Origen Del Diacetilo en Las Mantequillas Interés de Su Determinación

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ARXIUS de I'Esc. Sup. d'Agricultura.

Barcelona 63

ORIGEN DEL DIACETILO EN LAS MANTEQUILLAS


INTERÉS DE SU DETERMINACIÓN

C. Fernández y M. Rafecas
Departamento de Bromatologia, Toxicología y Análisis Químico Aplicado.
Facultad de Farmacia. Universidad de Barcelona

RESUM

Aquest treball consisteix en la revisió i ori- mateixes condicions cromatogrdfiques s'hi


gen del diacetil en les mantegues, així com identifiquen d'altres compostos de la fer-
en la descripció d'un metode analitic per mentació, com són I'acetaldehid, I'acetona
C . G . amb addicció de patró intern. En les i l'etanol.

RESUMEN

Este trabajo consiste en una revisión del terno. En las mismas condiciones cromato-
origen e interés del diacetilo en las mante- gráficas se identifican otros productos resul-
quillas, así como la descripción de un meto- tantes de la fermentación, como son acetal-
do de determinación de diacetilo por croma- dehido, acetona y etanol.
tografía de gases con adición de estándar in-

SUMMARY

This article revise the origin and interest the same chromatographical conditions we
of dyacethil in butter-milk and describe an identified other products of fermentation
method for determination of dyacethil by such as acetaldehyde, acetone and ethanol.
C.G. with addition of interna1 standard. In
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Los principales responsables del aroma de diacetylactis y Leuconostoc citrovorum (Ba-


los productos lácteos, en especial mantequi- digns, H.T. et al., 1962, Keenan, T.V., 1966
llas, quesos y yogures, son entre otros el ace- a y 1966 b). Sin embargo, desde el reconoci-
taldehido, etanol, acetona, diacetilo y ace- miento de que el diacetilo es el principal
toina (Hild, J . 1978, Lindsay, R.C. et al., componente del aroma de la mantequilla se-
1967, Mitchell, G.E. 1981, Biede, S.L. et al., gún Van Niel et al., (1929), la mayor parte
1979). de los estudios realizados se han dirigido a
El conocimiento del aroma de estos pro- investigar el origen y evolución de este com-
ductos tiene cada día mayor importancia en puesto.
la apreciación de la calidad de estos alime- Parece ser que hay cepas de S. diacetylac-
nentos, ya que este factor es responsable en tis, L. citrovorum y algunas de L. dextrani-
definitiva de la aceptación del producto. curn que producen cantidades significativas
de diacetilo (Galesloot, Th. E., 1962; Marth,
E.H., 1963; Seitz, E.W., et. al., 1963).
Origen de los componentes del aroma La ruta del diacetilo ha sido completamen-
te investigada; parte de la utilización del ci-
El aroma de la mantequilla, cuya calidad trato por cepas L. citrovorum, según Gales-
desde un cierto punto de vista está en fun- loot (1962), el a.acetolactato que deriva del
ción del mismo, se atribuye a un equilibrio catabolismo del citrato, es descarboxilado
entre los ácidos orgánicos y productos volá- para dar acetoina. El S. diacetylactis y L. ci-
tiles que se producen como metabolitos du-
rante la fermentación.
La fermentación y el desarrollo de este
aroma es debido a la acción que realizan dos
trovorurn desdoblan el citrato en acetato y
oxalacetato y descarboxilan el oxalacetato a
piruvato.
Sin embargo, un estudio de Speckman y
i
tipos de bacterias (Vedamuthy et al., 1977, Collins (1968), demostró que ni el a -
Speckman, R.A. et al., 1968). Las bacterias
productoras de ácido son normalmente ce-
acetolactato, ni la acetoina son los precur- 1
sores del diacetilo. Estos trabajos se basan
pas de Streptococus cremoris que fermenta
la lactosa produciendo ácidos láctico, acéti-
en que la acetoina se produce estequiométri- 1
camente a partir del piruvato y a-acetolacta-
co, propiónico, fórmico, pirúvico y trazas to y que, concluyendo, el diacetilo se forma
de acetaldehido, etanol y dióxido de carbo- por elacetaldehido-TPP y el acetil COA (Fi-
no. Las bacterias productoras de aroma son gura 1).
principalmente cepas de Leuconostoc citro-
vorum. Estas bacterias fermentan el ácido
cítrico y producen diacetilo (2,3-butanodio- Antecedentes bibliográficos
na) que es el componente característico del
aroma de las mantequillas. En la composición del aroma de las man-
El crecimiento de las cepas de Leuconos- tequillas según Siek, T.J. et al., (1970) hay
toc citrovorum es estimulado por el acetal- que destacar que a pesar de no encontrar
dehido según estudios de Lindsay et al. concentraciones elevadas de diacetilo, este
(1965), aunque este compuesto sirve de sus- constituye sin duda el mayor responsable del
trato, asimismo, para cepas de Streptococus aroma característico de este producto. (Ta-
lactis, Streptococus cremoris, Streptococus bla 1).
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Sin embargo, Lindsay, R.C. et al., (1966) compuestos volátiles que se desarrollan a lo
realizan unas pruebas de degustación de pro- largo de la fermentación de los productos
ductos lácteos fermentados de alta calidad lácteos obtiene datos muy significativos (Ta-
y productos sintéticos a los que añade los bla 11). En el punto cero de la fermentación
compuestos más característicos del aroma se observan concentraciones elevadas de ace-
(acetaldehido, diacetilo ...). Una vez ordena- taldehido. En un período intermedio se ob-
dos los diferentes productos según la propor- tiene diacetilo disminuyendo los valores de
ción de diacetilo que contienen (desde 0,05 acetaldehido. En el punto final, establecido
ppm hasta 3,42 ppm) se observa que no exis- a las 18 h., la concentración de este último
te una correlación clara en las puntuaciones es casi despreciable respecto al diacetilo, pu-
obtenidas. Otros estudios anteriores habían diendo justificarse este fenómeno por la con-
indicado que concentraciones más altas de densación de dos moléculas de acetaldehido
2,5 ppm de diacetilo, ocasionarían aromas para obtener el diacetilo (Figura 2).
no deseados al producto. Luego, Lindsay El diacetilo continúa su vía metabólica
(1966), llega a la conclusión de que sustan- dando lugar a acetoina y 2,3-butanodiol,
cias como el sulfito de dimetilo pueden con- siendo responsable de este proceso la dime-
trarrestar el exceso de otros aromatizantes. ti1 reductasa, presente en las cepas de L. ci-
No es pues sólo el diacetilo el que juega trovorum y S. diacetylactis.
un papel importante en el aroma, sino un El conjunto de todos estos productos, ob-
amplio conjunto de productos resultantes de tenidos en una proporción idónea, en un es-
todo el proceso de fermentación. tadio determinado en el proceso de fermen-
Refiriéndose a los esteres volátiles, Lind- tación, son los que nos indicarán el punto
say, R.C. et al. (1966) da un valor total de final de la misma.
1 ppm expresados en acatato de etilo, sien- La analítica centra pues su interés hacia
do el umbral aromático de 10 ppm. Sin em- estos productos finales, acetoina, acetalde-
bargo, no se puede desechar la posibilidad hido, diacetilo ... Para ello se han propues-
de que estos productos aunque en muy ba- to diversos métodos como de destilación,
jas concentraciones contribuyan junto con cromatografía en capa fina (C.C.F.), espec-
otros compuestos al aroma total de las man- trofotometría, etc. Nosotros en un primer
tequillas. paso en el estudio del aroma, centramos
Es también conocida la importancia del nuestra atención en la cuantificación del dia-
acetaldehido, así como la relación diaceti- cetilo sin olvidar los demás componentes vo-
lo/acetaldehido. Marsili, R.T. (1981) en un látiles.
estudio sobre la evolución de los principales

MATERIAL Y MÉTODO

El método que se propone, tiene como grafo de gases debidamente acondicionado.


fundamento la volatización del diacetilo El método permite además, en las condi-
(2,3-butanodiona) de la muestra, contenida ciones de la experiencia, el análisis de otros
en un vial cerrado herméticamente y la pos- componentes volátiles cuyo punto de ebulli-
terior inyección del llamado ((espacio de ca- ción no es elevado, tales como etanol, ace-
bezan (fase gaseosa del vial) en un cromató- tona, acetaldehido, etc. Sin embargo, para
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la acetoina, cuyo punto de ebullición es de -flujo gas portador


140 OC, sería necesario la reoxidación pre- (Nitrógeno):. . . . . . . . . . . . . 20 ml/min.
via por medio de FeCl, para obtener el dia- -atenuación:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 x 1
cetilo (Figura 3).
La tiempos de retención obtenidos para
cada uno de los patrones (en segundos), son
Material los siguientes:
- Vial de 12,5 ml. de capacidad, provistos
de tapón de goma de butilo y cápsula de
aluminio.
- Material volumétrico habitual.
- Baño termostatado (que aprecie +0,5'C),
ajustado a 75 "C.
- Cromatógrafo de gases, equipado con de- Preparación de la muestra
tector de ionización de llama y acoplado La determinación cuantitativa se realiza
a un sistema integrador. Columna croma- por el procedimiento de adición de estándar
tográfica de vidrio de 2 mt. de longitud, interno de concentración conocida.
con relleno de Carbowax 20 M al 20%,
sobre Chromosorb GAW. DMCS de 80- a) Preparación de la solución concentrada
100 mallas. estándar
Debido a la volatilidad del diacetilo y
- Jeringa tipo Hamilton (Gastight) mod.
los otros productos acetona, etanol, ace-
1001 LTN de 1 ml.
taldehido, la preparación se efectuará de 1
lasiguiente forma: colocar en un vial unos
5 m1 de agua, tapar y tararlo. Añadir, pe-
Reactivos
sando por diferencia, unos 50 mg. de ace-
- Diacetilo (Merck) p.a. taldehido. Pasar el contenido a un ma-
- Acetaldehido, etanol, acetona (Merck). traz aforado de l .O00 ml, lavando el vial
- Agua destilada. y el tapón 2-3 veces con agua destilada.
Efectuar la misma operación con otros
tres viales, a los que se añadirán respec- I
tivamente 50 mg. de acetona, 250 mg. de l
Método analítico
etanol y 250 mg. de diacetilo. Pasar el
Colocar los viales, que más adelante se de- contenido de estos viales al mismo ma-
tallan y a intervalos de 15 minutos, en un ba- traz de litro utilizado anteriormente, y en-
ño termostatado a 75 OC. Pasados 30 minu- rasar. Esta solución concentrada así pre-
tos tomar, con la jeringa Hamilton, 1 ml. del parada contiene:
espacio de cabeza del vial e inyectar rápida- - 50 ppm de acetaldehido;
mente en el cromatógrafo en las siguientes - 50 ppm de acetona;
condiciones:
-250 ppm de etanol;
-temperatura del horno: . . . . . . . 70 "C.
-250 ppm de diacetilo.
-temperatura del detector
e inyector: . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 "C.
b) Preparación de la solución diluida están- denadas la respuesta del integrador, (de-
dar. ben ~onstrilirsetantas gráficas como =;-
Tomar 10 m1 de la solución concentra- tándar se hayan adicionado). Calcular la
da y diluir a 100 ml con agua destilada ecuación de la recta que define los distin-
en un matraz aforado. Esta solución con- tos puntos de cada gráfico y hallar mate-
tiene: máticamente el punto de intersección de
- 5 ppm de acetaldehido; la recta con el eje de abcisas (y = O). La
- 5 ppm de acetona; distancia de este punto y el origen de or-
denadas, nos da la cantidad de sustancia
-25 ppm de etanol; problema en 1 g. de muestra.
-25 ppm de diacetilo. Para el cálculo del contenido en diace-
tilo de una muestra se han obtenido los
c) Preparación de la muestra y recta de re- siguientes resultados:
gresión. Cantidad de
Colocar cinco viales, rotulados 1.2, 3, diacetilo añadida Área integrador
4 y problema -1 g. de mantequilla- y
las cantidades de solución estándar diluí-
das, que se indican en la Tabla 111, a con-
tinuación se completa el volumen hasta
1 ml. con agua destilada.
Los viales así preparados contienen las
cantidades indicadas en la Tabla IV de las
sustancias estándar añadidas. Ecuación de la recta y = 442 x 1525 (r = 0.9863)
Para y = 0, nos da el contenido de diacetilo en 1
g. de muestra, por tanto x = 1525/442. De donde
d) Cálculos.
x = 3.4 ppm., cuya resolución gráfica se observa
Hacer un gráfico colocando en abcisas
en la Figura 4.
las cantidades adicionadas al vial y en or-
68 ARXIUS de I'Esc. Sup. d'Agricultura. Barcelor

ACIDO CITRICO OXALACETICO 4 ACETICO

PIRWICO + C02 OXALACETICO

'<
2 P I R W I C O + 2 TPP

ACETALDEHIDO - TPP ACETALDEHIDO - TPP

- TPP

ACETALDEH IDO
ACETIL COA

COA + TPP
I
,- ACETALDEHIDO
+ PIRUVTCO

+ 'rPP

DIACETILO ACETOINA + C02

ACETOINA

Figura 1.- Vías metabólicas a considerar en la formación del diacetilo.


ARXIUS de I'Elc. Sup. d'Agricultura. Barcelona 69

Figura 2.- Condensación de dos moléculas de acetaldehido para obtener el diacetilo.

Figura 3.- Oxidación de la acetoina para obtener el diacetilo.


70 ARXIUS de I'Esc. Sup. d'Agricultura. Barcelona

O X x+ 6.25 x+12.50 x.1075 x.25.00 mcg a k d idos


X

Figura 4.- Grdfico correspondiente al ejemplo citado en el texto.


Gráfico 1 .- Cromatograma
obtenido con una muestra
de mantequilla problema. 1) diacetilo,
2) etanol, 3) acetona, 4) acetaldehido.
?2 ARXIUS de I'Er. Sup. d'Agricultura. Barcelona

TABLA 1
Concentración de los compuestos volátiles de la mantequilla por C.G.,
segun Siek y Lindsay (1970)

Concentración en p.p.m.

Compuesto Hallados Valores bibliográficos

Acetona 0.13 >O.OI


Butanona O. 16 cO.01
2-Pentanona O. 14 0.01, >0.02
2-Hexanona 0.004 0.02
2-Heptanona 0.35 0.01, >3.4
2-Octanona 0.013 " 0.01
2-Nonanona 0.21 > 0.01
2-Decanona 0.08
2-Undecanona 0.24 3.6, 0.13
2-Tridecanona 0.35 0.88
Etanal 0.45 0.7
n-Propanal 0.07 0.07, 2.8, 0.16
n-Butanal 0.06 0.04
n-Pentanal 0.04 0.71, 0.005
n-Hexanal 0.20 O. 14, 0.24
n-Heptanal 0.03 0.16, 1.3
n- Decanal 0.01 0.10
n-Undecanal 0.08
Diacetilo O. 10 0.04, c0.01
*-Octalactona 0.40 2.6, >O.Ol
a-Decalactona 2.0 15, 9, ~ 0 . 0 1
a-Undecalactona 0.10 0.6, 0.7
a-Dodecalactona 5.0 28.5, 35
#-Tetradecalactona 4.0 21.5, 34
n-Undecalactona 0.05 0.5, 0.2
N -Decalactona O. 1 1.2, 0.6
N-Dodecalactona 0.3 1.6, 1.8
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Compuesto Hallado Compuesto Hallado

Formiato de etilo 0.99 Benceno 0.0005


Acetato de etilo 2.0 Tolueno 0.01 1
Butirato de etilo 0.01 Etilbenceno 0.007
Hexanoato de etilo 0.02 p-Xileno 0.002
Octanoato de etilo 0.03 m-Xileno 0.004
Acetato de metilo 0.01 o-Xileno 0.003
Etanol 0.53 metiletilbenceno 0.005
Cloroformo 0.02 p-Cimeno 0.0006
n-Octano 0.006 Benzoaldehido 0.002
n-Nonanona 0.006 p-Diclorobenceno 0.005
n-Decano 0.006 o-Diclorobenceno 0.05

TABLA 11
Compuestos orgánicos obtenidos en la fermentación a 23 "C, segun Marsili, F.T. (1981)

Concentraciones (u g/g)

Compuesto O h. a 23 "C. 18 h. a 23 "C. 168 h. a 3 "C.

Orótico 79.1 42.2 34.7


Cítrico 730.0 176.0 20.0
Pirúvico 1.3 33.0 <0.2
Láctico 45 .O 7410.0 5820.0
Úrico 20.4 18.8 19.7
Acético 5 610.0 730.0
Propiónico <10 90.0 40.0
Acetaldehido 0.02 0.77 1.46
Acetona 2.10 1.98 2.14
Etanol 1 .O0 24.15 37.30
Diacetilo <0.05 11.50 1.90
74 ARXIUS de I ' E r . Sup. d'Agricultura. Barcelona

TABLA 111
Preparación de los viales problema y estándar

Problema P+ 1 P+2 P+3 P+4

g. mantequilla 1 g. 1 g. 1 g. 1 g. 1 g.
ml. d e agua 1 ml. 0,75 ml. 0,50 ml. 0,25 ml. O ml.
ml. sol. diluida O ml. 0.25 ml. 0.50 ml. 0.75 ml. 1 ml.
-

TABLA IV
Concentración de los distintos estándar añadidos en los viales

P+1 P+2 P +3 P+4

mcg. acetaldehido 1,25 2.5 3,75 5


mcg. acetona 1,25 2,s 3,75 5
mcg. etanol 6.25 12.5 18,75 25
mcg. diacetilo 6,25 12,5 18,75 25

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