizeta
• Solución salina fisiológica
Preparación de las células
Preparar células al 3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).
1. Lavar aproximadamente 500 µL de sangre total con solución salina fisiológica 3

veces, entre cada lavado homogenizar la sangre antes de cada centrifugación, la
cual debe ser de al menos 1 minuto a 3200 rpm. Después de cada centrifugación
aspirar el sobrenadante por completo.

2. Tomar 300 µL (0.3mL) del paquete de eritrocitos lavados y depositar en un frasco

limpio que contenga 9700 µL (9.7 ml) de solución salina. Resuspender los
eritrocitos.
Para mantener las células viables durante su almacenamiento (que pueden ser
varios días), utilizar una solución del Alsever o cualquier solución que proporcione
nutrientes para la conservación celular (como el Adsol).
Realizar este procedimiento para cada célula (A1, A2, B, O, RhD heterocigota, y
RhD negativo).
3. Colocar en una gradilla 3 series de 4 tubos cada una, cada una para la
especificidad de cada antisuero del sistema ABO.
Rotular los tubos para cada antisuero como se muestra a continuación:
Serie 1 para suero anti-A Serie 2 para suero anti-B Serie 3 para suero anti-AB
Tubo Rótulo Tubo Rótulo Tubo Rótulo
1 Anti-A + CA1 1 Anti-B + CA1 1 Anti-AB + CA1
2Anti-A + CA2 2 Anti-B + CA2 2 Anti-AB + CA2
3 Anti-A + CB 3 Anti-B + CB 3 Anti-AB + CB
4 Anti-A + CO 4 Anti-B + CO 4 Anti-AB + CO
4. Colocar en una gradilla 2 series de 2 tubos cada una, una para la especificidad de
anti-D y la otra para la especificidad del control de Rh. Rotular los tubos para cada
antisuero como se muestra a continuación:
Serie 4 para suero anti-D Serie 5 para suero control de Rh

Tubo Rótulo Tubo Rótulo
1 Anti-D + CDpos 1 Control + CDpos
2 Anti-D + CDneg 2 Control + CDneg

Procedimiento:
1. Organizar los tubos en la gradilla en series y filas.
2. Dispensar antisueros y células a cada tubo de la siguiente manera

• Para antisueros del sistema ABO
Serie 1 agregar 50µL o una gota de anti-A
Serie 2 agregar 50µL o una gota de anti-AB
Serie 3 agregar 50µL o una gota de anti-B
A continuación, dispensar las células de la siguiente manera: Fila

1 dispensar 50µL o una gota de células A1
Fila 2 dispensar 50µL o una gota de células A2
Fila 3 dispensar 50µL o una gota de células B Fila
4 dispensar 50µL o una gota de células O
• Para antisuero anti-D y control de Rh Dispensar el

reactivo de la siguiente manera: Serie 1 dispensar 50µL
o una gota de anti-D Serie 2 dispensar 50µL o una gota
de control de Rh
A continuación, agregar células de la siguiente manera:

Fila 1 agregar 50µL o una gota de células D positivo heterocigotas Fila
2 agregar 50µL o una gota de células D negativo
3. Homogenizar el contenido de todos los tubos.
4. Centrifugar 30 segundos a 3200 rpm.

5. Leer los tubos, uno a uno, suavemente hasta que se desprendan todas las células
del botón que se formó al fondo del tubo.
6. Reportar inmediatamente el grado de aglutinación observada.
Nota. Para el control de calidad de especificidad siempre se espera obtener 4 cruces de

aglutinación o negativo.
Resultados esperados
El anticuerpo probado solamente reaccionará con los eritrocitos que posean el antígeno
correspondiente.
Si algún antisuero presenta reacción no específica o positiva débil (3+ o menos), debe
repetir la prueba, verificando que el procedimiento y condiciones sean las adecuadas,
considerando la calidad del material (tubos no rayados, estrellados o sucios), la
concentración de las células utilizadas, el volumen dispensado, la centrífuga, las
revoluciones por minuto y la forma de lectura. Si el resultado débil o inespecífico persiste,
el antisuero no es óptimo ni apto para su uso en pacientes.

TÍTULO Y POTENCIA DE ANTICUERPOS
Definición
El título y potencia según la NOM es la recíproca de la dilución del último tubo en donde
todavía se observa una cruz de aglutinación.
También se puede definir como la última lectura positiva de una cruz de aglutinación de
un anticuerpo probado en diluciones seriadas contra células que contienen el antígeno
correspondiente al suero probado.
El título y potencia tienen la intención de valorar la capacidad de reacción de los

anticuerpos IgM presentes en los antisueros anti-A, anti-B, anti-AB y anti-D, por lo que la
prueba implica realizar diluciones dobles seriadas del antisuero con solución salina.
Para la evaluación de los antisueros del sistema ABO se preparan diluciones desde 1:2
hasta 1:2048, y para el anti-D desde 1:2 hasta 1:512.
Para realizar esta prueba en tubo se requieren suspensiones celulares al 3%.
•
Bata
•
Guantes
•
Cubrebocas
•
Gradilla
•
Tubos de 10X75 o 12x75mm

•
Pipetas automáticas (10 -100 µL) o pipetas de transferencia o pipetas Pasteur
•
Puntas amarillas o bulbos
•
Solución salina fisiológica
•
Anti-A clase IgM
•
Anti-AB clase IgM
•
Anti-B clase IgM
•
Anti-D clase IgM o clase IgG+IgM
•
Suero control Rh correspondiente al Anti-D
•
Células A1
•
Células B
•
Células O
•
Células RhD positivo heterocigoto
•
Vórtex
•
Recipiente de punzocortantes
Preparar células al 3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).

veces, entre cada lavado homogenizar la sangre antes de cada centrifugación la
cual debe ser de al menos de 1 minuto a 3200 revoluciones. Después de cada
centrifugación aspirar el sobrenadante por completo.

limpio que contenga 9700 µL (9.7ml) de solución salina. Resuspender los
eritrocitos. Para mantener las células viables durante su almacenamiento (que
pueden ser varios días), utilizar una solución del Alsever o cualquier
solución que proporcione nutrientes para la conservación celular (como el Adsol).

Preparación de los sueros
1. Rotular para cada antisuero una serie de 12 tubos de la siguiente manera:

2. Tubo 1: SP (suero puro o suero sin diluir)
Tubo 2: 1:2
Tubo 3: 1:4
Tubo 4: 1:8
Tubo 5: 1:16
Tubo 6: 1:32
Tubo 7: 1:64
Tubo 8: 1:128
Tubo 9: 1:256
Tubo 10: 1:512
Tubo 11: 1:1024
Tubo 12: 1:2048
3. Agregar 100µL de solución salina a cada tubo a excepción del tubo 1 (SP).
4. En el tubo 1 y en el tubo 2 agregar 100 µL del antisuero a probar.
5. Homogenizar el contenido del tubo 2 (solución salina + antisuero)
6. Tomar 100µL del tubo 2 y agregarlos al tubo 3
7. Homogenizar con pipeta automática, pipeta Pasteur, pipeta de transferencia o

vortex.

7. Repetir los pasos del punto 4 al punto 6 hasta llegar al tubo marcado como 1:2048.
8. En otra serie de 12 tubos rotulados de la misma forma trasvasar 50 µL de cada

una de las diluciones preparadas, empezando de la muestra más diluida a la más
concentrada.
9. Agregar 50µL de las células con el antígeno correspondiente a cada uno de los
tubos de la serie.
10. Homogenizar
11. Centrifugar 30 segundos a 3200 rpm
12. Leer uno a uno los tubos, agitando suavemente hasta despegar completamente el
botón celular.
Nota. Recordar, que para el antisuero anti-A el título y potencia se evalúa únicamente con
células A1, para el anti-B son con células B, para el anti-AB con células A1 y células B y
para el anti-D con células RhD heterocigotas.
Resultados esperados
El título mínimo aceptado es igual o mayor a 1:256 para antisueros del sistema ABO y, de
1:64 para el anti-D.

Conclusión de Pruebas de Control de Calidad
Cuando alguna de las 3 pruebas (avidez, especificidad y título o potencia) no

cumpla con los requisitos mínimos e indispensables establecidos en la
normatividad, el antisuero no podrá ser utilizado para el proceso de muestras de
pacientes. Y deberá ser retirado de los refrigeradores y etiquetado como no apto
para su uso en el laboratorio. Finalmente se elaborará un reporte de los resultados
al jefe del laboratorio o al encargado del control de calidad en el laboratorio para la
correspondiente investigación.

TÍTULO DE SUERO DE COOMBS. CONTROL DE CALIDAD
Definición
En el mercado existen diferentes presentaciones del suero de Coombs que pueden ser
anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-IgD y anti-IgE (de ahí el nombre de antiglobulina); sin
embargo, también existe como anti-complemento, siendo anti-C3d, anti-C3b y anti-C4, los
más comunes.
El Coombs anti-IgG + anti-complemento (Suero de Coombs poliespecífico), es el más

utilizado para las pruebas y técnicas en tubo, pero también se pueden utilizar sueros de
Coombs monoespecíficos (anti-IgG o anti-complemento) en situaciones especiales.
En control de calidad, el suero de Coombs se utiliza para evaluar la cantidad y calidad de

las células sensibilizadas.
▪
Bata
▪
Guantes
▪
Cubrebocas
▪
Gradilla
▪
Tubos de 10X75 o 12x75mm
▪
Pipetas automáticas (10 -100 µL) o pipetas de transferencia o pipetas
Pasteur
▪
Puntas amarillas o bulbos
▪
Solución salina fisiológica
▪
Suero de Coombs poliespecífico o monoespecífico

▪
Células sensibilizadas con IgG
▪
Células sensibilizadas con complemento
▪
Células sensibilizadas con IgG y complemento
▪
Células no sensibilizas
▪
Vortex
▪
Recipiente de punzocortantes
▪
Incubadora
Preparación de las células sensibilizadas con IgG
Usar células RhD positivas (homocigotas o heterocigotas para antígeno D) y preparar al

3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).
1. Lavar aproximadamente 500 µL de células D positivas (homocigotas o

heterocigotas) con solución salina fisiológica 3 veces, entre cada lavado
homogenizar la sangre antes de cada centrifugación la cual debe ser de al menos
de 1 minuto a 3200. Después de cada centrifugación aspirar el sobrenadante por
completo.
2. Después del último lavado resuspender las células al 50% con solución salina
3. Agregar 100µL de anti-D clase IgG (RhoGAM)
4. Homogenizar las células con el reactivo
5. Incubar 1 hora a 37°C. Homogenizar las células cada 15 minutos en el baño maría
o incubadora.

6. Transcurrido el tiempo lavar las células 3 veces con solución salina. , entre cada
lavado homogenizar la sangre antes de cada centrifugación la cual debe ser de al
menos de 1 minuto a 3200. Después de cada centrifugación aspirar el
sobrenadante por completo.
7. Tomar una gota para resuspenderla al 3% en solución salina.
Preparación del suero de Coombs
1. Marcar para cada antisuero una serie de 9 tubos de la siguiente manera: Tubo
1: SP (suero puro o suero sin diluir)
Tubo 2: 1:2
Tubo 3: 1:4
Tubo 4: 1:8
Tubo 5: 1:16
Tubo 6: 1:32
Tubo 7: 1:64
Tubo 8: 1:128
Tubo 9: 1:256
2. Agregar 100µL de solución salina a cada tubo a excepción del tubo 1 (SP).
3. En el tubo 1 y en el tubo 2 agregar 100 µL solo el suero de Coombs.
4. Homogenizar el contenido del tubo 2 (solución salina + suero de Coombs).
5. Tomar 100µL del tubo 2 y agregarlos al tubo 3.
6. Homogenizar con pipeta automática, pipeta Pasteur, pipeta de transferencia o

vórtex.

7. Repetir los pasos del punto 4 al punto 6 hasta llegar al tubo marcado como 1:256.
8. En otra serie de 9 tubos marcados de la misma forma trasvasar 50 µL de cada una

de las diluciones preparadas, empezando de la muestra más diluida a la más
concentrada.
Evaluación de suero de Coombs
9. Agregar 50µL de los eritrocitos sensibilizados recién preparados.
10. Homogenizar.
12. Leer inmediatamente uno a uno los tubos, agitando suavemente hasta despegar
completamente el botón celular.
13. Reportar inmediatamente los resultados y el grado de aglutinación observada.
14. Si el resultado del título es menor de 1:32, agregar 25 o 50µL de suero anti-D
clase IgG RhoGAM a las células previamente sensibilizadas para aumentar la
cantidad de anticuerpo unido a los antígenos eritrocitarios para potenciar el título.
15. Incubar a 37°C durante media hora (30 minutos). Homogenizar las células cada 15
minutos en el baño maría o incubadora.

16. Transcurrido el tiempo lavar con solución salina fisiológica 3 veces, entre cada
lavado homogenizar la sangre antes de cada centrifugación la cual debe ser de al
menos de 1 minuto a 3200. Después de cada centrifugación aspirar el
sobrenadante por completo.
17. Tomar una gota para resuspenderla al 3% en solución salina.
18. Repetir la prueba (punto 1 al 13).
19. Si el resultado es mayor a 1:64 (por ejemplo 1:128), las células están muy
sensibilizadas (tienen mucho anticuerpo unido a los antígenos), desechar las
células.
20. Preparar células sensibilizadas con menor cantidad (50 o 75µL) de anti-D RhoGAM
(repetir procedimiento de preparación de células sensibilizadas con IgG,
preparación de suero de Coombs y evaluación del suero de Coombs).
Notas:
Unas células muy sensibilizadas no detectarán errores intrínsecos o extrínsecos de la

prueba, ya que el resultado siempre será positivo.
Unas células poco sensibilizadas, invitan a repetir la prueba, porque detectan falsas fallas
durante el procedimiento técnico.
Unas células con óptima sensibilización que permitan evaluar el trabajo diario del personal
y del material utilizado, deben poseer un título entre 1:32 y 1:64.
Para el control de calidad del suero de Coombs, el último tubo con aglutinación de una
cruz representa el título del suero.

El título de Coombs, además de ser una prueba de control de calidad, también puede ser
utilizada para el estudio de pacientes con Coombs directo positivo. En este caso el último
tubo con el grado de aglutinación más débil representa el título de la reacción, por lo que
los grados de aglutinación serán diversos y dependientes de las condiciones
inmunológicas de cada paciente; y puede variar de un día a otro derivado del tratamiento
prescrito por el médico. Es por ello, que resulta imperativo realizar título y potencia en los
pacientes con Coombs directo positivo para su seguimiento clínico.

Solución de baja fuerza iónica
Se disuelven 18g de glicina en 500 ml de agua destilada, seguidamente se añade NaOH
1.0 mol/L en goteo, y se mezcla continuamente, hasta que el pH alcance 6.7 (se requieren
aproximadamente 0.35 ml de NaOH 1.0 mol/L), a continuación, se adicionan 20 ml de
tapón de fosfatos 0.15 mol/L, pH 6.7 (obtenido mezclando aproximadamente a volúmenes
iguales Na2HPO4 0.15 mol/L con NaH2PO4 0.15 mol/L) y luego 1.79 g de NaCl disueltos
en 100 ml de agua destilada. Se lleva hasta 1 litro con agua destilada.
Cuando se utiliza la solución de baja fuerza iónica, se lavan dos veces los eritrocitos con
solución salina, luego una vez con solución de baja fuerza iónica y se vuelven a
suspender en dicha solución hasta una concentración de 3%, aproximadamente. Se
añade entonces un volumen de eritrocitos a un volumen de suero diluido en solución
salina (Mollison, 1987).

Procedimientos de rutina en el laboratorio de inmunohematología
DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO
La determinación los antígenos del sistema sanguíneo ABO, y del antígeno D del sistema
Rh, es una prueba de rutina en los pacientes, donadores e individuos sanos. Cuya
correcta determinación e interpretación resulta esencial, para disminuir los reportes de
resultados erróneos por factores intrínsecos o extrínsecos de la muestra.
El sistema sanguíneo ABO, es el más importante dentro de los sistemas sanguíneos

existentes, pues tiene una alta capacidad de reacción con los anticuerpos naturales que
poseen los individuos.
El segundo sistema de importancia es el sistema Rh, que posee una gran cantidad de
antígenos, sin embargo, el antígeno D es el que cobra mayor relevancia ya que tiene un
alto poder inmunogénico capaz de despertar la respuesta inmune de un sujeto que
carezca de dicho antígeno.
En la medicina transfusional los errores que involucran a los sistemas ABO y Rh (con
particular importancia el antígeno D), provocan diversas reacciones adversas en los
pacientes, que van desde la sensibilización a antígenos y producción de aloanticuerpos
hasta reacciones severas que en ocasiones puede causar la muerte del individuo.

Por lo anterior, las asociaciones y grupos dedicados a la medicina transfusional han

adquirido el reto y el compromiso de establecer lineamientos para la correcta realización
del grupo sanguíneo de los donadores y receptores de componentes sanguíneos. Así
mismo, hacen hincapié en los procedimientos administrativos de registro, pues es uno
punto crítico, susceptible a una gran variedad de errores.
• Bata
• Guantes
• Cubrebocas
• Gradilla
• Anti-D clase IgG+IgM (monoclonal o policlonal)
• Suero de Coombs poliespecífico
• Células A1
• Células A2
• Células B
• Células O
• Células sensibilizadas

• Incubadora
• Pizeta
Obtención de suero o plasma
Centrifugar la muestra de sangre total del paciente para obtener suero o plasma libre de
fibrina o eritrocitos respectivamente, según la muestra de la que se disponga.
Preparar células A1, células A2, células B, células O, células sensibilizadas y células no
sensibilizadas al 3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).

veces, entre cada lavado homogenizar la sangre antes de cada centrifugación la
cual debe ser de al menos de 1 minuto a 3200 revoluciones. Después de cada
centrifugación aspirar el sobrenadante por completo.

limpio que contenga 9700 µL (9.7ml) de solución salina. Resuspender los
eritrocitos.
Para mantener las células viables durante su almacenamiento (que pueden ser
varios días), utilizar una solución del Alsever o cualquier solución que proporcione
nutrientes para la conservación celular (como el Adsol).
Realizar este procedimiento para cada célula.

Preparación de las células del paciente
Preparar células al 3%, resuspendiendo en solución salina fisiológica o en el mismo

plasma o suero del sujeto en estudio (no se requiere el lavado previo de las células del
paciente).
Determinación de sistema sanguíneo ABO
La determinación correcta del sistema sanguíneo ABO obliga a realizar la prueba celular
para la investigación de antígenos y la prueba sérica, para la investigación de anticuerpos.
Procedimiento:
Para la determinación del sistema sanguíneo ABO es necesario disponer de 8 tubos, 4

tubos para montar el grupo directo y 4 tubos, para montar el grupo inverso, los cuales se
deben rotular de la siguiente forma:
Grupo directo Grupo inverso

Tubo Rótulo
Tubo Rótulo 5 CA1
1 Anti-A
6 CA2
2 Anti-AB
7 CB
Anti-B
3 8 CO
4 AT (autotestigo)
Prueba directa (prueba celular)
1. Agregar 100µL o 2 gotas del suero comercial (consultar el inserto del reactivo) a
cada tubo según corresponda y en el tubo marcado como AT dispensar 100µL o 2
gotas de suero o plasma del sujeto en estudio (paciente, donador o individuo
sano).

2. Agregar 50µL o una gota de eritrocitos del sujeto en estudio a cada uno de los 4
tubos designados para grupo directo.
Prueba inversa (prueba sérica)
3. Agregar 100µL o 2 gotas de suero o plasma del sujeto en estudio a cada uno de
los 4 tubos designados para el grupo inverso.
4. Agregar 50µL o una gota de células A1, A2, B y O a cada tubo según corresponda.
5. Homogenizar.
botón celular.
9. Interpretar los resultados para corroborar que el grupo directo e inverso

corresponden, es decir, que no tengan discrepancia.
Determinación de antígeno D del sistema Rh
Para la determinación del antígeno D en la superficie de los eritrocitos es necesario el uso

de sueros comerciales anti-D clase IgG más anti-D clase IgM ya que algunos individuos
cuentan con variantes del antígeno D, que pueden ser por una baja expresión de sitios
antigénicos o deleción de estos.

Procedimiento
1. Marcar 2 tubos de la siguiente forma:

Tubo Rótulo
9 Anti-D
10 SCRh (suero control de Rh)
2. Agregar 100µL o 2 gotas del suero comercial a cada tubo según corresponda
(consultar el inserto del reactivo).
3. Agregar 50µL o una gota de células al 3% del sujeto en estudio.
4. Homogenizar.
botón celular.
7. Reportar los resultados inmediatamente y el grado de aglutinación observada.
8. Interpretar los resultados.
En caso de tener un resultado negativo en los 2 tubos:
9. Homogenizar los 2 tubos
10. Recentrifugar 30 segundos a 3200 rpm.
11. Leer uno a uno los tubos suavemente hasta despegar el botón formado.
12. Registrar los resultados y verificar el resultado.

Si el resultado continúa siendo negativo:
13. Tomar una gota de sangre total del sujeto en estudio y lavarla 3 veces con
solución salina isotónica.
14. Resuspender las células al 3%.
15. Repetir la prueba (punto 1 al punto 7) con doble cantidad del antisuero
cerciorándose que el suero anti-D contenga anticuerpos clase IgG.
Si el resultado es negativo:
16. Incubar los tubos a 37°C por 30 minutos (o lo que diga su manual de
procedimientos o el inserto de su reactivo).
17. Transcurrido el tiempo de la incubación centrifugar 30 segundos a 3200 rpm.
19. Registrar los resultados.
Si el resultado es negativo:
20. Lavar las células 3 veces con solución salina isotónica.
21. El tercer lavado decantar a sequedad para eliminar la mayor cantidad de agua
posible.
22. Agregar 2 gotas o 100µL se suero de Coombs poliespecífico.
23. Homogenizar

En el caso de que el tubo marcado como anti-D se observe aglutinación y en el tubo

marcado como control de Rh no haya aglutinación, el sujeto será RhD positivo, es decir,
sus eritrocitos tienen el antígeno D sobre la membrana.
Por otra parte, si ambos tubos no presentan aglutinación (anti-D y control de Rh), el sujeto
será RhD negativo, es decir, que sus eritrocitos no expresan sobre la membrana el
antígeno D.
Finalmente, para validar la prueba:
28. Agregar 50µL o una gota de células sensibilizadas a cada uno de los tubos que no
haya presentado aglutinación.
29. Homogenizar
31. Leer uno a uno los tubos, suavemente hasta despegar el botón formado.

Resultados
Se espera observar un resultado de aglutinación de 2 cruces, para validar la prueba; en

caso de obtener un resultado negativo (no aglutinación) la prueba se invalida y deberá
repetir todo el procedimiento revisando que el material se encuentre en óptimas
condiciones, bien lavado, que los sueros utilizados hayan pasado el control de calidad y la
calidad de la muestra del paciente.

PRUEBA CRUZADA
Definición
Las pruebas cruzadas son pruebas in vitro en las cuales se aplican los factores que
intervienen en la reacción antígeno anticuerpo, para tratar de establecer si en el suero del
paciente existen anticuerpos dirigidos hacia los antígenos eritrocitarios del donador o, si
en el suero del donador existen anticuerpos contra los antígenos eritrocitarios del
paciente, en caso de que se presente alguna de las dos situaciones se estará frente a una
incompatibilidad sanguínea e implica la no transfusión del producto sanguíneo
(concentrado eritrocitario o plasma fresco congelado).
• Bata
• Guantes
• Cubrebocas
• Gradilla
• Anti-D clase IgG+IgM (monoclonal o policlonal)
• Suero de Coombs poliespecífico
• Células sensibilizadas


• Incubadora
• Pizeta
Procedimiento
Preparación de las células del paciente

paciente).
Preparación de células del donador
Tomar un piloto del concentrado eritrocitario lavarlo 3 veces con solución salina isotónica
y resuspender las células al 3%.

Prueba cruzada para concentrado eritrocitario
1. Rotular 3 tubos de la siguiente manera:

Tubo Rótulo
1 AT (autotestigo)
2 R (prueba menor)
3 D (prueba mayor)
2. Agregar 100µL o 2 gotas de suero o plasma a los tubos de la siguiente manera:

Tubo Suero o plasma del:
1 (AT) Receptor
2 (R) Donador
3 (D) Receptor
3. Agregar los eritrocitos al 3% de la forma siguiente:

Tubo Eritrocitos del:
1 (A) Receptor
2 (R) Receptor
3 (D) Donador
4. Homogenizar
7. Registrar los resultados
8. Interpretar los resultados
A esta fase se le denomina lectura rápida, la cual tiene como objetivo la detección de la
incompatibilidad al sistema ABO, por lo que es imperativo realizar la lectura adecuada
para observar si existe o no la interacción entre el antígeno y el anticuerpo en la prueba
cruzada menor y/o en la prueba cruzada mayor.

Un resultado positivo (aglutinación) en cualquiera de los tubos evidencia la presencia de

anticuerpos clase IgM.
Resultados positivos en cualquiera de los tubos, requiere el análisis de los resultados para
decidir si se repite la prueba.
Si el resultado fue positivo en cualquiera de los tubos, analizar los resultados para decidir
si se repite la prueba, se revisan los grupos del donador como del receptor, o si se
continua con el siguiente, la incubación.
Si los resultados son negativos.

9. Incubar a 37°C en baño maría durante 30 a 60 minutos
10. Terminado el tiempo de incubación centrifugar 30 segundos a 3200 rpm e

incubarlos nuevamente 1 minuto en el baño maría o incubadora.
11. Leer los tubos, uno a uno, suavemente hasta despegar el botón formado.
12. Registrar de inmediato los resultados en la hoja de registro.
Si el resultado es positivo, indica la presencia de una alta concentración de IgG, y se

analiza si se continúa o detiene la prueba.
Si el resultado es negativo.
13. Lavar los tubos 3 veces con solución salina fisiológica, el tercer lavado decantar a
sequedad.
14. Agregar 2 gotas de suero de Coombs.
15. Homogenizar.

17. Leer los tubos uno a uno, suavemente hasta despegar el botón formado.
19. Analizar los resultados
Si algún tubo resultó positivo (presentó aglutinación) realizar la búsqueda de anticuerpos

en el receptor o donador, según lo sugieran los resultados obtenidos.

IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS
La búsqueda de anticuerpos es un tipo de Coombs indirecto, la cual tiene el objetivo

identificar el anticuerpo específico de acción en frío, o caliente o frío y caliente, que ha
producido un paciente, derivado de una exposición a antígenos eritrocitarios no
conocidos.
Para la búsqueda de anticuerpos se utilizan células de fenotipo conocido, es decir, células

de las cuáles se conocen los antígenos eritrocitarios que presentan sobre la membrana y
son diferentes a los del sistema ABO y, se enfrentan al suero de un paciente que
previamente presentó una prueba cruzada incompatible, o una reacción transfusional, o
un Coombs directo positivo o se trata de una madre un bebé que desarrolló enfermedad
hemolítica del recién nacido.
Procedimiento
Preparación de las células del paciente para AT

paciente).

Preparación de células del panel
Si utiliza células comerciales, vienen resuspendidas al 3% listas para su uso.
Si utiliza células concentradas al 40%, como las que proporciona el IMSS, lavar 3 veces
con solución salina fisiológica y resuspender al 3%.
Si tiene células para trabajo en tarjeta, pero no dispone de tarjeta, solo de tubo,
concentrar las células eliminando 2/3 partes de la solución en la cual se encuentran
suspendidas.
Identificación de anticuerpos
1. Rotular 12 tubos con numeración consecutiva del 1 al 11 y el tubo restante como

2. AT (autotestigo).
3. Agregar 100µL o 2 gotas de suero o plasma del paciente a todos los tubos.
4. Agregar 50µL o una gota de células del panel, al tubo correspondiente. Al tubo
marcado como AT agregar células del paciente.
5. Homogenizar.
9. Incubar a 37°C en baño maría durante 30 a 60 minutos.



Si algún tubo resultó negativo (no presentó aglutinación):
16. Lavar los tubos 3 veces con solución salina fisiológica, el tercer lavado decantar a
sequedad.
17. Agregar 2 gotas de suero de Coombs.
18. Homogenizar.
20. Leer los tubos uno a uno, suavemente hasta despegar el botón formado.
22. Analizar los resultados.
Si algún tubo continúa sin presentar aglutinación:
23. Agregar 50µL o una gota de células sensibilizadas.
24. Homogenizar


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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

En inmunohematología la avidez es el procedimiento manual mediante el cual se valora el

La reacción antígeno-anticuerpo se visualiza mediante la reacción de aglutinación la cual

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

• Células RhD negativo

Células para prueba de avidez

1. Marcar en una placa de vidrio o porcelana, áreas de 25 mm o una pulgada para

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

3. Mezclar completamente los eritrocitos con el antisuero y activar el cronómetro.

5. Detener el cronómetro cuando observe la aparición de pequeñas partículas de

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

Si no se observan partículas de aglutinación durante los 2 minutos que dura la prueba, se

Reportar los resultados inmediatamente de haber concluido la prueba, ya que la muestra

Si se observó aglutinación reportar 2 características:

La prueba de avidez valida la presencia de anticuerpos clase IgM capaces de formar

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

La especificidad es la capacidad que tiene un anticuerpo de reaccionar única y

La especificidad en el control de calidad diario del laboratorio de inmunohematología,

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

• Anti-AB clase IgM

Preparación de las células

Preparar células al 3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).

1. Lavar aproximadamente 500 µL de sangre total con solución salina fisiológica 3

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

2. Tomar 300 µL (0.3mL) del paquete de eritrocitos lavados y depositar en un frasco

Serie 4 para suero anti-D Serie 5 para suero control de Rh

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

1. Organizar los tubos en la gradilla en series y filas.

2. Dispensar antisueros y células a cada tubo de la siguiente manera

A continuación, dispensar las células de la siguiente manera: Fila

• Para antisuero anti-D y control de Rh Dispensar el

A continuación, agregar células de la siguiente manera:

3. Homogenizar el contenido de todos los tubos.

4. Centrifugar 30 segundos a 3200 rpm.

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

6. Reportar inmediatamente el grado de aglutinación observada.

Nota. Para el control de calidad de especificidad siempre se espera obtener 4 cruces de

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

TÍTULO Y POTENCIA DE ANTICUERPOS

El título y potencia tienen la intención de valorar la capacidad de reacción de los

Para realizar esta prueba en tubo se requieren suspensiones celulares al 3%.

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

Preparación de las células

Preparar células al 3%, (concentración ideal para trabajar en tubo).

1. Lavar aproximadamente 500 µL de sangre total con solución salina fisiológica 3

2. Tomar 300 µL (0.3mL) del paquete de eritrocitos lavados y depositar en un frasco

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

Preparación de los sueros

1. Rotular para cada antisuero una serie de 12 tubos de la siguiente manera:

4. En el tubo 1 y en el tubo 2 agregar 100 µL del antisuero a probar.

5. Homogenizar el contenido del tubo 2 (solución salina + antisuero)

6. Tomar 100µL del tubo 2 y agregarlos al tubo 3

7. Homogenizar con pipeta automática, pipeta Pasteur, pipeta de transferencia o

Esp. Javier Bautista Juárez (Javier_bautista_juarez@hotmail.com)

8. En otra serie de 12 tubos rotulados de la misma forma trasvasar 50 µL de cada

11. Centrifugar 30 segundos a 3200 rpm

13. Reportar inmediatamente el grado de aglutinación observada.