TIPOS DE CROMATOGRAFAS

1. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.

2. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD.

3. CROMATOGRAFA DE INTERACCIONES HIDROFBICAS.

4. CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL.

5. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC).

6. CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (RPC).

7. ADSORCIN EN LECHO EXPANDIDO.

 1. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.

La separacin en esta cromatografa se basa en las diferencias de carga

entre las molculas.

Es capaz de separar molculas que difieren muy poco en la carga, de ah su

gran poder resolutivo.

Se utiliza una matriz (compuestos inorgnicos, resinas sintticas ) insoluble y

porosa que presenta grupos cargados unidos de forma covalente.

Los grupos cargados estn asociados a contraiones mviles.

Los intercambiadores pueden ser aninicos o catinicos.

Intercambiador aninico: Cuando la carga de los grupos de la matriz

es positiva, los contraiones son negativos (aniones). Ej: DEAE, QAE, AE

Intercambiador catinico: Cuando la carga de los grupos de la matriz

es negativa, los contraiones son positivos (cationes). Ej: SP, P, CM.

Intercambiadores fuertes: Se ionizan totalmente en un rango de pH

amplio, solo requiere de una pequea cantidad de lcali para cambiar el
pH. Ej: Grupos Sulfnicos y aminos cuaternarios.
La capacidad real de un intercambiador depende del
acceso a los grupos funcionales, de la concentracin y
fuerza inica del eluyente, de la naturaleza del contrain y
de la selectividad de los grupos cargados funcionales.

Las molculas se enlazan al intercambiador por fuerzas

electrostticas entre las cargas superficiales de la
molcula y los grupos cargados del intercambiador.

La recuperacin de la molcula se puede lograr por

variaciones del pH o de la fuerza inica del ambiente en
el cual se encuentra el complejo molcula-intercambiador

El pH en el microentorno de un intercambiador inico no

es el mismo que el del buffer de aplicacin o de elusin
debido al efecto Donnan (Provoca que los protones sean
atrados o repelidos cerca de la matriz).
FACTORES A TENER EN CUENTA PARA LA SELECCIN DE UN
INTERCAMBIADOR IONICO.

El punto isoelctrico de la protena.

La estabilidad del componente a separar, su peso
molecular y el de los contaminantes.
Requerimientos especficos de la aplicacin.

FACTORES A TENER EN CUENTA PARA LA SELECCIN DEL BUFFER.

Los iones del buffer no deben interactuar con el intercambiador.

La carga de las especies inicas que tienen la funcin de buffer deben ser
iguales que la de los grupos sustituyentes del intercambiador.
Deben utilizarse contraiones sencillos en el buffer.
Ej: Para DEAE-celulosa debe emplearse CL y acetato.
Ej: Para CM-celulosa debe emplearse K, Na y H-Tris.
Se debe evitar utilizar agentes polianinicos como el EDTA ya que se enlaza al
DEAE-celulosa y compite por los sitios de unin.
La cromatografa de intercambio inico se programa en dos etapas:

1. La aplicacin y adsorcin de la muestra.

Algunos componentes pueden no fijarse en esta etapa y son eliminados mediante
el lavado de la columna con un volumen del buffer equivalente al volumen de la
columna.

2. Elusin de los componentes fijados.

La separacin se obtiene debido a que cada componente presenta una afinidad
diferente por los grupos inicos del intercambiador. Esta afinidad es debido a las
diferencias entre sus cargas y puede controlarse por variaciones de la fuerza
inica y el pH del medio.
 CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ADSORCIN

Para la aplicacin la mezcla de protenas debe estar equilibrada con el mismo

buffer que se utiliz para equilibrar la columna.(Si la protena de inters se enlaza
fuertemente al intercambiador esto no es necesario).

El pH y la fuerza inica de la solucin de aplicacin debe ser igual al del buffer de

equilibracin.

Se recomienda que la longitud de la columna sea aproximadamente su dimetro.

La muestra no debe contener partculas precipitadas.

La velocidad de flujo para matrices convencionales puede oscilar entre 10 y 30

cm/h

Despus de aplicada la muestra, la columna debe lavarse.

 PROCEDIMIENTOS DE ELUCIN DE PROTENAS.

La elusin de las protenas adsorbidas al intercambiador se logra por

variaciones de pH, de fuerza inica o de ambos factores.

La elusin se puede realizar de modo continuo o discontinuo (por pasos).

Al final de la corrida cromatogrfica deben ser lavadas e higienizadas las

columnas
Cromatograma del proceso.
 Ejemplos de separacin de mezclas de protenas

Tenemos una disolucin acuosa de alanina e

histidina cuyos PI son respectivamente 6.1 y
7.6. Si el PH del medio es 6,5, y estamos
utilizando el gel Sephadex SP.
Prediga el orden de elusin.
 Cromatoenfoque.
Separacin de protenas segn sus
puntos isoelctricos.
Ofrece la ms alta resolucin
obtenida para separaciones basadas
en las diferencias de puntos
isoelctricos.
Es posible separar protenas que no
se resuelven bien en focalizacin
isoelctrica.
La fuerza inica de los buffer de cromatoenfoque
se deben mantener baja para favorecer la
interaccin fase estacionaria-protena.

Se crea un gradiente en la columna, las

protenas eluyen acorde con sus puntos
isoelctricos.
Se puede producir precipitacin o
agregacin de la protena en su valor de
punto isoelctrico.

La ventaja, en algunas ocasiones, es que

las protenas no eluyen exactamente a ese
valor.
Lmites del gradiente: 6-9. Separacin de tres
protenas cuyos pH isoelctricos son 6,5, 7,5 y 8,5
 2- CROMATOGRAFA DE AFINIDAD.

Es una de las tcnicas de mayor poder resolutivo.

Es una tcnica de separacin basada en las interacciones moleculares,

reversibles y especficas entre dos molecules biolgicamente activas.

k1
Producto + Ligando ProductoLigando K= k-1/k1

K-1

El ligando debe ser reconocido especficamente por el producto a purificar.

El ligando se inmoviliza qumicamente mediante enlaces covalentes en un

soporte o matriz insoluble, el ligando acta como el adsorbente.

La constante de disociacin(K) es un parmetro caracterstico de la fuerza de

afinidad entre el ligando y la molcula a purificar.
 Caractersticas de la constante de disociacin.

Los valores de la constante de disociacin entre 10-4 y 10-8 constituye un rango

apropiado para el desarrollo eficiente de la cromatografa de afinidad.

Si K<10-8 el grado de afinidad es muy fuerte por lo que puede requerir mtodos
muy drsticos para eluir la protena adsorbida.

Si K>10-4 puede conducir a la formacin de complejos muy lbiles que no

brindan seguridad para la retencin especfica en la matriz de la molcula a
purificar.
 Seleccin de la matriz a utilizar en la cromatografa:

La capacidad de adsorcin de un soporte depende de la cantidad de ligando

inmovilizado y su accesibilidad.

Se pueden encontrar tres situaciones diferentes:

1. El ligando, como el producto a separar son macromolculas 10000.

En este caso la porosidad de la matriz es el elemento ms importante, el producto
debe ser capaz de difundir libremente hacia el interior de los poros.
2. El ligando es una molcula 5000 y el producto a separar es una
macromolcula.
Debe ser utilizado un brazo espaciador entre la matriz y el ligando, para
garantizar que el producto a separar sea ms accesible al ligando inmovilizado.
3. El ligando es una macromolcula y el producto a separar es una molcula
pequea.
Es menos frecuente.
 Utilidad y seleccin del brazo espaciador:

Es necesario para ligandos de bajo peso molecular, que posea problemas de

accesibilidad o de baja afinidad hacia el producto a separar.

Est constituido por una cadena hidrocarbonada pequea y lineal.

G-(CH2)n-X

Grupo que se une a la matriz Grupo terminal (se une al ligando)

Ej: amina primaria o carboxilo.

El brazo espaciador aumenta la proximidad estrica entre el ligando

inmovilizado y el producto a separar.

La longitud ms utilizada del brazo espaciador es de 6 tomos de carbono.

 Soportes pueden ser de origen natural o sinttico.

polisacridos, como la agarosa, la celulosa

macroporosa esfrica y la dextrana.
matrices sintticas como los geles de
poliacrilamida

baja presin se utilizan partculas con

dimetros aproximados de 100 mm

de alta resolucin, con dimetros de partculas

entre 5 y 15 mm, a base de slica
 El ligando debe cumplir las siguientes
caractersticas:

Ser capaz de formar complejos reversibles con la

molcula a separar.

Presentar al menos un grupo reactivo qumicamente.

Su solubilidad compatible con los solventes utilizados

para la in movilizacin.

Debe ser estable durante las reacciones de

inmovilizacin.
 Tabla X-6 Principales molculas interactuantes usadas en
cromatografa de afinidad
Molcula interactuante 1 Molcula interactuante 2
Anticuerpos Antgenos
Enzimas Inhibidores-Cofactores-
Sustratos
Receptores Hormonas-Vitaminas-
Toxinas-Factores de
crecimiento
Glico-conjugados Lectinas
Acidos nucleicos Protenas-cidos nucleicos
Grupos aromticos Colorantes
contenidos en
macromolculas
Macromolculas que Iones metlicos
interactan con metales
 Etapas de la cromatografa de afinidad.

1. Aplicacin de la muestra: La muestra es aplicada bajo condiciones que

favorecen la unin especfica al Ligando.

2. Lavado: El material no unido al ligando es eliminado.

3.Elusin: La protena unida al ligando es recuperado por cambios en las

condiciones que favorecen la desorcin de la protena.
 3- CROMATOGRAFA DE INTERACCIONES HIDROFBICAS.

Esta tcnica separa protenas con diferencia en la

hidrofobicidad.

Es ideal esta tcnica para la captura y la etapa intermedia

de purificacin.

La separacin es basada en la interaccin reversible entre

la protena y la superficie hidrofbica del medio
cromatogrfico.

Esta tcnica es ideal para utilizarla despus de una

precipitacin salina con sulfato de amonio o despus de
obtenido el eluato de intercambio inico.
 Seleccin del ligando hidrofbico:

Se selecciona el medio con la mejor resolucin y

capacidad.

Generalmente la fuerza de unin del ligando a la protena

se incrementa en el orden siguiente: eter, isopropil, butil,
octil, fenil.
Seleccin del volumen de muestra a aplicar:

Para lograr una ptima separacin se debe aplicar un

volumen de muestra que no exceda el volumen de
capacidad de enlace de la columna.
Preparacin de la muestra:

La muestra de aplicacin debe estar al mismo pH que tiene el buffer en

que est equilibrada la columna y con alta fuerza inica (1.5 M de Sulfato
de Amonio
4M de cloruro de sodio.

La muestra de aplicacin debe estar libre de partculas en suspensin,

generalmente el tamao de poro del gel es menor de 34 m.

ElpH del buffer debe ser compatible con la estabilidad de

la protena y su actividad.
.
Preparacin de la columna:

Columnas preempacadas: Usando estas columnas se

logra mejorar la reproducibilidad de los procesos.

Columnas empacadas: Para todas las escalas de

produccin se debe aplicar lo siguiente:

Dimensin de la columna: De 5-15 cm de dimensin de

la columna.
Cantidad de gel: Se estima la cantidad de gel requerida
para la unin de la muestra, use 5 veces la cantidad de
este gel.
 Etapas de la cromatografa de interacciones hidrofbicas.

1.Aplicacin: Es aplicada a la columna la muestra en un buffer con alta

fuerza inica.
2.Elusin: La elusin es llevada a cabo generalmente por una
disminucin de la
concentracin de sales. Generalmente se utiliza un gradiente de
disminucin en la concentracin de sulfato de amonio.
Otros procedimientos de elusin incluyen:
Reducir la polaridad del eluente (gradiente de Etilenglicol hasta 50 %).
Adicionando especies caotrpicas (urea, guanidio) o detergentes.
Cambios de pH o de temperatura.
4- CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL.

Es una tcnica de separacin que se basa en las diferencias que

existen entre las dimensiones moleculares.

Esta tcnica es ideal para utilizarla en la etapa final de pulido donde el

volumen de muestra es reducido.

Esta tcnica ha recibido diversas denominaciones como son tamizaje

molecular, cromatografa de exclusin molecular.

Utiliza como medio de separacin un lecho de partculas pequeas en

estado de gel, que por lo general se encuentran empaquetadas en un
tubo en forma de columna.

La separacin de dos sustancias aplicadas en un extremo del lecho en

forma de mezcla se produce si uno de los componentes se mueve a
mayor velocidad, ya que recorre el lecho ms rpido y eluye primero.
 En esta cromatografa las molculas mayores abandonan primero el
lecho, mientras que las menores se retrasan. La matriz del gel presenta
un enrejado con una zona libre (poro) entre los entrecruzamientos. Las
molculas grandes no pueden penetrar en estas zonas, mientras que las
pequeas s.

Cuando se trata de una molcula que por su dimensin, es totalmente

inaccesible al interior del gel, migra slo a travs de los espacios
intersticiales y el volumen al cual eluye, se le denomina volumen
muerto de la columna (Vo). (Ninguna otra partcula puede eluir antes).

El volumen muerto de la columna (Vo) puede determinarse

mediante el volumen de elusin de una molcula que no es retardada,
por presentar una masa molecular mayor que el lmite de exclusin del
gel.
 Para que la resolucin sea elevada el volumen de muestra a aplicar no
debe exceder del 5% del volumen total de la columna.

La filtracin en gel es independiente de la concentracin de la muestra

aunque se debe evitar aplicar a la columna muestras muy viscosas.

La elusin de la protena de inters se realiza de forma isocrtica con

un nico buffer.
5- CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC).

Es capaz de separar macromolculas y especies

inicas, productos naturales lbiles, materiales
polimricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular.

HPLC ofrece una variedad de fases estacionarias lo que

permite una mayor gama de estas interacciones
selectivas y ms posibilidades para la separacin.
 HPLC puede ser de fase normal o de fase reversa.

En la cromatografa de fase normal se utiliza como fase estacionaria un

solvente polar (agua, metanol) y una fase mvil apolar (hexano).

Favorece la retencin de compuestos polares y la elusin de compuestos no

polares.

En la cromatografa de fase reversa se utiliza como fase estacionaria un

solvente apolar y una fase mvil polar.

Favorece la retencin de compuestos apolares y la elusin de compuestos

polares (acetonitrilo).
6. CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (RPC).

Esta cromatografa separa protenas y pptidos con diferencias en la

hidrofobicidad basado en una interaccin reversible entre la superfiicie
hidrofbica y el medio cromatogrfico.

RPC es til para escala analtica.

La muestra es cargada en la columna, bajo determinadas condiciones.

Se requiere del uso de solventes orgnicos para eluir la muestra en esta

cromatografa, ya que la unin de la muestra a la matriz es muy fuerte.

La elusin se realiza usualmente aumentando la concentracin del solvente

orgnico, comunmente se utiliza acetonitrilo.

RPC no es recomendable para la purificacin de protenas ya que la presencia

de solventes orgnicos puede desnaturalizar la protena, perdiendo la actividad
biolgica.
Cromatograma tpico del proceso:
7. ADSORCIN EN LECHO EXPANDIDO.

Esta tecnologa permite la aplicacin del crudo no clarificado.

En un nico paso de operacin la protena deseada es purificada, ya que se

combinan las operaciones de clarificacin, purificacin y concentracin.

La muestra es aplicada en modo expandido en la columna sobre el adsorbente

Streamline, la protena es capturada en el adsorbente, las partculas, clulas y
contaminantes pasan a travs de la columna.
 Teora de la adsorcin en lecho expandido:

Adsorbente Equilibracin Aplicacin Lavado Elusin Regeneracin

sedimentado (expandido) de la muestra (expandido) (empacado)
(expandido)
 Cromatograma tpico del proceso:

La muestra es aplicada en modo expandido en la columna sobre el adsorbente

Streamline, la protena es capturada en el adsorbente, las partculas, clulas y
contaminantes pasan a travs de la columna.
Seleccin del adsorbente de streamline:

Se selecciona el medio teniendo en cuenta las

caractersticas de la muestra que se va a utilizar en la
cromatografa.

La protena a purificar debe unirse fuertemente al

medio y los contaminantes con menor fortaleza.