Laminas Seminario de Lipasas

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LIPASAS MICROBIANAS: CARACTERIZACIÓN, CLASIFICACIÓN

PURIFICACIÓN Y APLICACIONES

LÁMINA 1. PORTADA

LÁMINA 2. Definición de lipasas

Las lipasas (EC 3.1.1.3) son conocidas como acilhidrolasas de triacilglicerol


que actúan sobre los enlaces ésteres carboxílicos y forman parte de la familia de
las serina hidrolasas

Otro dato importante es que No requieren ningún cofactor

En la figura que vemos aca, Los triglicéridos se hidrolizan en ácidos grasos y


glicerol, utilizando las lipasas. Los enlaces de ésteres carboxílicos pueden ser
hidrolizados por las esterasas además de las lipasas

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LAMINA 3 Reacciones catalizadas por lipasas

Las lipasas catalizan naturalmente la hidrólisis del enlace éster de los tri-, di-
y monoglicéridos en ácidos grasos y glicerol (comon la se muestra Fig. 2). Sin
embargo, también son activas en una amplia gama de sustratos. En todos los
casos, la reacción se lleva a cabo en la interfase de un sistema de reacción
bifásico. Este sistema bifásico resulta de la presencia de una fase orgánica
inmiscible, que contiene el sustrato hidrofóbico, en el agua

Las lipasas, como se ha dicho anteriormente, pueden catalizar otras


reacciones además de la hidrólisis de TAG, como la esterificación y
transesterificación, la cual puede a su vez clasificarse en alcohólisis (que se lleva
a cabo entre un éster y un alcohol), acidólisis (que se lleva a cabo entre un éster y
un ácido carboxilico), e interesterificación (entre dos ésteres)

Este tipo de reacciones ocurren en medio acuoso con solventes orgánicos o


libres de ellos, utilizando sustratos naturales o sintéticos. Además de las
reacciones mencionadas anteriormente, las lipasas pueden catalizar reacciones
menos comunes como la aminólisis (reacción de un éster con una amina primaria
para dar una amida y un alcohol)

Tambien se tiene que las reacciones de síntesis se producen en un medio


con baja actividad termodinámica del agua,

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Además, las lipasas pueden catalizar adición de Michael y reacciones de
epoxidación (Aouf et al., 2014).

La reacción es una adición de un enolato de una cetona o aldehído sobre el


carbono β de un compuesto carbonílico α,β-insaturado (el "aceptor" de Michael). ...
El producto resultante contiene un altamente útil patrón de dos carbonilos (C=O)
en 1,5.

La epoxidación es un método que consiste en la funcionalización de los


aceites vegetales o sus correspondientes ésteres metílicos a través de la
incorporación de un átomo de oxígeno en la insaturación de la cadena del ácido
graso (McNutt & He, 2016; Panchal, Patel, Chauhan, Thomas & Patel, 2017).
Diversas enzimas como las citocromo p450 monooxigenasas, oxigenasas con
doble centro de hierro, lipoxigenasas y peroxigenasas son capaces de catalizar
esta reacció.

LAMINA 4. FUENTES DE LIPASAS

En los seres humanos, la lipasa es producida por el páncreas, La función


principal de esta lipasa gástrica es ayudar a la absorción de grasas.

Distribución en la naturaleza

Lipasas animales

Las lipasas se encuentran en todos los niveles del reino animal; desde los
invertebrados hasta los mamíferos, y participan en varios niveles del metabolismo
de lípidos como la digestión de la grasa, y la absorción, reconstitución y
metabolismo de lipoproteínas (Desnuelle, 1972).

Lipasas veretales

Las lipasas en los vegetales se acumulan principalmente en los tejidos de


reserva de energía como las semillas y frutos (Koshland y Boyer 1968).

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Lipasas microbianas

Las lipasas de mayor interés industrial son las producidas por


microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) (Alford, 1964). La mayor parte
de ellas son lipasas extracelulares que tras ser sintetizadas por el microorganismo
son excretadas al medio de cultivo a través de la membrana celular.

LAMINA 5

Fuentes de lipasas microbianas

Estas lipasas naturales o recombinantes se utilizan generalmente en


diversas aplicaciones de bioingeniería.

En numerosos procedimientos biocatalíticos la lipasa B de Candida


antárctica es la enzima más utilizada y la que más patentes tiene.

La lipasa de Candida rugosa es otra lipasa científicamente significativa de


esta levadura, que es una mezcla de diferentes isoformas, es comercialmente
accesible, "Generalmente Reconocida como Segura" (GRAS) por lo cual, se utiliza
en la industria alimentaria

Las PLA1 y PLA2 de Fusarium oxysporum, Thermomyces lanuginosus, A.


niger y Trichoderma reesei son fosfolipasas de levaduras y hongos que se utilizan
en el desgomado de aceites vegetales.

Tambien tenemos la PLB extraídas de A. oryzae y A. niger (Mayordomo et


al., 2000; Magarvey et al., 2004).

Debido a su alta transfosfatidilación y actividades hidrolíticas, las PLD


aisladas de cepas de Actinomycete están disponibles comercialmente y se utilizan
en varios procedimientos industrializados (Munsch et al., 2018).

Finalmente como se menciona aca, Los géneros bacterianos más


reconocidos para la producción de lipasas y fosfolipasas son Pseudomonas,

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Bacillus y Streptomyces, seguidos de Burkholderia, Chromobacterium,
Achromobacter, Alcaligenes y Arthrobacter (Geoffry y Achur, 2018).

LAMINA 6

Clasificación de las enzimas lipasas

La clasificación más aceptada aun en el 2019 fue propuesta por Arpigny y


Jaeger (Arpigny y Jaeger, 1999; Jaeger y Reetz, 2012) desde 1999. Estos autores
las clasificaron en 8 familias: las lipasas verdaderas, la familia II o GDSL, la familia
III, la familia IV o HSL (lipasa sensible a hormona), la familia V, la familia VI, la
familia VII y la familia VIII.

LAMINA 7. CLASIFICACION DE LA FAMILIA 1

LAMINA 8

Clasificación, Propiedades y características de las lipasas

Las enzimas lipolíticas se dividen en dos grandes grupos: las lipasas y las
esterasas o carboxilesterasas.(Ro et al., 2014) Las lipasas son específicas para
acilgliceroles con ácidos grasos de cadena larga (> 10 átomos de carbono), siendo
la trioleína su sustrato de referencia; mientras que las esterasas actúan
específicamente sobre acilgliceroles de cadena corta (< 10 átomos de carbono), y
otros esteres simples, siendo la tributirina su sustrato estándar.(Du et al., 2018).

Estos dos tipos de enzimas se pueden diferenciar de otras características,


las cuales están relacionadas directamente con la especificidad de sustrato. En tal
sentido, las lipasas muestran preferencia por sustratos altamente hidrofóbicos, Sin
embargo, las esterasas actúan sobre sustratos más solubles aunque también
suele ser variable

Ambas enzimas muestran estabilidad en presencia de disolventes orgánicos,


siendo algo más pronunciado en lipasas,

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Tambien las Las esterasas pueden ser distinguidas de las lipasas por el
denominado “fenómeno de activación interfacial”, el cual solo ha sido observado
en lipasas.

Este fenómeno de activación interfacial es debido a un dominio hidrofóbico,


denominado lid (tapa), que se encuentra alrededor del centro activo de la enzima.
Por lo que requieren una concentración crítica de sustrato para que se produzca el
movimiento de lid, haciendo accesible el sustrato al centro activo (Park et al.,
2016).

Un dato importante es que La actividad funcional de las lipasas se sustenta


en la tríada de aminoácidos clásica: nucleófilo-ácido-histidina (Alam et al., 2002;
Mead et al., 2002), dilucidada inicialmente para las proteasas serínicas (Carter y
Wells, 1988).

Todas las familias de lipasas presentan el mismo mecanismo de reacción basado en la


triada catalítica Ser-His-Asp/Glu, donde el residuo Ser se encuentra embebido en la
secuencia consenso Gly-X-Ser-X-Gly, además presentan una activación interfacial en
presencia de sustratos insolubles y un loop o lid que protege el sitio activo (De Caro,
1981).

LAMINA 9

Masa molecular y punto isoeléctrico

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El peso molecular de las lipasas se sitúa en el rango de 19-60 kDa y se
conoce que son proteínas monoméricas.

ALGO DE VERDAD BASTANTE INTERESANTE ES QUE La posición del


ácido graso en el esqueleto de glicerol, la longitud de la cadena del ácido graso y
su grado de insaturación son los factores que modulan las propiedades físicas de
las lipasas (Carpen et al., 2019; Tong et al., 2016).

Se conocen algunos ejemplos de lipasas con masas moleculares ubicadas


fuera de este intervalo.

EN CUANTO A LOS puntos isoeléctricos que se han informado para la


mayor parte de las enzimas e isoenzimas de diversos orígenes se encuentran
entre 3,8 y 7,3

Tabla 1. Masas moleculares y puntos isoeléctricos de lipasas procedentes de


diversas fuentes

Fuente Masa molecular pH Referencia


(kDa)
Chromobacterium viscosum 33 7,1 Taipa et al., 1995
Candida rugosa 60 4,80-5,04 (isoenzimas) Lotti y Alberghina, 1996
Pseudomonas pseudoalcaligenes 32 7,3 Shuen-Fuh et al., 1996
Rhizomucor miehei 31,6 3,8 Wu et al., 1996
Salvado de arroz 9,4 ND Bhardwaj et al., 2001
Acinetobacter sp. 33 ND Snellman et al., 2002
Escorpión (glándulas digestivas) 50 ND Zouari et al., 2005
Calamar Todarodes pacificus (hígado) 27 ND Park et al., 2008

LAMINA 10

Influencia del pH

Las lipasas muestran actividades dependientes del pH,

generalmente a pH neutro 7,0 o hasta pH 4,0 y 8,0 las lipasas son estables,

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Chromobacterium viscosum, A. niger y Rhizophus sp., producen lipasas
extracelulares que son activas a pH ácido, y Pseudomona nitroaeducens produce
lipasas alcalinas y activas a pH 11,0 (Silveira et al., 2017).

LAMINA 11

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

La temperatura óptima para las lipasas puede encontrarse en el intervalo


entre 35 y 50 °C, aunque existen lipasas termoestables que exhiben valores de
temperatura óptima superiores a 50 °C,

Rhizomucor miehei (50 °C) (Wu et al., 1996),

salvado de arroz (80 °C) (Bhardwaj et al., 2001),

Acinetobacter sp. (55 °C) (Snellman et al., 2002).

El medio en el que se encuentre la enzima también influye en el valor de


temperatura óptima. De este modo, las lipasas presentes en preparados crudos,
con altas concentraciones de otras proteínas distintas de las proteasas, serán más
estables y exhibirán valores aparentes de temperatura óptima superiores

La inmovilización puede producir incrementos en los valores de temperatura


óptima de las lipasas solubles, debido a su efecto sobre la estabilidad enzimática

LAMINA 12

Plegamiento y aminoácidos catalíticos

Las lipasas presentan un dominio estructural compuesto por ocho cadenas β


que forman una hoja β.

Estas cadenas están conectadas por hélices α, que quedan empaquetadas a


ambos lados de la hoja β.

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El núcleo central es el responsable directo de la actividad catalítica y define
el plegamiento α/β-hidrolasa, común para muchas hidrolasas

Fig. 3. El pliegue de la alfa/beta-hidrolasa en el que las α-hélices están


representadas por espirales y las β-cuerdas se indican con flechas. Los residuos
del sitio activo se muestran como círculos. Adaptado de (Jaeger et al., 1999).

LAMINA 13

Figura 2.Diagrama del plegamiento α/β-hidrolasa. Las hélices α y las láminas


β están representadas por los cilindros y flechas, respectivamente. La

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ubicación topológica de los residuos del sitio activo está señalada por
círculos. Las líneas discontinuas indican la localización de posibles
inserciones.

LAMINA 14. CENTRO ACTIVO

En amarillo sitio activo

El centro activo de las lipasas permanece protegido por una cubierta que
impide la entrada del sustrato. Este solo tiene acceso cuando la enzima se
encuentra en su conformación activa y la cubierta se ha desplazado
(Derewenda et al., 1994b; Miled et al., 2003). Esta cubierta puede ser una
hélice a anfifílica (Lotti y Alberghina, 1996) o un lazo (Hui y Howles, 2002).

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LAMINA 15

Pleiss et al. clasificaron las lipasas en tres grupos según la geometría de su


sitio de unión (Fig. 6).

El primer grupo tiene un sitio de unión hidrofóbico, en forma de grieta,


situado cerca de la superficie de la proteína. Las lipasas de Rhizomucor y
Rhizopus presentan este tipo de sitio de unión.

El segundo grupo tiene una unión en forma de embudo, que incluye las
lipasas de C. antarctica, Burkholderia sp. y B. cepacia, así como las lipasas
pancreáticas de mamíferos.

El último grupo tiene un sitio de unión tipo túnel y comprende las lipasas de
C. rugosa, por ejemplo.

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Fig. 6. Forma de los tres tipos de sitios de unión de las lipasas identificados por
(Pleiss et al., 1998).

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LAMINA 16

El bucle α-helicoidal de las lipasas: La tapa “LID”

La resolución de las primeras estructuras tridimensionales de las lipasas de


R. miehei y de la lipasa pancreática humana permitió identificar una tapa sobre el
sitio activo (Ericsson et al., 2008). Como lo vimos anteriormente

La tapa está compuesta por una o más α-hélices, unidas a la estructura


principal de la enzima por una estructura flexible. Es un elemento móvil, que
descubre el sitio activo en presencia de una interfaz lípido-agua, generando un
cambio conformacional y permitiendo así el acceso del sustrato al sitio activo
(Aloulou et al., 2007).

Este mecanismo, conocido como activación interfacial, explica el


comportamiento no-Michaelis-Menten observado en la mayoría de las lipasas. De
hecho, la actividad de las lipasas aumenta drásticamente cuando la concentración
de sustrato es lo suficientemente alta como para formar micelas y emulsiones y,
por lo tanto, da lugar a curvas sigmoides cuando se traza la velocidad inicial de la
reacción frente a la concentración de sustrato.

La figura 7 que vemos aca muestra la conformación abierta y cerrada de las


lipasas de C. rugosa y Rhizomucor miehei.

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Fig. 7. Rhizomucor miehei lipasa. En gris su conformación abierta con fosfonato de
dietilo, PDB 4TGL, (Derewenda et al., 1992) y en negro su conformación cerrada,
PDB: 3TGL, (Brzozowski et al., 1992).

LAMINA 17

Activación interfacial

De manera general, las lipasas son enzimas que requieren de


activación interfacial para desplegar al máximo su actividad catalítica

Este fenómeno consiste en el incremento de la actividad enzimática en


presencia de interfaces lípido-agua

A nivel molecular, una interface consiste en un conjunto de dos capas


adyacentes de moléculas ordenadas con diferente carácter hidrofóbico-
hidrofílico (Malcata, 1996).

Cuando la enzima entra en contacto con una interface, el ambiente


dieléctrico en la superficie proteica se modifica, en el sentido de potenciar las
interacciones electrostáticas. Ello posibilita que la cubierta del centro activo se
desplace por decirlo de alguna manera, y se produce una reestructuración en la
conformación de la molécula

Como resultado, los aminoácidos catalíticos quedan expuestos al solvente en


una orientación adecuada, y alrededor de éstos se conforma la cavidad
oxianiónica,

Todo esto incrementa la afinidad de la enzima por sus sustratos lipídicos


y contribuye a la estabilización del estado de transición durante el ciclo
catalítico

Las características físicoquímicas del sustrato también contribuyen de


manera significativa a la activación interfacial

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En el estado agregado, los triacilglicéridos exhiben un grado de
ordenamiento elevado, que minimiza el número de estados conformacionales
que pueden presentar estas moléculas en solución acuosa, debido a la gran
flexibilidad de sus cadenas de ácidos grasos. Este efecto tiene implicaciones
favorables para el reconocimiento enzima-sustrato (Petersen, 1996).

LAMINA 18

La cavidad oxianiónica

El intermedio tetraédrico formado durante el mecanismo catalítico de las


lipasas se estabiliza por la presencia de enlaces de hidrógeno con dos
aminoácidos que forman la llamada cavidad oxianiónica de la lipasa. Estos
aminoácidos estabilizan el intermedio a través de enlaces de hidrógeno entre el
protón amida de su columna vertebral y el oxígeno del grupo carbonilo del sustrato

En la base de datos de ingeniería de lipasas, las lipasas se clasifican en


función de su cavidad oxianiónica en tres clases: GX, GGGX, e Y.

GX y GGGX, se muestran en la Fig. 6.

En el tipo GX, G es una glicina conservada, y X es el residuo de oxianión.

En el tipo GGGX, el residuo de cavidad de oxianión G va seguido de un


residuo hidrofóbico conservado X.

La cavidad de oxianión puede estar preformado en la conformación cerrada


sin la modificación geométrica al abrirse la tapa o sólo formarse al abrirse la tapa

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Fig. 4. Dos tipos de agujeros de oxianiones. (a) Tipo G X en la lipasa de R. miehei
(entrada PDB 4TGL): dietilfosfonato estabilizado por enlaces de hidrógeno con
Ser82 y Leu145. (b) Tipo G X en la lipasa de C. rugosa (entrada PDB 1LPM): (1R)-
hexilfosfonato de magnesio estabilizado por enlaces de hidrógeno con Gly124 y
Ala210. El sustrato se muestra en negro y los enlaces de hidrógeno están
esquematizados con líneas de puntos.
El tipo de orificio oxiánico juega un papel importante en las especificidades
de las lipasas hacia sus sustratos. De hecho, las lipasas con el tipo GX suelen
hidrolizar sustratos con una longitud de cadena de carbono media y larga,
mientras que el tipo GGGX se encuentra en las lipasas específicas de longitud
corta y en las carboxilesterasas.

Las lipasas fúngicas tienen el tipo de cavidad oxianiónica GX, donde X es


una serina o una treonina, y en la mayoría de los casos poseen un tercer
aminoácido, aspártico o asparagina, que también contribuye a estabilizar el
agujero oxianiónico mediante un enlace de hidrógeno (Pignede et al., 2000).

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Un tercer tipo de cavidad oxianiónica, el tipo Y, fue identificado por Fischer et
al. (Jaeger y Eggert, 2002). En el tipo Y la cavidad oxianiónica está formada por el
grupo hidroxilo de una cadena lateral de tirosina estrictamente conservada. Este
tipo se encuentra en la lipasa A de C. antarctica (familia abh38); en algunas
esterasas, como las de la cocaína, y en algunas lipasas bacterianas ((Jaeger y
Eggert, 2002; Irimescu et al., 2005).

LAMINA 19

Mecanismo catalítico

Las lipasas catalizan la hidrólisis de lípidos por el mismo mecanismo que las serina
proteasas. El sitio activo presenta un residuo de serina (Esquema I.2) que es activado
por un residuo de histidina y aspartato, éstos hacen que el hidroxilo de la serina sea
altamente nucleofílico. Los tres residuos serina, histidina y aspartato constituyen
latríada catalítica.

El mecanismo se puede explicar de la siguiente manera:

Primer paso: el grupo acilo del éster es atacado por el oxígeno de la serina, que es
activado por los puentes de hidrógeno que forman la serina con la histidina y ésta con
el aspartato. Asíse genera un intermediario tetraédrico (A) cuya carga negativa se
estabilizaa través de enlaces hidrógeno por los residuos treonina y glutamina. Estos
residuos se encuentran en el hueco oxianión.

Segundo paso: eliminación del alcohol generándoseel complejo acil-enzima(B).

Tercer paso: adición de un nucleófilo al complejo acil-enzima,


formándosenuevamenteel complejo tetraédrico(C).

Cuarto paso: liberación del producto y regeneracióndel sitio activo.

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LAMINA 20

Selectividad

La selectividad de las lipasas está relacionada con su preferencia por realizar


determinadas reacciones. Se pueden distinguir tres tipos de selectividad: la
selectividad de tipo, la regioselectividad y la enantioselectividad. A continuación se
analizan los fundamentos de estos tipos de selectividad (Casas et al., 2018).

Selectividad de tipo

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La selectividad de tipo está asociada a la preferencia por un sustrato
determinado, por ejemplo, tri-, di- o monoglicéridos.

Por ejemplo, se demostró que una lipasa de monoacilglicerol aislada de


eritrocitos humanos sólo hidroliza monooleoglicerol, en comparación con los
correspondientes di- y triglicéridos (Sommadelpero et al., 1995).

Esta selectividad también se refiere a la preferencia de las lipasas hacia los


ácidos grasos de cadena corta, media o larga y al grado de insaturación y las
posibles sustituciones del sustrato.

Además, las lipasas pueden mostrar quimioselectividad, que es la


especificidad de las lipasas hacia un grupo químico específico.

LAMINA 21

Regioselectividad

La regioselectividad se define como el ataque preferencial de las lipasas


hacia un determinado enlace éster en el esqueleto de glicerol de los triglicéridos,
es decir, enlace éster primario o secundario.

La mayoría de las lipasas microbianas hidrolizan las posiciones sn -1 de los


triglicéridos y sólo unas pocas son capaces de hidrolizar la posición sn -2. Las

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lipasas con especificación sn -1 son producidas por Rhizopus arrizhus, Aspergillus
níger, Y. lipolytica, R. miehei, R. delemar y T. lanuginosus.

Las lipasas con especificación sn -2 son inusuales, e incluyen las de


Staphylococcus (Horchani et al., 2010) y la lipasa C de Geotrichum sp FO401B
(Ota et al., 2000). Por último, algunas lipasas son lipasas no específicas que
actúan al azar sobre los triglicéridos. Ejemplos de lipasas no específicas son las
de Staphylococcus aureus (Vadehra y harmon, 1967), S. hyicus (Vanoort et al.,
1989) , Corynebacterium acnes (Hassing, 1971) , C. viscosum (Sugiura e Isobe,
1975) y C. antárctica.

Fig. 8. Identificación de los enlaces ésteres potencialmente hidrolizados por


las lipasas en una molécula de triacilglicerol (Casas et al., 2018).

LAMINA 22

Enantioselectividad

Una molécula quiral es una molécula con un centro asimétrico, que puede
adoptar dos formas enantioméricas, R y S. Los enantiómeros R y S son imágenes
especulares no superponibles entre sí (Fig. 8), cuyas propiedades químicas, como
el punto de fusión, la solubilidad y la reactividad, son muy similares. Sin embargo,
suelen tener propiedades biológicas diferentes. De hecho, un enantiómero

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determinado puede mostrar actividad terapéutica, mientras que el otro puede ser
inactivo o incluso tóxico (Kasprzyk y Baker, 2013). La enantioselectividad se
refiere a la preferencia de las lipasas hacia un enantiómero particular de una
molécula quiral, en una reacción química que implica una mezcla racémica
(mezcla de ambos enantiómeros). La enantioselectividad es, por tanto, de gran
interés en la industria farmacéutica.

Fig. 9 Representación de una alanina quiral en sus dos posibles formas


enantioméricas R y S. El centro quiral está representado por un asterisco Casas et
al., 2018).

LAMINA 23

Purificación de las lipasas bacterianas

El propósito de la purificación no es sólo aislar las enzimas de los


contaminantes, sino también mejorar su actividad, estabilidad y vida útil.

Una vez purificadas las proteínas hasta el nivel de homogeneidad, se pueden


realizar estudios estructurales y conformacionales (Nadeem et al., 2009, 2015a).

Además, las lipasas purificadas son necesarias para hacer formulaciones


importantes a nivel industrial y medicinal. La purificación es un paso clave que se
realiza para interpretar la función real de una enzima específica. Las células

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bacterianas se eliminan del caldo de cultivo después del proceso de fermentación
para obtener las lipasas extracelulares.

El extracto libre de células se concentra entonces mediante la extracción con


disolventes orgánicos, la ultrafiltración o la precipitación con sulfato de amonio.

La precipitación con sulfato de amonio se utiliza sobre todo en las primeras


etapas de la purificación, considerándose como un paso de separación en bruto, y
va seguida de una combinación de pasos cromatográficos (Saxena et al., 2003).

El caldo o el cultivo celular se somete a varias etapas, desde la precipitación


de la sal hasta la cromatografía en columna, dependiendo de la naturaleza de las
proteínas y del nivel de purificación deseado.

Para la purificación de las lipasas se utilizan varias técnicas cromatográficas,


como el intercambio de aniones, el intercambio de cationes y la cromatografía de
exclusión por tamaño. Los datos de varios estudios sugieren que las lipasas se
han purificado desde 2,4 hasta 500 veces con un rendimiento global del 10,3-36%
(Tabla 2).

LAMINA 24

Tabla 2. Estrategias de purificación utilizadas recientemente para diversos


estudios de lipasas bacterianas.

Cepas bacterianas Purificación Rendimiento Referencia


(%)
Burkholderia ubonensis SL-4 Precipitación con sulfato de amonio, 68.5/13.34 (Yang et al., 2016)
intercambio aniónico, Q-sefarosa y
cromatografía de filtración en gel superdex 75.
Bacillus sp. Precipitación con sulfato de amonio y 5.1/10.5 (Sivaramakrishnan and
cromatografía de intercambio iónico Incharoensakdi, 2016)
Pseudomonas aeruginosa Precipitación con sulfato de amonio y filtración 36/20 (Unni et al., 2016)
BUP2 con gel sephadex G-100
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Precipitación con sulfato de amonio y 101.1/15.7 (Mo et al., 2016)
YB103 cromatografía con fenil sefarosa
Bacillus pumilus Precipitación con sulfato de amonio, 210/36 (Faouzi et al., 2015a)
tratamiento térmico (30 minutos a 70 °C),
cromatografía Mono-S y sephacryl S-200
Geobacillusstearothermophilus Tratamiento térmico (30 min a 70 °C), DEAE- 18.3/19.7 (Ekinci et al., 2015)
AH22 celulosa, sephadex G-150, sephadex G-25
Yersinia enterocolitica KM1 Ultrafiltración, precipitación con sulfato de 26.0/10.3 (Ji et al., 2015)
amonio, sephacry™ HRS-100, superdex G-75
Idiomarina sp. W33 Precipitación con sulfato de amonio, DEAE- 7.4/24.6 (Li et al., 2014)

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sefarosa, sephacryl S-200
Pseudomonas aeruginosa Precipitación con sulfato de amonio, 4.96/54.1 (Bose and Keharia, 2013)
AAU2 cromatografía de permeación en gel
Staphylococcus sp Precipitación de sulfato de amonio, S-200 23.92/32 (Daoud et al., 2013)
Aneurinibacillus Cromatografía de intercambio aniónico Q- 15.6/19.7 (Masomian et al., 2013)
thermoaerophilus Sefarosa y filtración en gel Sephadex G-75
HZ
Stenotrophomonas maltophilia Precipitación de sulfato de amonio, 60.54/8.4 (Li et al., 2013)
CGMCC 4254 cromatografía hidrofóbica de la acción recíproca
(sus siglas en ingles, HIC)
Bacillus pumilus RK31 Centrífuga de velocidad, precipitación con 186/NR (Kumar et al., 2012a,b)
sulfato de amonio, filtración en gel sephadex
G- 200, celulosa DEAE (intercambio iónico)
Pseudoalteromonas sp. NJ 70 Precipitación con sulfato de amonio, fenil- 27.5/25.4 (Wang et al., 2012)
sefarosa 6FF, DEAE sephadex A-50
Chromohalobacter sp. LY7-8 Precipitación con sulfato de amonio, sephacryl 10.2/12.9 (Xin and Hui-Ying, 2012)
S-100
Halobacillus sp. strain LY5 Precipitación con sulfato de amonio, celulosa 8.7/10.3 Xin et al., 2012)
DEAE, sephacryl S-100
Staphylococcus aureus Cromatografía de fenil sefarosa CL-4B, 6.76/20 (Sarkar et al., 2012)
cromatografía de superosa-12
Bacillus subtilis NS 8 Ultrafiltración, DEAE-Toyopearl, sephadex G- 500/16 (Olusesan et al., 2011)
75
Amycolatopsis mediterranei DSM Precipitación con sulfato de amonio, Q 398/36 (Dheeman et al., 2011)
43304 sefarosa HP y cromatografía en columna
toyopearl phenyl-650
Ralstonia sp. CS274 Precipitación con sulfato de amonio, 4/20.8 (Yoo et al., 2011)
ultrafiltración y cromatografía en columna de
fenil sefarosa CL-4B

Las estrategias de purificación incluyen la concentración del medio de cultivo


por ultrafiltración o precipitación con sulfato amónico, seguido de purificación
adicional, el uso de técnicas sofisticadas tales como cromatografía de afinidad,
cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel (Gupta et al., 2004). Varias
técnicas novedosas como procesos de membrana, inmunopurificación,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía en columna, etc. se aplican
para la purificación de lipasas (Saxena, Sheoran, Giri, & Davidson, 2003). Las
propuestas de esquemas para producción y purificación de lipasa a gran escala
deben ser de alto rendimiento, rápidos y lo menos costosos posibles.

LAMINA 25

Inhibidores, inhibición y efecto de aditivos sobre la actividad enzimática

• Organofosfatos , como el dietil-p-nitrofenilfosfato y el diisopropil-


fluorofosfato Carbodiimidas en presencia de nucleófilos, como el
glicin-etil éster,

23
• y por el iodo.

• También son inhibidores de lipasas los ácidos borónicos y el


fenil-metil-sulfonil-fluoruro, así como los metales pesados, el EDTA.

• Algunos terpenos, los iones halógenos, los alcaloides, el cloroformo,


el n-hexanol, el dietil-fenil carbonato, el bromoformo, varias
lactonas y algunos carbamatos en presencia de detergentes.

• Algunos cationes metálicos pueden producir inhibición

• Muchas lipasas requieren del ion Ca2+ para mantener una


conformación estable y/o catalíticamente competente. Los
detergentes o surfactantes son aditivos de primera importancia para
la actividad lipolítica

LAMINA 26

Aplicaciones de las enzimas lipolíticas

Las aplicaciones de las reacciones que pueden ser catalizadas por las
enzimas lipolíticas son múltiples y muy diversas:

• En la industria alimentaria permiten: producir ésteres aromatizantes y del


sabor, ésteres de azúcar que actúan como emulsionantes, modificar la
composición de ácidos grasos de los triglicéridos mediante la introducción
de omega-3 y/o eliminar los ácidos grasos saturados (Nagarajan, 2012;
Adlercreutz, 2013).

En la industria farmacéutica se utilizan para resolver mezclas racémicas


usadas en la síntesis de fármacos y para producir enantiómeros
biológicamente activos (Bornscheuer, 1999¸ Sharma et al., 2012; Adlercreutz,
2013).

24
• En la industria cosmética y de perfumería se usan para producir por
esterificación mono- y diacilgliceroles que se emplean como surfactantes y
compuestos responsables del aroma (Sharma & Kanwar, 2014).

• En la industria del papel permiten eliminar las resinas de la pasta de papel


(Sharma et al., 2012).

• En la industria de los detergentes se usan como aditivos para eliminar las


manchas de grasa (Sharma et al., 2012).

• En el diagnóstico clínico se pueden emplear como biomarcadores para


detectar pancreatitis o infección tuberculosa (Sharma et al., 2012).

LAMINA 27

• En ensayos analíticos para secuencias de ADN específicas se pueden


utilizar como genes indicadores acoplados con sustratos cromogénicos
(Nagarajan, 2012).

• En la producción de biodiesel se emplean como una alternativa a la


catálisis química alcalina que es nociva para el medio ambiente, mediante la
transesterificación de aceites en metanol u otro alcohol diferente y producir
ésteres alquílicos de ácidos grasos (Adlercreutz, 2013).

• Se usan en la síntesis de biopolímeros a partir de monómeros


estructuralmente complejos (Nagarajan, 2012).

• Finalmente, se pueden usar en tratamiento de residuos y biorremediación


de derrames de petróleo (Sharma et al., 2012).

LAMINA 28

Conclusiones

Las lipasas son enzimas extraordinariamente versátiles que han


recibido considerable atención en biotecnología desde hace más de tres

25
décadas. Esto se debe a las peculiares propiedades funcionales que exhiben
estas moléculas, dado su carácter de enzimas interfaciales.

La activación en interfaces, una especificidad de sustrato amplia y una


selectividad basada en múltiples determinantes estructurales, una
sensibilidad de la actividad enzimática muy rica frente a numerosos y
variados efectores, la posibilidad de inmovilización con altas retenciones de
la actividad funcional, la estabilidad operacional de los biocatalizadores
inmovilizados, la estabilidad en solventes orgánicos, y la capacidad de
desarrollar la catálisis en medios con baja actividad de agua, son algunos de
los aspectos más atractivos de las lipasas que han determinado su papel
protagónico en numerosos procedimientos de la tecnología enzimática.
Profundizar en las bondades y limitaciones de estas enzimas como
biocatalizadores, contribuye a la optimización de los procesos
biotecnológicos en los que ellas participan y, por tanto, a una mejor
aplicación de las lipasas para la obtención de bioproductos de utilidad
humana.

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