Pada kultur jaringan eksplan seringkali berubah menjadi coklat (browning) atau

hitam (blackening) sesaat setelah isolasi yang selanjutnya dapat menghambat

pertumbuhan dan akhirnya menyebabkan kematian jaringan. Pencoklatan sangat
umum terjadi pada spesies tanaman berkayu, terutama bila eksplan diambil dari pohon
dewasa. Penghambatan pertumbuhan biasanya sangat kuat pada beberapa spesies yang
umumnya mengandung senyawa tanin atau hidroksifenol dengan konsentrasi tinggi.
Pencoklatan pada jaringan muda lebih sedikit dibandingkan dengan jaringan yang tua
(George dan Sherrington 1984). Tang dan Newton (2004) juga melaporkan bahwa
pencoklatan jaringan sangat menurunkan regenerasi secara in vitro dari kultur kalus
pada beberapa tanaman berkayu, khususnya regenerasi tanaman melalui jalur
organogenesis. Meskipun sebagian besar kultur kalus berubah menjadi coklat, ada
sebagian kecil tidak mencoklat selama proses regenerasi in vitro pada Virginia pine
(Pinus virginiana Mill.). Kultur kalus dari tunas pucuk Scots pine (Pinus silvestris L.)
juga ditandai dengan pencoklatan secara cepat dan ketidakmampuan beregenerasi
(Laukkanen et al. 1999). Oxydative browning merupakan salah satu penyebab mengapa
Protea cynarioides tidak diperbanyak melalui teknik kultur jaringan (Wu dan Toit
2004). Azghandi et al. (2002) melaporkan bahwa pencoklatan pada eksplan kalus tua
pistachio dan kultur media di sekitar kalus menjadi masalah pada fase inisiasi dan
proliferasi.
Beberapa macam tanaman khususnya tanaman tropika mempunyai kandungan
senyawa fenol yang tinggi yang teroksidasi ketika sel dilukai atau terjadi senesens
(George dan Sherrington 1984). Akibatnya jaringan yang diisolasi menjadi coklat atau
kehitaman dan gagal tumbuh. Pencoklatan jaringan terjadi karena aktivitas enzim
oksidase yang mengandung tembaga seperti polifenol oksidase dan tirosinase (Lerch
1981) yang dilepaskan atau disintesis dan tersedia pada kondisi oksidatif ketika
jaringan dilukai. Substrat untuk enzim ini ada bermacam-macam pada jaringan yang
berbeda, yang umum adalah tirosin atau o-hidroksifenol seperti asam klorogenik.
Enzim dan substrat dalam keadaan normal akan tertahan dalam ruang berbeda di
dalam sel dan akan keluar bersama-sama pada saat sel dilukai atau hampir mati. Fenol
mempunyai fungsi alami penting dalam mengatur oksidasi IAA. Apabila fenol yang
terlarut dalam air digunakan pada eksplan jambu biji maka pertumbuhan tunas dan
kalus akan terpacu (kemungkinan melalui sinergisme dengan auksin), dan akan
menjadi racun apabila konsentrasinya meningkat (Cassman et al. 1978).
Toksisitas fenol kemungkinan disebabkan oleh ikatan reversibel antara hidrogen
dan protein. Penghambatan pertumbuhan yang tidak dapat diperbaiki terjadi ketika
fenol teroksidasi menjadi senyawa aktif quinon yang tinggi yang kemudian memutar,
memolimerase dan/atau mengoksidasi protein menjadi senyawa melanat yang makin
meningkat. Juma et al. (1994) meneliti kultur jaringan tanaman kopi dan menemukan
bahwa tingkat oksidasi fenol tergantung pada sumber potongan ruas batang sebagai
eksplan dan spesies tanaman. Kopi robusta cenderung lebih bermasalah dengan
pencoklatan dibandingkan dengan kopi arabica. Ozyigit et al. (2007) melaporkan
bahwa terbentuknya senyawa fenol di- pengaruhi oleh struktur kimianya, spesies
tanaman, proses biologi (organogenesis atau somatik embriogenesis), dan tahap
perkembangannya. Metabolisme fenol mempengaruhi sistem kultur jaringan secara

positif dengan metabolisme auksin (kecepatan pembelahan sel dan sintesis dinding sel
serta senyawasenyawa lain yang berhubungan), tetapi oksidasi fenol yang berubah
menjadi quinon dan senyawa lain (polimerasenya) yang sangat beracun menyebabkan
pencoklatan medium dan kematian eksplan. Harm et al. (1983) mengemukakan bahwa
betasianin dilepaskan ketika jaringan bit dilukai di dalam kultur. Substrat ini akan
cepat teroksidasi dan menjadi zat penghambat secara sempurna.
Menurut Huang et al. (2002) pencoklatan yang sering menyebabkan kematian
awal dari tunas bambu yang ditanam secara in vitro berkorelasi langsung dengan
aktivitas polifenol oksidase (PPO). Selama di dalam kultur, aktivitas PPO paralel
dengan pencoklatan eksplan. Vaughn dan Duke (1984) menyimpulkan bahwa:
1. PPO adalah suatu enzim plastida (plastidic enzym) yang belum jelas, tetapi tidak aktif
sampai tergabung dalam plastida tersebut.
2. Dalam jaringan hijau yang sehat, PPO ada dalam bentuk laten pada membran
tilakoid dan tidak terlibat dalam sintesis senyawa fenolic. Dalam leukoplas, protoplas,
atau amiloplas, PPO sering kali dalam bentuk laten dalam rudimentary thylakoid.
3. PPO secara normal berfungsi sebagai suatu oksidasi fenol yang secara in vivo hanya
terjadi pada senesens atau sel yang rusak.
4. Dalam fungsi kloroplas, PPO kemungkinan terlibat dalam beberapa aspek kimia
oksigen, yaitu sebagai mediator dalam pseudocyclic photophosphorylation.
Tang dan Newton (2004) membandingkan kalus yang mengalami pencoklatan
dan yang tidak pada Virginia pine. Peningkatan lipid peroksida dan polifenol oksidase
serta penurunan enzim anti oksidan askorbat peroksidase (APOX), glutation reduktase
(GR), dan superoksida dismutase (SOD) diamati pada kedua macam kalus tersebut.
Ternyata aktivitas enzim anti oksidan menurun secara cepat sesaat setelah
pengkulturan dimulai, khususnya pada 3-4 minggu periode kultur. Konsentrasi asam
amino yang mudah larut berbeda. Putresin menurun 63,8-71,5% pada jaringan yang
mengalami pencoklatan. Spermidin menurun 47-65,6%, dan spermin menurun 62,374,5%. Disimpulkan bahwa pencoklatan jaringan berhubungan dengan akumulasi
polifenol oksidase dan penurunan putresin, spermidin, dan spermin yang menghambat
pertumbuhan kalus, diferensiasi tunas dan perakaran. Newton et al. (2004a)
menyimpulkan bahwa penambahan poliamin dapat menanggulangi pencoklatan
jaringan menjadi kultur kalus normal melalui penurunan kerusakan oksidatif dan
peningkatan regenerasi tanaman dengan beraksi sebagai zat pengatur tumbuh.
Andersone dan Levinsh (2002) juga melaporkan bahwa penurunan aktivitas
peroksidase dan polifenol oksidase berhubungan dengan peningkatan kemampuan
jaringan untuk mulai tumbuh secara in vitro. Tabiyeh et al. (2006) mengemukakan
bahwa pencoklatan dalam kultur jaringan disebabkan karena meningkatnya produksi
senyawa fenolat yang diikuti oksidasi oleh aktivitas enzim oksidase (PPO) dan
polimerasinya. Fenilalanin amonia liase (PAL) adalah salah satu enzim dalam
fenilpropanoid yang sangat berpengaruh terhadap terjadinya pencoklatan. Salah satu
penyebab utama pencoklatan dalam kultur in vitro adalah luka karena pemotongan
pada jaringan. Luka tersebut memacu stres dan menyebabkan peningkatan aktivitas
PAL yang diikuti oleh produksi fenilpropanoid dan menyebabkan pencoklatan.

Menurut Ahmad et al. (1995) waktu yang dibutuhkan untuk pencoklatan

Pistacia vera dipengaruhi oleh konsentrasi dan kombinasi zat pengatur tumbuh dalam
media induksi. Induksi kalus dalam media yang mengandung NAA (2 atau 5 mg/l) atau
NAA (5 mg/l)+ kinetin (2,5 mg/l) dapat mempertahankan kalus tetap putih kehijauan
selama 10-13 minggu. Tahtamouni et al. (2001) mempelajari pertumbuhan dan sifat pir
liar (Pyrus syriaca Boiss.) dengan preservasi in vitro dalam MS dengan osmotikum.
Tunas mikro (0,1 cm) pada titik tumbuh disimpan dalam media yang mengandung 3, 6,
9, atau 12% baik sukrosa, sorbitol atau manitol. Pertumbuhan sangat terhambat
dengan bertambahnya konsentrasi osmotikum. Terjadi tahapan kerusakan fisiologis
(pencoklatan ujung tunas, pangkal tunas, dan pengguguran daun) dengan adanya
peningkatan osmotikum dan sepertinya periode preservasi diperpanjang. Di antara
perlakuan yang dicoba untuk osmotikum, sukrosa pada konsentrasi rendah paling baik
untuk mengurangi kerusakan fisiologis dan untuk tumbuh kembali.
Penanggulangan pencoklatan pada jaringan khususnya pada eksplan yang baru
diisolasi dan pada media tumbuh yang digunakan, menurut George dan Sherrington
(1984) seringkali dilakukan dengan menggunakan salah satu cara dari beberapa
pendekatan, yaitu:
1. Menghilangkan senyawa fenol.
2. Modifikasi potensial redoks.
3. Penghambatan aktivasi enzim fenol oksidase.
4. Penurunan aktivitas fenolase dan ketersediaan substrat.
Menghilangkan Senyawa Fenol
Fenol sering dikonotasikan sebagai zat penghambat yang harus dihilangkan dari
kultur in vitro. Berbagai metode untuk menghindari pembentukan fenol telah
dilakukan, dan yang paling umum adalah dengan mentransfer eksplan ke media baru.
Tetapi peningkatan jumlah subkultur seringkali menyebabkan akumulasi mutasi sel-sel
dan menyebabkan hilangnya sel yang efektif untuk membentuk embriogenesis.
Penambahan arang aktif ke dalam media kultur seringkali dapat menghindari
pembentukan inhibitor fenolat (Hutami 2006). Arang aktif menghilangkan pewarnaan
dengan menyerap dan mengoksidasi fenol dan menginaktifkan peroksidase. Arang aktif
mengurangi pencoklatanpada eksplan palem dan kultur media (Tisserat 1979),
sehingga memacu eksplan untuk tumbuh secara organogenesis. Arang aktif juga
mengontrol pencoklatan media dan menstimulasi pertumbuhan tunas Strelitzia regnae
dan Anemone aronaria (Mensuali-Sodi et al. 1993). Aliyu dan Mashood (2005)
melaporkan bahwa pencoklatan pada eksplan jambu mete (Anacardium occidentale L.)
disebabkan karena adanya senyawa metabolit sekunder yang dapat dikurangi dengan
mentransfer eksplan beberapa kali (subkultur), penambahan arang aktif, dan
perlakuan gelap.
Para ahli biokimia menemukan bahwa ekstraksi enzim dari tanaman aktif
sering dihambat oleh adanya polifenol atau tanin. Dalam hal ini berbagai senyawa
(khususnya protein, amida, dan poliamida) ditambahkan agar bereaksi dengan fenol
dan menyimpan kembali aktivitas enzim. Kafein adalah salah satu amida yang telah
berhasil digunakan (Goldstain dan Swain 1965 dalam George dan Sherrington 1984).
Poliamida yang paling umum digunakan untuk tujuan ini adalah polivinilpirolidon

(PVP) (Loomis dan Battail 1966). Untuk isolasi enzim, PVP biasanya digunakan
bersamasama dengan senyawa reduksi seperti -merkaptoetanol. Fenol diabsorbsi PVP
melalui ikatan hidrogen, untuk melindungi oksidasinya.
Batt dan Dhar (2004) melaporkan bahwa PVP 0,5% sangat efektif untuk
menghilangkan senyawa fenolat dan persentase eksplan yang hidup maksimum dapat
dicapai pada micropropagasi pohon betina Myrica esculenta. Newton et al. (2004b) juga
melaporkan bahwa penambahan anti oksidan akan mengurangi dan menghambat
pencoklatan
melalui
penurunan
akumulasi
peroksidase.
Penambahan
polivinilpolipirolidon (PPVP) dan 1,4-ditio- DL-treitol (DTT) terbukti meningkatkan
pembentukan kalus, diferensiasi dan pertumbuhan tunas, serta pertumbuhan akar
Virginia pine melalui penghambatan pencoklatan jaringan selama inisiasi kultur dan
subkultur tunas selanjutnya. Dibandingkan dengan kontrol, pemberian 5 g/l PVPP dan
2 g/l DDT menyebabkan frekuensi pembentukan kalus meningkat 15%, pertumbuhan
tunas meningkat 26%, dan perakaran meningkat 19%.
Modifikasi Potensial Redoks
Kecenderungan senyawa menjadi teroksidasi atau tereduksi tergantung pada
oksidasi-reduksi (redoks) potensial dari suatu larutan. Senyawa pereduksi yang redoks
potensialnya rendah seperti asam askorbat sangat efektif untuk menghindari
pencoklatan dari isolasi jaringan tanaman atau ekstrak tanaman dan sering
diasumsikan bahwa hal tersebut menghambat oksidasi fenol (George dan Sherrington
1984). Oksigen yang tidak larut meningkatkan redoks potensial larutan dan
menyebabkan oksidasi lebih cepat. Reduksi sementara dengan mengisolasi eksplan
segar pada oksigen dapat membantu menghindari terjadinya pencoklatan.
Penghambatan Aktivasi Enzim Fenol Oksidase
Senyawa penkhelat/pengikat selain mempunyai kemampuan mengikat
unsur/senyawa lain juga dapat mengganggu aktivitas enzim peroksida. Weinstein et al.
1951 dalam George dan Sherrington 1984) menemukan bahwa EDTA dapat
menghambat aktivitas polifenol oksidase pada daun bunga matahari yang dikulturkan
secara in vitro, dan disimpulkan bahwa senyawa khelat menghilangkan metal esensial
untuk aktivitas enzim oksidase. NaFeEDTA dan EDTA keduanya dapat menghilangkan
penghitaman pada tunas pucuk Carex dan Simth (1968) menyatakan bahwa hal
tersebut terjadi karena pengikatan tembaga yang dibutuhkan dalam pembentukan
enzim fenolase, ketika dia menemukan bahwa agen pengikat/penkhelat dapat
melindungi pencoklatan dari isolat segar tunas pucuk dari Carex flacca. Beberapa
reaksi oksidatif juga dikatalisir secara biokimia oleh ion-ion seperti Cu++, Co++, dan
Zn++.
Penurunan Aktivitas Fenolase dan Ketersediaan Substrat
Tingkat oksidasi fenol dapat dikurangi dengan pengurangan aktivitas enzim
spesifik atau pengurangan substrat untuk oksidasi. Aktivitas oksidasi polifenol tertinggi
pada pH 6,5 dan menurun pada pH lebih rendah (Ichihashi dan Kako 1977 dalam
George dan Sherrington 1984). Perendaman eksplan pada campuran asam askorbat
dan asam sitrat tidak hanya mengekspose eksplan pada senyawa reduksi tetapi juga
pada pH rendah. Huang et al. (2002) melaporkan bahwa aktivitas PPO sejajar dengan

pencoklatan eksplan pada bambu. Pencoklatan tertinggi diperoleh dari medium dengan
pH 8, di mana pH tersebut konsisten dengan pH optimum enzim pada bambu.
Stabilitas PPO tertinggi pada bambu pada pH 10.
Aktivitas enzim, biosintesis, dan oksidasi fenol akan meningkat dengan adanya
cahaya (Creasy 1968). Pencoklatan jaringan kemungkinan akan berkurang atau dapat
dihindari apabila biakan baru disimpan di ruang gelap sampai 14 hari sebelum
ditransfer ke ruangan dengan intensitas cahaya rendah (500-1000 lux). Pencoklatan
dari isolasi potongan batang Phalaenopsis telah berhasil ditanggulangi dengan
mengkulturkan eksplan selama 2 minggu pertama dalam ruang gelap dengan suhu
26oC. Setelah itu kultur dipindah ke ruang terang dengan suhu 22oC (Pieper dan
Zimmer 1976). Wu dan Toit (2004) melaporkan bahwa pengurangan oxydative
browning terbaik adalah dengan mengaduk eksplan selama 1 jam dalam larutan anti
oksidan yang mengandung asam askorbat 100 mg/l dan asam sitrat 1500 mg/l sebelum
ditanam dalam medium. Kombinasi perlakuan tersebut dengan fotoperiodisitas 16 jam,
mampu menghasilkan pertumbuhan tunas hingga 100%.
Penanggulangan yang Sering Dilakukan dalam Praktek dengan Pra-perlakuan
Dari uraian di atas telah diterangkan beberapa cara untuk menghindari
pencoklatan dalam kultur in vitro, tetapi sayangnya tidak satupun dari cara tersebut
efektif untuk semua spesies tanaman, dan untuk beberapa tanaman masih merupakan
masalah. Seringkali kombinasi dari beberapa cara tersebut perlu dilakukan. Ada
beberapa cara yang sering digunakan sebagai pra-perlakuan terhadap eksplan antara
lain (1) perendaman atau pencelupan dan (2) pra-kondisi pada media dasar.
Perendaman atau pencelupan
Pada beberapa spesies, pra-perlakuan dapat membantu menghindari
pencoklatan seperti pencucian dengan air mengalir pada biji walnut selama 24 jam
untuk menghilangkan fenol sebelum disterilisasi dan dikecambahkan secara in vitro
(Rodriguez 1982). Eksplan juga dapat direndam dalam air steril selama 2-3 jam setelah
isolasi sebelum dikulturkan. Pada beberapa spesies tanaman berkayu, perendaman
eksplan dari bagian masak fisiologis pohon tersebut di dalam air, atau pra-kultur ke
dalam media tanpa suplemen selama beberapa hari tidak hanya efektif untuk
menghindari atau menghilangkan kerusakan karena fenolat, tetapi juga
menghilangkan beberapa faktor penghambat pertumbuhan meskipun tanpa adanya
pencoklatan.
Bonga (1977) melaporkan bahwa tunas dorman dari pohon Abies balsamea
masak (tanpa daun) yang direndam dalam air atau dalam larutan yang mengandung
asam kafeat selama 15 menit sampai 24 jam sebelum dikulturkan, akan membentuk
tunas adventif. Perlakuan tunas dengan asam malonat 0,1% selama 15 menit setelah
perendaman akan meningkatkan respon tersebut. Tabiyeh et al. (2006) melaporkan
bahwa perlakuan glutation (GSH) diberikan dengan pencelupan dasar potongan tunas
pucuk dari aksis embrio Pistachia vera L. ke dalam larutan GSH 0,1 mM sebelum
dikulturkan pada media MS yang mengandung BAP, dapat mengurangi secara total
senyawa fenolat penyebab pencoklatan dan meningkatkan pertumbuhan. Tao et al.
(2007) melaporkan bahwa pra-perlakuan pencelupan eksplan Platanus occidentalis L.

dalam anti oksidan dan absorben pada saat yang sama dapat menghilangkan beberapa
efek samping.
Pra-perlakuan dengan vitamin C 10 g/l dapat mengurangi kontaminasi dan
pencoklatan secara efektif. Suatu penelitian membuktikan bahwa faktor optimal dan
level perlakuan BA 0,5 mg/l, arang aktif 2,0 g/l, dan PVP 1,5 g/l mengakibatkan
pencoklatan hanya 16,5%, dan secara umum disimpulkan bahwa waktu pengambilan
eksplan, bagian tanaman yang digunakan, dan pra-perlakuan eksplan adalah faktor
utama yang mempengaruhi kontaminasi dan pencoklatan pada fase inisiasi kultur
jaringan P. occidentalis L.
Pra-kondisi pada media dasar
Eksplan dari beberapa spesies dapat terhindar dari pencoklatan apabila pada
awalnya dikulturkan dalam media tanpa zat pengatur tumbuh. George dan
Sherrington (1984) menemukan bahwa ruas batang kedelai dapat berkembang menjadi
masa kalus yang friabel (yang menghambat pertumbuhan tunas secara langsung)
apabila segera dikulturkan pada media yang mengandung auksin dan sitokinin. Hal
tersebut diperkirakan karena tingginya konsentrasi auksin indogenous.
Potongan jaringan mula-mula dikulturkan dalam media dasar selama beberapa
hari sebelum ditransfer ke dalam media dengan IBA 0,005 mg/l dan BAP 1,1 mg/l.
Jumlah tunas yang terbentuk meningkat dengan meningkatnya waktu pra-perlakuan
sampai 20-25 hari. Apabila diperpanjang lagi jumlah tunas akan menurun. Nhut et al.
(2006) melaporkan hasil penelitiannya pada easter lily (Lilium longiflorum) bahwa
pembentukan kalus embriogenik diperoleh dari kalus friabel yang dikulturkan baik
pada media padat/cair dengan volume yang berbeda mengandung -naphthaleneacetic
acid (NAA) 1,0 mg/l dan thidiazuron (TDZ) 0,2 mg/l.
Jumlah embrio somatik yang berasal dari kalus embriogenik pada media cair,
khususnya pada volume 20 ml (170) lebih besar dari media padat (28) dan tahap
perkembangan bentuk embrio somatik terlihat jelas di bawah mikroskop (globular,
hati, dan bentuk kotiledon). Sebagian kalus yang terendam dalam media cair
mengalami pencoklatan/nekrosis karena hilangnya respirasi sementara kalus yang
muncul di permukaan cairan mengalami embriogenesis. Kemudian embrio somatik
yang masak ditransfer ke media tanpa hormon (1/2 MS), maka sekitar 78% dari total
embrio berkembang menjadi planlet dengan radicle dan plumule yang normal. Setelah
1 bulan planlet diaklimatisasi dengan keberhasilan tumbuh 98%.
Pembentukan polifenol dari potongan eksplan segar dapat dipengaruhi oleh zat
pengatur tumbuh. Kandungan kinetin yang tinggi sangat diperlukan untuk
pertumbuhan tunas pucuk Pelargonium, tetapi media agar menjadi berwarna gelap
apabila konsentrasi kinetin yang ditambahkan lebih dari 1 mg/l. Persentase hidup
eksplan meningkat dengan pengkulturan pada minggu pertama dalam media dasar
tanpa zat pengatur tumbuh dan selanjutnya ditambah sitokinin atau auksin (Debergh
dan Maene 1977).
Mikroorganisme terdapat di berbagai tempat seperti tanah, debu, air, udara,
kulit dan selaput lendir. Mikroorganisme dapat berupa bakteri, fungi, protozoa dan
lain-lain. Mikroorganisme mudah terhembus udara dan menyebar ke mana-mana
karena ukuran selnya kecil dan ringan. Mikroorganisme dapat menyebabkan banyak

kerusakan. Pengendalian mikroorganisme ditujukan untuk mencegah penyebaran

penyakit, membasmi mikroorganisme pada inang, serta mencegah pembusukan dan
kerusakan bahan. Mikroorganisme dapat dihambat atau dibunuh secara fisik dan
kimia. Secara fisik melalui suhu, tekanan, radiasi dan penyaringan, misalnya sterilisasi,
pembakaran atau sanitasi. Secara kimia melalui perubahan komposisi molekul
misalnya dengan senyawasenyawa fenolik, alkohol, klor, iodium dan etilen oksida.
Keefektifan zat antimikrobial tergantung konsentrasi, jumlah dan jenis
mikroorganisme, suhu, bahan organik terlarut dan pH (Pelczar dan Chan, 1988).
Sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil
yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kotor.
Sehingga harus dilakukan: sterilisasi lingkungan kerja, alat-alat, media dan bahan
tanaman (Gunawan, 1988).
Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering
dilakukan dalam kotak pindah (transfer box). Kotak ini biasanya terbuat dari kaca dan
tertutup. Di dalamnya terdapat lampu germicidal yang memancarkan radiasi ultra
violet untuk sterilisasi. Sterilisasi juga dapat dilakukan dengan alkohol 70%, kaporit
atau formalin. Pada masa sekarang, kotak pindah dilengkapi blower berkecepatan 100
flow per menit, untuk mencegah kontaminasi dari udara. Kotak pindah disebut
Laminar Air Flow Cabinet apabila dilengkapi aliran udara yang melalui filter HEPA
(High Efficiency Particulate Air) berporipori kurang dari 0,3 m (Gunawan, 1988).
Sterilisasi otoclaf menggunakan panas dan tekanan uap air. Temperatur sterilisasi
biasanya 121oC, sedang tekanan sekitar 17,5- 20 psi. Lama sterilisasi tergantung dari
volume dan jenis bahan. Alat-alat dan air disterilisasikan selama 1 jam, tetapi media
hanya 20-40 menit. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan: degradasi
vitamin dan asamasam amino, inaktivasi sitokinin zeatin riboside dan perubahan pH
yang mengakibatkan depolimerisasi agar.
Kultur murni in vitro cendawan perusak kayu Coriolus versicolor dan
Schizophyllum commune merupakan koleksi Laboratorium Jurusan Biologi FMIPA
UNS yang disimpan di Sub-lab Biologi, Laboratorium MIPA Pusat UNS. Agar kondisi
kultur selalu optimum, maka dilakukan peremajaan secara berkala. Peremajaan
dilakukan dengan menginokulasikan biakan ke medium taoge sukrosa agar segar
secara aseptik. Semua kegiatan dilakukan dalam laminar air flow cabinet yang telah
disterilisasi dengan penyemprotan alkohol 70% dan penyinaran lampu UV selama 1-2
jam. Namun ternyata masih terjadi kontaminasi setelah masa inkubasi 3 hari.
Mikroorganisme kontaminan berasal dari enam genus, yakni cendawan Mucor,
Rhizopus, Aspergillus, Cladosporium, Dictyostelium dan golongan Saccharomyces. Mucor
dan Rhizopus
Klasifikasi Mucor
Divisi : Amastigomycota
Subdivisi : Zygomucotina
Kelas : Zygomycetes
Ordo : Mucorales
Familia : Mucoraceae
Genus : Mucor

Ciri morfologi koloni: hifa seperti benang putih; bagian tertentu tampak
sporangium dan sporangiofor berupa titik-titik hitam seperti jarum pentul. Ciri
mikroskopis: hifa tanpa sekat, terdapat sporangium dan sporangiospora.
Klasifikasi Rhizopus
Divisi : Amastigomycota
Subdivisi : Zygomycotina
Kelas : Zygomycetes
Ordo : Mucorales
Familia : Mucoraceae
Genus : Rhizopus
Ciri morfologi koloni: hifa seperti benang berwarna putih sampai kelabu hitam;
bagian tertentu tampak sporangium dan sporangiofora berupa titik-titik hitam seperti
jarum pentul. Ciri mikroskopis: hifa tanpa sekat, terdapat rizoid dan sporangiospora.
Dalam penelitian ini Mucor dan Rhizopus ditemukan hampir di semua kultur in vitro
yang terkontaminasi. Pertumbuhan miseliumnya sangat lebat dan mendominasi
seluruh permukaan media kultur. Hampir 80% dari kultur in vitro yang diamati pada
penelitian ini diserang oleh kedua cendawan ini.
Aspergillus dan Cladosporium
Klasifikasi Aspergillus
Divisi : Amastigomycota
Subdivisi : Deuteromycotina
Kelas : Deuteromycetes
Subkelas : Hyphomycetidae
Ordo : Moniliales
Familia : Moniliaceae
Genus : Aspergillus
Ciri morfologi koloni: koloni berwarna hijau kebiruan dengan area kuning
sulfur pada permukaannya; miselium berbentuk benang halus. Ciri mikroskopis:
terdapat konidiofor, sel kaki dan kepala berkonidium terdiri dari gelembung, fialid
serta kadang-kadang metula dan konidium; fialid dapat dibentuk langsung pada
gelembung uniseriat atau metula biseriat; kepala konidium berbentuk kolumner atau
radial. Aspergillus adalah cendawan yang paling sering mengkontaminasi karena
pertumbuhan koloninya sangat cepat.
Klasifikasi Cladosporium
Divisi : Amastigomycota
Subdivisi : Deuteromycotina
Kelas : Deuteromycetes
Subkelas : Hyphomycetidae
Ordo : Moniliales
Familia : Dematiaceae
Genus : Cladosporium
Ciri morfologi koloni: warna hijau kehitaman; struktur kompak seperti
beludru;

pertumbuhan relatif lambat. Cendawan kelas Deuteromycetes yang ditemukan pada

penelitian ini adalah Aspergillus dan Cladosporium. Frekuensi kontaminasi kultur oleh
Aspergillus relatif lebih tinggi dibandingkan Cladosporium, tetapi masih lebih rendah
dibanding Mucor dan Rhizopus. Aspergillus dan Cladosporium adalah cendawan yang
banyak menyerang tumbuhan tingkat tinggi (parasit) dan banyak ditemukan pada
produk-produk pasca panen (Setyawati, 1989).
Klasifikasi Saccharomyces
Divisi : Amastigomycota
Subdivisi : Ascomycotina
Kelas : Ascomycetes
Subkelas : Hemiascomycetidae
Ordo : Endomycetales
Familia : Saccharomycetaceae
Genus : Saccharomyces
Ciri morfologi koloni: tidak membentuk miselium, koloni berupa lendir
berwarna putih, permukaan koloni licin. Ciri mikroskopis: satu sel, bentuk bulat
sampai lonjong, ditemukan adanya tunas. Cendawan golongan Ascomycetes yang
ditemukan pada penelitian ini adalah Saccharomyces atau biasa dikenal sebagai
khamir. Frekuensinya tidak begitu sering ditemukan pada kultur yang terkontaminasi.
Sumber penyebarannya adalah tanah atau bahan penelitian berupa tumbuhan yang
terkena parasit. Oleh karena itu kebersihan ruang kultur menjadi sangat penting untuk
menekan tingkat kontaminasi khamir ini.
Dictyostelium
Klasifikasi Dictyostelium
Kelas : Acraciales
Genus : Dictyostelium
Ciri morfologi koloni: terdapat agregasi yang merupakan pusat struktur seluler
pertama yang bersifat amoeboid. Termasuk kapang lendir seluler. Kapang lendir
merupakan kumpulan mikroorganisme yang heterogen. Padanya terdapat ciri-ciri
hewan dan tumbuhan. Fase vegetatif atau somatik yang aseluler dan merayap jelas
mempunyai struktur dan fisiologi seperti binatang; struktur reproduksifnya seperti
tumbuhan, yaitu menghasilkan spora yang terbungkus dinding yang nyata. Gabungan
fase seperti binatang dan tumbuhan dalam satu daur hidup ini merupakan ciri
pembeda kapang lendir. Ada empat tipe kapang lendir berdasarkan perbedaan
struktur, fisiologi dan daur hidupnya. Keempatnya ialah kapang lendir sejati
(Myxomycetes), kapang lendir endoparasit (Plasmodiophoromycetes), kapang lendir
jaring (Labyrinthulales) dan kapang lendir selular (Acraciales).
Klasifikasi kapang lendir menantang dan sulit dideskripsikan. Mereka kadangkadang diklasifikasikan sebagai filum tersendiri dalam dunia Protista. Namun kadangkadang dimasukkan dalam dunia Fungi. Dalam klasifikasi yang lain lagi, Myxomycetes
dan Plasmodiophoromycetes dianggap mempunyai status taksonomi sejajar dengan
cendawan sejati, sedang Acraciales dan Labyrinthulales dianggap terpisah karena
pertalian keturunannya tidak jelas.

Kapang lendir seluler merupakan organisme yang hidup bebas dan ameboid;
plasmodiumnya tidak multi nukleat. Daur hidupnya menarik, tumbuh tanah untuk
mendapatkan bakteri yang menjadi makanannya. Kapang lendir seluler yang
ditemukan pada penelitian ini adalah genus Dictyostelium. Hal ini ditentukan dari
morfologi koloni yaitu adanya plasmodium yang tersebar di seluruh permukaan
medium kultur yang terkontaminasi. Plasmodium ini lama kelamaan membentuk
agregrat berupa benang miselium yang sangat halus dan menjadi pusat koloni. Setelah
munculnya papila apikal, kolum silindris berubah menjadi semacam siput, lalu topi
sombrero, terbentuk tangkai dan akhirnya terbentuk tubuh buah (Alexopoulos dan dan
Bold, 1967). Frekuensi ditemukannya Dictyostelium relatif jarang. Sumber
Dictyostelium adalah tanah atau debu (Pelczar dan Chan, 1988), sehingga untuk
menghindarinya harus diperhatikan masalah kebersihan ruangan.
Induksi kultur yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat
penting dalam kultur jaringan. Bahan tanam dari lapangan mengandung debu, kotoran
dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Eksplan tanaman yang diambil
dari lapangan dapat menjadi sumber kontaminan. Hasil penelitian terbaru
menunjukkan bahwa melimpahnya cendawan Penicillium spp. pada suatu kultur
merupakan kurang efisiennya proses sterilisasi permukaan menggunakan 0,35%
sodium hipokhlorida selama 3 menit.
Penanganan bahan tanaman, peralatan kultur dan persiapan media dapat
menjadi sumber berkembangnya kontaminan (Omamor et al., 2007). Kontaminan
hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta sporaspora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, dengan media yang mengandung gula,
vitamin dan mineral, maka kontaminan terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh
secara cepat. Dalam beberapahari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur.
Eksplan yang tertutupi kontaminan akhirnya mati.