1

Tcnicas analticas
instrumentales
- Son aquellas en que medimos una lectura en un
instrumento.
- Filosoficamente podrian ser todas, ya que una
balanza o una bureta TAMBIEN son un
instrumento, pero se llama instrumentales a las
electrnicas, generalmente mas rpidas.
Error y ruido
En el anlisis cuantitativo tradicional llamamos error a las
diferencias (absolutas o relativas) entre el valor medido y el
verdadero (o esperado). Hay aleatorios y sistemticos.
En los instrumentos que miden rpido, se suele denominar ruido a
la desviacion respecto del promedio, y error a las diferencias que
se obtienen despues de tratar los datos. Es nomenclatura, jerga,
ya que se trata de los viejos errores aleatorios o sistematicos !
98
100
102
104
106
108
110
error
98
100
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error
ruido
2
Precision y exactitud
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98
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110
ruido: precision error: exactitud (tambien es jerga !)
Ruido en 2 dimensiones
3
Relacion seal / ruido
En toda medicin, la seal es lo que
queremos medir y el ruido es aquello que
molesta, sea lo que sea.
Queremos aumentar la relacin S/N.
Analgico vs. Digital
Analgico: es la comparacin contra una escala (la
mayoria de las veces lineal). Casi siempre se basa en la
capacidad del ojo-cerebro para comparar LONGITUDES.
En principio tiene precision infinita.
En la prctica, la precision est dada por la capacidad de
diferenciar una longitud de otra con certeza.
Digital: es la entrega de un CODIGO, cuya estructura
no tiene nada que ver con la medida en si, sino que es
una convencion humana. Por ejemplo, 44. Otro
ejemplo: cuarenta y cuatro. Otro ejemplo: XLIV.
Otro ms: forty four. La precision mxima est
dada por el mismo cdigo. (En este caso, una unidad)
4
La naturaleza nos parece
(generalmente) analgica
Una concentracin parece contnua. Una cantidad de
masa parece contnua. Una absorbancia parece
continua. En realidad no lo son (ya que atomos,
moleculas, fotones son en realidad discretos), pero
son tan pequeos que lo tratamos como continuo. Lo
continuo es analgico.
Contraejemplos: single molecule spectroscopy;
contador de fotones; contador geiger en analisis
radiactivo; nmero de particulas detectadas en
espectroscopias de masa.
Ventajas de lo digital
Guardar y transferir los datos con exactitud. Es posible
hacerlo sin que se deteriore la seal.
La lectura puede automatizarse.
Si el que lee es un humano, la lectura no depende de
errores de apreciacin (paralaje, etc.)
Desventajas:
Lectura errnea por dislexia temporaria.
por ejemplo: confundir 428 con 482 al anotar.
Dificultad para que el operador determine en
tiempo real si una magnitud aumenta o disminuye.
5
Conversion analogica-digital
sistema
sensor
adecuacion
Conversor
A/D
12 bits
i = 4-25 A
V= 0-1V
V / Volts salida salida en binario
0 0 000000000000
0.000244 1 000000000001
0.000488 2 000000000010
0.000733 3 000000000011
0.000977 4 000000000100
...... ...... .......
0.999512 4093 111111111101
0.999756 4094 111111111110
1 4095 111111111111
Parametros de un A/D
Resolucion = numero de posibles valores = 2
nro de bits
8 bits = 256 valores (0.4%), 12 bits = 4096 valores (0.02%)
32 bits = 4294 millones de valores (0.2 ppb)
Velocidad = muestras por segundo (Sa/s o s
-1
)
Multmetro digital: 1-2 s
-1
Placas A/D sonido: 44 ks
-1
Placas digitalizadoras de video: 18 Ms
-1
Osciloscopios digitales: 500 Gs
-1
En quimica se usan diversas velocidades segun
que cosa querramos medir.
6
Ruidos (o errores) que solamente
aparecen en los sistemas digitales
error 1 LSB (least significant bit). Es la incerteza
digital del instrumento. Dice 14.32, pero podria ser 14.31
o 14.33, MAS ALLA de otras fuentes de error.
error de redondeo Se produce al utilizar datos digitales
en formato de baja resolucion numerica (pocos bits).
Aunque el resultado final sea de 8 bits (aprox 0.4%), la
aritmetica para llegar a ese resultado precisa al menos 12
bits, y mejor aun 16 o 32 bits.
De donde viene el ruido ?
Mas ruido es menos repetibilidad, menos sensibilidad,
mayor limite de deteccin. De donde viene ?
Las fuentes de ruido son muchisimas:
- electrostatico/electromagnetico de 50 Hz
- mala regulacion de fuentes de alimentacion
- los mismos componentes electronicos
- ruido real del sistema a medir
- el primero es generalmente el mayor, y por suerte el
mas facil de solucionar.
7
De donde viene el ruido ?
- electrostatico/electromagnetico de 50 Hz
- Cables mal blindados.
- Malas conexiones de tierra.
- Transformadores en las cercanias del equipo.
- Cercanas de emisores de radio (includo celulares!)
- Placa A/D dentro de la computadora y mal blindada.
- No usar jaulas de Faraday en el sistema a medir.
De donde viene el ruido ?
- mala regulacion de fuentes de alimentacion
- Algunos equipos de bajo costo no regulan bien los
voltajes internos. La mala regulacion de estos voltajes
aparece en las mediciones. Hay que modificar el
equipo, o cambiarlo por otro.
8
De donde viene el ruido ?
- los mismos componentes electronicos
aun en un equipo de buena calidad, la naturaleza
discreta de los electrones y la tecnologa de
fabricacion de los semiconductores y demas
componentes electronicos producen un ruido de fondo
que siempre est, aunque mejora a medida que se
perfecciona la tecnologa.
Eliminacion del ruido
Si ya se redujo al mnimo el ruido electrosttico /
electromagntico, y no se quiere cambiar el equipamiento,
se puede bajar el ruido de dos formas:
-Filtros analgicos
-Filtros digitales
Filtran las frecuencias del ruido, tratando de no tocar las
frecuencias de la seal. Se colocan ANTES del A/D.
Muchos tipos diferentes. Van DESPUES del A/D o se
aplican en diferido directamente en la computadora.
9
Filtro analgico
sistema
sensor
adecuacion
Conversor
A/D
12 bits
0
50
100
150
200
250
Filtro analgico
sistema
sensor
adecuacion
Conversor
A/D
12 bits
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
F
10
Filtro digital
sistema
sensor
adecuacion
Conversor
A/D
12 bits
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
Filtro digital
sistema
sensor
adecuacion
Conversor
A/D
12 bits
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
11
Un ejemplo: espectrofotmetro
de matriz de diodos Ocean Optics
rendija nica
fuente de luz
cubeta
prisma o red de
difraccion fija
matriz de diodos
rendija de entrada
detector
fuente de luz
prisma o red de
difraccion mvil
rendija de salida
cubeta
espectrofotometro de barrido
espectrofotometro de arreglo
de diodos (diode array)
Ocean Optics Red Tide 650
1 - Entrada de fibra ptica
2 - Rendija nica (entrada)
3 - filtro de entrada
4 - espejo enfocador 1
5 - red de difraccin
6 - espejo enfocador 2
7 - lentecitos (opcionales)
8 - detector de array de
diodos
12
Ocean Optics Red Tide 650
12 bits
A/D
650 seales
analgicas
procesador
interno
USB
Detector Sony ILX511 CCD
No. of elements 2048 pixels
Sensitivity 75 photons per count (at 400 nm)
Pixel well depth ~62,500 electrons
Signal-to-noise ratio 250:1 (at full signal)
A/D resolution 12 bit
Dark noise 3.2 RMS counts (RMS = )
Corrected linearity >99.8%
Optical resolution ~2.0 nm FWHM
Stray light <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm
Dynamic range:
2 x 10
8
(system); 1300:1 for a single acquisition
Data transfer rate: Full scans into memory every
13 milliseconds with USB 2.0 port
Integration time: 10 microseconds to >60
seconds (detector's limit is ~15 sec)
Como leer especificaciones
13
Ruido en una medicin
Sensitivity 75 photons per count
Pixel well depth ~62,500 electrons
62500 / 75 = 833 cuentas al maximo de luz
(suponiendo 1 foton por electron)
Dark noise 3.2 RMS counts
(suponemos ruido como = 3.2 cuentas)
Promediando muchos espectros
El ruido se reduce
en un factor de n
1/2
a expensas del
tiempo de
medicin.
14
Promediando pixels contiguos
El ruido se reduce en
un factor de n
1/2
a
expensas del
ensanchamiento de
las bandas.
2D - promedio de frames
El ruido se reduce
en un factor de n
1/2
a
expensas del tiempo
de medicin.
1 frame 16 frames 100 frames
15
2D - promedio de pixels contiguos
El ruido se reduce
en un factor de n
1/2
a expensas de la
perdida de definicion
espacial.
no prom 4x4 pixels 10x10 pixels
Relacion seal/ruido:
conclusiones
El objetivo de toda medicion es minimizar el ruido,
para de esta forma poder medir mas precisamente la
seal.
Para ello se tienen todos los cuidados posibles en la
toma de datos y se filtran los resultados obtenidos.
En todo hay un trade of. Una mejor relacion S/N
nos va a costar tiempo, o resolucin, o dinero.
1
Cromatografias - lo bsico
Mikhail Tswett. Berichteder Deutschenbotanischen Gesellschaft, 24, 316-23 (1906)
columna de CaCO
3
, eluida con eter de petroleo
Una fase movil y una fase estacionaria o fija.
Cada componente a cromatografiar tiene
diferente afinidad por cada una de las fases.
Un componente mas afin a la fase fija va a
tardar mas tiempo en salir de la columna, ya
que cada una de sus moleculas permanece
mucho tiempo en la fase fija.
Se obtienen experimentalmente bandas
conteniendo la substancia, de forma mas o
menos gaussiana.
2
Experimentalmente ...
detector
tiempo de retencin
t
M
= el tiempo que tarda la fase
movil en atravesar la columna
t
R
= el tiempo medio en salir el
pico del analito
k
A
= (t
R
-t
M
)/t
M
si k
A
<1, mala separacin
si k
A
> 20, tarda mucho ...
se usa entre 1 y 5
3
Selectividad y resolucion
Baja selectividad y
alta resolucion R
Baja selectividad y
baja resolucion R
Alta selectividad y
media resolucion R
selectividad: slo tiempo de los picos
resolucion: tiempos y anchos
Selectividad
Si tenemos dos substancias A y B, el factor de
selectividad, = k
B
/ k
A
.
Por convencion la substancia A es la que eluye
mas rpido, asi que siempre > 1.
= k
B
/ k
A
tambin es = K
B
/ K
A
, el cociente de
las constantes de reparto
4
Resolucin R
anchuras w en la base
equivalen a 4.
anchuras w
1/2
= 2.35
Como mejorar el mtodo ?
Para mejorar la performance analtica de un
mtodo tenemos que conocer sus fundamentos
y encontrar un modelo terico que pueda
justificar y predecir las observaciones.
5
El enfoque desde el equilibrio
la columna
un plato terico
Se llama plato terico por analoga a la
destilacin (son las mismas ecuaciones).
En cada plato se establece el equilibrio entre las
fases con K
eq
= c
movil
/ c
fija
Una vez establecido ese equilibrio, la fase movil
avanza un poco, llevandose parte de la substancia.
El enfoque desde el equilibrio
El factor de retencin depender del tiempo en que
(en promedio) las molculas de la substancia
ocupen en cada una de las fases, el cual ser
proporcional al coeficiente de particin en
equilibrio.
Para verlo, lo mejor es una simulacin numrica.
Se puede bajar el archivo excel cromato.xls, en el que cada dos celdas horizontales hay un plato
terico, compuesto por una porcion de fase estacionaria o fija y una de fase mvil. Se pueden
variar los parmetros del equilibrio entre las fases y ver como cambia el cromatograma.
6
valor inicial en la
fase fija= 1
(c
m
+c
f
)*f
part
y
todo uno para
abajo porque la
fase es movil
lo que habia,
MENOS lo que
hay en la celda
movil
Altura equivalente del plato terico
AEPT (HETP en ingles) = L / N
L = longitud de la columna (real)
N = numero de platos teoricos (virtual)
HETP = altura del plato terico (virtual)
N = t
R
2
/
2
=

5.55 t
R
2
/ w
1/2
2
= 16 t
R
2
/ w
2
7
Resolucin y platos tericos
ms platos
tericos (notar
la raiz !)
maximizar
selectividad
(cambiar fases)
aumentar
capacidad k
hasta 5 aprox.
(a veces se usa k
PR
)
0
1
0 5 10 15 20
kB
k
B
/
(
1
+
k
B
)
Bandas no simtricas
A veces las bandas se ven asimtricas. Eso es debido a
varios factores, la sobrecarga (mucho analito) es la mas
comn de ellas.
correcta
colas de solutos
polares en
columnas que
tienen grupos -OH
8
Un enfoque cintico
Las condiciones de equilibrio en una columna casi nunca se
cumplen, la fase mvil se mueve demasiado rpido.
Los platos tericos y su altura, por lo tanto, no corresponden
a los que indicaran los equilibrios.
Ademas, hay otros factores que influyen en el numero
de platos tericos de una columna, algunos dependientes
de la velocidad de flujo de la fase movil.
Ecuacin de van Deemter
caminos
mltiples y
otros
factores
poco claros
difusin
longitudinal
tiempo de
equilibracion entre
fases
altura plato
terico
9
Trmino A - multiples caminos
No hay una teora
definitiva que explique
este trmino. Una de sus
causas es la posibilidad
de cada parte del eluato
de ir por diferentes
caminos en el
empaquetado
Trmino B/u - difusin
Por el slo paso del tiempo, y aunque no haya movimiento de
solvente, las substancias difunden en todas direcciones.
En especial, la difusion longitudinal hace ensanchar las
bandas, y cuanto mas tiempo pase, mas se ensanchan.
Por eso, al aumentar la velocidad u, para la misma
cromatografa el termino de difusion se hace mas chico,
achicando la altura del plato terico y mejorando la anchura de
pico (ya que aumenta N, para la misma columna)
10
Trmino C.u - no equilibrio
El equilibrio entre las fases tarda un cierto tiempo. Durante ese
tiempo, la parte del soluto que est en la fase movil se va
moviendo. Eso hace que la banda se ensanche, y cuanto mas
rpida sea la velocidad u, mas se ensancha, por lo tanto la
altura del plato terico se vuelve mayor.
1
En una columna cromatografica
Para tener mas platos teoricos
conviene usar particulas mas finas
2
Ecuacin de van Deemter
caminos
mltiples
MEJORA CON
PARTICULAS
FINAS.
difusin
longitudinal
tiempo de equilibracion
entre fases MEJORA
CON PARTICULAS
FINAS.
altura plato
terico
Se usa silica mas fina, y por lo
tanto se precisa mas presin ...
y se sigue por este camino ...
3
... hasta tener una HPLC
Equipos de HPLC
4
HPLC
Las columnas estan empaquetadas con una fase
estacionaria muy fina que obliga a usar altas
presiones.
Por lo tanto hay que usar una bomba capaz de dar esas
altas presiones, y mangueras (tubing) que las pueda
soportar.
Las fase movil es un lquido.
La resolucin y el dimetro de las
partculas de la fase estacionaria.
silica 10 micrones silica 5 micrones
5
HPLC es un conjunto de cromatografas,
segn las columnas que se usen.
Partes comunes
Vlvula de inyeccin.
Bomba.
Detector
Mezcladores de solvente.
Partes diferenciadas
Columnas de distinto tipo.
Otros accesorios.
6
Vlvula de inyeccin
Poder cargar a
baja presion y
eluir la muestra
a alta presin.
Alta repetibilidad
en cantidad de
muestra inyectada.
Bomba
Generar muy alta
presion (6000 psi
~ 400 Atm).
No tener
pulsaciones.
Poder regular el
caudal y/o la
presin.
Resistir la
corrosin de los
solventes y las
muestras.
7
Detectores
El mas usado:
Detector de absorbancia
Espectros a lo largo de la elusin,
tomados con espectrofotmetro de
matriz de diodos.
La celda tiene muy
pequeo volumen
y paso ptico
normal.
8
Detector de fluorescencia:
muy selectivo y sensitivo
Para los compuestos de alta fluorescencia, el lmite de
deteccin es unas 100 veces menor que los de absorbancia.
El ms universal:
Detector de indice de refraccin
9
Detectores
electroqumicos
Comparacin de detectores
10
Qu columna usar ?
Qu columna usar ?
11
Solventes
Los solventes para HPLC deben ser MUY puros.
Calidad HPLC es una de las calidades mas altas.
Las impurezas de un solvente malo producen:
- seal de fondo en el detector
- arruinan las columnas, en especial por partculas
Aun con estas precauciones, se usa una
precolumna cortita del mismo tipo que la
columna a usar, pero mas barata.
Solventes - poder de elusin
Serie eluotrpica en cromatografia en fase directa de almina o slica
12
Fase reversa
El pH no debe ser mayor a 7.5 o se destruye la columna !
Fuerza eluotrpica en fase reversa
S
mezcla
= V
a
S
a
+ V
b
S
b
+ ...
13
Gradientes de solventes
Si se tienen 2 bombas, se pueden mezclar 2 o ms
solventes en la proporcion que uno quiera.
De esta forma, se comienza con un solvente que eluye
poco, y las substancias mas afines por el solvente salen
rpido.
Las substancias mas afines por la fase estacionaria
se van sacando aumentando la fuerza de elucin de
la mezcla con un gradiente.
Aminoacidos derivatizados con o-ftalaldehido
en columna de fase reversa C
18
14
Columnas de exclusin molecular
Partculas nanoporosas de slica o polmeros que
atrapan a las moleculas pequeas, y las grandes no
entran. En un rango intermedio, las molculas
pasan tiempos estadisticamente diferentes dentro
de la fase slida.
Columnas de exclusin molecular
La slica es mas rgida, soporta mayor presin y T.
Los polimeros pueden sintetizarse de diversas propiedades y
tamao de poro en 5 rdenes de magnitud
15
Cromatografa de intercambio inico
Los cationes o aniones presentan diferente afinidad por el
relleno de la columna, permitiendo la cromatografa.
Resinas de intercambio inico
16
Detectores para cromatografia ionica
CONDUCTIVIDAD CONDUCTANCIA
ELECTRICA
ANIONES Y CATIONES DE
ACIDOS O BASES
MODERADAMENTE
FUERTES (pKa O pKb < 7)
AMPEROMETRIA OXIDAXION/REDUCCION EN
UN ELECTRODO INERTE
ANIONES Y CATIONES
OXIDABLES O REDUCIBLES
UV/VIS ABSORCION DE LUZ ANIONES Y CATIONES QUE
ABSORBEN.
METALES PESADOS
DESPUES DE REACCION CON
COMPLEJANTES QUE DAN
COLOR.
SILICATOS Y FOSFATOS
MEDIANTE REACCION CON
MOLIBDATO.
ALCALINOTERREOS CON
ARSENAZO I
FLUORESCENCIA EMISION MOLECULAR NH4+, AMINOACIDOS,
POLIAMINAS CON
REACCION CON
orto FTALALDEHIDO
Selectividad a diversos iones
17
Cromatografa inica
mS columna de
intercambio
aninico
Columnas supresoras.
columna de
intercambio
aninico
columna
supresora
(catinica)
mS
mS
sin supresion
con supresion
18
Solventes de elusin
Aplicaciones de la cromatografa inica
Iones inorgnicos, con columna
supresora y detector conductimtrico
alfa-aminocidos naturales
19
Otros tipos de cromatografas
- de afinidad.
- de exclusin inica
- de gases (muy usada, la vemos en la prxima clase)
El mejor detector de todos:
el espectrometro de masas.
Los espectrmetros de masa permiten determinar la masa
exacta de molculas nicas, por lo tanto su identidad qumica.
Precisan un alto vaco para que las molculas puedan volar
libremente sin chocar, ya que en eso se basa la separacin por
masa molecular.
como conectar un HPLC, cuya salida es un
lquido a T y P ambientes con un sistema de
ultra-alto vaco ?
20
Electrospray
Electrospray
1
Cromatografa de Gases
En la cromatografia de gases (GC), la muestra se vaporiza y se
inyecta en la entrada de la columna.La elusion se efecta con un
gas inerte (He) o no reactivo respecto de la muestra (N
2
o H
2
).
La fase mobil no interacta con el analito, solo lo lleva. El
analito pasa a la fase movil por su presin de vapor, que es
funcion de la temperatura y de la afinidad que tenga por la fase
estacionaria.
La fase estacionaria es un slido, donde el analito se adsorbe o
mas comunmente una capa fina de liquido sobre un soporte
slido donde se disuelve el analito.
2
El gas carrier
El gas carrier suele ser He, H
2
o N
2
. Viene normalmente en un
tubo a presion (150 atm) que se conecta con reguladoras de
presin, valvulas aguja (de caudal) y medidores de presin y de
flujo. Se le suele poner un filtro con tamiz molecular para
eliminar el agua y alguna impureza que el gas pueda tener.
N
2
He
H
2
Lo mas comun es inyectar con una jeringa dentro de un septum
de goma o silicona, pero tambien se usan llaves de 6 vias como
las de HPLC que tienen mayor repetibilidad que una jeringa.
Sistema de inyeccin
la inyeccin debe ser rpida y ocupar lo menos posible en el
inicio de la columna (como cuando se siembra en una capa bien
fina en una columna separativa manual).
3
Sistemas de inyeccin
Hay 3 tipos basicos de inyeccion:
Sin divisin (non split)
Con divisin (split injection)
Directa o en columna (column injection)
4
Para bajas relaciones de division (splitting), las
areas se vuelven no lineales y no se puede
cuantificar bien.
http://www.sge.com/support/training/injection
5
Ventajas y desventajas:
La inyeccion con division sirve para analitos en concentracion
apreciable, ya que diluye mucho la muestra. Es la que da los picos
mas finos y la mejor separacion. Mal limite de deteccin y baja
repetibilidad para analisis cuantitativo.
La inyeccion sin division es para analitos en muy baja
concentracion y no diluye la muestra. Baja repetibilidad. Baja
separacion, y si no se tiene cuidado con al atrapamiento del
disolvente enfriando el inicio de la columna, los picos salen muy
anchos.
La inyeccion directa en columna es la mejor para cuantificar (no
se pierde analito). Tambin hay que atrapar el disolvente.
Util cuando no se puede calentar el analito por descomposicion.
La calidad de separacion es intermedia.
Tipos de columnas
hay dos tipos bsicos de columnas: las
empaquetadas (partculas dentro de la
columna como en HPLC) y las
capilares o abiertas, que solo tienen
fase estacionaria en la superficie
interior.
Las longitudes varan entre 2 y 100m.
Se hacen de acero inoxidable, de vidrio,
de silica fundida y de teflon. Suelen
venir enrolladas para que entren dentro
del horno del equipo de CG.
6
Columnas empaquetadas
Se hacen de vidrio, acero inoxidable, cobre, aluminio o teflon.
Tienen 2-3 metros de largo y diametros interiores de 2 a 4 mm.
Estan llenas de un soporte solido recubierta por una capa fina
(0.05 - 1 m) de la fase estacionaria lquida.
Tienen baja separacion, pero admiten mucha cantidad de
muestra. Se van usando cada vez menos a medida que las
capilares se hacen mejores.
Tipos de columnas abiertas (capilares)
7
Comparacion entre tipos de columnas
La fase estacionaria
Salvo en las columnas tipo PLOT, que son solamente slidas, la
fase estacionaria es in liquido que esta cubriendo al soporte
slido.
Esa fase lquida debe tener las siguientes propiedades:
(1) baja volatilidad (punto de ebullicin al menos 100
o
C mas alto
que la maxima temperatura de la columna.
(2) estabilidad trmica y qumica.
(3) no sangrar de su soporte slido, para lo cual se suele unir
covalentemente al soporte mediante alguna reaccin.
8
La fase estacionaria
Para separar diversos componentes, se usan fases
afines con los analitos a resolver: lo similar disuelve
lo similar.
Las fases polares tienen grupos funcionales como
CN, -CO- and OH. Las no polares son de tipo
hidrocarburos o dialquilsiloxanos.
9
El horno
La temperatura de la columna debe ser posible de
cambiar a voluntad, en lo posible de forma
programada. La programacion de temperatura variable
puede usarse para mejorar la separacion, como los
gradientes de solventes en HPLC.
Una temperatura apenas arriba del promedio de los
puntos de ebullicion de la muestra suele dar tiempos
de elusion razonables (2-30 min). Para muestras con
analitos de rango amplio de volatilidad casi siempre
hay que usar temperatura programada.
Detectores para GC
El detector ideal tiene:
1. Buena sensibilidad
2. Buena estabilidad y reproducibilidad.
3. Respuesta lineal de varios ordenes de
magnitud.
4. Rango de temperaturas de 25
o
C a 400
o
C.
Ningun detector es ideal !
10
Flame Ionization Detectors (FID)
El detector de ionizacion en llama es el mas
ampliamente usado. Se aplica a casi todas las muestras.
La salida de la columna se mezcla con aire (y si es necesario
H
2
) y se enciende mediante una chispa.
La mayoria de los compuestos orgnicos producen iones y
electrones al ser pirolizados con la llama de H
2
/aire,
aumentando la conductividad de la llama que se mide con una
fuente de alta tensin.
Los carbonilos y carboxilos no producen casi iones, y por lo
tanto no se ven, bajando la sensibilidad para cetonas, aldehidos
y acidos carboxilicos.
11
Flame Ionization Detectors (FID)
Se aplica un potencial de 100-500 volts en la llama producida
que contiene el analito.
Se mide la corriente en la llama (~10
-12
A).
El detector FID tiene alta sensibilidad (~10
-13
g/s), amplio
rango lineal (~10
7
), y bajo ruido.
Es destructivo para la muestra.
Thermal Conductivity Detectors(TCD)
El detector mas universal y uno de los mas antiguos es el de
conductividad termica.
El elemento sensor es una resistencia calefactora chiquita, que
disipa su energia en el gas que va saliendo. Si la conductividad
termica aumenta por la presencia de algun analito en el gas, la
temperatura en la resistencia baja, y se detecta el analito.
Para la resistencia se usa un alambre de Pt, Au, W o un termistor
NTC de semiconductor.
12
Thermal Conductivity Detectors(TCD)
La ventaja es la universalidad (detecta todo) y la simplicidad.
Gran rango dinmico (~10
5
), y que no es destructivo, asi que se
pueden colocar otros detectores detras o hasta colectar la
muestra (GC preparativa).
La desventaja es que tiene baja sensibilidad (~10
-8
g/mL de gas
carrier ), de 10
4
a 10
7
veces menos que otros detectores.
Esta sensibilidad la mayoria de las veces no alcanza para usarse
con una columna capilar fina.
Thermal Conductivity Detectors(TCD)
13
Electron-Capture Detectors(ECD)
El detector de captura de electrones se volvio uno de los mas
usados en muestras ambientales porque detecta selectivamente
compuestos con halgenos, como pesticidas y PCBs.
La salida de la columna pasa cerca de un emisor de partculas ,
usualmente niquel-63. Esto causa la ionizacin del gas carrier y
la produccion de muchos electrones secundarios. En ausencia de
analito estos electrones producen una corriente electrica
constante de fondo. La corriente disminuye fuertemente em
presencia de substancias orgnicas, que pueden capturar
electrones.
El ECD es selectivo hacia analitos que
contengan grupos fuertemente
electronegativos como halogenos,
peroxidos, quinonas y grupos nitro.
No detecta grupos funcionales como
aminas o alcoholes.
Se usa mucho para detectar insecticidas
clorados.
difusor
aislador
fuente
radiactiva
Electron-Capture Detectors(ECD)
14
Atomic Emission Detectors (AED)
En el detector de emisin atmica la salida de la columna se
coloca en un plasma de helio energizado a microondas que lo
calienta hasta atomizarlo y emitir luz. la luz se colecta con un
espectrofotometro de matriz de diodos.
15
Thermionic Detectors (TID)
El detector termoinico tambien llamado de llama alcalina es
un FID modificado poniendole una bolita de vidrio que contiene
RbSO
4
. Su respuesta a atomos de P y N esta aumentada de 10
4
a
10
6
veces respecto a C.
Comparado con un FID normal, es 500 veces mas sensible a
compuestos conteniendo P y 50 veces mas para compuestos
conteniendo N. Eso lo hace muy util para detectar medicamentos,
pesticidas y herbicidas que suelen tener estos elementos.
Obviamente, no se puede usar N
2
como gas carrier.
Anlisis cualitativo
La CG se usa mucho como criterio de pureza de compuestos
orgmicos. Los contaminantes aparecen como picos adicionales.
Las areas bajo los picos dan una estimacion gruesa de la cantidad
de contaminacion presente.
Tambien se usa para evaluar procedimientos de purificacin y de
avance de reacciones.
Los tiempos de retencion t
R
son utiles para la identificacion de
compuestos incognita presentes en una muestra, pero es preferible
usar para informar los indices de retencion.
16
El indice de retencion
El indice de retencion I fue propuesto por Kovats para identificar
analitos en un cromatograma.
Se basa en el hecho de que existe una relacion entre el logaritmo
del tiempo de retencion t
R
y el numero de carbonos de una
molecula en una serie anloga.
Como estandar se usa la serie de los n-alcanos. El hexano tiene
(convencion) I=600, el heptano I=700, el nonano I=900, etc.
El I de un compuesto cualquiera se determina encerrandolo entre
dos alcanos y aplicando la formula:
17
Ventaja:
Mientras que los tiempos de retencin son muy variables
de acuerdo a la columna y temperaturas empleadas los
indices de retencion son bastante independientes de las
condiciones de la cromatografa.
Esto permite que existan tablas de Indices de retencion
para miles de compuestos que facilitan la identificacion
de incognitas. Por supuesto, NO ES INFALIBLE ni es
una prueba determinante de identidad quimica.
Anlisis cuantitativo
Como en HPLC, la seal del detector se puede usar para
cuantificar. Mediante un procedimiento cuidadoso se logra 1%
de exactitud y buena repetibilidad.
La mejor medida de la cantidad de analito es el area bajo la
curva. La integracion se hace normalmente con computadora
(estos conceptos se ven en el laboratorio).
Dado que la inyeccin suele tener poca repetibilidad, es
conveniente usar un estandar interno.
18
Interfase con espectrometro de masa
La cromatografia de gases es muy adecuada para ser acoplada a
un MS. De esta forma se tiene una identificacion quimica de la
molecula. El uso de indices de retencion + espectroscopia de
masa da mucho fundamento para establecer la naturaleza del
analito, permitiendo de una vez hacer un analisis cuali-
cuantitativo completo.
ESPECTRO DE LINEAS VS ESPECTRO DE BANDAS
























Variacin de la sensibilidad con la corriente de lmpara







El diagrama de niveles de energa de la figura anterior sugiere que una
lnea atmica contiene nicamente una longitud de onda. Sin embargo, existen
distintos fenmenos por los que las lneas atmicas tienen en realidad anchuras
finitas.
La anchura de lnea efectiva, D
l1/2
, es la anchura en unidades de longitud
de onda cuando se mide a la mitad de la seal mxima. El ensanchamiento de las
lneas espectrales se debe a las siguientes causas:
a) Ensanchamiento natural. Se produce como consecuencia del Principio
de Incertidumbre de Heisenberg, debido a que el tiempo de vida de un
electrn en un estado excitado es limitado, del orden de 10
8
segundos. Se
demuestra que el ensanchamiento natural puede explicarse por la
ecuacin:
t.E = h
Los ensanchamientos de lnea por este proceso son del orden de 10
5
nm,
bastante inferiores a los debidos a otros efectos.
b) Ensanchamiento Doppler. Se origina como consecuencia del movimiento
de los tomos del analito en el interior de la cubeta atmica. De forma
anloga a como sucede con las ondas de sonido, la frecuencia de la
radiacin emitida o absorbida por un tomo que se mueve rpidamente
aumenta si el movimiento es hacia el detector, y disminuye si se aleja del
mismo.
El ensanchamiento de una lnea atmica (a la mitad de la altura) por este
efecto viene dado por la expresin:
=2o/c*((2 ln
2
)RT)
1/2
/M
donde o es la frecuencia del fotn absorbido, T la temperatura absoluta
de las especies absorbentes, M el peso atmico, R, la constante de los
gases y c la velocidad de la luz. De la expresin anterior se deduce que
este efecto es ms intenso cuanto mayor es la temperatura y ms ligero el
elemento en cuestin.
Como en el interior de las cubetas atmicas, los tomos individuales
presentan una distribucin estadstica de velocidades de Maxwell-
Boltzmann, las frecuencias que llegan al detector muestran una
distribucin aproximadamente simtrica, con un mximo que corresponde
a un desplazamiento Doppler de cero. En las llamas ms comunes, estos
ensanchamientos son de 5x10
4
a 5x10
3
nm.
c) Ensanchamiento de presin. Es el resultado de las colisiones entre las
especies que absorben o emiten con otros tomos o iones presentes en el
medio (ensanchamiento Lorentz) o incluso con tomos del mismo elemento
(ensanchamiento Holtsmark). Estas colisiones provocan pequeos cambios
en los niveles energticos atmicos y, en consecuencia, se origina una
dispersin de las longitudes de onda emitidas o absorbidas.
El ensanchamiento de una lnea espectral por efecto Lorentz se expresa
por
=
2
N * (2RT(M1+M2)/M1M2 )
1/2

donde
2
es un parmetro relacionado con el dimetro de las especies que
colisionan, N el nmero de tomos o molculas extraas por unidad de
volumen, M1 el peso atmico o molecular de la especie extraa, M2 el
peso atmico o molecular de la especie absorbente, R la constante de los
gases y T la temperatura absoluta. El ensanchamiento debido a este
efecto es del mismo orden de magnitud que el producido por efecto
Doppler. El efecto Holtsmark depende, evidentemente, de la
concentracin de analito, si bien, el ensanchamiento que produce es solo
del orden de 10
5
nm con disoluciones 1 M, por lo que puede considerarse
despreciable.

d) Efectos producidos por campos elctricos y magnticos. La presencia de
campos elctricos (efecto Stark) o magnticos (efecto Zeeman) origina ciertas
perturbaciones en las lneas de absorcin o emisin, si bien, nicamente se
ponen de manifiesto al operar en presencia de campos muy intensos o cuando el
medio est muy ionizado, como en un plasma. En absorcin atmica presenta un
cierto inters en cuanto que se han desarrollado algunos sistemas para corregir
el fondo basados en ello, y que ms adelante se comentarn.
Generacin de Vapor Atmico

Llama (FAAS)
Atomizacin electrotrmica (ETAAS) (GF-AAS)
Sistemas de vapor fro (CV-AAS)
Generacin de hidruros voltiles (HG-AAS)








Caractersticas de las llamas



Llama Relacin
combustible/comburente
(l.min
-1
)
T (K) V (cm.min.
-1
)
Aire-propano 0,3-0,45/8 2200 45
Aire-acetileno 1,2-2,2/8 2500 160
Aire-hidrgeno 6/8 2300 320
N
2
O-acetileno 3,5-4,5/10 3200 285









Absorcin de luz por diferentes llamas



Distribucin de tomos de Cromo en una llama
aire-acetileno



La llama posee algunas desventajas
Eficiencia de nebulizacin baja
Es muy crtico el control de temperatura
La llama es un entorno muy reactivo
La zona de la llama donde se produce la absorcin es
muy pequea
El tiempo de residencia del analito en la zona de
absorcin es muy pequeo




Programa de calentamiento y curva de
absorcin en ETAAS



Modificadores de Matriz


Sn HNO3
Se Ni(NO3)2 Pd(NO3)2,
Sb Pd(NO3)2
Pb (NH4)2HPO4
Hg (NH4)2S, K2Cr2O7, KMnO4
Cd (NH4)2HPO4, NH4F, EDTA,cido ascrbico, cido
tartrico, HNO3
As Ni(NO3)2, Pd(NO3)2
Al Mg(NO3)2











INTERFERENCIAS
Se considera aqu la influencia de diversos factores sobre la absorbancia
atmica del elemento a determinar y la forma de evitar o paliar dichos efectos.
En general, las interferencias pueden clasificarse en fsicas, qumicas y
espectrales.
Interferencias fsicas
Este tipo de interferencias se debe a cambios en las propiedades fsicas,
tales como viscosidad, densidad, tensin superficial, etc. en la disolucin del
analito y en los patrones, los cuales pueden afectar al proceso de nebulizacin
y, en consecuencia, al nmero de tomos presentes en la llama.
Algunas tcnicas utilizan disolventes orgnicos para aumentar la eficacia
de la nebulizacin y tambin la temperatura de la llama, si bien, la presencia de
sustancias orgnicas origina una gran variedad de interferencias, sobre todo al
aumentar la emisin de fondo de la llama y provocar fluctuaciones en su
temperatura.
Cuando se utiliza atomizacin electrotrmica, las interferencias fsicas
como las descritas anteriormente no aparecen, ya que el analito se coloca
directamente en el atomizador, sin nebulizacin previa. Sin embargo,
determinados disolventes suelen causar problemas cuando se introducen en el
tubo de grafito, ya que producen una absorcin de fondo entre 200250 nm a
2500 C, incluso despus de haber secado previamente la muestra.
En cualquier caso, las interferencias fsicas pueden evitarse procurando
que las propiedades fsicas y la matriz sea la misma en la muestra y en los
patrones. Tambin utilizando el mtodo de adicin estndar o, incluso, a veces,
simplemente operando con disoluciones ms diluidas.
Interferencias qumicas
Las interferencias qumicas son aquellas en las cuales algn tipo de
compuesto qumico est presente, o se forma en la llama, con la consiguiente
disminucin de la poblacin de tomos libres.
La causa ms comn de este tipo de interferencia es la formacin de
xidos, hidrxidos, carburos o nitruros metlicos trmicamente estables.
Estas interferencias se evitan operando con llamas ms calientes, ya que el
grado de disociacin de estos compuestos aumenta con la temperatura.
En otras ocasiones, la interferencia se produce cuando en la muestra
existen aniones o elementos que pueden formar aniones, tales como aluminio,
boro, etc. Estos aniones pueden formar sales con el analito lo suficientemente
estables como para disminuir la poblacin de tomos neutros. As, la
absorbancia atmica del calcio disminuye en presencia de silicato, por
formacin de un silicato complejo de calcio bastante estable trmicamente
(refractario). La interferencia debida a la formacin de estas especies puede
evitarse aumentando la temperatura, o bien empleando agentes liberadores,
que son cationes que reaccionan preferentemente con la interferencia,
impidiendo as su interaccin con el analito. De este modo, la interferencia del
silicato en la determinacin de calcio se reduce aadiendo (a la muestra y a los
patrones) un exceso de iones lantano o estroncio. Estas especies hacen que se
forme silicato de estroncio o de lantano, en lugar de formarse silicato de
calcio.
Tambin pueden utilizarse agentes complejantes protectores, los cuales
evitan la combinacin del elemento de inters con la especie interferente. Uno
de los ms usados con esta finalidad es el AEDT, que, adems de formar
quelatos estables con muchos cationes metlicos, se descompone fcilmente en
la llama.

Ionizacin
En las llamas que utilizan aire como oxidante, la ionizacin del analito es
prcticamente despreciable salvo para los metales del Grupo I. Sin
embargo, si la temperatura de la llama es ms elevada, como cuando se
emplea oxido nitroso u oxgeno como oxidante, los tomos neutros del
analito pueden originar iones sencillos y electrones libres durante la
vaporizacin trmica, segn el proceso:
M<>M
+
+ e

La constante Ki que controla esta reaccin depende de la temperatura y del
potencial de ionizacin. En la tabla se indica el porcentaje de ionizacin para
unos cuantos elementos a diferentes temperaturas.

Porcentaje de ionizacin
Elemento
2200 K 2800 K
Li
Na
K
Cs
Ca
Sr
< 0.01
0.3
2.5
28.3
< 0.01
< 0.1
16.1
26.4
82.1
96.4
7.3
17.2

Los elementos alcalinos presentan una fuerte tendencia a formar iones en
la llama, observndose que esta tendencia aumenta desde el litio (Ei=5.39 eV)
hasta el cesio (Ei=2.89 eV). Por su parte, los alcalinotrreos tienen menos
tendencia a ionizarse, si bien, pueden formarse iones moleculares del tipo
MOH+.
En general, cuanto mayor sea la temperatura y menor la energa de ionizacin,
tanto mayor ser el nmero de iones producidos, por lo que la fraccin de
tomos en estado fundamental se reduce y el lmite de deteccin se hace
menos favorable.
Esta interferencia se evita con la adicin de un supresor de ionizacin, el cual
es un elemento que proporciona una concentracin de electrones relativamente
alta, con lo que inhibe la ionizacin del elemento de inters.
M <> M+ + e
B > B+ + e
La presencia del elemento B, fcilmente ionizable, hace que el equilibrio de
ionizacin de M se desplace a la izquierda. A estas especies se las denomina
tambin reguladores de ionizacin.
.
Interferencias espectrales
Una interferencia espectral tiene lugar cuando se produce absorcin o
emisin por una especie a la misma longitud de onda que el analito, o a una
longitud de onda tan prxima que el monocromador no puede separar ambas
seales.
En general, en absorcin atmica, las interferencias espectrales son poco
corrientes, debido a que las lneas de la fuente son extremadamente estrechas
y especficas. Sin embargo, no es cierto, como suele decirse, que la tcnica
est libre de este tipo de interferencias. Pueden considerarse los siguientes
casos:
* Superposicin de lneas de resonancia de algn componente de la
matriz con la lnea de resonancia del analito. As, por ejemplo, el
aluminio y el vanadio presentan lneas de resonancia a 3082.15 y 3082.11
, por lo que el vanadio interfiere en la determinacin de aluminio.
Este tipo de interferencia es muy rara, ya que solo se han encontrado
doce pares de lneas que se interfieren mutuamente. Adems, la
interferencia se evita fcilmente utilizando otra lneas de resonancia de
las del analito. Concretamente, en el ejemplo anterior, se podra utilizar la
lnea que presenta el aluminio a 3097.7 .

Target
element
Spectral line
(nm)
Interfering
element
Spectral line
(nm)
Al V
Ca Ge
Cd As
Co In
Cu Eu
Fe Pt
Ga Mn
Hg Co
Mn Ga
Sb Pb
Si V
Zn Fe


* Presencia en la llama de productos con bandas de absorcin anchas.
As, por ejemplo, la presencia de calcio en la llama aire-acetileno origina
CaOH, el cual interfiere en la determinacin de bario, como puede
observarse en la figura, donde se ha representado la banda de absorcin
del CaOH y la lnea de resonancia del bario.
La interferencia, en este caso particular, se elimina fcilmente utilizando
xido nitroso como oxidante, en lugar de aire, ya que la mayor
temperatura alcanzada hace que se descomponga el CaOH,
desapareciendo, en consecuencia, su banda de absorcin..

* Absorcin debida al fondo. La absorcin del fondo es un trmino que se
utiliza para designar colectivamente una serie de efectos tales como la
absorcin por molculas o radicales originados en la llama por la matriz de la
muestra, por la propia llama, as como la dispersin de radiacin por partculas
slidas o gotitas de lquido, etc.
La correccin del fondo se hace necesaria en muchas ocasiones, para lo
cual se han propuesto diferentes mtodos, algunos de los cuales se describen a
continuacin:
Utilizacin de una fuente continua. La correccin del fondo por este
mtodo consiste en utilizar una fuente de radiacin continua,
generalmente una lmpara de hidrgeno o de deuterio* La radiacin
procedente de esta lmpara y la procedente de la lmpara de ctodo
hueco se hacen pasar alternativamente (10 o ms veces por segundo) a
travs de la muestra.
La radiacin procedente de la lmpara de ctodo hueco es absorbida por
el analito (banda muy estrecha) y por el fondo (banda ancha). Sin
embargo, la seal de absorbancia medida procedente de la lmpara de
deuterio indica, casi exclusivamente la absorcin del fondo, ya que la
cantidad de radiacin absorbida por el analito sobre esa banda tan ancha
es prcticamente despreciable De esta forma, obteniendo la diferencia de
seales entre ambas lmparas, el efecto del fondo se elimina o se reduce
considerablemente.









Efecto Zeeman







Sistema de SmithHieftje. En la conferencia de Pittsburgh, en 1982, se
present un nuevo mtodo para la correccin del fondo, de fundamento
sorprendentemente sencillo. Se sabe, desde hace tiempo, que cuando se
hace pasar una intensidad de corriente excesivamente alta a travs de
una lmpara de ctodo hueco, se produce un ensanchamiento de la lnea de
emisin y una disminucin de la intensidad, justamente a la longitud de
onda de inters
Este efecto se debe a que las corrientes elevadas producen una gran
concentracin de tomos no excitados, los cuales son capaces de absorber
la radiacin producida por las especies excitadas (fenmeno de auto-
absorcin). Smith y Hiefje consideraron que el fenmeno podra aplicarse
a la correccin del fondo. Para ello, se hace funcionar la lmpara, en
primer lugar, a baja intensidad, con lo que su radiacin es absorbida por el
analito y por el fondo. A continuacin, se hace pasar a travs de la lmpara
un impulso de corriente mucho ms intenso, pero de poca duracin, con lo
que tiene lugar el fenmeno de la auto-absorcin, reducindose
considerablemente la absorcin de la muestra, mientras que el fondo
absorber en la misma proporcin que antes. La correccin del fondo se
obtiene por la diferencia entre ambas seales.










Histricamente, en Emisin Atmica, se comenz utilizando:
Llama, arco elctrico y chispa elctrica.

En la actualidad, las fuentes de plasma son las ms usadas

Cules son las ventajas de la emisin de plasma vs. llama y/o
arco/chispa?

Menor interferencia entre elementos (altas temperaturas);
Buenos espectros de emisin para muchos elementos en las
mismas condiciones de excitacin;
Registro simultneo para un gran nmero de elementos
(anlisis multielemental);
Determinacin de bajas concentraciones de elementos
refractarios (resistentes a la descomposicin trmica);
Permite la determinacin de no metales (Cl, Br, I, S)
Intervalos lineales de concentracin que abarcan varios rdenes
de magnitud.

Qu es un plasma?
Mezcla gaseosa conductora de la electricidad que contiene una
concentracin significativa de cationes y electrones, con carga
neta cero. Se usa ARGN. Las especies conductoras son los iones
argn, electrones y, en menor concentracin, cationes de la
muestra. Una vez formados los iones de argn, son capaces de
absorber la energa suficiente de una fuente externa para mantener
las altas temperaturas (hasta 10000K) y la ionizacin.

Existen TRES tipos de plasma
1) Plasma de acoplamiento inductivo (ICP)
(2) Plasma de corriente continua (DCP)
(3) Plasma inducido por microondas (MIP)


Los iones resultantes y sus electrones asociados interaccionan con
el campo magntico oscilante que se produce en la bobina,
movindose en trayectorias circulares. Se alcanzan altas
temperaturas, hacindose necesario el aislamiento trmico del
cilindro exterior, inyectando Ar de forma tangencial alrededor de
las paredes del tubo.

En el ncleo del plasma se alcanzan temperaturas de hasta
10.000K. El nebulizador perfora el plasma y las molculas de
muestra son calentadas por conduccin y radiacin cuando
atraviesan el plasma anular. En el centro del canal se alcanzan
temperaturas de 5.000 a 7.000K. El plasma de Ar excita los
tomos presentes en la muestra a un estado M+. Conociendo la
temperatura en el canal central y los valores de las primeras
energas de ionizacin, se sabe que la mayora de los elementos se
ionizarn y aquellos tomos con valores inferiores a 10 eV lo
haran en ms de un 50%. Es decir el Ar es una fuente de
ionizacin eficiente. Esto lo podemos apreciar en la tabla
siguiente, donde se muestran las energas de ionizacin de
algunos elementos incluido el Ar.

Z Elemento E-I (eV) E-II (eV) Observaciones
18 Ar 15.76 27.62
Gas Plasmgeno limita la energa mxima de los iones
presentes a 15.75 eV
47 Ag 7.57 21.48
Excitado como Ag+
13 Al 5.98 18.82
Excitado como Al+
56 Ba 5.21 10.00
Excitado como Ba+ y Ba++. Dobles cargas.
27 Co 7.86 17.05
Excitado como Co+
58 Ce 5.6 12.3
Excitado como Ce+ y Ce++. Dobles cargas
9 F 17.42 34.98
No se excita. Indetectable por ICP-MS
14 Si 8.15 16.34
Excitado como Si+
10 Ne 21.56 41.07
No se excita. Indetectable por ICP-MS
Elementos
excitados como M+
Ar, Ag, Al, As, Au, B, Be, Bi, Br, C, Cd, Cl, Co, Cr, Cs,
Cu, Dy, Er, Fe, Ga, Ge, H, Hg, I, In, Ir, K, Kr, Li, Mn,
Mo, N, Na, Nd, Ni, O, Os, P, Pd, Pr, Pt, Pu, Rb, Re, Rh,
Rn, Ru, S, S, Se, Si, Ta, Tb, Te, Th, Tl, Tm, U, W, Xe,
Zn
Elementos
excitados como M+,
M++
Ba, Ca, Ce, Eu, Gd, Hf, La, Lu, Mg, Nb, Pb, Ra, Sc, Sm,
Sn, Sr, Tc, Ti, V, Y, Yb, Zr
Elementos
Indetectables por
ICP-MS
F, He, Ne



La introduccin de la muestra en el ICP es un proceso crtico en
esta tcnica. La gran mayora de los anlisis de ICP se realizan
sobre muestras lquidas, siendo necesario una corriente de gas
para que la muestra alcance el plasma. La forma ms fcil de que
la muestra lquida sea introducida en la corriente de gas es en
forma de aerosol originado en un nebulizador. Despus del
nebulizador existe una cmara de spray, cuya funcin es la de
separar y desechar las gotas grandes de la solucin que se hayan
formado en el proceso de pulverizacin.
Existen diversos tipos de nebulizadores, cada uno de ellos con sus
ventajas y sus inconvenientes.
- Nebulizador Cross-Flow (Flujo cruzado): Estos nebulizadores
son menos susceptibles al bloqueo que cualquier otro, aunque
tambin puede ocurrir. Se basa en un spray ascendente donde un
chorro horizontal de gas pasa o cruza la parte superior del tubo
por donde se inyecta la muestra, rompindose en una nube de
pequeas gotas. Esto permite que funcione con bomba
peristltica, que es la encargada de mantener un caudal de entrada
al nebulizador constante.

Cross-Flow o de Flujo cruzado

- Nebulizador Concntrico o Meinhard: Existen de diversos tipos.
Estn basados en la pulverizacin de la muestra lquida
introducida a traves de un tubo central por medio de un flujo de
Argon que viaja en un tubo externo y concentrico al de la
muestra). Los de tipo A, se utilizan para propsitos generales, los
de tipo C se utilizan para muestran con una alta concentracin de
slidos en suspensin y los de tipo K, reducen considerablemente
el caudal de gas.

Concntrico
- Nebulizador Ultrasnico: La muestra alimenta una superficie
donde existe un trasductor piezoelctrico que trabaja a una
frecuencia entre 0.2 a 10 Mhz. La onda longitudinal, que se
propaga perpendicular a la superficie del transductor hacia la
interfase aire-lquido, produce una presin que rompe la
superficie en un aerosol. Este mecanismo aumenta la sensibilidad
y lmite de deteccin, pero necesita ms tiempo de limpieza y si la
matriz es compleja, el fondo aumenta.



CULES SON LAS CARACTERSTICAS ACTUALES DE UN
ESPECTRMETRO DE EMISIN ATMICA?

Son de tres tipos:
1 Secuenciales (para ir de una lnea de emisin a otra en pocos
segundos, hasta obtener una buena relacin seal/ruido);

2 Multicanal simultneos (medida simultnea o cuasi simultnea
de las lneas de emisin de una gran nmero de elementos)

Veamos las caractersticas de cada uno de ellos:
Secuenciales:
Incorporan un monocromador de red con un detector
fotomultiplicador

Giro de la red por medio de un motor controlado digitalmente de
manera que las se van enfocando secuencialmente y con
precisin en la rendija de salida.
En otros casos, la red es fija y es la rendija y el tubo
fotomultiplicador los que se mueven a lo largo del plano o curva
focal Tambin existen instrumentos con dos juegos de rendijas y
tubos fotomultiplicadores, para las distintas regiones de trabajo.

Secuencial con barrido giratorio.
Cuando se tratan de espectros complejos, el barrido se hace largo
y poco prctico. Por tanto, se requiere un espectrmetro de
barrido giratorio en qu consisten?
- La red, o el detector y la rendija se mueven mediante un
motor de dos velocidades;
- El instrumento se mueve rpidamente o gira hacia una
prxima a una lnea. Entonces, el movimiento se ralentiza y el
instrumento barre a travs de la lnea en una serie de pequeas
etapas (de 0,01 nm a 0,001 nm);
- Minimizamos el tiempo gastado en las regiones de sin datos
tiles, sin embargo
- se necesita tiempo en las lneas analticas para obtener buenas
relaciones seal/ruido. Caracterstica nica de estos equipos:
mecanismo de transmisin electromagntico que puede barrer de
165 a 800 nm en 20 ms.

Qu ventajas presenta un espectrmetro de barrido giratorio?
Coste significativamente menor que el de los espectrmetros
multicanal;
Son ms verstiles (no estn restringidos a preseleccionadas)
Sin embargo:
Son ms lentos
Consumen ms muestra que sus homlogos multicanal
simultneos.

MULTICANAL.
La rendija de entrada, las de salida y la superficie de la red se
localizan alrededor de un crculo de Rowland, cuya curvatura
corresponde a la curva focal de la red cncava.

POLICROMADORES.
La radiacin de las distintas rendijas fijas se reflejan mediante
espejos hacia (1) los tubos fotomultiplicadores. (2) Sistemas de
elementos en serie (dispositivos bidimensionales de inyeccin de
carga o dispositivos de acoplamiento de carga como detectores)


DETECCION POR ESPECTROMETRIA DE MASAS
Tanto el plasma como los iones deben pasar desde condiciones
atmosfricas a alto vacio en el espectrmetro de masas. Esto se
hace gracias a la interfase de extraccin de iones (ion extraction
interface). La interfase posee dos conos de metal (Ni o Pt) con un
orificio central de 1 mm, a travs de los cuales el plasma y los
iones son extraidos al MS a travs de un nivel de vacio creciente.
Al primer cono se le denomina sampler y a travs de l se accede
a una cmara con un vacio de 10 mbar generado por una bomba
rotatoria. El segundo cono es el skimmer y a travs de l se llega a
una cmara con una presin de 10
-3
mbar generado por una
bomba Turbomolecular. Una vez dentro de la cmara principal, el
gas es separado de los iones + y bombeado hacia fuera. Los iones
remanentes son extraidos y enfocados en el cuadrupolo (donde la
presin es de 10
-6
mbar) a travs de las lentes inicas.
Las lentes inicas tienen como misin enfocar el haz de iones que
entrar en el cuadrupolo. Las lentes tienen forma cilndrica o de
plato y son cuatro. Junto con las lentes tambin existe una barrera
de fotones, el cual impide que la luz emitida por los procesos de
desexcitacin en el plasma pase a travs del analizador de masas y
llegue al detector.




La interfase est compuesta por dos conos, el de muestreo y el
skimmer que inyectan el flujo del plasma en la zona de vacio por
medio de un vacio diferencial. De presin atmosfrica (760 Torr)
donde se encuentra el plasma, hasta unos 2 Torr que existe en la
zona entre conos. Este vacio es generado por medio de una bomba
rotatoria.
En el mercado hay diversas formas y estilos de conos, aunque el
diseo bsico no ha cambiado desde los modelos originales. Se
utilizan diviersos materiales tales como Al, Cu, Ni y Pt, aunque el
Ni es el mejor en la relacin calidad/precio. El material sobre el
que se construye debe tener una buena conductividad tanto
trmica como elctrica. Si se introducen materiales orgnicos, se
debe utilizar conos de Pt ya que es menos susceptible de
degradacin que el Ni. En el caso de que se inyecte agua regia no
se deben de utilizar los conos de Pt ya que esta es la nica mezcla
cida que ataca al Pt.
Los conos de muestreo de Ni duran bastante (varios meses) y
necesita solamente una limpieza peridica con ultrasonidos sobre
todo si la muestra tiene muchas sales o est muy acidulada. A
veces es necesario utilizar un papel con abrasivo de tamao de
grano muy fino. La vida media de este cono se reduce
drsticamente cuando se utiliza cido sulfrico y con soluciones
muy cidas. Si son de Pt pueden llegar a 8000 horas de uso. Este
cono se puede bloquear cuando se introducen muestras con
partculas slidas suspendidas.
El skimmer es ms pequeo y menos robusto que el sampler,
sobre todo en la punta, la cual es mucho ms aguda y regular. Su
limpieza es la misma que la del de muestreo. Los conos skimmer
se colocan generalmente entre 6 a 7 mm de distancia del de
muestreo y tambin se fabrica con Ni o Pt. La punta de este cono
tiene una repercusin directa sobre la sensibilidad del aparato y
sobre el nivel de iones poliatmicos. Generalmente no tiene por
que bloquearse en comparacin con el sampler.
La funcin de las lentes inicas es transportar los iones
procedentes del skimmer al espectrmetro de masas.
Los principios bsicos del funcionamiento de las lentes inicas
son los mismos que los de las lentes electromagnticas usadas en
televisores y microsondas de electrones. Incluso hay programas
que permiten simular el enfoque del haz de modo parecido a un
ICP.
Supongamos iones positivos de carga z que se forman en una
regin de potencial V inicial. La energa potencial ser
z x Vinicial. Este ion viajar a travs de una regin si el potencial
est por debajo de Vinicial. Es decir ir a las lentes inicas si los
potenciales V1 y V2 son menores que Vinicial. La situacin es
parecida que una montaa rusa. Aplicando un voltaje superior a
Vinicial se pararn los iones. Cuando los iones se mueven lo
hacen con una energa cintica de z (Vinicial-V). La velocidad
ser (2z (Vinicial-V)/m). Una vez en el interior del cilindro los
iones experimentan un potencial uniforme y se mueven a
velocidad constante e igual direccin. Dentro del cilindro, si V1
es distinto a V2 los potenciales entre los cilindros varan con la
posicin. Las superficies equipotenciales curvas dan una misin
de enfoque. Cada lente incorpora un disco central para prevenir
que los fotones del plasma puedan llegar al detector, que se
denomina photon stop.
Celda de Colisin Reaccin :
La celda de colisin/reaccin consiste en un octopolo (ORS) en el
que se eliminarn las interferencias poliatmicas por el efecto de :

Hidrgeno : gas reactivo, que reacciona con las
interferencias
Helio: gas inerte que colisiona con los interferentes.

La principal fuente de interferencias espectrales en ICP-MS son:

1.- Superposicin directa de un elemento diferente
con un istopo de la misma masa nominal, es una
interferencia isobrica. Sn-114 con Cd-114.

2.- Superposicin de un in poliatmico formado
por la combinacin de especies derivadas del gas
del plasma, disolvente de la muestra y/o matriz de
la muestra. Ca
40
O
16
con Fe
56
.

3.- Especies dobles cargadas formadas por la
prdida de dos electrones en vez de uno. El
cuadrupolo separa los iones en base a su relacin
m/c, as un in doble cargado tendr la masa M/2.
As
136
Ba
2+
se solapa con
68
Zn
+
.

Modos de trabajo celda de colisin/reaccin

Modo Hidrgeno reaccin :
Utiliza un gas reactivo el hidrgeno.
Mecanismo de reaccin.
Especfico para la eliminacin de interferencias
poliatmicas de Argn.
Especfico para determinaciones de Ca ; Fe y Se.

Modo Helio Colisin :
Utiliza un gas inerte el helio, que no reacciona con la
matriz de la muestra y por ello no se producen nuevas
interferencias.
General, elimina mltiples interferencias. Puede ser
aplicado a todas las matrices y a todas las muestras
utilizando las mismas condiciones analticas.

Modo Normal :
Se opera sin gas aadido en la celda de colisin.
El oct Apolo solo acta como gua del haz de iones.
Este modo se utiliza para el anlisis de elementos de
masas bajas no interferidos, como Li, Be y B. Tambin
para elementos que no requieren eliminar interferencias
tales como Pb, Tl y U.
Cuadrupolo.
La funcin del espectrmetro de masas cuadrupolar consiste en
separar los iones en funcin de su relacin carga masa.


Son cuatro barras de metal que se encuentran paralelas y
equidistantes al eje. Idealmente estas barras tienen una forma
hiperblica. La tolerancia en cuanto a las dimensiones de
construccin es de 10 m o menos. Las barras opuestas estn
unidas. Voltajes DC y RF de amplitud U y V respectivamente se
aplican a cada par. El voltaje DC es positivo para una parte del
par y es negativo para el otro. El voltaje RF de cada par tienen la
misma amplitud pero tienen signo opuesto. Las trayectorias de los
iones y propiedades de transmisin de un cuadrupolo puede ser
calculado con cierta exactitud. El diagrama de estabilidad es
esencialmente un grfico del parmetro a (U/(m/z)) en funcin de
q (V/(m/z)). Solamente se muestra el cuadrante derecho superior.
A cada pareja de polos se le aplica un potencial constante,
mediante corriente continua (DC) y simultneamente un potencial
oscilante mediante corriente alterna (AC). De esta forma se
consigue crear una distribucin de campo en el espacio interior a
los 4 polos, caracterizado por las ecuaciones de potencial

donde U es el potencial DC, V el mximo potencial AC y w la
frecuencia de oscilacin de dicho campo. La figura siguiente nos
muestra como se aplican estos potenciales sobre los polos.
Una partcula i sometida a la accin del campo cuadrupolar,
describe una trayectoria definida por las ecuaciones de
movimiento de Mathieu.

Estas trayectorias definen los iones que van a ser capaces de
atravesar el cuadrupolo y llegar al sistema de deteccin. De esta
forma, variando los potenciales U y V aplicados a los polos,
podemos sintonizar una determinada masa y medir la seal
que de ella llega al detector.

Las trayectorias de los iones est determinada por U, V, m/z y
otros parmetros fijos tales como el radio de las barras y la
frecuencia RF. Para la mayora de los valores de a y q, los
campos Rf y Dc se desplazan fuera de las barras. Tales
trayectorias se les denomina inestables ya que los iones tienen
caminos inestables. Los iones con caminos estables son aquellos
que se encuentran dentro de las barras. Estos iones tienen valores
de a y q que se encuentran dentro de la zona piramidal del
diagrama.
Como se observa dentro del diagrama un ion con m/z = M tendr
un camino estable a travs de las barras, si a y q seleccionados
permiten que los valores correspondientes de a y q sobre la linea
de scan se site bajo la punta del diagrama de estabilidad. Los
iones vecinos para esos valores U y V se encuentran fuera de la
regin estable.

Figura 27. Zonas de funcionamientos de un cudrupolo. Expresin
grfica de las ec de Mathieu.
Los valores de U y V pueden ser cambiados continuamente bajo
control informtico entre valores discretos seleccionados (peak
hopping ) o a travs de una regin de inters (multichannel
scanning).
Detector.
El ms utilizado es el Channeltron electron multiplier (electron
multiplicador). El efecto es muy parecido al fotomultiplicador. Es
un tubo de vidrio abierto con un cono en una terminacin. Para la
deteccin de iones positivos, el cono es sometido a un alto
potencial negativo (aproximadamente -3kV).


Cuando los iones salen del analizador de masas, son atraidos por
el potencial negativo del cono. Cuando los iones chocan con su
superficie, se originan uno o ms electrones secundarios. El
potencial dentro del tubo vara continuamente con la posicin, tal
que los electrones secundarios se mueven hasta llegar a otra zona
donde se originan otros electones secundarios, y as
sucesivamente. El tubo est cubierto por un material
semiconductor.
La vida media del multiplicador est determinada por la carga
total acumulada.

Sistema de vacio.

El plasma se encuentra a presin atmosfrica mientras que el
espectrmetro de masas requiere el movimiento de iones sin
colisin, o bajo un sistema de vacio. La estrategia de vacio para el
ICP-MS es reducir gradualmente la presin en estadios separados
por una tcnica que se le denomina bombeo diferencial. El
sistema tiene tres orificios (sampler, skimmer y orificio de
bombeo diferencial). En el primer estadio se utiliza un bombeo
mecnico. La velocidad de bombeo es baja. En las lentes inicas,
la presin es de 10
-5
Torr. Virtualmente todo el gas que viene
desde el plasma a travs del skimmer es evacuado. El tercer
estadio es de 10
-7
Torr o menos para la zona del cuadrupolo y
detector.
Las bombas rotorias o mecnicas se utilizan para la interfase. Se
fundamenta en el giro de un rotor dentro de un cilindro de metal o
stator. El rotor contiene dos barras que carga y presiona sobre las
partes internas del estator. El aceite ayuda a lubricar los brazos.
La presin que se alcanza es de 10
-4
mbar. Otro tipo de bombas
son las bombas turbomoleculares, las cuales originan alto vacio
en poco tiempo. Se trata de una turbina que gira a altas
velocidades (30.000 rpm) dentro de un cilindro hueco. El gas de
la cmara fluje a la bomba y es comprimido por la turbina. Aqu
se utiliza lquido refrigerante. Por ltimo, las bombas de difusin
o difusoras no tienen movimiento mecnico. El bombeo consiste
de un tubo de metal que est enfriado por agua en la parte
superior y calentado en la parte inferior. El aceite es volatil a altas
temperatura. Las molculas de aceite vaporizadas pasan a travs
de las paredes frias, condensndose. Los tomos de gas colisionan
con las molculas de aceite. Eventualmente, los atomos del gas
del flujo de la cmara pasan a un puerto donde se desaloja
mecnicamente.

I nterferencias
Existen dos tipos de interferencias principales :
a)Espectroscpicas
b) No espectroscpicas o efectos de matriz.
El primer grupo se puede subdividirse en cuatro tipos:
-Solapamientos isobricos.
-Iones Poliatmicos.
-Iones oxidados refractarios.
- Iones con carga doble

Las interferencias no espectroscpicas se subdividen en
- efectos de supresin
- efectos fsicos causados por altos slidos disueltos totales.
La extensin de los problemas de interferencia estn relacionados
con la naturaleza de la matriz de la muestra, por lo tanto pueden
ser minimizados con una cuidadosa preparacin de esta.
Solapamientos isobricos.
Un solapamiento isobrico existe cuando dos elementos tienen
istopos de igual masa. En general, las dos masas pueden diferir
por una pequea cantidad, pero la resolucin 0.005 m/z no puede
ser resuelta por un analizador de masas cuadrupolo usado
normalmente en los equipos ICP. Para discriminar las masas hay
que utilizar un sistema de resolucin con un doble enfoque de
masas.
Existen elementos con uno (Co), dos (Sm) o incluso tres (Sn)
istopos libres de solapamientos isobricos. Sin embargo el In
puede tener un solapamiento con 115Sn y 113Cd. Como regla
general, las masas impares tienen solapamientos y las pares no
muestran solapamientos. A veces el istopo ms abundante tiene
un solapamiento isobrico 48Ti (73.7 de abundancia) y 48Ca. La
masa 138 puede tener Ba, La y Ce. En la mayora de las muestras
la concentracin de Ba es mayor que La o Ce. Por lo tanto en la
prctica 138Ba puede usarse para medir sin necesidad de ninguna
correccin de datos. Sin embargo, un problema ms grave existe
entre Hg y Pb con la masa 204. 204Pb es el nico istopo estable
de Pb, por lo que su determinacin precisa es crtica, ya que el
resto de las masas se dividen por l. Hg est en bajas
concentraciones en muestras geolgicas, pero es un contaminante
comn en HNO3, por lo que es necesario realizar una correccin,
haciendo una medida de 201Hg segn la relacin siguientes:
204Pb = (204Hg-201Hg/13.2)*6.8
En principio, cualquier solapamiento isobrico puede ser
corregido segn este mtodo, incluso ya mucho software de ICP
incorpora estas correcciones. De todas formas, incluso haciendo
estas correcciones existe tambin un grado de error.
56Fe y 57Fe son istopos libre de solapamientos isobricos, sin
embargo estn sometidos a interferencias de iones poliatmicos.
58Fe se puede utilizar para el anlsiis de muestra con alta relacin
Fe/Ni. Pero muestras con Ni alto la seal debida a 58Ni es ms
grande que 58Fe. La efectividad de la correccin entre 48Ca y
48Ti ha sido demostrada para la determinacin de Ti en dos
muestras geolgicas ricas en Ca (NBS-1b (caliza arcillosa y NBS-
120b (roca fosfatada). Adems de los solapamientos isobricos
entre elementos presentes en una muestra de la matriz o en los
cidos de disolucin, existe una serie de solapamientos con Ar, el
gas del plasma, y con Kr y Xe, el cual puede aparecer como
impurezas en argn lquido. Ya que la mayor poblacin de iones
en el plasma est formado por Ar, entonces correcciones de la
masa 40 para 40Ar(99.6), 40K (0.01%) y 40Ca (96.9) no puede
realizarse, por lo que se utilizan istopos alternativos. La
presencia de Kr puede interferir con 84Sr y 88Sr. Para una precisa
determinacin de Sr ser necesario utilizar balas de gas Ar de alta
pureza. Adems Kr tiene tres solapamientos con Se, el Xe tiene
nueve istopos 124-136, site de los cuales tiene solapamientos
con Ba o Te.
Iones Poliatmicos.
Desde un punto de vista prctico, este tipo de interferencias son
ms graves que los solapamientos isobricos. Los iones resultan
de una combinacin de corta vida de dos o ms especies atmicas
por ejemplo ArO+. Ar, H y O son las especies dominantes en el
plasma y estas pueden combinarse unas con otras o con elementos
de la matriz, especialmente con los elementos principales que
estn presentes en los solventes o cidos usados durante la
preparacin de la muestra (N, S y Cl). Un gran nmero de iones
poliatmicos puede ocurrir, sobre todo a masas superiores a 82.
La formacin de estos iones depende de la geometra de
extraccin, parmetros del plasma y sistema del nebulizador. Pero
sobre todo es la naturaleza del cido y la matriz de la muestra de
la que depende. Para agua desionizada, los picos poliatmicos
principales ocurren a 56 (ArO), 42 (ArH2) y 80 (Ar2).
Pero la muestra est generalmente acidificada (aguas naturales) o
digeridas (suelos, rocas y muestras biolgicas), con una variedad
de cidos orgnicos antes del anlisis. Si utilizamos HNO3 o
H2O2, los picos de iones poliatmicos son muy parecidos a los de
agua desionizada y por lo tanto es una matriz ideal.
Si utilizamos HCl o H2SO4, las matrices son ms complejas.
En HCl las principales ocurren entre 51 y 53 (35Cl16O y
37Cl16O) con dos pucos similares a 52 y 54 que resultan de la
combinacin de ArO con 37ClOH y ArO con 35ClOH.
Adems a 75 y 77 ocurre con la formacin de ArCl causando
interferencais con As y Se en una matriz de HCl.
En H2SO4 los picos poliatmicos ocurren a 48 (SO) , 64 (SO,
S2), 49 (SOH con SO) y 50 (SO con SOH) los cuales son el
resultado de la combinacin de S y O. Para analizar Fe se prefiere
usar 57Fe que 56Fe ya que interfiere con ArOH.
Muchas de estas interferencias se originan a causa de O y H.
Estos elementos son derivados de la disociacin de agua desde la
solucin. Esto se puede reducir si la cantidad de vapor de agua se
reduce usando un regulador de temperatura en la spray chamber.
Iones oxidados refractarios.
Estas especies ocurren como un resultado de la disociacin
incompleta de la matriz de la muestra o a partir de la
recombinacin del plasma en la cola. Cualquiera que fuera el
origen de estos iones, el resultado es una interferencia de M
unidades de 16 MO, 32 MO2 o 48 MO3. En general el nivel de
xidos que cabe esperarse se puede predecir de la fuerza de enlace
monxido del elemento referido. El oxgeno es introducido en el
plasma en forma de vapor de agua y en gotas de agua producidas
por el nebulizador. El agua causa una reduccin de la temperatura
del plasma ya que parte de esta energa se utiliza para disociar las
molculas. Esto produce un cambio significante en el equilibrio
del plasma. Las relaciones entre MO+ /M+, tasa de flujo del
nebulizador y energade RF deben ser controladas.
Las relaciones de MO+ /M+ (relacin de la especie oxido con
respecto al elemento) son altas con altos flujos y bajas RF. En
general, el nivel de formacin de xido raramente excede 1.5%
para la mayora de los elementos. A bajos tiempos de residencia,
la muestra se disocia ms Aunque la especies trixidos son raras,
su ocurrencia puede ser crtica en algunas matrices, por ejemplo
en Re. Uno de los problemas ms importantes reside en la
formacin de xidos con LREE., las cuales pueden originar
interferencias serias sobre las HREE. Las REE es un grupo que se
encuentran entre 139La a 175Lu. Cualquier elemento por encima
de 155 puede estar afectado por oxidos refractarios. Algunos
autores han registrado valores de CeO+ del 30%.
Para desarrollar una estrategia de correccin se puede analizar una
muestra solamente con el elemento problamtico y reconocer su
contribucin de xidos. 151Eu est afectada por 135Ba16O y
134Ba16O1H) 153Eu est afectada por 137Ba16O y
136Ba16O1H).
Iones con carga doble
En el ICP, la mayora de los iones son productos de iones con
carga nica, aunque algunas especies tienen carga mltiple. La
extensin de la formacin de iones con carga doble en el plasma
est controlada por la segunda energa de ionizacin del elemento
y las condiciones de equilibrio del plasma. Aquellos elementos
con una segunda energa de ionizacin ms baja que la primera de
Ar alcanzar un grado significante de formacin de carga 2+.
Estos elementos son los alcalino-terreos, metales de transicin y
REE.
El flujo de gas nebulizador puede afectar a iones cargados. A
tasas de flujo bajas, la temperatura del plasma aumenta y el
equilibrio deriva hacia la formacin de iones 2+. Estos se produce
en un 1%. En general la presencia de iones 2+ implica una
prdida de sensibilidad para las especies +1, y genera un nmero
de solapamientos isotpicos a la mitad de la masa del elemento
padre. Afecta sobre todo a Mn y Fe con Ga y Ge.
Atenuacin de las interferencias Los modernos equipos disponen
de herramientas para minimizar los efectos de las interferencias
mediante
-Optimizacin del equipo: correccin de RF y flujo de gas de
nebulizacin. No es adecuado para anlisis multielementales.
-Uso de gases mezcla o solventes: la presencia de gas molecular
puede cambiar las propiedades fundamentales del plasma. Por
ejemplo la inclusin de H y N aumenta los procesos de
ionizacin, debido a la alta conductividad trmica de estos gases
diatmicos.
-Introduccin de muestra: las tcnicas de introduccin de muestra
seca reduce las interferencias. -Fuente de plasma alternativo: He,
plasma de He inducido por microondas.No espectroscpicas o
efectos de matriz.Muestras con 500gml-1 de TDS origina una
considerable seal de deriva, ya que puede bloquear los conos.
Cuando se analiza una solucin con altos niveles de elemento
refractario, la seal se estabiliza despus de 20 minutos,
depositndose la muestra en los conos.
Sintona.
La sintonia es una operacin bsica que se realiza antes de una
sesin analtica. El objetivo es conseguir una seal estable y
sensible usando una solucin de sintona de 10 ppb de Li, Y, Ce y
Tl. Los parmetros de sintona a tener en cuenta son sobre todo la
posicin de la antorcha, flujo de gas y posicin de las lentes
extractoras e inicas.
Estabilidad y Deriva.
Durante una sesin analtica, la estabilidad de la seal puede no
permanecer constante por razones diversas. Para corregir la
variacin de la seal se puede utilizar una correccin externa o
interna.
Si el analito cambia la seal de forma linear con el tiempo, se
puede utilizar una correccin de deriva externa. En la prctica se
utiliza una misma solucin intermitentemente durante la sesin.
Normalmente se utiliza para rocas una solucin monitor de 10
ppb. Despus se aplica la correccin pertinente. La base de esta
correccin es que cambia linealmente. Esto generalmente ocurre
en la mayora de los casos. En general la prdida de seal con el
tiempo puede deberse a una obstruccin de los conos. Pero no
todos pierden y no es siempre la misma cantidad.
La principal ventaja de esta correccin es que no se aade nada a
la muestra y que el comportamiento de cada elemento es
monitorizado independientemente y una correccin especfica
puede aplicarse. La correccin interna supone la correccin de un
elemento usando un segundo punto de referencia. en ICP-AES se
le denomina standarizacin interna. Un standard interno se puede
utilizar con distintos propsitos.
a) Monitorizar y corregir las fluctuaciones de la seal durante
tiempos cortos y largos.
b) Calibrar un segundo elemento.
c) Corregir los efectos de matrices no especificadas.
La efectividad de un standar interno requiere que su
comportamiento refleje exactamente la de otros elementos, es
decir que tenga sensibilidades parecidas. En ICP-MS el usto de
standard interno viene heredado del ICP-AES. Sin embargo
raramente un elemento puede monitorizar el comportamiento de
todo el resto. Para elegir el standar interno se debe tener en cuenta
que no hay interferencias isobricas o poliatmicas. Este se aade
al blanco, standar y muestra. En general tambin puede usarse un
standard natural si se analizan slidos (utilizado en laser).
Los dos elementos ms usados como standards internos son Indio
(I) y Rodio (Rh). Ambos se encuentra en la zona central del rango
de masas 115In, 113In y 103Rh, ocurren en bajas
concentraciones en muchos tipos de muestras, y son ionizados
casi un 100% (In=98.5% y Rh=93.8%), no sufren solapamientos
isobricos y Rh es monoisotpicos y In tiene un istopo
dominante 115In con 95.7%. Aunque son muy buenos candidatos,
en la prctica no lo son siempre.

ADQUISICIN E INTERPRETACIN DE DATOS

El ICP-MS proporciona dos tipos de medidas:
1.- Scanning : Realiza una exploracin de un
rango de masas definido y el cuadrupolo camina
secuencialmente a travs de todo el rango de
masas definido. Es el mtodo de adquisicin ms
adecuado para la investigacin de muestras
desconocidas, donde la matriz es desconocida y
se precisa conocer la posible presencia de
analitos que puedan originar interferencias en la
medida de las muestras.

2.- Peak jumping : Donde el operador
selecciona los istopos a ser medidos y las masas
no seleccionadas son saltadas. Es el mtodo de
medida utilizado cuando los analitos objeto de
estudio son conocidos y no se requiere otra
informacin adicional ( por ejemplo, la presencia
o no de otros analitos).


1
Mtodos en bulk
Conductimetra
Junto con el pH, una de las
mediciones mas comunes en aguas.
Indica principalmente la cantidad
de iones disueltos.
2
Titulaciones conductimtricas
Mtodos estticos de interfase
3
Potenciometras
Titulaciones potenciomtricas
4
Mtodos dinmicos de interfase
Coulombimetria
Aunque es una tcnica que
depende de superficie de los
electrodos, se mide la
electrlisis completa de la
solucin en bulk.
A i constante, el potencial se
dispara cuando se termina la
especie electroactiva.
Si se have a V constante, la i se
reduce a cero al acabarse la
especie electroactiva.
5
Mtodos dinmicos de interfase
Electrogravimetra
Se deposita la especie en un electrodo, a potencial o a corriente constante
y se mide la carga y el peso de la capa de material depositado.
6
Microbalanza de cuarzo
A mayor masa depositada,
mayor valor de L.
A mayor valor de L, menor
frecuencia de resonancia.
La sensibilidad es de ng/Hz
Microbalanza de cuarzo
7
Mtodos dinmicos de interfase
Voltametras
Se controla el potencial de un electrodo llamado de trabajo
Segn se elija este potencial, se puede elegir medir diversas
especies con distintos potenciales redox.
Los potenciales aplicados pueden ser constantes
(cronoamperometra), en rampa (polarografa), en rampas
cclicas (voltametra cclica), en pulsos (polarografa de
pulsos), o en formas ms complejas.
Es posible hacer un paso de pre-concentracin eligiendo el
potencial de deposicin antes de hacer la medicin (stripping).
8
Cronoamperometra
Si se aplica un pulso de potencial suficiente para permitir una oxidacin (o reduccin)
de una o ms especies, la corriente aumenta bruscamente y luego cae como t
-1/2
a
medida que se va perdiendo la concentracin cerca del electrodo y solamente se
rellena por la difusin. El alto de esta seal es funcin de la concentracin en bulk.
Polarografas
Se usa un electrodo de
gota de Hg, que se renueva
constantemente.
El electrodo es pequeo y
va creciendo, asi que la
corriente no baja, sino
que incluso sube durante
el crecimiento.
Para tener buenos
resultados las gotas deben
ser reproducibles.
9
Polarografa de barrido lineal
2H
+
(aq)+2e
-
H
2
(g)
Ventajas y desventajas del
electrodo de Hg
Se renueva en cada gota, no hay que limpiarlo.
Tiene un alto sobrepotencial de H
2
, que hace que su rango de
potencial sea mas amplio.
Usa Hg, que es txico y est regulado en muchos pases.
Es muy sensible a impurezas en el Hg que tapan el goteo, y a
perturbaciones mecnicas que alteran el tamao de la gota.
10
Muestreo de corriente
Si se puede predecir la caida de la gota (por ejemplo, obligndola a caer con un
martillo!) se puede medir solamente en el punto anterior a la caida y evitar
todas las curvas de crecimiento de gota.
polarografia comn. polarografia muestreada.
La curva es mas bella pero no se obtiene ninguna ventaja real en
sensibilidad o selectividad.
Polarografas pulsadas
diferencial de pulsos de onda cuadrada
i = i(s
2
)-i(s
1
)
11
Polarografas pulsadas
Mayor resolucin (0.05 V de diferencia en E
0
contra 0.20 V)
Mayor sensibilidad (10
-7
M contra 10
-5
M)
Redisolucin o stripping
1) Se depositan el/los analitos sobre un electrodo inerte como en una
coulombimetria a potencial constante, con buena agitacin. En este paso se
puede ademas medir la carga depositada.
2) Se efecta un barrido de potencial, de forma que oxide (y redisuelva) los
metales que se hayan depositado (y preconcentrado) en el paso anterior.
Se puede llegar a LD ~ 10
-9
M
12
Electrodos enzimticos
La enzima provee gran selectividad al sistema. Otros analitos o
interferentes prcticamente no dan seal.
Como la enzima no se comunica bien con el electrodo, se usa
un mediador soluble o bien un polimero con sitios redox que
facilita la comunicacin.
Se pueden usar diversas combinaciones de enzimas: Por
ejemplo: una acetilcolinesterasa seguida de una colina-oxidasa.
Los electrodos de GOx son la base de los mtodos de medicin
de glucosa in situ para diabticos.
Electrodos enzimticos
1
Microscopa ptica 1
ptica y microscopios
Bibliografa:
Light and video microscopy. Randy Wayne. Captulos 4, 6 y 11
(los captulos 2 y 3 para repasar ptica)
Digital microscopy. Sluder y Wolf, eds. Captulo 10
http:/ / www.olympusmicro.com/
Porqu microscopa?
RobertHooke,1665
HeLacells expressing GFP-
Myosin IIAand Ch-Tubulin. The
cells have been depleted of
mitotic centromere-associated
kinesin (MCAK), a microtubule
depolymerizer, for 36 hours.
http://cellimages.ascb.org
elhipocampo delratn brainbow
Livet,Nature2007
2
microscopioactual
1er.microscopioptico
http://www.olympusmicro.com/
Cmo podemos observar cosas muy pequeas?
Repaso:refraccin ylentes
n
a
=c/v
a
c=velocidad delaluz enelvaco
v
a
=velocidad enelmedio a
Ley deSnell
n
a
.senu
a
=n
b
sen u
b
Lente (convergente)
3
Lentes convergentes.ptica geomtrica
donde f R/2
R=radiodecurvatura delalente
ptica geomtrica bsica para lentes convexas
Sepuede demostrar que,
f
1
s
1
s
1
= +
s
s
y
y
M = =
M=magnificacin lateral
4
Imgenes:qu es realyqu es virtual?
Coachella,US,2012
Ejercicio:Sitoms unafotodeunapersona,queseencuentraa3.90mdela
lente,usandounacmaraconunalentededistanciafocaliguala85mm,
cualesladistanciaquedeberahaberentreelsensor ylalente?Entrar la
imagencompletadelapersona(1.75mdealto)enelsensor cuyotamaoes
24x36mm?
Utilizando lupas,podemos magnificar ~10veces laimagen deunobjeto
Cmo funciona una lupa?
f
cm 25
angular in Magnificac =
u
u
=
5
Cuando necesitamos magnificar ms.. Diagrama ptico del
microscopio tradicional
Mtotal= Mobjetivo*Mocular
Diagrama ptico del microscopio corregido a infinito
Ventajas:permite introducir componentes pticos (filtros,
polarizadores,etc)sinafectar laposicin delplano focalni introducir
aberraciones
6
Componentes deunmicroscopio ptico decampoclaro
ocular
objetivos
condensador
fuente deluz
muestra
Diagrama ptico del microscopio corregido a infinito,
deteccin con cmara
lente
cmara
7
Configuraciones:microscopios derechos einvertidos
derecho invertido
Componentes deunmicroscopio ptico decampoclaro:
fuente deluz
Seusan habitualmente lmparas confilamento incandescente
detungsteno otungsteno/halgena:sonbaratas ylo
suficientemente brillantes para microscopa decampoclaro
8
Cmo lograr una iluminacin homognea conuna fuente deluz no
homognea?
Usamos unsistema delentes ydiafragmas para optimizar la
iluminacin:elcondensador
condensador
Iluminacin crtica
Planos conjugados:estn en
foco simultneamente
Lallamaseenfoca enlamuestra
Problema:es muy difcil obtener una iluminacin noes
homognea
Vamos ausar este tipo deiluminacin enmicroscopa
confocal
lente del
condensador
seubica enelplano focaldela
lente delcondensador
9
Iluminacin deKohler
Noseformaimagen delfilamento enelplano delamuestra ylailuminacin es
homognea (cada punto delafuente ilumina toda lamuestra)
Planofocaldelalente
delcondensador
Componentes deunmicroscopio ptico
(ocular)
objetivos
condensador
fuente deluz
muestra
10
Componentes deunmicroscopio ptico:Objetivos
Esuna delas partes ms importantes porque colecta laluz que proviene de
lamuestra:va adefinir laresolucin
Laapertura numrica deunobjetivo
NA=n.sen u
Laintensidad deluz colectada es proporcional aNA
2
/M
2
11
Componentes deunmicroscopio ptico:Objetivos
Paraaumentar laapertura numrica deunobjetivo,sepuede
usar aceite deinmersin (n=1.51,igual ndice derefraccin
que elvidrio)
Laimportancia delobjetivo enmicroscopa ptica
http://openi.nlm.nih.gov
Lasdosimgenes fueron tomadas conobjetivos 40x...qu est pasando?
Cual es lamenor distancia que podemos resolverenelmicroscopio?
diatomeas
12
Repaso:laluz secomporta como una onda
rango visible
longitud deonda (nm)
Repaso:interferencia ydifraccin
Interferencia constructiva ydestructiva
si o =m interferencia constructiva
mxima
patrn dedifraccin
generado por 2ranuras
13
Difraccin enaperturas circulares
discodeAiry
orden 0
orden 1
orden 2
sinu
1
=1.22/D
(posicin delprimermnimo)
Qu tiene que ver ladifraccin conlamicroscopa?
Unobjetivo demayorapertura numrica colecta luz proveniente
dems rdenes dedifraccin:reconstruye mejor laimagen
Laluz es difractada enlamuestra,lalente colecta slo una partedelaluz y
reconstruye laimagen conlaluz colectada.
Una partcula puntual (tamao despreciable frente a)seobserva como un
discodeAiryatravs delmicroscopio
objetivo
muestra
14
Enelplano focalposteriordelobjetivo seformaelpatrn
dedifraccin
Resolucin enmicroscopa ptica decampoclaro
Resolucin (R):distancia mnima entredospartculas para serobservadas
independientemente
Criterio deRaleigh:sepueden distinguir 2partculas puntuales enlamuestra si
elmximo deldiscodeAirydeuna coincideconelprimermnimo delaotra.
Paramicroscopa ptica decampoclaro sepuede demostrar que si NA(obj)>
NA(cond):
Resolucin =1.22 /(NA(obj)+NA(cond))
Resolucin nodepende delamagnificacin!
resolucin enmicroscopa ptica decampoclaro:200300nm
15
Ejercicio:
Laimagenformadaporelobjetivodeunmicroscopiocondistanciafocal=
5mm seencuentraa160mm def.Eloculartieneunadistanciafocal de
26mm.
a)Determinarlamagnificacinangulardelmicroscopio
b)Elojopuedediferenciar2puntossiestosseencuentranseparadosms
de 0,1 mm. Cual es la mnima separacin entre 2 puntos en la muestra
quepodraserobservada(oresuelta)porestemicroscopio?
c) Qu propiedades deber tener el microscopio para poder observar
estospuntosenformaseparada?ConsiderarNA(cond)=1
1
Microscopa ptica 2
Tcnicas de generacin de contraste y
adquisicin y anlisis de imgenes
Bibliografa:
Fundamentals of light microscopy and electronic imaging.
Douglas Murphy. Wiley. Cap 7
http://www.olympusmicro.com/
Diagrama ptico del microscopio corregido a infinito,
deteccin con cmara
lente
cmara
Cmo se registran las imgenes? Cmaras CCD
2
Para ver una muestra, se necesita contraste
contraste= (I
m
-I
b
)/I
b
I
b
= intensidad del fondo
I
m
= intensidad de la muestra
tinciones con colorantes
(absorcin de luz)
fluorescencia
(emisin de luz)
Cmo generamos contraste en muestras transparentes?
Microscopa de campo oscuro y de contraste de fase
3
Interaccin delaluz conlamuestra
Laluzqueinteractaconlamuestrapuede:
cambiardedireccindepropagacin(dispersin,refraccin,
difraccin)
retrasarse/adelantarse(cambiodefase)yaqueelndicede
refraccin (n)es distinto aldelentorno
Vamosaaprovecharestaspropiedadesparagenerarcontraste
Microscopa decampooscuro
Elcondensador sebloquea deformatal que lamuestra seilumina conun
haz deluz formando uncono.
Laapertura numrica delcondensador es mayoraladelobjetivo
Slo llega luz difractada alobjetivo
condensador
condensador de
campooscuro
4
Microscopa de campo oscuro
campo claro
campo oscuro
Unamodificacindemicroscopadecampooscuroconsisteencolocar
enelplanofocaldelcondensadordecampoclaro(NA cond >NA obj)un
anilloenelcuallapartecentralposeeunfiltrodeuncolormientrasque
laparteexternaposeeotrofiltrodeotrocolor.Cmoseveunamuestra
transparenteutilizandoesteanillo?
Parapensar...
condensador
5
Microscopa de contraste de fase
Repaso:Iluminacin deKohler
Planofocaldelalente
delcondensador
6
Microscopa de contraste de fases
camino ptico (OP) = n.t
n = ndice de refraccin
t= espesor
La luz incidente en la muestra se retrasa o acelera respecto de
la que atraviesa el medio por refraccin
t ). n n ( OP
2 1

n
1
= muestra
n
2
= medio
Las diferencias de camino ptico determinan
diferencias de fase
7
Luz difractada (DF) y luz directa (DI)
DI
DF
luz
incidente
En muestras celulares, la luz difractada
se retrasa ~ /4 respecto a DI
(no es vlido para cualquier muestra)
lmpara
Microscopa de contraste de fase
iluminacin en forma
de cono hueco
DI
DF
condensador
objetivo
8
Microscopa de contraste de fase: Coleccin de luz
El anillo de fase introduce
a) OP = /4 de la luz directa respecto de la difractada
b) absorcin parcialmente la luz directa
DI DF
Convirtiendo una diferencia defase endiferencia de
amplitud:interferencia
La luz difractada est retrasada /2 respecto a la directa
La intensidad (amplitud de la onda) de la luz directa disminuye hasta
hacerse similar a la difractada
sincontraste defase
concontraste defase
9
Comparacin campo claro y contraste de fase
campoclaro contraste defase
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/phasecontrast/
interferencia destructiva
(positivephasecontrast)
interferencia constructiva
(negativephasecontrast)
Ya sabemos cmo mirar la muestra: cmo
cuantificamos las observaciones?
cmara
10
Cmaras CCD (charged coupled devices)
pixel
nivel degris =cte*fotones
amplificador
digitalizador
intensidad en
"escala de
grises"
Ganancia =nro.deelectrones/nivel degris
seexpresa enelectrones/ADU
ADU=analogtodigitalunit
Formato y lectura de CCD
tamao del pixel ~6 m
velocidades: 30 cuadros/s (full frame)
500 cuadros/s (frame transfer)
11
Efectos de la digitalizacin
Tamao de la imagen y resolucin con cmaras
Cual es el rea de la muestra que estamos observando?
imagen muestra
Ejercicio:
Determinar el tamao de la regin de la muestra que es observada en un
microscopio ptico con un objetivo 60x (NA=1.2) equipado con una
cmara CCD de 256*256 pixeles (tamao del pixel 12 m). Considerar
que el objetivo es el nico componente del microscopio que introduce
magnificacin.
Qu area de la muestra es observada en cada pixel de la cmara?
(tamao del pixel, tp)
12
Lmites de resolucin :
pxeles pequeos (< lmite de resolucin ptica):
Resolucin = 1.22 / (NA(obj) + NA(cond)) =200-300 nm
(tamao de pixel menor a 100 nm, aprox)
pxeles grandes (>>> lmite de resolucin):
Resolucin= 2*tp
Tamao de la imagen y resolucin con cmaras
Parmetros relevantes de una cmara CCD
1. Full well capacity (FWC, nro mximo de electrones)
2. Fuentes de ruido
Ruido estadstico: existen variaciones al azar en el flujo
de fotones.
Ruido oscuro (control de la temperatura): se generan
electrones (huecos) trmicamente.
Ruido de lectura: relacionado con amplificar y
transferir la carga entre pixeles
13
ParmetrosrelevantesdeunacmaraCCD
Seexpresa como 2
n
donde nes elrango dinmico enbits
Rango dinmico=FWC/Ruido
(enlaprctica es unpoco menor,ya que seusa el90%delaFWC)
Ej:FWC=2560electrones
ruido =10electrones
256niveles degrises que sepueden discriminar
Resolucin (mxima)delaimgen=8bits
Parmetros relevantes de una cmara CCD
3. Eficiencia cuntica (fotones detectados/incidentes)
14
CmarasCCDs color
Serecubren pixeles continuos confiltros rojo (1pixel),verde (2
pixeles)oazul (1pixel)para asemejar laimagen aladeteccin por el
ojo humano
Desventajas:
menor QE
menor resolucin espacial
1
Espectroscopa de emisin
molecular
2
3
4
5
6
RELAJACION RADIATIVA:
LUMINISCENCIA
emisin de luz desde un estado excitado
electrnico
FLUORESCENCIA
Estado excitado singulete, transicin
permitida, tiempos cortos, del orden de
10
-10
a 10
-7
segundos.
FOSFORESCENCIA
Estado excitado triplete, transicin
prohibida, tiempos largos, mayores a
10
-6
segundos, y hasta horas.
QUIMIOLUMINISCENCIA
Cualquiera de los anteriores si se alcanza
el estado excitado por una reaccin
qumica. (Palitos de luz en recitales,
Luminol, bichos de luz, Noctiluca, etc.)
RELAJACION
NO RADIATIVA
no se emite luz, sino que el estado
excitado decae a traves de mecanismos
vibracionales y rotacionales
CONVERSION INTERNA
de un estado electronico a otro en tiempos
del orden del 10
-12
segundos.
RELAJACION VIBRACIONAL
dentro de un estado electronico en tiempos
de 10
-12
a 10
-10
segundos.
fotones emitidos
Rendimiento (Q) = <1
fotones absorbidos
RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA (Q):
Aquellas moleculas que decaen rapidamente por relajacion no
radiativa tienen menos fluorescencia. Por eso las moleculas mas
fluorescentes suelen ser rgidas y/o estericamente impedidas de
rotar y vibrar.
Si tenemos que:
entonces Q = k
f
/ (k
f
+ k
d
)
= constante de velocidad de emisin
= constante de velocidad de decaimiento no radiativo
k
f
k
d
7
= tiempo de vida intrnseca o natural,
sin ningn proceso no radiativo
TIEMPO DE VIDA INTRINSECO DE LA FLUORESCENCIA:
es el tiempo de vida si slo volviera al estado basal por fluorescencia
Hay equipos para medir tiempos de vida de fluorescencia, que son
muy utiles en anlisis qumico.
Tambien hay microscopios de tiempos de vida de fluorescencia.

n
= 1 / k
d
= tiempo de vida experimental
TIEMPO DE VIDA EXPERIMENTAL: tiempo promedio que un fluorforo
pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier va)
= 1 / (k
f
+

k
d
)
Fluormetro de 2 monocromadores
8
Fluormetro de 1 monocromador
y detector de matriz de diodos
Fluormetro con fuente de luz
monocromtica
9
Fuentes de luz
Lamparas de Xenon,
continuas y pulsadas
Lamparas de Hg
Hg / Xe, fuertes en el
UV
Lamparas de filamento
(malas)
LEDs
Laseres
Lamparas de arco de Xe
UV
Ozone Free
Visible
Lamparas de arco de Hg/Xe
10
Light Emitting Diodes (LED)
350 nm to 1300 nm
390-405 nm,
UV cercano
Laseres
Helium-cadmium
Nd-
YAG
doblado
532 nm
Diodo
laser
rojo
200 300 400 500 600 700
Wavelength (nm)
295nm
325nm
351 nm
364 nm
445nm
650 nm
576nm
Titanium:Sapphire
690 nm 990 nm Blu-Ray
laser 405
nm
11
Diodos Laser
Diodos Laser:
405 nm Violeta (Blu Ray)
445 nm Azul (diodo)
473 nm Azul (Nd-YAG)
532 nm Verde (Nd-YAG)
588 nm Amarillo
635 nm Rojo (diodo)
no es un diodo:
700-1000 nm IR (TiSa)
Detectores
Scallop

Image courtesy of BioMEDIA ASSOCIATES http://www.ebiomedia.com
Scallop Eyes
From http://www.eyedesignbook.com/index.html
12
APD
El fotodiodo de avalancha es muy
rapido, chiquito, robusto, sirve para
contador de fotones y tambien en
rgimen lineal (analgico). Tiene
buena respuesta en el IR cercano.
El fotomultiplicador (PMT) es
voluminoso, rpido y precisa de una
fuente de muy alta tension (1000 V).
Sirve para contador de fotones y en
regimen lineal. Tiene mejor respuesta
a cortas longitudes de onda.
dinodos
fotoctodo

Fuente de 1000
a 2000 Volts
e
-
anodo
Salida de
corriente
e
-
e
-
e
-
divisor de tension hecho con resistencias
e
-
e
-
e
-
e
-
e
-
e
-
e
-
e
-
e
-
Vaco
El PMT clsico
Window
13
Photon Counting (Digital) y deteccin analgica
Primary Advantages:
Sensitivity (high signal/noise)
Increased measurement stability
Primary Advantage:
Broad dynamic range
Adjustable range
S
i
g
n
a
l
time
Constant
High Voltage Supply
Discriminator
Sets Level
PMT
TTL Output
(1 photon = 1 pulse)
PMT
Voltage Supply
Computer
Anode Current
=
Pulse averaging
Medicin
Photon Counting: Analog:
level
Ocean Optics Red Tide 650
1 - Entrada de fibra ptica
2 - Rendija nica (entrada)
3 - filtro de entrada
4 - espejo enfocador 1
5 - red de difraccin
6 - espejo enfocador 2
7 - lentecitos (opcionales)
8 - detector de array de
diodos
14
Ocean Optics Red Tide 650
12 bits
A/D
650 seales
analgicas
procesador
interno
USB
Detector Sony ILX511 CCD
No. of elements 2048 pixels
Sensitivity 75 photons per count (at 400 nm)
Pixel well depth ~62,500 electrons
Signal-to-noise ratio 250:1 (at full signal)
A/D resolution 12 bit
Dark noise 3.2 RMS counts (RMS = )
Corrected linearity >99.8%
Optical resolution ~2.0 nm FWHM
Stray light <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm
Dynamic range:
2 x 10
8
(system); 1300:1 for a single acquisition
Data transfer rate: Full scans into memory every
13 milliseconds with USB 2.0 port
Integration time: 10 microseconds to >60
seconds (detector's limit is ~15 sec)
Desde la fuente de luz a la
medicin
15
Desde la fuente de luz a la
medicin
E
foton
= hc/
= 405 nm
h = 6.62x10
-34
J.s
c = 3x10
8
m.s
-1
E
foton
= 4.9x10
-19
J
I
fuente
= 0.1 mW de luz
= 10
-4
W = 10
-4
J.s
-1
= 2.04x10
14
fotones/s
Desde la fuente de luz a la
medicin
de los 2.04x10
14
fot/s,
solo el 1% llega al centro
de la cubeta, porque el
LED lanza luz en un
angulo amplio.
Quedan 2.04x10
12
fot/s
16
Desde la fuente de luz a la
medicin
Excitacion efectiva:
2.04x10
12
fot/s
Absorbancia = 0.1
Transmitancia T = 10
-A
= 0.794 = 79.4%
Fraccin absorbida = 1 - T = 0.206 = 20.6%
absorbi 4.20x10
11
fot/s
Desde la fuente de luz a la
medicin
absorbi 4.20x10
11
fot/s
eficiencia cuantica de fluorescencia = 0.22
emision = 9.24x10
10
fot/s
17
Desde la fuente de luz a la
medicin
emision = 9.24x10
10
fot/s
pero solo una minima fraccin pasa por el
agujero de 2 mm a la entrada del instrumento!
Desde la fuente de luz a la
medicin
emision total = 9.24x10
10
fot/s
emision que entra = 2.57x10
7
fot/s
distancia al
agujero = 3 cm
Area esfera de
3cm de radio =
4R
2
= 113 cm
2
Area agujero =
r
2
= 0.031 cm
2
fraccin de luz
que entra =
0.00028 (0.03%)
18
Desde la fuente de luz a la
medicin
emision que entra =
2.57x10
7
fot/s
Ancho de banda de la
fluorescencia = 150
nm, se divide entre
150 partes del sensor,
aprox. 197000 fotones
por cada una (aunque
a los centrales les toca
mas que a los bordes)
Desde la fuente de luz a la
medicin
197000 fotones por
cada parte del sensor
correspondiente a un
nanometro, a 75
fotones por cuenta
(especificacion del
sensor del equipo) =
2630 cuentas / nm (si
dejamos que la luz se
capte durante 1
segundo).
19
La absorbancia de la muestra atena la entrada
de la luz de excitacin
Efecto de filtro interno
Rhodamine B
from Jameson et. al., Methods in Enzymology (2002), 360:1
epsilon [F]/um Abs Abs /2 T 1-T
20000 0 0 0 1 0
1 0.02 0.01 0.9772 0.0228
2 0.04 0.02 0.955 0.045
3 0.06 0.03 0.9333 0.0667
4 0.08 0.04 0.912 0.088
5 0.1 0.05 0.8913 0.1087
6 0.12 0.06 0.871 0.129
7 0.14 0.07 0.8511 0.1489
8 0.16 0.08 0.8318 0.1682
9 0.18 0.09 0.8128 0.1872
10 0.2 0.1 0.7943 0.2057
11 0.22 0.11 0.7762 0.2238
12 0.24 0.12 0.7586 0.2414
13 0.26 0.13 0.7413 0.2587
14 0.28 0.14 0.7244 0.2756
15 0.3 0.15 0.7079 0.2921
16 0.32 0.16 0.6918 0.3082
17 0.34 0.17 0.6761 0.3239
18 0.36 0.18 0.6607 0.3393
19 0.38 0.19 0.6457 0.3543
20 0.4 0.2 0.631 0.369
21 0.42 0.21 0.6166 0.3834
22 0.44 0.22 0.6026 0.3974
23 0.46 0.23 0.5888 0.4112
24 0.48 0.24 0.5754 0.4246
25 0.5 0.25 0.5623 0.4377
26 0.52 0.26 0.5495 0.4505
27 0.54 0.27 0.537 0.463
28 0.56 0.28 0.5248 0.4752
29 0.58 0.29 0.5129 0.4871
30 0.6 0.3 0.5012 0.4988
31 0.62 0.31 0.4898 0.5102
32 0.64 0.32 0.4786 0.5214
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 0.5 1 1.5 2
absorbancia
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 0.1 0.2 0.3
absorbancia
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
Intensidad de Fluorescencia y concentracin del fluorforo
Efecto de filtro interno
Se usan concentraciones con absorbancia menor a 0.1
20
Geometra de la medicin de fluorescencia
Tiempos de vida
La La luminiscencia luminiscencia decae decae exponencialmente exponencialmente
= 1 / (k
f
+

k
d
)
L
t
L L
e t

=
0
) (


(t)
L
0
L
L
emision emision a a tiempo tiempo = t = t
emision emision a a tiempo tiempo = 0 = 0
tiempo tiempo de de vida vida experimental experimental
21
Midiendo tiempos de vida obtenemos
informacion valiosa
Quenching Quenching estatico estatico ( (formacion formacion de de complejos complejos): ):
El El fluoroforo fluoroforo se se une une a a una molecula una molecula quencher, y quencher, y el complejo formado el complejo formado no no es es
emisivo emisivo. . Solamente el fluoroforo Solamente el fluoroforo no no unido puede emitir luz unido puede emitir luz. Los . Los tiempos tiempos de de
vida vida son son los mismos los mismos, , los correspondientes los correspondientes al al fluoroforo fluoroforo. .
Quenching Quenching dinamico por mecanismo dinamico por mecanismo de de Frster Frster (FRET): (FRET):
Un aceptor Un aceptor de de energa cerca energa cerca ( (pero pero no no tanto tanto) ) del fluoroforo del fluoroforo le come le come su su
energia por un mecanismo energia por un mecanismo de de acoplamiento dipolo acoplamiento dipolo- -dipolo dipolo. Al . Al fluoroforo fluoroforo se se lo lo
llama donor y al quencher llama donor y al quencher aceptor aceptor. La . La constante constante de energy transfer de energy transfer cae cae
como como R R
-6 -6
. Se . Se usa usa mucho mucho en en estudios estudios biolgicos biolgicos. .
Quenching Quenching dinmico dinmico ( (colisional colisional): ):
La La molecula molecula quencher quencher colisiona colisiona con con el estado excitado del fluoroforo el estado excitado del fluoroforo y le y le hace hace
perder su energia perder su energia en forma no en forma no radiativa radiativa. El . El tiempo tiempo de de fluorescencia fluorescencia se reduce se reduce
porque k porque k
nr nr
aumenta aumenta, , ya que ya que hay hay una nuevo paso una nuevo paso de de desactivacion desactivacion. .
Quenching estatico
La emision decae con la concentracin de quencher.
22
Quenching dinmico
que tipo de quenching es ?
esttico dinmico
23
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
http:// http://www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html
1
Espectroscopa de emisin
molecular - Aplicaciones

f
= Q = fotones emitidos / fotones absorbidos = I
f
/ I
abs
Relacion experimental entre la
fluorescencia y la concentracin
I
f
=
f
I
abs
=
f
(1 - 10
-lc
)
I
abs
= I
inc
(1 - T) = I
inc
(1 - 10
-A
) = 1 - 10
-lc
si lc 0 ; (1 - 10
-lc
) 2.303 lc
Y por lo tanto, I
f
= 2.303
f
I
inc
lc
la aproximacion se cumple al 5% si A < 0.05
2
Mtodos de anlisis
Directos: para cuantificar un analito ya fluorescente
Indirectos:
a) por formacion de complejos fluorescentes entre el
analito y una molecula auxiliar.
b) por reaccion qumica que forma un compuesto
fluorescente.
c) por disminucion de la fluorescencia (quenching) debido
a la presencia del analito.
Metodos directos:
Los iones de lantnidos y actinidos suelen mostrar fluorescencia.
P.ej. Ce, Pr, Nd, U, etc.
Ce (III)
ex
= 260nm,
em
= 350 nm.
U(VI)
ex
= 520nm,
em
= 620 nm.
Algunas moleculas de interes biomdico presentan
fluorescencia. P. ej. Riboflavina (vitamina B12), NADH,
FAD/FADH
2
, clorofila, aminoacidos aromticos, porfina, etc
3
Metodos indirectos:
a) iones inorgnicos por formacion de complejos fluorescentes
Ca
2+
dependent fluorescence
emission spectra of fluo-3
Familia del Calcium Green
EDTA
4
Determinacin de calcio
Calceina (
ex
= 450 nm,
em
= 520 nm).
fura-2, indo-1, fluo-3, fluo-4, Calcium Green-1.
-Ondas de concentracin de Ca
2+
en ovocitos, asociados con la
meiosis.
Function and characteristics of repetitive calcium waves
associated with meiosis, Alex McDougall and Christian Sardet,
Current Biology 1995, 5:318-328
Metodos indirectos:
b) molculas orgnicas por reaccin qumica
- aminas
- aminocidos
- protenas
(Y en combinacion
con HPLC)

ex
= 340 nm,
em
= 455 nm

ex
= 390 nm,
em
= 475 nm
5
Metodos indirectos:
b2) actividad enzimtica
Metodos indirectos:
c) por quenching de fluorescencia
Complejo de Zr-alizarina
excitation 470 nm (azul)
emision 520 nm (verde)
Sensibilidad al F
-
0.001 ug/ml
Interferentes: Be, CO, Cr, Cu, Fe,
Ni, Th, etc.
Cu
2+
Bathocuporine 6x10
-3
ppm
Fe
3+
Rhodamine B 2x10
-3
ppm
Ni
2+
Na(PAN) 6x10
-5
ppm
Pb
2+
Eosin 1x10
-1
ppm

F
-
Alizarina 1x10
-3
ppm
6
Quenching estatico
La emision decae con la concentracin de quencher.
Sistemas de medicin
sensores
7
8
Sanguchitos de cubreobjetos rellenos con una solucin 10 mM de [Ru(bpy)
3
]Cl
2
, sumergido
en agua dentro de una capsula de Petri.
Las fotos se toman a traves de un filtro anaranjado que deja pasar solamente la
fluorescencia, se divide pixel a pixel por la iluminacion de excitacion correspondiente a cada
punto, se usa la curva de calibracion de Temperatura vs. fluorescencia y se muestran en falso
color con ImageJ, despues de aplicar un filtro gaussian de 5 pixeles.
(a) Durante el calentamiento se ve un gradiente de temperatura de 1 grado aprox.
(b) Placa sin calentamiento, termalizada, se ven variaciones maximas de 0.18 C
9
Optodos en el mar Negro
Ver el video de las variaciones en el tiempo en:
http://www.mpi-bremen.de/Binaries/Binary14293/black_sea_fluctuations.gif
10
Espectroscopa de emisin
molecular - Conclusiones
- la espectroscopa de fluorescencia presenta muy alta sensibilidad
analtica.
- es posible aumentar la selectividad de la tcnica mediante
mtodos adecuados.
- los equipos tradicionalmente fueron caros, pero su costo est
bajando muy rapidamente.
- es posible hacer medidas de buena calidad con instrumental de
campo basado en equipos de uso masivo (cmaras, celulares, etc)
- la microscopa de fluorescencia permite no slo la deteccin
sino la medicin de parmetros qumicos y fsicos con alta
sensibilidad y robustez.
1
Microscopa de fluorescencia
Bibliografa:
Light and video microscopy. Randy Wayne. Captulos 4, 6 y 11
(los captulos 2 y 3 para repasar ptica)
http://www.olympusmicro.com/
Introduccin: Microscopa de campo claro
Cmo podemos generar contraste para ver especficamente
una molcula en estudio?
contraste= (I
m
-I
b
)/I
b
I
b
= intensidad del fondo
I
m
= intensidad de la muestra
2
Introduccin: Fluorescencia
Deteccin
Iluminacin
Microscopa de fluorescencia por epiiluminacin
3
Iluminacin
LEDs (light emitting diodes)
caras
rango amplio de
baja duracin
Lmparas de arco de mercurio
baratos
rango estrecho de (salvo LEDs blancos)
alta duracin
potencia ?
Separando luz de excitacin de luz de emisin
cubo de fluorescencia
4
Separando luz de excitacin de luz de emisin:
filtros y dicroicos
filtros pasabanda
pasa bajo pasa alto
espejo dicroico
excitacin
emisin
dicroico
T
r
a
n
s
m
i
s
i

n

longitud de onda (nm)
Separando luz de excitacin de luz de emisin:
filtros y dicroicos
5
Objetivos
El objetivo cumple doble funcin: ilumina la muestra y colecta
la fluorescencia
Resolucin: 0.61 /NA
Deteccin
Iluminacin
Microscopa de fluorescencia por epiiluminacin
6
Microscopa de fluorescencia: un color, muchos colores.
Cmo medir al mismo tiempo fluorescencia de 2 sondas
distintas?
Microscopa de fluorescencia por transiluminacin
Ventaja: se puede combinar con tcnicas de generacin de contraste
(simultneamente)
Desventaja: mucho cuidado con la alineacin
filtro de excitacin
filtro de emisin
7
Cmo eliminamos la luz fuera de foco?
Limitaciones de microscopa de fluorescencia
Se excita y observa un volumen muy grande
de la muestra: la luz de fluorescencia fuera de
foco disminuye el contraste de la muestra
Microscopa confocal
elemento clave
8
Fuente de excitacin: Lseres
Monocromticos
Coherentes
Colimados
Iluminacin crtica: El haz del laser se enfoca en un punto de la muestra
(limitado por difraccin)
En confocal vamos a utilizar iluminacin crtica
Iluminacin crtica (delaprimera clase demicroscopa)
Planos conjugados:estn en
foco simultneamente
Lallamaseenfoca enlamuestra
Problema:es muy difcil obtener una iluminacin noes
homognea
Vamos ausar este tipo deiluminacin enmicroscopa
confocal
lente del
condensador
9
apertura
confocal
objetivo
muestra
lser
espejo
dicroico
espejo
lente
detector
resolucin lateral: 200-300 nm
resolucin axial: 600-1000 nm
Imgenes en un microscopio confocal
10
Tomando imgenes en un confocal
El lser se enfoca en un punto (limitado por difraccin)
de la muestra
El detector no es una cmara sino un PMT (fototubo
multiplicador) o un APD(fotodiodo de avalancha)
Dos mtodos posibles para adquirir una imgen:
1. Mover la platina secuencialmente
2. Mover el haz del lser
Microscopa confocal por barrido del lser
Se escanea el laser usando 2
espejos que se mueven en x e y
respectivamente
Cada cierto perodo de tiempo (tiempo del pixel) se integra
la seal detectada
El pixel se define como la distancia recorrida por el lser
sobre la muestra durante
11
Barrido en z y reconstruccin 3D
http://www.bumc.bu.edu/busm-pm/research/laboratories/lmnt/
El descubrimiento de la GFP (green fluorescent
protein
Premio Nobel en Qumica 2008
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008
Revolucion el mundo de la biologa porque permiti la
marcacin especfica de una protena en estudio en clulas
vivas
12
Shimomura
Aisl GFP como un producto secundario de la purificacin de acuorina. Para ello
us 50 000 aguavivas!
El cromforo no era el complejo entre una proteina y una molcula fluorescente
sino que se formaba por una reaccin entre 3 aminocidos
Chalfie
Objetivo: usar GFP para marcar endgenamente protenas de
inters
Problema: se necesitarn otras enzimas del aguaviva para
producir el grupo cromforo?
13
Tsien
Objetivo: Detectar AMPc, mediante FRET utilizando PKA
Marcaciones con sondas qumicas hacan que PKA perdiese actividad.
Problema: slo exista GFP, para FRET se necesitan 2 colores.
Solucin
Mutaciones random(no se conoca la estructura) dio lugar a cyan, entre otras
Una vez que se conoci la estructura, se pudo racionalizar mutaciones: poniendo
un anillo aromtico cerca del fluorforo corri la lambda al rojo: yfp
14
Qu sabemos de la estructura de la GFP?
-barrel structure, with
chromophore housed within the
barrel.
Tsien (Annual Review Biochem 1998)
El cromforo se forma espontneamente (from Serine-65, Tyrosine-66,
Glycine-67) sin la necesidad de la maquinaria celular. Se libera H
2
O
2
durante la
sntesis
27 kDa
Qu sabemos de la estructura de la GFP?
mutantes YFP
15
It is possible to insert the gene for GFP into cells
and use the resulting protein as a reporter for a
variety of applications.
Ejemplos de aplicaciones
http://tsienlab.ucsd.edu
16
Microscopa de fluorescencia: un color, muchos colores
32-cell purpleurchinembryoexpressing3xGFP-Ensconsinmicrotubule
bindingdomaintolabel microtubules.
http://raven.zoology.washington.edu/celldynamics
GFP-PGL-1, whichlabelsPgranules, inaC. elegans embryo. Pgranulesarecytoplasmicgranulesthat
containgeneproductsproductsrequiredfor normal germlinedevelopment andareselectively
partitionedintoandinheritedbytheprimordial germlineblastomere.
http://raven.zoology.washington.edu/celldynamics
dinmicadel citoesqueleto:
microtubulosmarcadoscon
GFPy endosomascon TMR
HeLacellsexpressingGFP-MyosinIIAand
Ch-Tubulin. Thecellshavebeendepletedof
mitoticcentromere-associatedkinesin
(MCAK), amicrotubuledepolymerizer, for 36
hours.
http://cellimages.ascb.org
0 50 100 150 200 250 300
0
100
200
300
N

d
e

p
i
x
e
l
e
s
nivel de gris
0 50 100 150 200 250 300
0
100
200
300
N

d
e

p
i
x
e
l
e
s
nivel de gris
VERDE ROJ O
A B
C
D
0 50 100 150 200 250 300
0
100
200
300
N

d
e

p
i
x
e
l
e
s
nivel de gris
0 50 100 150 200 250 300
0
100
200
300
N

d
e

p
i
x
e
l
e
s
nivel de gris
VERDE ROJ O
A B
C
D
VERDE ROJ O
A B
C
D
Problema 9
620 650 610 550 600 rojo
530 (filtro pasaalto) 510 450 500 verde
filtro de emisin (rango
en nm)
dicroico ( de
corte, nm)
filtro excitacin
(rango en nm)
Cubo
GFP
(exc)
GFP
(em)
mCherry
(exc)
mCherry
(em)
GFP
(exc)
GFP
(em)
mCherry
(exc)
mCherry
(em)
1
Aplicaciones defluorescencia alestudio
desistemas biolgicos
1. Principles of Fluorescence Spectroscopy.JosephLakowicz.
Plenum Press,New York(3ra.edicin)
Porqu fluorescencia para estudiar sistemas biolgicos?
Provee informacin de:
propiedades delentorno
interacciones delabiomolculas conotros compuestos
organizacin estructural delabiomolcula,mecanismos de
reaccin,etc.
Seusa fluorescencia ensistemas biolgicos noslo para
detectar lapresencia deuna molcula dadasino para medir
funcin biolgica.
2
Desarrollodetcnicas
(anisotropa,tiempodevida,
medicionesdealtapresin,etc,
etc)
Sntesisdesondasfluorescentes
Fluorescencia
intrnsecade
protenas
usodesondasfluorescentesparaestudiosde
protenas
GregorioWeber
19161997
Cmo usar la fluorescencia como herramienta para estudiar
biomolculas?
Emisin (enH
2
O)
TRP
TYR
PHE
295 280
Absorcin
Una de las primeras sondas usadas: residuos aromticos.
porqu fluorescen?
Haymuy pocos Trp enlas protenas.Lafluorescencia deestos
residuos es muy sensiblealapolaridad delmicroentorno
3
Efectos delsolvente
Paraesta transicin esperaramos
ex =em peero....
So
S
1
So
S
1
fluorescein,www.probes.com
absorcin emisin
Efectos delsolvente
So
S
1
em
ex
solventrelaxation
(10
12
s)
solvent
fluorophore
solventrelaxation
(10
12
s)
www.olympusmicro.com
4
La fluorescencia intrnseca de protenas se usa para estudiar
la relacin estructura-funcin
maxdetriptofanoenH20:340nm
sinCa
2+
conCa
2+
Annexin V
Meers and Mealy,Biochemistry 1993,32,54115418
Qu experimento haran para demostrar que el Trp cambi su
microentorno?
Efectos delsolvente
polarityofthesolvent
Weberand Farris,Biochemistry (1979)
Prodan

em
serelaciona conlapolaridad delmicroentorno delfluorforo
5
350 400 450 500 550 600
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
E
m
i
s
s
i
o
n

I
n
t
e
n
s
i
t
y
wavelength
fase
gel
fase
lquida
Weber, G. and Farris, F. Biochemistry, 1979.
Emission spectra
440 490
El efecto del solvente tambin se usa para estudiar
biomembranas
laurdan
Sondas para estudiar biomembranas
vesculas con2
fosfolpidos distintos
emisin
al rojo
emisin
al azul
clulas (reconstruccin 3D
deimgenes confocales)
Dodes,JLR 2012
6
Ejercicio:
Explicar loscambios observados enelespectro defluorescencia de
las sondas C153,C343observados durante latransicin
monmeromicela desoluciones delpolmero F88.
monmero
micela
Grantetal.Langmuir,2005
calor
FRET (Frster resonance energy transfer)
Porqu FRET es importante?
Sirve para ver asociaciones
Medir distancias en el rango de los
Determinar cambios conformacionales
y muchas cosas ms
En qu consiste FRET?
D*-A
k
t
D-A*
Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes
Ojo! no hay emisin y reabsorcin de fotones! Es una interaccin
dipolar
7
Transferencia deenerga por elmecanismo deFrster
1/t
o
D
D*
...
A
kt
D
...
A*
D
...
A+fotn
kf
D
...
A
kd
E=eficienciadeFRET
t
o
D
=tiempodevidadeldonor,enausenciadelaceptor
6 6
o
6
o
t
t
r R
R
kf) (kd k
k
n absorbiero que D de molculas
eron transfiri que D de molculas
E
+
=
+ +
=

6
o
o
D
r
R 1
kt
(

t
=
D y A estn cerca y a distancia fija
0 20 40 60
0.0
0.5
1.0
|
T
r ()
FRETocurre adistancias moleculares
Ro=distanciadeFrster
rangodeFRET:10100
6 6
o
6
o
r R
R
E
+
=
Conociendo (o midiendo) Ro puedo conocer la distancia
donor-aceptor: FRET es una regla espectroscpica.
8
D
o
D
D
o
D
1
I
I
1 E
t
t
= =
Laeficiencia deFRETsepuede medir fcilmente.Sepuede
demostrar:
Cmo medimos la eficiencia de FRET?
Donor
excitacin
(ex D)
Acceptor
I

fluorescencia
deDbaja
fluorescencia
deAsube
}

c
t
| k
=
0
4
A D
4
A
4
o
D
2
6
o
d ) ( ) ( I
n N 128
) 10 (ln 9000
R
k
2
=factordeorientacin(relacionadoconlaposicinrelativaD
A).Usualmenteseconsidera=2/3,orientacinalazardeDyA
Integraldesolapamiento
LadistanciadeFrster
6 6
o
6
o
r R
R
E
+
=
D
o
D
I
I
1 E =
9
}

c
0
4
A D
d ) ( ) ( I
Integraldesolapamiento
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
l
Paracalcularla,normalizarelespectrodefluorescencia:
}

=
0
D
1 d ) ( I
Aplicaciones :FRETensensores biolgicos
Kraynov y col, Science 2000
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
n
o
r
m
a
l
i
z
a
d
a
(nm)
400 500 600 700
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
n
o
r
m
a
l
i
z
a
d
a
(nm)
400 500 600 700
GFP Alexa 546(A)
--- excitacin
__
emisin
10
Aplicaciones:FRETensensores biolgicos
clulasquesemueven
clulaquieta
altoFRET (ointensidad)
bajoFRET (ointensidad)
Kraynovycol,Science2000
Aplicaciones 2:mecanismo deATPsintasa
donor
acceptor
ATPsynthase
Zimmermannetal.EMBOJ(2005)
ADP +Pi
ATP
H
+
H
+
donor (TMR)
aceptor(Cy5bis)
11
Aplicaciones 2:mecanismo deATPsintasa
ATPs ATPs ntesis ntesis
ATPhidrlisis
Zimmermannetal.EMBOJ(2005)
1.Se quiere determinar si dos protenas A y B interactan. Para ello, se marca la protena A con la sonda
fluorescente FITC en una relacin 1:1 (moles de sonda a moles de protena) y la protena B con la sonda
fluorescente ReAsH, tambin en relacin 1:1. Posteriormente se mezclan ambas protenas marcadas hasta
las concentraciones indicadas en la siguiente tabla y se mide la fluorescencia de la muestra resultante
utilizando ex = 470 nmobtenindose los siguientes resultados:
0.63 0.95 3 1 4
0.54 1.12 2 1 3
0.33 1.81 1 1 2
0.02 3.00 0 1 1
Intensidad a
em =620
nm
Intensidad a
em=520 nm
[B-ReAsH]
(M)
[A-FITC]
(M)
Muestra
a.Existe asociacin entre ambas protenas? J ustificar explicando cualitativamente los resultados
obtenidos en la tabla.
b.Que pasara si a la muestra 4 le agrega protena B sin marcar? Grafique esquemticamente los
espectros de emisin obtenidos antes y despus del agregado.
Datos:
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
400 450 500 550 600 650 700
ex(nm)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
FITC ReAsH
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
450 500 550 600 650 700 750
em(nm)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
FITC ReAsH
Problema 5
1
Citometra de flujo
Bibliografa:
Flow Cytometry: Principles and Applications Editado por
Marion G. Macey, PhD. (captulos 1 y 11)
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
Para qu queremos contar y clasificar clulas?
Un ejemplo: Infeccin por HIV
El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T
(que son parte del sistema inmunolgico), se replica y finalmente los
destruye.
El nmero de estos linfocitos nos informa del estado inmunolgico del
enfermo
2
Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?
Para clasificar y contar clulas especficas necesitamos:
a. Diferenciar los linfocitos del resto de las clulas de la sangre
b. Usar una sonda que se una especficamente a protenas de
membrana nicas en las clulas de inters y que pueda ser
observada con facilidad.
Anticuerpos o Inmunoglobulinas
Intervienen en la respuesta inmune de los organismos ante la
presencia de un patgeno
Se unen al antgeno y lo inactivan
Esta unin ayuda a activar la respuesta inmune
regin a la
que se une
el antgeno
La regin variable es la zona de reconocimiento del antgeno
3
Un ejemplo: anticuerpos en infecciones bacterianas
tambin puede haber unin al Fc pero con menor afinidad
Unin antgeno-anticuerpo
Ag + Ac Ag-Ac K= 10
4
-10
11
M
-1
Fc
Fab
4
5 clases de anticuerpos que se diferencian por la secuencia de
aminocidos de la cadena pesada
<1 15 75 <1 10 % en sangre
1 1 or 2 1 1 5 nmero de unidades
cadena pesada
IgE IgA IgG IgD IgM Propiedades
Marcacin con anticuerpos
Los anticuerpos presentan alta afinidad y especificidad por un
antigeno dado sondas muy especficas
Directa
Ac
Indirecta
Simple y rpida
se puede usar un Ac marcado para
muchas marcaciones distintas
se amplifica la respuesta (varios Ac
secundarios se unen a uno primario)
5
Uso de anticuerpos para microscopa de fluorescencia
Figure 1 Primary rat hippocampus neurons. Immunofluorescence
detection of primary neuronal cells stained with mouse anti-MAP2
antibody (green) and astrocytes stained with rabbit anti-GFAP
antibody (red). Nuclei are stained with DAPI (blue)
Otras aplicaciones: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay )
Biochemistry. 5th edition.
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L.
6
Aplicaciones de ELISA: Test de embarazo
Se detecta gonadotrofina corinica humana (hCT) producida en la placenta
Los anticuerpos pueden usarse para detectar
protenas expecficas de clulas
Cmo las contamos y clasificamos rpidamente?
Citometra de flujo
7
Para qu queremos contar y clasificar clulas?
Un ejemplo: Infeccin por HIV
El virus se une a receptores de membrana (CD4) de ciertos linfocitos T
(que son parte del sistema inmunolgico), se replica y finalmente los
destruye.
El nmero de estos linfocitos nos informa del estado inmunolgico del
enfermo
Objetivos de citometra:
1. Realizar medidas (de fluorescencia y dispersin de luz)
sobre clulas individuales para clasificarlas. Las clulas se
estudian individualmente pero se realizan los anlisis en una
poblacin grande (10
4
) de clulas
2. Separar distintas subpoblaciones de acuerdo a sus
propiedades
8
Citometra de flujo
Surge a mediados de la dcada del 70
Resulta de avances en:
Microscopa
Tinciones citoqumicas
Tinciones fluorescentes (1880)
Anticuerpos conjugados (1950)
Anticuerpos monoclonales (1975)
Electrnica
Fotomultiplicador (1945)
Computacin
Esquema general de un citmetro de flujo
fuente de
excitacin
celda de flujo
detectores
ptica para la
separacin de
seales
9
Laser optics
Laser Beam
Flow
chamber
Sheath
Sample
La celda de flujo
Se estudian 5000- 50000 clulas/s
El punto de interrogacin
laser
10
Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?
Podemos reconocer los linfocitos por sus propiedades nicas de
tamao y granulosidad
Qu seales colectamos?
Dispersin de luz: Forward scattering
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
Se mide la dispersin de luz para ngulos entre
0.510 (proporcional a r
2
)
11
Qu seales colectamos?
Dispersin de luz: Side scattering
http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/
La dispersin va a depender del contenido de la
clula: granulosidad o complejidad
Representacin de los datos: Histogramas y dot plots
12
Este tipo de representacin simplifica la deteccin de
poblaciones celulares
separamos los linfocitos!
Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?
Se pueden utilizar anticuerpos para reconocer ciertas protenas
de membrana caractersticas de tipos especficos de linfocitos
13
Esquema general de un citmetro de flujo
fuente de
excitacin
celda de flujo
detectores
ptica para la
separacin de
seales
Adems de la informacin de dispersin de luz, colectamos la
fluorescencia de cada clula
Podemos seleccionar una poblacin y analizar la distribucin de
fluorescencia de esa poblacin
analizamos nicamente la
distribucin de fluorescencia
de los linfocitos
14
Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber
1. cuales son linfocitos T?
2. cuales de estos linfocitos son CD4+?
CD3= marcador de linfocitos T: anticuerpos anti CD3
linfocitos T
Anticuerpos anti CD4 que emitan a otra
Cmo sabemos cules son linfocitos T CD4+?: tenemos que saber
1. cuales son linfocitos T?
2. cuales de estos linfocitos son CD4+?
15
Controles y calibraciones
1. Coeficiente de variacin (CV): el ruido experimental se determina con
microesferas de tamao uniforme
SD= desvo standard de la distribucin
CV = (SD/promedio) 100
Controles y calibraciones
2. Control de isotipo: se necesita conocer la unin inespecfica del
anticuerpo. Se usa anticuerpo de igual Fc y distinto Fab
Problema 1 (25 puntos)
Las plaquetas son fragmentos citoplasmticos pequeos carentes de ncleo de 2-3 m de dimetro derivados de la
fragmentacin de sus clulas precursoras, los megacariocitos. Las plaquetas se caracterizan por expresar el antgeno
CD41a.
A una muestra de plaquetas suspendidas en buffer se le realiz el siguiente ensayo:
Se prepararon tres tubos conteniendo 300 l de la muestra. Al tubo 1 no se le agreg nada, al tubo 2 se le agreg un
anticuerpo anti CD41a conjugado con un fluorforo que emite en el verde (FITC,
mx em
=520 nm) y al tubo 3 se le
agreg el mismo anticuerpo anti CD41a que se us en el tubo 2 pero sin conjugar con FITC. Posteriormente a los tres
tubos se les agreg una cantidad conocida de microesferas de 5 mde dimetro marcadas con una sonda que emite en
el rojo (sytox red ,
mx em
=660 nm). A continuacin se realiz un estudio citomtrico de los 3 tubos. Considere que
los espectros de emisin de ambas sondas no estn solapados y que las microesferas no interactan con las plaquetas ni
con los anticuerpos.
a) Realice un grfico de dot-plot de Forward (FSC) vs Fluorescencia en el canal rojo para el tubo 1 indicando las
regiones donde Ud esperara encontrar las esferas y las plaquetas. Justifique
b) Grafique los histogramas de fluorescencia que esperara obtener para los tres tubos en los siguientes casos.
i) considerando la poblacin total de eventos sin delimitar regiones
ii) considerando la regin conteniendo las plaquetas
c) Indique si los controles realizados le permiten posicionar correctamente el Marker o si falta algn control. Justifique
d) Cmo se podra calcular el nmero de plaquetas/ml de la muestra suponiendo que no pueda medir fcilmente el
volumen de muestra que pas por el citmetro?
16
Muchas sondas, algunos problemas
Qu controles haran para evitar este problema?
Controles y calibraciones
La emisin de fluorescencia de una (o
varias) de las sondas se ve en ms de
1 detector
3. Compensacin
s
1
=f
a,1
.s
a
+(1-f
b,2
).s
b
s
2
=(1-f
a,1)
.s
a
+f
b,2
.s
b
1 y 2 = nmero de detectores
a y b = sondas fluorescentes
17
deflection plates
Cell sorting: separacin y clasificacin de clulas
Objetivo: separar una poblacin celular en una muestra compleja
para estudiarla posteriormente
Francis Crick and James Watson point out features of their model for the
structure of DNA. (A. Barrington Brown/Science Source/Photo Researchers,
Inc.)
ACIDOS NUCLEICOS ADN
ARN
Mtodos de cuantificacin DNA-RNA
Estrategias para aislar y amplificar un determinado
fragmento de DNA o un mRNA
Estrategias para aislar, amplificar, expresar y mutar un
determinado DNA o mRNA
Estrategias para analizar diferencias de cantidad de
mRNA o DNAs, nivel OMICs
ADN
ARN
Unidades espacialmente equivalentes
Las cadenas de azucares-fosfatos no estn igualmente espaciadas a lo largo del eje
de la hlice . Se forman as surcos diferentes, denominados surco MAYOR y MENOR
VARAIACIONES CONFORMACIONALES EN LA DOBLE HELICE
Apareamiento de bases igual
Los grupos azucar-fosfato que constituyen la cadena
Son flexibles y adoptan distintas conformaciones
Helice B fisiolgica
34
Helix Base pair/turn Rotatition/bp Vertical Rise/bp Helical diameter
A 11 +34,7 2,56 23
B 10 +34 3,38 19
C 9,33 +38,6 3,32 19
Z 12 -30 5,71 18
Estructura premRNA
Estructura predicha de mRNA de OPTC
Estructura tRNA
Evaluacin of Nucleic Acids
Espectrofotometricamente
Cantidad
Calidad
Electroforesis gel (Colorantes fluorescentes)
Calidad
Cuantificacin (aproximada)
Mtodos de cuantificacin DNA-RNA aislados
Rango espectral con distintas
concentraciones de DNA
Absorbance spectrum of different concentrations of
calf thymus DNA . Detection range is between 220 and
310 nmand resolution was set at 1 nm.
Absorbancia
Espectro absorbancia de
cidos Nucleicos
Ley de Beer
A=.b.c
A
260
1.0 50

g/ml
DNA
A
260
1.0 40

g/ml RNA
A
260
/ A
280
~2.0
A
260
DNA ss
1.0 33

g/ml
Purinas y Pirimidinas Absorben fuertemente a 260
Aromaticidad de las estructuras de anillos heterocclicos
Hipocromismo
Grado de purificacin
(contaminacin protenas)
Melting
Temperatura
1000 6000 pb: agarosa standard
10
6
pb: agarosa campo pulstil
Electroforesis en gel agarosa
cidos nucleicos
Alga Rhodophyceae
10 500 pb: poliacrilamida 4-5%
-
+
Loading Buffer
Glicerol
Colorantes de corrida
Azul de bromofenol ( 300pb)
Orange G ( 50pb)
Xylene Cyanol ( 4000pb)
Preparacin de la muestra
Densidad
(para % de agarosa entre 0,5 y 1,4%)
Bromuro de Etidio
(BrEt)
Agente intercalante inespecfico
Detecta DNA simple y doble cadena
Y tambien RNA
Fluoresce a la luz UV
Deteccin
DAPI
Otros Colorantes de Acidos nucleicos
Syber-green Picogreen
Heterocycles
Odd number of Carbon Bridge
Cyanine Dyes
Contienen grupo
-CH= , hace de puente entre
dos anillos heterocclicos
conteniendo N
Familia
TOTO
ssDNA
dsDNA
Concentracin agarosa
DNAds lineal: % de agarosa
L
o
g
(
P
M

o

K
b
s
)

0,5%
0,7%
1%
1,2%
% de agarosa
a b
b > a
DNAs ms grandes
F
R

Cualitativos (sintticos):
1Kb Ladder DNA Marker
Cuantitativos (ADN de fagos o plsmidos digeridos por ER)
Marker Lambda EcoRI/HindIII
PM ADN fago = 48.5kpb
5 l de solucin 50 ng/l
Marcadores de Peso Molecular
Muestra
Degraded RNA
DNA
28S
18S
5S rRNA, tRNA,
and other small
RNA molecules
mRNA = background smear
high low MW
100 50 25 ng
Genomic DNA
markers
Estrategias para aislar un fragmento de DNA
Fuente: Genoma
PCR: Polimerase Chain Reaction, permite amplificar y tener
aislado un determinado fragmento de DNA o mRNA
Clonado: Permite aislar un fragmento determinado de DNA,
permite construccin de bibliotecas con todos los fragmentos
de DNA de un genoma o con todos os fragmentos de DNA que
se expresan y dan lugar a un mRNA
DNA genmico
Clonado
Preparacin de
bibliotecas
genmicas
PCR
PCR: Polymerase chain reaction
Reaccin en cadenade la polimerasa
Reaccin en cadena de la polimerasa
Inventada en1985 por Kary B.Mullis
Premio Nobel de Qumica, 1993
Es una tcnica que permite hacer millones de copias identicas a partir de una muestra
de DNA de concentracin muy baja
Polimerasa
Primers (oligos DNA)
Templado
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
Mezcla de los 4 deoxirribonucletidos trifosfato que componen el DNA
Mg ++
Termocicladora
94 C 50 C 72 C
Visualizacin
Geles de agarosa , BrEt
Fragmento
800 pb
Caractersticas de los primers
1. Longitud del primer
18-24 nt
Muy largos: errores en la sntesis, fallas en el annealing: bajo rendimiento
2. Tm (T melting)
T a la cual la mitad de las bases del primer estn apareadas con el DNA molde.
El 50% del largo del primer esta apareado con el templado
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Tm aumenta con la longitud del primer y el contenido (G+C)
Tm: 55-70C -2 primers: Tm similares
T annealing depende de la Tm de los primers -5C por debajo del Tm ms bajo del
par de primers T annealing: al menos 50C).
3. Especificidad Reconocer una secuencia nica dentro del DNA templado
Especificidad de un primer depende de la longitud (ms largo menos probabilidad de
encontrar 2 seq iguales en el DNA templado). Primers cortos: inespecficos (a t de ann
baja: priming inespecfico si hay una homologa corta en el extremo 3; taq funciona esas
t) Long: 18-24 ntUn primer
Un primer de 15 nt puede
funcionar bien para amplificar
un fragmento de un plsmido,
pero puede ser inespecfico
para amplificarlo de DNA
genmico
4. Complementariedad de secuencias
Sin complementariedad intra-o inter-primers.
Complementariedad intra-primer (+ de 3 b): se pliega (estructuras de doble cadena)
interfiere con el annealing al DNA templado
Complementariedad inter-primer: dmeros formacin de producto por competencia.
5. Contenido G/C; poli(T/A-G/C).
45-55% GC(para tener buen Tm)
Sin poli(T/A-G/C)
PoliT, PoliA o Poli T/A , unin ms dbil: se puede separar el complejo primer-templado en
esa zona (brecha).
PoliG, PoliC o Poli G/C , unin ms fuerte: annealing no especfico.
6. Extremo 3
G o C en el extremo 3
Asegura la unin del primer al molde en el extremo 3 donde se une la polimerasa
(unin ms fuerte que A/T) la eficiencia de la reaccin
Tipos de PCR:
RT-PC, Ror Reverse Transcriptase PCR
Real Time PCR or qPCR
Inverse PCR
AFLP PCR
Colony PCR
In Situ PCR
Nested PCR
Single Cell PCR
TEMPLADO de PCR
RT-PCR
semicuantitativa
Comparacin con genes
Housekeeping genes presentes en
todas las clulas se expresan
constitutivamene :
GAPDH
Actina
Tubulina
REAL TIME PCR
Deteccin y cuantificacin del producto de PCR mediante una
sonda fluorescente que se une al DNA o un agente intercalante.
Esta seal fuorescente aumenta en proporcin directa al aumento
del producto de PCR y se registra a lo largo del tiempo
Sistemas de deteccin:
agentes fluorescentes
intercalantes SYBER-
Green
sondas marcadas con
fluorocromos
Taq (actividad 5- 3 exo)
hidroliza la sonda se
separa el fluorocromo del
quencher
FIGURE 13. Real-time PCR quantitation of retinoblastoma mRNA. RT-PCR of duplicate samples of total HeLa RNA was performed with the
PLATINUM Quantitative RT-PCR THERMOSCRIPT One-Step System (cDNA synthesis was performed at 60C) and detected using a FAM-
labeled Molecular Beacon probe (400 nM) on an ABI Prism 7700. Panel A. Relative fluorescence intensity of duplicate samples during PCR.
Panel B. Standard curve.
CT
Northern blot
Marcacin no radioactiva:
Digoxigenina: se usa uno de los dNTPs marcado con digoxigenina
Deteccin: Anticuerpo conjugado con enzima (ALP) o fluorocromo
Biotina: se usa uno de los dNTPs biotinilado.
Deteccin: Streptavidina conjugada con enzima (ALP) o anti-biotina
Usos:
NB, SB, hibridacin in situ
Marcacin flourescente: Se usa uno de los dNTPs marcado con un fluorocromo:
Cyanin 5, Cyanin 3, fluorescena, otros.
Deteccin de la sondaUsos: FISH, microarrays Cy5
Cy5-dCTP
Sondas de oligonucletidos
Marcacin de extremos5 o 3
Los oligonucletidos se marcan enzimticamente en el extremo 3 por el agregado de
dNTPsmarcados o por fosforilacindel extremo 5 TdT(Transferasaterminal)cataliza la
incorporacin de dNTPsal 3OH en ausencia de templado. PNK (polinucleotidokinasa)
Fosforilael extremo 5 a partir de g-ATP
PNK (polinucleotidokinasa)
Marcacin Sondas de DNA por PCR
La PCR permite la amplificacin y marcacin de cantidades nfimas de
DNA. Se necesita disear los primers. Se hace una rx de PCR utilizando
uno de los nucletidos marcados.
OMICS
DNA genmico
Clonado
Preparacin de
bibliotecas
genmicas
Reaccin de ligacin
Ligasa T4
Hay que
separar cada
fragmento
Vector para biblioteca genomica
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
CLONADO
Biblioteca de cDNA
SECUENCIACION
Next-generation sequencing technologies
POLIMERASA
RNA POL II
MIDIENDO LA EXPRESIN GNICA
La expresin gnica es una medida de los eventos de transcripcin
y traduccin
Como una primera aproximacin se mide abundancia de transcripto
RT-PCR (real-time PCR)
Northern blot
DNA Microarrays or Gene Chips
Metodos basados en secuenciacin
DNA microarrays
ARRAYS ALTA DENSIDAD
ChIP
Inmunoprecipitacin
de Cromatina
INPUT:DNA purified from sonicated cell extract prior to treatment with antibody, with
crosslinks reversed
CHIP on CHIP
EXPRESION DE PROTEINAS
RECOMBINANTES
DNA a
clonar
Vector
Digestin con
enzimas de
restriccin
Ligacin
Transformacin
E. coli competentes
Seleccin
Screening
ESQUEMA DE CLONADO
Plantas transgenicas
Bacterias modificadas
Protenas recombinantes
Terapia gnica
mRNA de la
protena de
inters
SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1
ERA
CADENA
5cap
mRNA
Transcriptasa reversa
DNA polimerasa
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
AAAAAA(A)
n
A 3
cDNA
PCR
Primers: Forward incluye AUG
Reverse incluye STOP
F
R
Clonado en vector de expresin
PROMOTOR
PCR
Primers: Forward incluye AUG
Reverse incluye STOP
F
R
Clonado en vector de expresin
PstI
KpnI
Sistemas de expresin
E. coli
Rpido , barato, fcil (cuando funciona)
Fcil clonado
Cultivo barato
Rpido crecimiento
Deficiente en modificaciones post-traduccionales eucariotas
glicosilacin, fosforilatcon, etc.
Deficiente en ciertos tRNAs comunes a genes eucariotas
Ciertas protenas se pliegan mal y forman cuerpos de inclusin
Levaduras
Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae
Clonado en E. coli, luego se transforma el DNA en la
levaduras
Rapido crecimiento, no tan alta produccin.
Modificaciones post-traduccionales
Sistemas de expresin eucariotas
Baculovirus / Clulas de insectos
Clonado en E. coli, transfeccin clulas de insecto,
Modificaciones post-traduccionales muy semejantea a mamiferos
Seales de secrecin, glicosilacn and fosforilacin
Expresa bien protenas secretadas de membrana, e intracelulares
Sistemas de clulas de mamiferos
Autenticas modificaciones post-traduccionales
Erythropoeitin (Epogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)
CHO cells (Chinese hamster ovary)
HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), BHK (baby
hamster kidney cells)
Companias : Genentech (S. San Francisco, CA, USA), Roche
(Basel, Switzerland), Novartis (Basel, Switzerland) and Bayer
(Berkeley, CA, USA), proteinas recombinantes de uso
medicinal )
Ejemplos de sobrexpresin de protenas para purificacin
PROMOTORES en general INDUCIBLES
Bacterias: Lactosa o anlogos IPTG
Levaduras: Galactosa
Cromatografa de afinidad
Expresin y purificacin de protenas
recombinantes
Promotor
MCS
TAG
Protenas de fusin
Gene 1 gene of interest
MET ... LEU ARG THR-stop MET VAL ILE ... stop
ATG ... GTG CGA ACC TAA ATG GTG ATC ... TAG
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... stop
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Gene 1 gene of interest
Corte proteasa
Protenas Humanas recombinantes
Erythropoietin (EPO)
Insulina
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)
alpha-L-iduronidase (rhIDU; laronidase)
acetylgalactosamine-4-sulfatase (rhASB; galsulfase)
Dornase alfa ( DNAsa)
Tissue plasminogen activator (TPA)
Glucocerebrosidase Ceredase by Genzyme
Interferon (IF) Interferon-beta-1a
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)
Viral recombinantes
Protena de envoltura de hepatitis B virus
Molecular biology enzymes
Factor X
Taq Pol
AMMV (Transcriptasa reversa)
Enzimas de restriccin
La mutagnesis in vitro es usada para producir cambios en la
informacin gentica. Anlisis de los subsecuentes cambios , en
la expresin y actividad del producto ayuda a elucidar el efecto
funcional de la mutacin.
Tipos
Mutagenesis al azar
Mutagenesis sitio dirigida
MUTAGENESIS
Al azar
Taq DNAP I sin proofreading ( 0,1x 10
-4
a 2x10
-4
)
Manganeso aumenta velocidad de error
[dNTPs] no equimolar
Se transforma el producto mutado en E. coli y Levadura
Screening por fenotipo
Clonado
Screening
Secuenciacion
Figure 1A. PCR for Base Substitutions. Primers containing the base changes of interest as a non-complementary break in the primer
sequence (indicated by the blue bubble in primer A) are used in a PCR reaction. As the primers are extended, the resulting amplification
product incorporates the mutation, replacing the original sequence (shown as a blue bar in the PCR product).
Dirigida
Dirigida
Evolucin dirigida
Forma de optimizar enzimas , para adaptar protenas a las demandas industriales y
para avanzar en ele entendimiento de las relaciones estructura funcin en las
biocatalisis
Estabilidad estructural
Termoestabilidad
Mayor reactividad
Selectividad enantiomero
Solubilidad
Expresin
Mtodos para mutagenizar
Screen for P450cam aromatic hydroxylation activity using horseradish peroxidase (HRP) [9]. (a) Naphthalene is taken up by the E. coli cell where it is
hydroxylated by P450cam. The resulting naphthol is oxidatively coupled by intracellularly coexpressed HRP and converted into fluorescent polymers,
which remain associated with the cell. (b) Representative results of screening the first P450cam random mutant library using fluorescence digital
imaging (inset shows image of a section of an agar plate). Naphthalene hydroxylation activities, as measured by the total fluorescence generated
during a fixed incubation period, are plotted in descending order. The range of total fluorescence of clones expressing wild-type P450cam is indicated
with gray bar. Confirmed higher activity mutants are labeled.
Objetivo:
Evolucin de citocromo P450, enzima con mas actividad
Catlisis de oxidacin de sustratos orgnicos. Mejoramiento de actividad peroxigenasa
(oxidacin usando peroxido). Hidroxilacion de alcanos, alquenos, alcoholes, cidos
grasos, amidas, hidrocarburos poliaromaticos y heterociclos
Otro ejemplo
Uso de seleccin genetica en E.coli, para aislar variantes termofilicas de
Indolglicerol fosfato sintetasa , que permitiera a las clulas crecer mas rpido a 37 C